JP6210603B2 - リゾクトニア菌抵抗性遺伝子 - Google Patents
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Description
本発明者らはこれまで、イネの完全長cDNAを網羅的に過剰発現した2万以上のシロイヌナズナ系統(イネFOXシロイヌナズナ系統、非特許文献1)について、トマト斑葉細菌病菌(Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000, Pst3000)及びアブラナ科野菜類炭疽病菌(Colletotrichum higginsianum)に対する抵抗性スクリーニングを行い、両菌に対し抵抗性を示す系統を選抜し、その原因となるイネ遺伝子を10個以上同定した(非特許文献2及び3)。そのうちの1つである遺伝子BSR1を過剰発現する形質転換イネは、細菌である白葉枯病菌及び子のう菌であるいもち病菌に対し強い抵抗性を示した(特許文献1及び2)。しかし、担子菌であるリゾクトニア菌により引き起こされるイネ紋枯病に対しては、有効な抵抗性遺伝子はほとんど知られていない。
本発明はこのような知見に基づくものであり、以下の〔1〕〜〔8〕を提供する。
〔1〕以下(a)及び(b)の工程を含む、植物にリゾクトニア菌に対する抵抗性を付与する方法;
(a)以下(i)から(iv)からなる群より選択されるDNA又は該DNAを含むベクターを植物細胞に導入する工程、及び
(b)工程(a)においてDNA又はベクターが導入された植物細胞から植物体を再生する工程、
(i)配列番号:3に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNA、
(ii)配列番号:1又は2に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA、
(iii)配列番号:3に記載のアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び/又は挿入されたアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNAであって、植物にリゾクトニア菌に対する抵抗性を付与する機能を有するタンパク質をコードするDNA、及び
(iv)配列番号:1又は2に記載の塩基配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであって、植物にリゾクトニア菌に対する抵抗性を付与する機能を有するDNA。
〔2〕以下(a)から(d)からなる群より選択されるDNA又は該DNAを含むベクターを有効成分として含有する、植物にリゾクトニア菌に対する抵抗性を付与するための薬剤;
(a)配列番号:3に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNA、
(b)配列番号:1又は2に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA、
(c)配列番号:3に記載のアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び/又は挿入されたアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNAであって、植物にリゾクトニア菌に対する抵抗性を付与する機能を有するタンパク質をコードするDNA、及び
(d)配列番号:1又は2に記載の塩基配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであって、植物にリゾクトニア菌に対する抵抗性を付与する機能を有するDNA。
〔3〕以下(a)から(d)からなる群より選択されるDNA又は該DNAを含むベクターが導入された、リゾクトニア菌に対する抵抗性を有する形質転換植物体;
(a)配列番号:3に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNA、
(b)配列番号:1又は2に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA、
(c)配列番号:3に記載のアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び/又は挿入されたアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNAであって、植物にリゾクトニア菌に対する抵抗性を付与する機能を有するタンパク質をコードするDNA、及び
(d)配列番号:1又は2に記載の塩基配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであって、植物にリゾクトニア菌に対する抵抗性を付与する機能を有するDNA。
〔4〕〔3〕に記載の形質転換植物体の子孫又はクローンである、リゾクトニア菌に対して抵抗性である植物体。
〔5〕〔3〕又は〔4〕に記載の形質転換植物体の繁殖材料であって、リゾクトニア菌に対して抵抗性である形質転換植物体の繁殖材料。
〔6〕〔3〕又は〔4〕に記載の形質転換植物体から単離された細胞であって、リゾクトニア菌に対して抵抗性である細胞。
〔7〕〔3〕又は〔4〕に記載の形質転換植物体から単離された器官であって、リゾクトニア菌に対して抵抗性である器官。
〔8〕以下(a)及び(b)の工程を含む、リゾクトニア菌に対して抵抗性である形質転換植物体の製造方法;
(a)以下(i)から(iv)からなる群より選択されるDNA又は該DNAを含むベクターを植物細胞に導入する工程、及び
(b)工程(a)においてDNA又はベクターが導入された植物細胞から植物体を再生する工程、
(i)配列番号:3に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNA、
(ii)配列番号:1又は2に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA、
(iii)配列番号:3に記載のアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び/又は挿入されたアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNAであって、植物にリゾクトニア菌に対する抵抗性を付与する機能を有するタンパク質をコードするDNA、及び
(iv)配列番号:1又は2に記載の塩基配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであって、植物にリゾクトニア菌に対する抵抗性を付与する機能を有するDNA。
(a)下記(i)から(iv)からなる群より選択されるDNA又は該DNAを含むベクターを植物細胞に導入する工程、及び
(b)工程(a)においてDNA又はベクターが導入された植物細胞から植物体を再生する工程、
(i)配列番号:3に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNA、
(ii)配列番号:1又は2に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA、
(iii)配列番号:3に記載のアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び/又は挿入されたアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNAであって、植物にリゾクトニア菌に対する抵抗性を付与する機能を有するタンパク質をコードするDNA、及び
(iv)配列番号:1又は2に記載の塩基配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであって、植物にリゾクトニア菌に対する抵抗性を付与する機能を有するDNA。
本発明において「含む」は「含む」及び「からなる」の両方を意味する。
配列番号:1の塩基配列は、DDBJのAccession No: AK072163として知られる。配列番号:1に記載の塩基配列におけるタンパク質のコード領域は、106番目の塩基から1761番目の塩基(終止コドンを含む)である。
一方配列番号:2の塩基配列は、RAPDBのAccession No: Os08g054730(Os08t054730-01)として知られる。配列番号:2に記載の塩基配列におけるタンパク質のコード領域は、104番目の塩基から1759番目の塩基(終止コドンを含む)である。配列番号:2に記載の塩基配列では、配列番号:1の塩基配列の冒頭のGTが欠失している。
またシロイヌナズナであればAkamaら(Akama. et al. Plant Cell Reports. 12, 1992, 7-11.)の方法が挙げられ、ナタネであればWangら(Wang, Y.P. et al. Plant Breeding. 124, 2005, 1-4.)の方法が挙げられ、トマトであればKoblitzとKoblitz(Koblitz, H and Koblitz, D. Plant Cell Reports. 1, 1982, 143-146.)の方法やMorganとCocking(Morgan, A. and Cocking, E.C. Z.Pflanzenpysiol. 106, 1982, 97-104.)の方法が挙げられ、大豆であればLazzeriら(Lazzeri, P.A. et al., Plant Mol. Biol. Rep. 3, 1985, 160-167.)の方法やRanchら(Ranch, J.P. et al., In Vitro Cell Dev. Biol. 21, 1985, 653-658.)の方法が挙げられ、ジャガイモであればVisserら(Visser, R.G.F. et al. Theor. Appl. Genet. 78, 1989, 594-600.)の方法が挙げられ、トレニアであればAida, Rら(Aida, R. and Shibata, M. (1995), Breed. Sci. 45:71-74)の方法が挙げられるが、これらに限定されない。
一旦、染色体内に本発明のDNAが導入された形質転換植物体が得られれば、該植物体から有性生殖又は無性生殖により子孫を得ることが可能である。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから細胞や器官、繁殖材料(例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラスト等)を単離し、それらを基に該植物体を量産することも可能である。本発明には、本発明のDNAが人為的に導入された植物細胞、該細胞を含む植物体、該植物体の器官(例えば花、葉、根、茎等)、該植物体の子孫及びクローン、並びに該植物体及びその子孫及びクローンの繁殖材料が含まれる。これらの植物細胞、該細胞を含む植物体、該植物体の器官、該植物体の子孫及びクローン、並びに該植物体及びその子孫及びクローンの繁殖材料は、リゾクトニア菌に対して抵抗性を示す。これらは、植物にリゾクトニア菌に対する抵抗性を付与するための材料として使用することができる。
本発明の薬剤に含まれるDNAは、ベクターに挿入された形態であってもよい。ベクターとしては、植物細胞内で挿入遺伝子を発現させることが可能なものであれば特に制限はない。例えば、植物細胞内での恒常的な遺伝子発現を行うためのプロモーター(例えば、ジャガイモ・キチナーゼ遺伝子SK2のプロモーター、カリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーター等)を有するベクターや外的な刺激により誘導的に活性化されるプロモーターを有するベクターを用いることも可能である。
本発明の薬剤は、上記DNAや該DNAが挿入されたベクター自体であってもよく、また、これらが植物細胞への導入のための他の成分と混合されているものであってもよい。例えば、上記DNA、上記DNAを挿入したベクター、上記DNAが導入されたアグロバクテリウム、これらを含む生化学的試薬や溶液は、本発明における薬剤に含まれる。
〔1〕以下(a)及び(b)の工程を含む、植物に(1)又は(2)に記載の糸状菌および細菌もしくは(3)に記載の糸状菌に対する抵抗性を付与する方法;
(1)リゾクトニア菌、トマト斑葉細菌病菌及びアブラナ科野菜類炭疽病菌、
(2)リゾクトニア菌及びトマト斑葉細菌病菌、
(3)リゾクトニア菌及びアブラナ科野菜類炭疽病菌、
(a)以下(i)から(iv)からなる群より選択されるDNA又は該DNAを含むベクターを植物細胞に導入する工程、及び
(b)工程(a)においてDNA又はベクターが導入された植物細胞から植物体を再生する工程、
(i)配列番号:3に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNA、
(ii)配列番号:1又は2に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA、
(iii)配列番号:3に記載のアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び/又は挿入されたアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNAであって、植物に(1)又は(2)に記載の糸状菌および細菌もしくは(3)に記載の糸状菌に対する抵抗性を付与する機能を有するタンパク質をコードするDNA、及び
(iv)配列番号:1又は2に記載の塩基配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであって、植物に(1)又は(2)に記載の糸状菌および細菌もしくは(3)に記載の糸状菌に対する抵抗性を付与する機能を有するDNA。
〔2〕以下(a)から(d)からなる群より選択されるDNA又は該DNAを含むベクターを有効成分として含有する、植物に(1)又は(2)に記載の糸状菌および細菌もしくは(3)に記載の糸状菌に対する抵抗性を付与するための薬剤;
(1)リゾクトニア菌、トマト斑葉細菌病菌及びアブラナ科野菜類炭疽病菌、
(2)リゾクトニア菌及びトマト斑葉細菌病菌、
(3)リゾクトニア菌及びアブラナ科野菜類炭疽病菌、
(a)配列番号:3に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNA、
(b)配列番号:1又は2に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA、
(c)配列番号:3に記載のアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び/又は挿入されたアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNAであって、植物に(1)又は(2)に記載の糸状菌および細菌もしくは(3)に記載の糸状菌に対する抵抗性を付与する機能を有するタンパク質をコードするDNA、及び
(d)配列番号:1又は2に記載の塩基配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであって、植物に(1)又は(2)に記載の糸状菌および細菌もしくは(3)に記載の糸状菌に対する抵抗性を付与する機能を有するDNA。
〔3〕以下(a)から(d)からなる群より選択されるDNA又は該DNAを含むベクターが導入された、(1)又は(2)に記載の糸状菌および細菌もしくは(3)に記載の糸状菌に対する抵抗性を有する形質転換植物体;
(1)リゾクトニア菌、トマト斑葉細菌病菌及びアブラナ科野菜類炭疽病菌、
(2)リゾクトニア菌及びトマト斑葉細菌病菌、
(3)リゾクトニア菌及びアブラナ科野菜類炭疽病菌、
(a)配列番号:3に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNA、
(b)配列番号:1又は2に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA、
(c)配列番号:3に記載のアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び/又は挿入されたアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNAであって、植物に(1)又は(2)に記載の糸状菌および細菌もしくは(3)に記載の糸状菌に対する抵抗性を付与する機能を有するタンパク質をコードするDNA、及び
(d)配列番号:1又は2に記載の塩基配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであって、植物に(1)又は(2)に記載の糸状菌および細菌もしくは(3)に記載の糸状菌に対する抵抗性を付与する機能を有するDNA。
〔4〕〔3〕に記載の形質転換植物体の子孫又はクローンである、(1)又は(2)に記載の糸状菌および細菌もしくは(3)に記載の糸状菌に対して抵抗性である植物体;
(1)リゾクトニア菌、トマト斑葉細菌病菌及びアブラナ科野菜類炭疽病菌、
(2)リゾクトニア菌及びトマト斑葉細菌病菌、
(3)リゾクトニア菌及びアブラナ科野菜類炭疽病菌。
〔5〕〔3〕又は〔4〕に記載の形質転換植物体の繁殖材料であって、(1)又は(2)に記載の糸状菌および細菌もしくは(3)に記載の糸状菌に対して抵抗性である形質転換植物体の繁殖材料;
(1)リゾクトニア菌、トマト斑葉細菌病菌及びアブラナ科野菜類炭疽病菌、
(2)リゾクトニア菌及びトマト斑葉細菌病菌、
(3)リゾクトニア菌及びアブラナ科野菜類炭疽病菌。
〔6〕〔3〕又は〔4〕に記載の形質転換植物体から単離された細胞であって、(1)又は(2)に記載の糸状菌および細菌もしくは(3)に記載の糸状菌に対して抵抗性である細胞;
(1)リゾクトニア菌、トマト斑葉細菌病菌及びアブラナ科野菜類炭疽病菌、
(2)リゾクトニア菌及びトマト斑葉細菌病菌、
(3)リゾクトニア菌及びアブラナ科野菜類炭疽病菌。
〔7〕〔3〕又は〔4〕に記載の形質転換植物体から単離された器官であって、(1)又は(2)に記載の糸状菌および細菌もしくは(3)に記載の糸状菌に対して抵抗性である器官;
(1)リゾクトニア菌、トマト斑葉細菌病菌及びアブラナ科野菜類炭疽病菌、
(2)リゾクトニア菌及びトマト斑葉細菌病菌、
(3)リゾクトニア菌及びアブラナ科野菜類炭疽病菌。
〔8〕以下(a)及び(b)の工程を含む、(1)又は(2)に記載の糸状菌および細菌もしくは(3)に記載の糸状菌に対して抵抗性である形質転換植物体の製造方法;
(1)リゾクトニア菌、トマト斑葉細菌病菌及びアブラナ科野菜類炭疽病菌、
(2)リゾクトニア菌及びトマト斑葉細菌病菌、
(3)リゾクトニア菌及びアブラナ科野菜類炭疽病菌、
(a)以下(i)から(iv)からなる群より選択されるDNA又は該DNAを含むベクターを植物細胞に導入する工程、及び
(b)工程(a)においてDNA又はベクターが導入された植物細胞から植物体を再生する工程、
(i)配列番号:3に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNA、
(ii)配列番号:1又は2に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA、
(iii)配列番号:3に記載のアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び/又は挿入されたアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNAであって、植物に(1)又は(2)に記載の糸状菌および細菌もしくは(3)に記載の糸状菌に対する抵抗性を付与する機能を有するタンパク質をコードするDNA、及び
(iv)配列番号:1又は2に記載の塩基配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであって、植物に(1)又は(2)に記載の糸状菌および細菌もしくは(3)に記載の糸状菌に対する抵抗性を付与する機能を有するDNA。
本発明においてアブラナ科野菜類炭疽病菌とは、子嚢菌類の糸状菌、Colletotrichum higginsianumを指す。アブラナ科野菜類炭疽病菌はカブ、コマツナ、ダイコン、チンゲンサイ等アブラナ科の野菜の葉に斑点を引き起こす。多湿下では病斑がぬれるように広がり、葉腐れを起こす。激しいと苗がとろけるように腐敗する。
〔1〕以下(a)及び(b)の工程を含む、イネの種子の大きさを増加させる方法;
(a)以下(i)から(iv)からなる群より選択されるDNA又は該DNAを含むベクターをイネ細胞に導入する工程、及び
(b)工程(a)においてDNA又はベクターが導入されたイネ細胞からイネを再生する工程、
(i)配列番号:3に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNA、
(ii)配列番号:1又は2に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA、
(iii)配列番号:3に記載のアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び/又は挿入されたアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNAであって、イネの種子の大きさを増加させる機能を有するタンパク質をコードするDNA、及び
(iv)配列番号:1又は2に記載の塩基配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであって、イネの種子の大きさを増加させる機能を有するDNA。
〔2〕以下(a)から(d)からなる群より選択されるDNA又は該DNAを含むベクターを有効成分として含有する、イネの種子の大きさを増加させるための薬剤;
(a)配列番号:3に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNA、
(b)配列番号:1又は2に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA、
(c)配列番号:3に記載のアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び/又は挿入されたアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNAであって、イネの種子の大きさを増加させる機能を有するタンパク質をコードするDNA、及び
(d)配列番号:1又は2に記載の塩基配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであって、イネの種子の大きさを増加させる機能を有するDNA。
〔3〕以下(a)から(d)からなる群より選択されるDNA又は該DNAを含むベクターが導入された、種子の大きさが増加した形質転換イネ;
(a)配列番号:3に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNA、
(b)配列番号:1又は2に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA、
(c)配列番号:3に記載のアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び/又は挿入されたアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNAであって、イネの種子の大きさを増加させる機能を有するタンパク質をコードするDNA、及び
(d)配列番号:1又は2に記載の塩基配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであって、イネの種子の大きさを増加させる機能を有するDNA。
〔4〕〔3〕に記載の形質転換イネの子孫又はクローンである、種子の大きさが増加した形質転換イネ。
〔5〕〔3〕又は〔4〕に記載の形質転換イネの繁殖材料であって、種子の大きさが増加した形質転換イネの繁殖材料。
〔6〕〔3〕又は〔4〕に記載の形質転換イネから単離された細胞。
〔7〕〔3〕又は〔4〕に記載の形質転換イネから単離された器官。
〔8〕以下(a)及び(b)の工程を含む、種子の大きさが増加した形質転換イネの製造方法;
(a)以下(i)から(iv)からなる群より選択されるDNA又は該DNAを含むベクターをイネ細胞に導入する工程、及び
(b)工程(a)においてDNA又はベクターが導入されたイネ細胞からイネを再生する工程、
(i)配列番号:3に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNA、
(ii)配列番号:1又は2に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA、
(iii)配列番号:3に記載のアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び/又は挿入されたアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNAであって、イネの種子の大きさを増加させるタンパク質をコードするDNA、及び
(iv)配列番号:1又は2に記載の塩基配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであって、イネの種子の大きさを増加させる機能を有するDNA。
〔1〕以下(a)及び(b)の工程を含む、イネの稔性を減少させる方法;
(a)以下(i)から(iv)からなる群より選択されるDNA又は該DNAを含むベクターをイネ細胞に導入する工程、及び
(b)工程(a)においてDNA又はベクターが導入されたイネ細胞からイネを再生する工程、
(i)配列番号:3に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNA、
(ii)配列番号:1又は2に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA、
(iii)配列番号:3に記載のアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び/又は挿入されたアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNAであって、イネの稔性を減少させる機能を有するタンパク質をコードするDNA、及び
(iv)配列番号:1又は2に記載の塩基配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであって、イネの稔性を減少させる機能を有するDNA。
〔2〕以下(a)から(d)からなる群より選択されるDNA又は該DNAを含むベクターを有効成分として含有する、イネの稔性を減少させるための薬剤;
(a)配列番号:3に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNA、
(b)配列番号:1又は2に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA、
(c)配列番号:3に記載のアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び/又は挿入されたアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNAであって、イネの稔性を減少させる機能を有するタンパク質をコードするDNA、及び
(d)配列番号:1又は2に記載の塩基配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであって、イネの稔性を減少させる機能を有するDNA。
〔3〕以下(a)から(d)からなる群より選択されるDNA又は該DNAを含むベクターが導入された、稔性が減少した形質転換イネ;
(a)配列番号:3に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNA、
(b)配列番号:1又は2に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA、
(c)配列番号:3に記載のアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び/又は挿入されたアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNAであって、イネの稔性を減少させる機能を有するタンパク質をコードするDNA、及び
(d)配列番号:1又は2に記載の塩基配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであって、イネの稔性を減少させる機能を有するDNA。
〔4〕〔3〕に記載の形質転換イネの子孫又はクローンである、稔性が減少した形質転換イネ。
〔5〕〔3〕又は〔4〕に記載の形質転換イネの繁殖材料であって、稔性が減少した形質転換イネの繁殖材料。
〔6〕〔3〕又は〔4〕に記載の形質転換イネから単離された細胞。
〔7〕〔3〕又は〔4〕に記載の形質転換イネから単離された器官。
〔8〕以下(a)及び(b)の工程を含む、稔性が減少した形質転換イネの製造方法;
(a)以下(i)から(iv)からなる群より選択されるDNA又は該DNAを含むベクターをイネ細胞に導入する工程、及び
(b)工程(a)においてDNA又はベクターが導入されたイネ細胞からイネを再生する工程、
(i)配列番号:3に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNA、
(ii)配列番号:1又は2に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA、
(iii)配列番号:3に記載のアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び/又は挿入されたアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNAであって、イネの稔性を減少させる機能を有するタンパク質をコードするDNA、及び
(iv)配列番号:1又は2に記載の塩基配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであって、イネの稔性を減少させる機能を有するDNA。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
1.材料と方法
(1)イネFOXナズナ系統
トマト斑葉細菌病菌、アブラナ科野菜類炭疽病菌及びリゾクトニア菌に対し抵抗性を示すイネFOXシロイヌナズナ系統のスクリーニングにはイネFOXナズナ系統のT2種子を使用した。
Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000(Pst3000)を、改良型Dip法(Dubouzet et al.,2011)により、(0.5〜2)×108 CFU/mlの菌濃度で、イネFOXシロイヌナズナ系統に接種した。播種後3週間後のFOX系統を上記の菌液に浸し、6日後に生存の有無で選抜した。
アブラナ科野菜類炭疽病菌にはC. higginsianumを用いた。感染は、Pst3000による選抜にも用いた改良型dip法で行った。感染液の分生子濃度は105〜106 conidia/mlである。感染6日後の生存の有無を指標に、アブラナ科野菜類炭疽病菌に抵抗性である系統を選抜した。
リゾクトニア菌(R.solani)にはイネ紋枯病菌を用いた。9cmシャーレのPDA培地(ニッスイ)に継代3日後に、全体に広がった菌と培地全体を乳鉢に移し、50mlの滅菌水で破砕攪拌し接種液を作製した。シロイヌナズナは湿度ほぼ100%の加湿状態で土栽培したものを用いた。接種液をロゼット葉1枚につき5μlずつ、1植物体につき3葉ずつdrop接種した。接種後も加湿条件下で栽培し7日後に病斑長を測定した。評価は葉長に対する病斑長の比で比較した。
Pst3000抵抗性の定量的評価はDubouzet et al.,(2011)に記載の方法で行った。C. higginsianum抵抗性の定量的評価は、同菌を106conidia/mlの濃度でロゼット葉に10μl drop接種し、15日後の病斑長を測定することにより行った。
イネの品種は日本晴を用いた。イネでの発現ベクターはpRiceFOX (Nakamura et al. 2007)を用いた。イネの形質転換はアグロバクテリウムEH105株を用いて高速形質転換法(Toki et al. 2006)で行った。
止め葉より2番目、3番目の葉身を、それぞれ葉先側半分と葉基側半分に切断し、それぞれ接種に使用した。OsPSR1:OXイネはT0植物を使用した。シャーレ中の湿ったシートの上に切り葉を置き、上記のリゾクトニア菌接種液を1枚の葉につき20μlずつdropした。接種後25℃、14時間日長、加湿条件下に置き8日後に病斑長を測定した。
トマトの品種は矮性トマトのマイクロトムを用いた。アグロバクテリウムにはEHA105株を用いた。播種後7日目のトマト子葉片を前培養培地(1mg/Lゼアチン、3%スクロース、0.8%寒天を含むMS培地)で2日間前培養したものを外植片として用いた。アグロバクテリウムの接種は外植片を菌懸濁液に3分間浸漬した後、前培養培地上で2日間共存培養させることで行った。共存培養後の外植片は選抜培地(10mg/Lハイグロマイシン、200mg/Lカルベニシリンを含む前培養培地)に移植し、以降、カルスを経て不定芽が再分化するまで2週間おきに新しい選抜培地に移植しながら培養した。再分化した不定芽を発根培地(1%スクロース、0.8%寒天を含む1/2MS培地)上で発根させた後、鉢に入れた培養土に移植した。
播種後約5週間のトマト植物体をPst3000菌液(5×108cfu/ml)に20秒間浸し、6日後に接種葉の病徴を観察した。定量的な検定では、Pst3000菌液(2×108cfu/ml)に20秒間浸し、3日後に接種葉を磨砕し、磨砕液を希釈してプレートにまくことにより、植物体内の生菌数を計測した。
(1)トマト斑葉細菌病菌抵抗性選抜
イネFOXナズナ系統約21,000系統を対象にスクリーニングを行い、最終的にPst3000抵抗性を示す85系統を選抜した。
上記の85系統について更にC. higginsianum抵抗性検定を行い、両菌に対して複合抵抗性を示す系統があるかどうか調べた。その結果、18系統で複合抵抗性が確認された。これらの系統についてゲノムDNAを抽出し、挿入されているイネ完全長cDNAをPCRで増幅して末端の塩基配列を決定することにより遺伝子を同定した。
上記18系統の挿入遺伝子を同定後、一部のcDNAについては農業生物資源研究所のイネゲノムリソースセンターより完全長cDNAを取寄せ、イネFOXナズナ系統作製に用いられたpBIG2113SFベクター(Kondou et al., 2009)のSfiIサイトに連結した。得られたプラスミドをアグロバクテリウムGV3101に導入し、シロイヌナズナにFloral dip法で導入することにより再導入過剰発現シロイヌナズナ系統を作製した。
上記の再導入系統を用いて更にR.solani抵抗性検定を行い、抵抗性を示す系統を取得した。抵抗性を示した系統は、OsPSR1(AK072163,Os08g0547300)の再導入系統であった(図1)。さらにOsPSR1再導入系統はPst3000抵抗性、C. higginsianum抵抗性を示すことを定量的評価法で確認した(図2)。Blastによる相同性解析から、OsPSR1は新規のチトクロームP450タンパク質をコードしていることが明らかになった。既知タンパク質ではシロイヌナズナのCYP78A9(AT3G61880),CYP78A6(AT2G46660)と相同性が最も高かった。これらの遺伝子が花、鞘等の生殖器官や種子の形態形成に関与する報告はあるものの、病害抵抗性に関しては何ら報告されていない(Ito et al.,2000; Fang et al.,2012)。
OsPSR1過剰発現シロイヌナズナの草丈はWTより高く(図3a)、花は大きかった(図3b)。花は花弁、がく片、雄ずい、雌ずい共に大きかった。また鞘は長く、種子は大粒で稔性は低かった。胚軸と葉柄は長く、葉は上扁成長をしていた。
上記1.(6)の方法によりOsPSR1遺伝子(AK072163)を過剰発現するイネの再分化苗をホルモンフリー培地上で得ることができたが、高発現の苗は何故か根が出てこず、これらは土に移植することは無理であった。そこで再分化苗を水耕液(木村氏B液)に移し水耕栽培を行うと、徐々に根の発根・伸長が認められた。根が十分伸長後、土に移植し通常の形質転換イネと同様に栽培した。イネ紋枯病抵抗性検定はOsPSR1を高発現するイネのT0世代で行い、ほぼ同様の大きさ、生育ステージのイネ(日本晴)を対照として用いた。菌を接種後、WTの日本晴では病徴が拡大していくのに対し、過剰発現体ではほとんど拡大が認められなかった。したがってOsPSR1遺伝子を過剰発現するイネは、紋枯病に抵抗性であることが示された(図4)。なおOsPSR1過剰発現イネの種子は大粒で稔性が著しく低かった。
OsPSR1遺伝子(AK072163)を過剰発現するトマト(マイクロトム)を作製し、T1世代でトマト斑葉細菌病抵抗性検定を行った。接種後、WTのトマト葉では病徴が拡大していくのに対し、過剰発現体ではほとんど拡大が認められなかった。さらに、植物体内の生菌数を計測すると過剰発現体では有意に少なかった。したがって、OsPSR1過剰発現トマトはトマト斑葉細菌病に抵抗性であることが示された(図5)。なお、過剰発現トマトの形態はWTと大きな違いは認められなかった。
Claims (2)
- 以下(a)及び(b)の工程を含む、植物にリゾクトニア菌に対する抵抗性を付与する方法;
(a)以下(i)から(iv)からなる群より選択されるDNA又は該DNAを含むベクターを植物細胞に導入する工程、及び
(b)工程(a)においてDNA又はベクターが導入された植物細胞から植物体を再生する工程、
(i)配列番号:3に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNA、
(ii)配列番号:1又は2に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA、
(iii)配列番号:3に記載のアミノ酸配列において1もしくは50以内のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び/又は挿入されたアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNAであって、植物にリゾクトニア菌に対する抵抗性を付与する機能を有するタンパク質をコードするDNA、及び
(iv)配列番号:1又は2に記載の塩基配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであって、配列番号:1又は2に記載の塩基配列に対し90%以上の同一性を有する塩基配列からなり、植物にリゾクトニア菌に対する抵抗性を付与する機能を有するDNA。 - 以下(a)から(d)からなる群より選択されるDNA又は該DNAを含むベクターを有効成分として含有する、植物にリゾクトニア菌に対する抵抗性を付与するための薬剤;
(a)配列番号:3に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNA、
(b)配列番号:1又は2に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA、
(c)配列番号:3に記載のアミノ酸配列において1もしくは50以内のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び/又は挿入されたアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNAであって、植物にリゾクトニア菌に対する抵抗性を付与する機能を有するタンパク質をコードするDNA、及び
(d)配列番号:1又は2に記載の塩基配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであって、配列番号:1又は2に記載の塩基配列に対し90%以上の同一性を有する塩基配列からなり、植物にリゾクトニア菌に対する抵抗性を付与する機能を有するDNA。
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