WO2013020486A1 - 一种植物抗高温基因及其应用 - Google Patents

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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor

Definitions

  • Promote bolting of plants including: increase the number of side moss and / or the number of main moss and / or the number of branches);
  • FIG. 1 The figure shows the morphological phenotype of the ninth rosette leaf of the 20-day seedling.
  • the ruler is 5mm.
  • FIG. 1 The figure shows the morphological phenotype of the ninth rosette leaf of the 20-day seedling.
  • the ruler is 5mm.
  • Any substance which increases the activity of the ERECTA protein, enhances the stability of the ERECTA protein, promotes the expression of the ERECTA protein, prolongs the effective action time of the ERECTA protein, or promotes the transcription and translation of ERECTA can be used in the present invention as a plant resistance
  • Any substance which can reduce the activity of ERECTA protein, decrease the stability of ERECTA protein, inhibit the expression of ERECTA protein, reduce the effective action time of ERECTA protein, or reduce the transcription and translation of ERECTA can be used in the present invention as a down-regulator and antagonist of ERECTA.
  • step (ii) contacting the cells, tissues or organs of the plant with the Agrobacterium in step (i) to transfer the vector into a plant cell, tissue or organ.
  • the treatment method was a progressive treatment method: 30 ° C for 24 hours ⁇ 32 ° C for 24 hours ⁇ 36 ° C for 24 hours ⁇ 38 ° C for 24 hours ⁇ 43 ° C for 24 hours, and the final treatment temperature was 45 ° C. Watering is uniform during the treatment to maintain the consistency of the soil moisture content of each plant. After the treatment, the water was rehydrated at a normal temperature of 25 ° C for 2-3 days, and the phenotype was observed.
  • the inventors of the present invention performed the high temperature stress treatment of the £R£C3 ⁇ 4 overexpression material.
  • the treatment was carried out at 40 °C for 48 hours, it was found that the whole seedlings of er-J05 were dark green to dry and almost died (Fig. 5A).
  • Fig. 5A some leaves of wild-type Col-0 were dark green and wilted, and the petioles and new leaves showed a normal bright green state (Fig. 5A).

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Abstract

提供了一种植物抗高温基因及其应用。所述的抗高温基因可用于改良植物的抗高温性状，并同时具有促进植物发育、提高植物的产量或增加植物的生物量等功能。该基因还可用于植物育种领域，开发优良品种。

Description

一种植物抗高温基因及其应用
技术领域
本发明属于生物技术和植物学领域； 更具体地， 本发明涉及一种植物抗高温基因及 其应用。 背景技术
全球气候变化带来的频繁高温胁迫是植物面临的主要非生物胁迫之一， 严重影响了 植物的生长发育和作物产量， 是持续农业所面临的紧迫问题。
目前许多植物生长的最适温度为 15〜28 °C。过冷或过热的天气往往极大地影响植物 的生长发育， 特别是对炎热的高温忍耐力不强。 然而， 对于一些适合于人们食用或观赏 的植物， 需要保证一年四季均衡地生长或供应， 以满足人们日常生活所需。 因此， 选育 或通过生物学的其它手段筛选出的耐热性、 抗逆性优良的品种显得尤为重要。
鉴于传统的育种方法筛选的成功率低，耗时长，开发一些新的选育技术也是重要的。 目前本领域较为先进的技术是通过分析和鉴定出与植物抗逆相关的基因来对植物进行 改造或筛选。 尽管目前已经鉴别出一些抗逆 (如抗热；)相关的基因， 然而还需要通过大量 的努力进一步开发和寻找新的抗热基因， 以为植物品种的改良提供更多、 更好的途径。 发明内容
本发明的目的在于提供一种植物耐热基因及其应用。
在本发明的第一方面， 提供一种 ERECTA (简称 ER)蛋白或编码该蛋白的多核苷酸的 用途， 用于提高植物耐热 (抗热、 抗高温或耐高温)能力； 促进植物的发育； 提高植物的产 量； 增加植物的生物量； 降低植物的气孔密度； 或提高植株的 (瞬时)水分利用效率。
在另一优选例中， 所述的促进植物发育、 提高植物的产量或增加植物的生物量包括： 促进植物叶子 (包括： 子叶和真叶)的增大 (包括增加叶片的长度和 /或宽度)；
增长植物的叶柄；
促进植物的细胞 (包括： 表皮细胞和叶肉细胞)变大；
促进植物的抽苔 (包括： 增加侧苔和 /或主苔的数目和 /或分枝数)；
增加植物的花序数目。
在另一优选例中， 所述的耐热是指可耐受的温度大于 (包含等于) 28°C ; 更特别地可耐受 的温度大于 30°C； 更特别地可耐受的温度大于 35 °C； 更特别地可耐受的温度大于 40°C。
在另一优选例中，所述的 ERECTA蛋白或编码该蛋白的多核苷酸用于制备耐热 (抗热、 抗高温、 耐高温)能力提高、 发育快、 产量增加、 生物量增加或气孔密度低的植物。
在另一优选例中， 所述的植物选自 (但不限于)： 十字花科植物、 禾本科植物或茄科植 物。 在另一优选例中， 所述的植物选自 (但不限于)： 十字花科的拟南芥、 油菜、 大白菜、 小白菜、 甜菜； 禾本科的水稻、 小麦、 大麦、 玉米、 黑麦、 高粱、 大豆； 茄科的番茄 (西 红柿)、 辣椒、 马铃薯、 烟草、 枸杞、 颠茄。
在另一优选例中， 所述的 ERECTA蛋白来源于十字花科植物 (如拟南芥， 油菜)， 茄科 植物 (如番茄）， 禾本科植物 （如水稻、 玉米、 小麦、 大麦） 。
在另一优选例中， 所述的 ERECTA蛋白来源于拟南芥。
在另一优选例中， 所述 ERECTA蛋白是：
(a) 如 SEQ ID NO: 3所示氨基酸序列的蛋白； 或
(b) 将 SEQ ID NO: 3所示氨基酸序列经过一个或多个 (如 1-20个； 较佳地 1-10个； 更佳地 1-5个)氨基酸残基的取代、 缺失或添加而形成的， 且具有提高植物抗热能力功能 的由 (a)衍生的蛋白； 或
(c) 氨基酸序列与 (a)限定的氨基酸序列有 70%以上 （较佳地 80%以上； 更佳地 90%以上； 更佳地 95%以上； 更佳地 99%以上） 相同性且具有提高植物抗热能力功 能的多肽； 或
(d) 具有 (a) 蛋白功能的 SEQ ID NO: 3的蛋白片段 （较佳地， 其与 SEQ ID NO: 3的 序列相同性高于 70%; 更佳地高于 75%; 更佳地高于 80%; 更佳地高于 85%; 更佳地高 于 90%; 更佳地高于 95%; 更佳地高于 98%或 99%)。
在另一优选例中， 所述编码 ERECTA蛋白的多核苷酸是：
(i) 具有 SEQ ID NO: 1所示序列的多核苷酸；
(ii) 核苷酸序列在严格条件下能够与 (i)限定的多核苷酸序列杂交且编码的蛋白具有 提高植物抗热能力功能的多核苷酸；
(iii) 核苷酸序列与 (i)限定的多核苷酸序列有 70%以上 （较佳地 80%以上；更佳地 90% 以上； 更佳地 95%以上； 更佳地 99%以上） 相同性且编码的蛋白具有提高植物抗热能力 功能的多核苷酸； 或
(iv) 具有与 SEQ ID NO: 1所示序列互补的序列的多核苷酸。
在另一优选例中， 所述编码 ERECTA蛋白的多核苷酸是：
(!') 具有 SEQ ID NO: 2所示序列的多核苷酸；
(ϋ') 核苷酸序列在严格条件下能够与 (Γ)限定的多核苷酸序列杂交且编码的蛋白具 有提高植物抗热能力功能的多核苷酸；
(iii') 核苷酸序列与 (i')限定的多核苷酸序列有 70%以上相同性且编码的蛋白具有提 高植物抗热能力功能的多核苷酸； 或
(iv') 具有与 SEQ ID NO: 2所示序列互补的序列的多核苷酸。
在本发明的另一方面， 提供一种提高植物耐热能力、 促进植物发育、 提高植物的产量、 增加植物的生物量、 降低植物的气孔密度或提高植株的 (瞬时)水分利用效率的方法， 所述 方法包括： 提高植物中 ERECTA蛋白的表达或活性。
在另一优选例中， 所述的方法包括： 将编码 ERECTA蛋白的多核苷酸转入植物中。 在另一优选例中， 所述的方法包括步骤：
(i) 提供携带表达载体的农杆菌， 所述的表达载体含编码 ERECTA蛋白的多核苷酸；
(ii) 将植物细胞、 组织或器官与步骤 (i)中的农杆菌接触， 从而使所述编码 ERECTA 蛋白的多核苷酸转入植物。
在另一优选例中， 所述方法还包括：
(iii) 选择出转入了编码 ERECTA蛋白的多核苷酸的植物细胞、 组织或器官； 以及 (iv) 将步骤 (iii)中的植物细胞、 组织或器官再生并选出转基因植物。
在本发明的另一方面， 提供一种具有耐热能力、 发育快、 产量增加、 生物量增加、 气 孔密度低或 (瞬时)水份利用率高的植物， 其是由前述方法制备获得的转基因植物。
在本发明的另一方面， 提供一种 ERECTA蛋白或编码其的多核苷酸的用途， 用作鉴 定植物的耐热能力、 发育情况、 产量情况、 生物量情况、 气孔密度情况或 (瞬时)水分利 用效率的分子标记物。
在本发明的另一方面， 提供一种鉴定植物耐热能力、 发育情况、 产量情况、 生物量 情况、 气孔密度情况或（瞬时）水分利用效率的方法， 包括： 检测待测植物中 ERECTA蛋 白的表达； 若待测植物中该多肽的表达量高于 (较佳地为在统计学上高于， 如高 20%以上； 更佳地高 50%以上； 更佳地高 80%以上)该类植物中 ERECTA蛋白表达的常规值 (平均值)； 则该种植物是具有耐热能力、 发育良好、 产量高、 生物量高或气孔密度低的植物； 若待测 植物中该多肽的表达量低于 (较佳地为在统计学上低于， 如低 20%以上； 更佳地低 50%以 上； 更佳地低 80%以上)该类植物中 ERECTA蛋白表达的常规值 (平均值)； 则该种植物是 不具有耐热能力、 产量低、 生物量低或气孔密度高的植物。
本发明的其它方面由于本文的公开内容， 对本领域的技术人员而言是显而易见的。 附图说明
图 1、 EREC7 超表达促进了莲座期拟南芥植株的发育。
(A) Realtime PCR显示 ERECTA 基因在野生型 (Col-0)以及两个超表达转基因株系 L2-3和 L7-1中的表达量。 生物学重复 3次， 所示结果为平均值士 SD。
(B) 1/2MS培养基生长 10天幼苗表型。 标尺为 lmm。
(C) 土培 20天莲座期苗表型。左侧一排为整体观察， 右侧一排为依次将左侧苗莲座 叶 (未包括子叶；)按照生长次序在叶柄基部剪下， 由左至右排列。 标尺为 l cm。
图 2、 EREC7 超表达通过促进细胞伸长影响叶片发育。
(A) 图中显示为土培 20天苗第九片莲座叶形态学表型。 标尺为 5mm。 (B) 叶片横切面半薄切片示意图。
(C) -(D) 叶片长度 (C)、 叶片宽度 (D)测量统计值。 所示结果为平均值士 SD， **表示 P<0.01， n=20。
图 3、 EREC7 超表达促进植株侧苔发育。
(A) 超表达株系土培 30天成苗形态学照片。 标尺 =2cm。
(B) 单株植株平均花序数目测量统计值。 所示结果为平均值士 SD， **表示 P<0.01， n=20 ; 纵坐标的数值的单位是 "个" 。
图 4、 ERECTA超表达导致叶片气孔密度降低。
(A)Col-0、 er-105, 35 S : .ERECTA L2-3 35 S : .ERECTA L7- 1成熟莲座叶片远轴面气 孔分布的扫描电镜照片。
(BHC)气孔密度 (B)、 气孔系数 (C)测量统计值。 所示结果为平均值士 SD， n=25。 B 中， 纵坐标数值的单位是个 /mm2 ; C中纵坐标数值为比值， 由叶片一个区域内气孔数目 /(气孔数目与表皮细胞数目之和)所得。 是叶片气孔发育的一个衡量指标。
图 5、 ERECTA超表达植株具有 40 °C高温胁迫抗性。
(A) 土培 2周 Col-0、 er-105, ERECTA超表达株系 L2-3和 L7- 1在 40°C处理 48h的 表型。 从左至右依次为野生型 Col-0、 er-105、 35 S : :ERECTA L2-3 L7- l。 标尺为 l cm。
(B) 高温胁迫成活率统计。 高温处理后复水 2-3天， 萎蔫至枯黄视为死亡植株， 植 株保持新绿视为可以存活植株。 结果重复 3次。所示结果为平均值士 SD， *表示 P<0.05， 表示 P<0.01， n=20。
图 6、 高温胁迫下野生型、 突变体及超表达植株电导率的测定。
为 Col-0、 er-105, 35 S : :ERECTA L2-3 ： L7- 1在高温胁迫 0h、 12h、 24h、 36h禾口 48h 的电导率测定。 所示结果为测定电导率与总电导率的比值 （离子渗漏； ion leakage)。 n=10， 生物学重复 3次。
图 7、 ERECTA超表达株系具有 30 °C高温胁迫抗性。
(A) 土培苗 21 °C生长 3天后， 移至 30°C高温处理， 30天后观察表型。
(B) 处理后的植株复水 2-3天， 统计成活率。 n=20， 处理重复 3次。 所示结果为平 均值士 SD， *表示 P<0.05。
图 8、 质粒 35S-C1301的图谱。
图 9、 基于 ERECTA (简写 ER)和 ERECTA-like (简写 ERL)基因激酶结构域的序列 同源性的系统发生图。
分析采用 PAUP软件的近邻结合法和最大简约法分别检测了同源性和进化相关性 (数 值黑色 (位于横线上侧)代表同源性，数值红色 (位于横线下侧)代表进化相关性)。 ERECTA 的同源基因基于 ERECTA(At2g26330， B组）和 ERECT A-Like(At5g62230和 At5g07180， A组)。 其中， At (拟南芥)， Bo (甘蓝)， Eg (棕榈)， Gm (大豆)， Hv (大麦)， Le (番茄)， Os (水 稻）， Sb (高粱)， So (甘蔗)， Ta (小麦）， Zm (玉米)。
图 10、 EREC7 超表达提高了拟南芥的蒸腾效率。
Col-0、 35 S: HC7¾ L7- 1在短日照生长条件 （光照 8小时） 下的蒸腾效率测定。 所 示结果为最大光合速率与蒸腾速率的比值。
为 Col-0、 er-105、 35S: :ERECTA L2-3 ： L7- 1在高温胁迫 0h、 12h、 24h、 36h禾口 48h 的电导率测定。 所示结果为测定电导率与总电导率的比值 （离子渗漏； ion leakage)。 n=10， 生物学重复 3次。
图 11、 番茄的 EREC7 过表达株系与野生型相比， 叶片变大， 耐热性提高。
(A) 25 °C土培 4周 ERECTA过表达转基因番茄 (35S: HC ¾)与空载对照 TO代植株 的叶片形态学表型。
(B) 番茄转基因植株 (包括 ERECTA过表达 (35S: HC ¾)与空载对照)顶端扦插苗 25 °C生长 2周后， 45 °C处理 72小时的表型。
(C) 番茄转基因植株 (包括 ERECTA过表达 (35S: HC ¾)与空载对照)顶端扦插苗 25 °C生长 2周， 45 °C处理三天后复水 2天的表型。
图 12、 油菜的 EREC7 过表达株系与野生型相比， 耐热性提高。
TO代转基因油菜 (35S: HC ¾和空载 )25 °C土培 4周后， 高温处理的表型 (左图）。高 温处理后室温 （25 °C ) 复水 2天的表型 (右图）。 具体实施方式
本发明人经过深入的研究，发现了一种新的植物耐热基因- £R£C ¾，及其编码蛋白。 本发明还公开了编码这种耐热基因的用途， 尤其是用于改良植物的抗极端高温的性状， 并同时提高植物的生长量。 可以将™ ¾基因应用于植物的培育中， 选育出具有特定 品质性状的品种。 本发明中， 对于适用于本发明的植物 (或作物)没有特别的限制， 只要其适合进行基因的 转化操作， 如各种农作物、 花卉植物、 或林业植物等。 所述的植物比如可以是 （不限于)： 双 子叶植物、 单子叶植物、 或裸子植物。 更具体地， 所述的植物包括 (但不限于)： 小麦、 大麦、 黑麦、 水稻、 玉米、 高梁、 甜菜、 苹果、 梨、 李、 桃、 杏、 樱桃、 草莓、 木莓、 黑莓、 豆、 扁豆、 豌豆、 大豆、 油菜、 芥、 罂粟、 齐墩果、 向日葵、 椰子、 蓖麻油植物、 可可豆、 花生、 葫芦、 黄瓜、 西瓜、 棉花、 亚麻、 大麻、 黄麻、 柑桔、 柠檬、 葡萄柚、 菠菜、 苘苣、 芦笋、 洋白菜、 大白菜、 小白菜、 胡萝卜、 洋葱、 土豆、 西红柿、 青椒、 鳄梨、 桂皮、 樟脑、 烟叶、 坚果、 咖啡、 茄子、 甘蔗、 茶叶、 胡椒、 葡萄树、 蚝麻草、 香蕉、 天然橡胶树和观赏植物等。
作为一种优选方式， 所述的 "植物"包括但不限于： 十字花科、 禾本科、 蔷薇科的植物。 比如， 所述的 "植物 "包括但不限于： 十字花科的拟南芥、 油菜、 大白菜、 小白菜、 油菜、 甜菜等， 禾本科的水稻、 小麦、 大麦、 玉米、 黑麦、 高粱、 大豆等； 茄科的番茄 (西红柿）、 辣椒、 马铃薯、 番茄、 烟草、 枸杞、 颠茄等。
如本文所用， 所述的 "该类植物中 ERECTA蛋白表达的常规值 (平均值)" 当是一种 用于判定 ERECTA蛋白表达的 "阈值" ， ERECTA蛋白作为一种已知蛋白， 本领域人 员可以方便地了解这种常规值。 比较蛋白表达差异的方法也是人们熟知的， 例如通过简 单的免疫印迹试验得知。
如本文所用， 所述的术语 "耐热" 、 "抗热" 、 "抗高温" 或 "耐高温"可互换使 用。
本发明中， 选择合适的 "对照植物" 是实验设计的例行部分， 可以包括对应的野生 型植物或无目的基因的相应植物。 对照植物一般是相同的植物物种或甚至是与待评估植 物相同的品种。 对照植物也可以是因分离而丢失转基因植物的个体。 如本文所用的对照 植物不仅指完整植物， 也指植物部分， 包括种子和种子部分。
如本文所用， 所述的术语 "提高" 、 "改良" 或 "增加" 是相互可以交换的并且在 应用含义上应当意指与本文中定义的对照植物相比较， 至少 2%、 3%、 4%、 5%、 6%、 7%、 8%、 9%或 10%、 优选的至少 15%或 20%、 更优选 25%、 30%、 35%或 40%更多的 产量和 /或生长等其他有益的农艺性状。 本发明的 ERECTA蛋白是本领域已知的一种蛋白，其高度保守地存在于一些植物中。 其在植物中的保守性情况见图 9。
本发明的 ERECTA蛋白 (多肽)可以是重组多肽、 天然多肽、 合成多肽。 本发明的多 肽可以是天然纯化的产物， 或是化学合成的产物， 或使用重组技术从原核或真核宿主 (例 如， 细菌、 酵母、 高等植物、 昆虫和哺乳动物细胞)中产生。 根据重组生产方案所用的宿 主， 本发明的多肽可以是糖基化的， 或可以是非糖基化的。 本发明的多肽还可包括或不 包括起始的甲硫氨酸残基。
本发明还包括 ERECTA蛋白的片段、 衍生物和类似物。 如本文所用， 术语 "片段"、 "衍生物"和 "类似物"是指基本上保持本发明的 ERECTA蛋白相同的生物学功能或活 性的多肽。 本发明的多肽片段、 衍生物或类似物可以是 (i)有一个或多个保守或非保守性 氨基酸残基 (优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽， 而这样的取代的氨基酸残基可以是 也可以不是由遗传密码编码的， 或 (ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽， 或 (iii)成熟多肽与另一个化合物（比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形 成的多肽， 或 (iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽 (如前导序列或分泌 序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列， 或融合蛋白；)。 根据本文的定义这些片段、 衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
任何一种 ERECTA蛋白的生物活性片段都可以应用到本发明中。 在这里， ERECTA 蛋白的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持全长的 ERECTA蛋白的全 部或部分功能。 通常情况下， 所述的生物活性片段至少保持 50%的全长 ERECTA蛋白 的活性。 在更优选的条件下， 所述活性片段能够保持全长 ERECTA蛋白的 60%、 70%、 80%、 90%、 95%、 99%、 或 100%的活性。
在本发明中， 术语 "ERECTA蛋白"指具有 ERECTA蛋白活性的 SEQ ID NO: 3序 列的多肽。 该术语还包括具有与 ERECTA蛋白相同功能的、 SEQ ID NO: 3序列的变异 形式。 这些变异形式包括 (但并不限于；)： 若干个 (通常为 1-50个， 较佳地 1-30个， 更佳 地 1-20个， 最佳地 1-10个， 还更佳如 1-8个、 1-5个)氨基酸的缺失、 插入和 /或取代， 以及在 C末端和 /或 N末端 (特别是 N末端)添加或缺失一个或数个 (通常为 1-50个，较佳 地 1-30个， 更佳地 1-20个， 最佳地 1-10个， 还更佳如 1-8个、 1-5个)氨基酸。 例如， 在本领域中， 用性能相近或相似的氨基酸进行取代时， 通常不会改变蛋白质的功能。 又 比如， 在 C末端和 /或 N末端 (特别是 N末端)添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋 白质的功能。 该术语还包括 ERECTA蛋白的活性片段和活性衍生物。
多肽的变异形式包括： 同源序列、 保守性变异体、 等位变异体、 天然突变体、 诱导 突变体、在高或低的严紧度条件下能与 ERECTA蛋白 DNA杂交的 DNA所编码的蛋白、 以及利用抗 ERECTA蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽， 如包 含 ERECTA蛋白或其片段的融合蛋白。
任何与所述的 ERECTA蛋白同源性高（比如与 SEQ ID NO: 3所示的序列的同源性为 50%或更高； 优选的， 同源性为 60%或更高； 优选的， 同源性为 70%或更高； 优选的， 同源性为 80%或更高； 更优选的， 同源性为 90%或更高， 如同源性 95%， 98%或 99%) 的、 且具有 ERECTA蛋白相同功能的蛋白也包括在本发明内。这些蛋白包括， 但不限于 来源于玉米 ZmERECTA A， ZmERECTA B,来源于水稻的 OsERECTA A， OsERECTA B, 来源于两色蜀黍的 SbERECTA A， SbERECTA B， SbERECTA C， 来源于大豆的 GmERECTA A， GmERECTA B， GmERECTA C， GmERECTA D (序列参见专利 CN 101589147或 WO 2008039709 A2或 US 2011/0035844 Al)。
发明还提供 ERECTA蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然 ERECTA蛋白的差别 可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。 这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。 诱导变异体可以通过各种技术得到， 如通过辐 射或暴露于诱变剂而产生随机诱变， 还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技 术。 类似物还包括具有不同于天然 L-氨基酸的残基 (如 D-氨基酸)的类似物， 以及具有非 天然存在的或合成的氨基酸 (如 β、 Υ -氨基酸)的类似物。 应理解， 本发明的多肽并不限 于上述例举的代表性的多肽。
修饰 (通常不改变一级结构；)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或 羧基化。 修饰还包括糖基化。 修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基 (如磷酸酪氨酸， 磷 酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶 解性能的多肽。
在本发明中， "ERECTA蛋白保守性变异多肽"指与 SEQ ID NO: 3的氨基酸序列相 比， 有至多 20个， 较佳地至多 10个， 更佳地至多 5个， 最佳地至多 3个氨基酸被性质 相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。 这些保守性变异多肽最好根据表 1进行氨基酸 替换而产生。
表 1
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本发明还涉及编码本发明 ERECTA蛋白或其保守性变异多肽的多核苷酸序列。 所述 的多核苷酸可以是 DNA形式或 RNA形式。 DNA形式包括 cDNA、 基因组 DNA或人工 合成的 DNA。 DNA可以是单链的或是双链的。 DNA可以是编码链或非编码链。 编码成 熟多肽的编码区序列可以与 SEQ ID NO: 1或 SEQ ID NO: 2所示的编码区序列相同或者 是简并的变异体。如本文所用， "简并的变异体"在本发明中是指编码具有 SEQ ID NO: 3的蛋白质， 但与 SEQ ID NO: l或 SEQ ID NO: 2所示的编码区序列有差别的核酸序列。 优选的， 选择 ERECTA基因组序列 (SEQ ID ΝΟ: 1， 同时包含外显子和内含子)或该序列 的变异体 (含简并的变异体)用于提高植物耐热 (抗热、 抗高温或耐高温)能力； 促进植物的 发育； 提高植物的产量； 增加植物的生物量； 降低植物的气孔密度； 或提高植株的 (瞬时) 水分利用效率。
编码 SEQ ID NO: 3的成熟多肽的多核苷酸包括： 只编码成熟多肽的编码序列； 成熟 多肽的编码序列和各种附加编码序列； 成熟多肽的编码序列 （和任选的附加编码序列） 以及非编码序列。
术语 "编码多肽的多核苷酸"可以是包括编码所述多肽的多核苷酸， 也可以是还包 括附加编码和 /或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体， 其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽 或多肽的片段、 类似物和衍生物。 此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或 非天然发生的变异体。 这些核苷酸变异体包括取代变异体、 缺失变异体和插入变异体。 如本领域所知的， 等位变异体是一个多核苷酸的替换形式， 它可能是一个或多个核苷酸 的取代、 缺失或插入， 但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少 50%， 较佳地至少 70%， 更佳地至少 80%相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷 酸可杂交的多核苷酸。 在本发明中， "严格条件" 是指: (1)在较低离子强度和较高温度 下的杂交和洗脱， 如 0.2 X SSC, 0.1%SDS， 60 °C ; 或 (2)杂交时加有变性剂， 如 50%(ν/ν) 甲酰胺， 0.1%小牛血清 /0.1%Ficoll， 42 °C等；或 (3)仅在两条序列之间的相同性至少在 90% 以上，更好是 95%以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与 SEQ ID NO: 3所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。 如本文所用， "核酸片段" 的长度至 少含 15个核苷酸， 较好是至少 30个核苷酸， 更好是至少 50个核苷酸， 最好是至少 100 个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术 (如 PCR)以确定和 /或分离编码 ERECTA 蛋白的多聚核苷酸。
应理解， 虽然本发明的™ ¾基因优选获自禾本科植物， 但是获自其它植物的与 水稻 £R£C ¾基因高度同源 (如具有 80%以上， 如 85%、 90%、 95%、 甚至 98%序列相同 性)的其它基因也在本发明考虑的范围之内。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周 知的， 例如 BLAST。
本发明的 ERECTA蛋白核苷酸全长序列或其片段通常可以用 PCR扩增法、重组法或 人工合成的方法获得。 对于 PCR扩增法， 可根据本发明所公开的有关核苷酸序列， 尤其 是开放阅读框序列来设计引物， 并用市售的 cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方 法所制备的 cDNA库作为模板， 扩增而得有关序列。 当序列较长时， 常常需要进行两次 或多次 PCR扩增， 然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
本发明也涉及包含所述的多核苷酸的载体， 以及用所述的载体或 ERECTA蛋白编码 序列经基因工程产生的宿主细胞。
本发明中， ERECTA 蛋白多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。 术语 "重组表达 载体"指本领域熟知的细菌质粒、 噬菌体、 酵母质粒、 植物细胞病毒、 哺乳动物细胞病 毒或其他载体。 总之， 只要能在宿主体内复制和稳定， 任何质粒和载体都可以用。 表达 载体的一个重要特征是通常含有复制起点、 启动子、 标记基因和翻译控制元件。
包含上述的适当 DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当 的宿主细胞， 以使其能够表达蛋白质。 宿主细胞可以是原核细胞， 如细菌细胞； 或是低 等真核细胞， 如酵母细胞； 或是高等真核细胞， 如植物细胞。 代表性例子有： 大肠杆菌， 链霉菌属、 农杆菌； 真菌细胞如酵母； 植物细胞等。
所述的多核苷酸在高等真核细胞中表达时， 如果在载体中插入增强子序列时将会使 转录得到增强。 增强子是 DNA的顺式作用因子， 通常大约有 10到 300个碱基对， 作用 于启动子以增强基因的转录。
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、 启动子、 增强子和宿主细胞。 用重组 DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。转化植物可使 用农杆菌转化或基因枪转化等方法， 例如喷洒法、 叶盘法、 水稻幼胚转化法等。 本发明提供了所述的 ERECTA蛋白或其编码基因的用途， 用于提高植物的耐高温能 力； 并且， 所述的 ERECTA 蛋白还可用于： 促进植物的发育； 提高植物的产量； 增加植 物的生物量； 或降低植物叶片的气孔密度。 所述的促进植物发育或增加植物的产量或生物量 包括： 促进植物叶子 (包括： 子叶和真叶)的增大 (包括增加叶片的长度和 /或宽度)； 增长植物 的叶柄； 促进植物的细胞 (包括： 表皮细胞和叶肉细胞)变大； 促进植物的抽苔 (包括： 增加侧 苔和 /或主苔的数目和 /或分枝数)； 增加植物的花序数目。 或用于筛选对于调节植物的耐高 温能力、发育、产量或生物量、或气孔密度有用的物质 （即：所述物质通过调节 ERECTA 蛋白的表达来调节植物的耐高温能力、 发育、 产量、 生物量或气孔密度)。
本发明还涉及 ERECTA的激动剂或拮抗剂及其用途。由于 ERECTA的激动剂或拮抗 剂可调节 ERECTA的表达和 /或调节 ERECTA的活性等， 因此， 所述的 ERECTA的激动 剂或拮抗剂也可通过对 ERECTA的影响来调节植物的耐高温能力、 发育、 产量、 生物量 或气孔密度， 从而达到改良植物的目的。
任何可提高 ERECTA蛋白的活性、 提高 ERECTA蛋白的稳定性、 促进 ERECTA蛋 白的表达、 延长 ERECTA蛋白有效作用时间、 或促进 ERECTA的转录和翻译的物质均 可用于本发明， 作为可用于提高植物的耐高温能力、 促进植物发育、 提高植物产量或生 物量或降低植物叶片气孔密度的物质。任何可降低 ERECTA蛋白的活性、降低 ERECTA 蛋白的稳定性、 抑制 ERECTA蛋白的表达、 减少 ERECTA蛋白有效作用时间、 或降低 ERECTA的转录和翻译的物质均可用于本发明， 作为 ERECTA的下调剂、 拮抗剂或抑 制剂 (即： 下调 ERECTA蛋白表达的物质)， 如抗所述 ERECTA蛋白的抗体， 干扰所述 ERECTA蛋白的编码基因表达的干扰分子 （如可形成 microRNA的干扰分子）。所述的下 调剂、 拮抗剂或抑制剂可用于降低植物的耐高温能力、 抑制植物发育、 减少植物的产量 或生物量或增加植物叶片气孔密度。 在得知了靶序列后， 制备干扰特定基因表达的干扰 分子的方法是本领域人员熟知的。
本发明还涉及一种改良植物的方法， 该方法包括调节所述植物中 ERECTA蛋白的表 达。
一方面， 本发明提供了一种提高植物的耐高温能力、 促进植物发育、 增加植物产量 或生物量、降低植物叶片气孔密度或提高植株的水分利用效率的方法，所述的方法包括： 提高植物中 ERECTA蛋白的表达或活性； 或使所述植物过量表达 ERECTA蛋白。
另一方面， 本发明还提供了一种降低植物的耐高温能力、 抑制植物发育、 减少植物 的产量或生物量或增加植物叶片气孔密度的方法， 所述的方法包括： 降低所述植物中 ERECTA蛋白的表达， 包括使 ERECTA蛋白不表达或低表达。
在得知了所述的 ERECTA蛋白的用途后， 可以采用本领域人员熟知的多种方法来调 节所述的 ERECTA蛋白的表达。 比如可通过本领域人员已知的途径将携带 ERECTA基 因的表达单位 (比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，并使之表达活性的 ERECTA蛋白。 此外，也可以采用本领域人员熟知的多种方法来降低 ERECTA蛋白的表达或使之缺失表 达， 比如将携带反义£^£ ¾基因的表达单位 (比如表达载体或病毒等)递送到靶点上， 使得细胞或植物组织不表达或降低表达 ERECTA蛋白。
作为本发明的一种实施方式， 将编码 ERECTA蛋白的基因通过常规的方法克隆到适 当的载体中，将所述的带有外源基因的重组载体导入到可表达所述 ERECTA蛋白的植物 细胞中， 使所述的植物细胞表达 ERECTA蛋白。可通过将所述植物细胞再生成植物， 获 得过量表达 ERECTA蛋白的植物。
优选的， 提供了一种制备转基因植物的方法， 包括：
(1) 将外源的 ERECTA蛋白的编码多核苷酸转入植物细胞、 组织、 器官或组织， 获 得转化入 ERECTA蛋白的编码多核苷酸的植物细胞、 组织、 器官或种子； 和
(2) 将步骤 (1)获得的转入了外源 ERECTA蛋白的编码多核苷酸的植物细胞、 组织、 器官或种子再生成植物植株。
作为一种优选的实例， 所述的方法包括步骤：
(si) 提供携带表达载体的农杆菌， 所述的表达载体含有 ERECTA蛋白的编码多核苷 酸；
(s2) 将植物细胞、 组织、 器官与步骤 (si)中的农杆菌接触， 从而使 ERECTA蛋白的 编码多核苷酸转入植物细胞， 并且整合到植物细胞的染色体上；
(S3) 选择出转入 ERECTA蛋白的编码多核苷酸的植物细胞、 组织、 器官或种子； 以 及
(s4) 将步骤 (S3)中的植物细胞、 组织、 器官或种子再生成植物。
其它增加 £^£ ¾基因或其同源基因表达的方法是本领域周知的。 例如， 可通过用 强启动子驱动从而增强 ERECTA 基因或其同源基因的表达。 或者通过增强子 (如水稻 waxy基因第一内含子、 Actin基因第一内含子等)来增强该 ¾基因的表达。适用于 本发明方法的强启动子包括但不限于： 35s启动子， 水稻、 玉米的 Ubi启动子等。
作为一种选择方式， 还提供了一种降低植物中 ERECTA蛋白的表达的方法， 所述 的方法包括：
(1) 将干扰 £R£C ¾基因表达的干扰分子转入植物细胞、 组织、 器官或种子， 获得 转化入所述干扰分子的植物细胞、 组织、 器官或种子； 和
(2) 将步骤 (1)获得的转入了所述干扰分子的植物细胞、 组织、 器官或种子再生成植 物。
作为一种优选的实例， 所述的方法包括步骤：
(i) 提供携带可干扰基因表达的载体的农杆菌， 所述的载体选自下组：
(a) 含有反方向启动的 ERECTA蛋白的编码基因或基因片段 (反义分子)的载体；
(b) 含有可在植物体内形成特异性干扰 ERECTA蛋白的编码基因表达 (或转录)的成 分的干扰分子的载体；
(ii) 将植物的细胞、组织或器官与步骤 (i)中的农杆菌接触， 从而使所述载体转入植物 细胞、 组织或器官。
较佳地， 所述方法还包括：
(iii) 选择出转入了所述载体的植物细胞、 组织或器官； 和
(iv) 将步骤 (iii)中的植物细胞、 组织或器官再生成植物。
其它抑制 ¾基因或其同源基因表达的方法是本领域周知的。
本发明还包括利用前述任一种方法获得的植物， 所述的植物包括： 转入了 ERECTA 基因或其同源基因的转基因植物； 或者 ERECTA蛋白表达量 （包括低表达或不表达） 降 低的植物等。
可采用任何适当的常规手段， 包括试剂、 温度、 压力条件等来实施所述的方法。 此外， 本发明还涉及利用 ERECTA蛋白或其编码基因作为一种基因转化植株后代的 追踪标记。本发明还涉及利用 ERECTA蛋白或其编码基因作为一种分子标记， 通过检测 植物中 ERECTA蛋白的表达情况， 鉴定植物的耐高温性能、 产量高低、 气孔密度等。 以 及利用 ERECTA蛋白或其编码基因进行改良品种的筛选。
在本发明的具体实施方式中，本发明人利用拟南芥生态型 Col-0与 Ler进行 QTL分 析， 鉴定出一个参与高温胁迫的基因 £^£ ¾(Αί2§26330)。 为探讨 £R£C ¾在植物抗高 温胁迫方面的应用前景，本发明人构建了拟南芥中 35S启动的 £R£C ¾基因超表达株系。 数据表明 ERECTA基因超表达不但赋予了植株对极度热胁迫 (40°C )的抗性， 而且还使植 株对中度热胁迫 (30 °C )的抗性增强。 同时， 这些转基因植株的细胞增大， 导致各器官的 增大、 生物量的增大； 而相应的， 气孔数目显著减少。
本发明首次功能鉴定了耐高温的 QTL基因 ERECTA , 并对其在抗高温分子育种中的 应用潜力进行了分析评估。 本发明人的数据显示， J^cr^超表达株系在获得胁迫抗性 的同时， 生长发育并没有受到阻碍； 相反， 超表达株系的叶片增大、 花序增多， 生物学 产量显著提高。 这说明 ^CTM表达量的增加在一定程度上促进了植株的发育。 因此， 可以将 £R£C ¾作为靶基因来改造作物， 有望平衡作物产量和提高抗性二者间的关系。 下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。 应理解， 这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。 下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规 条件如 J.萨姆布鲁克等编著， 分子克隆实验指南， 科学出版社， 2002中所述的条件， 或 按照制造厂商所建议的条件。 除非另外说明， 否则百分比和份数按重量计算。
除非另行定义， 文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义 相同。 此外， 任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。 文中所 述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
1. 材料与方法
1. 材料
(1) 拟南芥 (Arabidopsis thaliand) 生态型： Columbia (Col-0)。
(2) 菌禾中： 农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens) , GV3101 (Invitrogen)。
(3) 转基因材料： col-0 P35S::ERECTA。
2. 方法
2.1 拟南芥种植
拟南芥无菌培养时， 种子经表面 (70%乙醇， 30秒； 无菌水冲洗 4次)和深层 (7%次 氯酸钠， 10分钟； 无菌水 3 次;)消毒后， 播于 1/2 MS (1/2χ Murashige禾 P Skoog basal medium, 0.8%琼脂粉， pH 5.8)固体培养基上， 4°C放置 72 h， 然后转入 22°C培养。 一周 后， 将幼苗移栽于浸透营养液 (3 g/10 L 花无缺， 上海永通化工有限公司;)的人工土壤 (蛭 石、 黑土和珍珠岩为 3 : 1 :0.5)中， 然后转入人工气候室中培养。 其中用于遗传分析的植 株在光周期为 14小时光照 10小时黑暗 （14/10(L/D))的人工气候室中培养。
2.2 胁迫处理
通过极度高温和中等高温胁迫处理观察鉴定转基因植株及其对照的高温耐受性。 拟南芥的正常生长温度是 21-23 °C。 温度升至 30°C属于中等高温胁迫 (一般野生型 Col-0在 30 °C可存活 30天左右）；温度升至 40°C属于极端高温 (一般野生型 Col-0可在 40 °C存活 48小时左右；)； 用两种程度的高温胁迫处理， 使得结果更客观。 2.2.1 极度高温 (40°C)
取在土壤中生长 2-3 星期的拟南芥材料于光照培养箱 (MMM Climacell-111)中进行 处理。 每个处理样本 30个植株， 同一处理重复 3次。 处理条件为 40°C， 湿度 80%。 处 理方法采用渐进处理法， 即温度由 21 °C—— 30°C 12小时—— 36 °C 12小时—— 40°C。 土壤层大于等于 10公分， 保证处理期间水份充足。 Ler背景的材料在处理 24小时 (S卩： 40°C处理 24小时后观察)或者常温复水 2-3天后观察统计成活率； col-0背景材料处理 48 小时或者常温复水 2-3天后观察统计成活率。
2.2.2 中等高温 (30 °C)
取在土壤中生长 3天的拟南芥幼苗， 放至 30°C培养箱处理， 30天后观察表型。 处 理后的植株复水 2-3天， 统计成活率。 n=20， 处理重复 3次。
2.3 拟南芥转化
拟南芥转化采用喷洒法。取生长状况良好的 4-5周龄植株 (转化前一周剪去主苔， 利 于侧苔抽出产生更多的花苞，提高转化效率)。将含有转基因载体 ¾)的农杆 菌于 28°C培养至 OD6QQ值 1.2至 1.4之间， 5,000 rpm 离心 10 min， 菌体沉淀悬浮于新 鲜配制的转化液 C 1/2 MS 液体培养基含 5%CWA 蔗糖， 0.03% CVA Silwet L-77中， 至终 浓度 OD6Q(^0.6-0.8。 转化前， 将已授粉花以及果荚去除， 并使土壤吸足水。 转化时将菌 液均匀喷洒拟南芥， 至叶片上有液滴落下， 将植物用黑色的塑料袋覆盖保持湿度， 避光 过夜。 24小时候后将植物转移到正常条件下生长。待种子成熟后将植株混合采收于纸袋 中， 在干燥器中放置 7天后脱粒。 T1代种子消毒后播种在含有 30μ§/ιη1 Hygromycin B 的 1/2 χ MS培养基上进行筛选。 对 Hygromycin B无抗性的苗表现为无法正常生长， 十 分短小。 而携带转基因载体的阳性苗则表现为下胚轴与根可以正常伸长， 子叶较大。
2.4 载体构建
p35S::ERECTA
在载体 pCambia 1301(www.cambia.org.au)的基础上构建植物表达载体。首先将 NOS 终止序列（参见 The Plant Journal (2001) 27(2), 101-1 13)导入 pCambia 1301的 EcoRI/Pstl 位点， 获得 C1301Nos3 '。 然后将一个 0.9kb 的 CaMV 35S启动子片段 (参见 The Plant Journal (2001) 27(2), 101-113)利用 Pstl和 Kpnl位点连入 C1301Nos3，获得 35S-C1301 , 同 时还引入了其它的多克隆位点， 具体分布见图 8。
将 £R£C ¾全长基因组序列 (包括 5'UTR和 3'UTR)分为两段， 前段 (5 ' 端片段)由 PCR扩增获得， 后段 (3 ' 端片段)由酶切 BAC获得。 具体操作步骤如下： 将 BAC T1D16 用 EcoRI和 SnaBI双酶切， 回收 7.8K左右大小的片段， 即为 £R£C ¾全长基因组序列 后段 (3 ' 端片段；)； 与 EcoRI和 Smal双酶切过的 pBluescript II SK(购自 Stratagene)相连 接。验证正确的克隆用 Kpnl与 BamHI双酶切后连至 pCambia 1301 (www.cambia.org.au), 构成 pERECTA：： ERECTA。
以 BAC T1D16 (； 来 自 于 Arabidopsis Biological Resource Center http://www.arabidopsis.org； Accession NO. 2585430) 为模板， PCR 扩增（弓 I物 5 ' -t ATCGATgtatatctaaaaacgcagtcg-3 ' (SEQ ID NO: 4)； 5 '-aatatttgtcagttcttgagaag-3 ' (SEQ ID NO: 5) 获得 412bp £R£C ¾ genomic DNA 5'端片段，并在其 5 '端引入 Clal酶切位点。 测序正确后， 连入 Clal/Sphl 双酶切的 pERECTA::ERECTA。 将上述获得的重组质粒用 Clal/BamHI双酶切，得到 ERECTA全长的基因组序列（SEQ ID NO: 1)，连入 35S-C 1301 , 获得 p35S::ERECTA。
2.5电导率测定
在处理过程中各时间点， 每个基因型选取 5株土培两周左右植株上的 15张新生成 熟叶片， 每张叶片沿中脉一分为二， 所有样品等量分为 10份， 分别置放于 3ml去离子 水中， 28 °C摇床摇过夜。 用电导仪 (Mettler toledo, FE30)测定电导率 IL1 ; 然后样品进行 高温高压处理 10分钟， 待样品温度降至室温时测定电导率 ILt ; 按照下式计算相对电导 率。
离子渗漏 （Ion leakage) = ILi/ILt 100% 公式 1
2.6气孔密度观察统计
利用扫描电镜观察成熟莲座叶片的远轴面， 每张叶片取 5个区域进行观察， 至少观 察 5张叶片。 计算每平方毫米面积内的气孔数， 作为气孔密度的测量值。
2.7气孔系数观察统计
利用扫描电镜观察成熟莲座叶片的远轴面， 每张叶片取 5个区域进行观察， 至少观 察 5张叶片。 气孔系数 (Stomata index, SI)的计算采用下列公式：
SI=气孔数 /(气孔数 +表皮细胞数) χ 100% 公式 2
2.8 ERECTA功能缺失突变体 er-105
该突变体获自 Arabidopsis Biological Resource Center http://www.arabidopsis.org (cs89504)。
详细的建立方法参考文献 The Plant Cell, Vol. 8， 735-746, April, 1996。
2.9 油菜的转基因 1 . 将油菜种子在 75%的酒精中浸泡 30秒， 再用 0.1%的升汞溶液浸泡 10min， 随后 用无菌水冲洗， 将消毒好的种子铺于含 1/2MS 培养基上， 并在 25 °C±rC， 光强为 80μηιο1/ηι2· 8培养 4-7天。
2. 将培养 4-7d后的油菜无菌苗， 用解剖刀切下子叶柄， 接种到含有 lmg/L 2， 4-D 的 1/2MS培养基上培养 2天。
3 . 培养 2天后的子叶柄跟 OD6Q()=0.5 的农杆菌 (转化有前述构建的 p35S::ERECTA) 共培养 30-60sec， 吸干子叶柄上的菌液， 共培养 1-2天 CMS+l mg/L 2， 4-D) 0
4. 转入筛选培养基 MS+3mg/L 6-BA+0.15mg/L NAA+2.5mg/L AgN03+Cef 250-500 mg/1 (或者 Carb: 250-500 mg/1) +载体自带的筛选基因。
5. 待抗性芽长到 l-2cm后， 自芽基部切下插入到 1/2MS生根培养基中诱导生根， 经 2-3周后再生苗不定根长成后， 开瓶炼苗 2d。
6.待根系形成后洗去根部琼脂，转入盛有培养土的小钵中，用塑料薄膜覆盖保湿 l-2d 后揭开， 培养 2周后移入大田进行正常栽培管理。
2.10 番茄的转基因
1. 供试种子在 70%的酒精中浸泡 1分钟， 无菌水冲洗 3次。 再用 10%的次氯酸钠 溶液浸泡 5-10分钟， 无菌水冲洗 5-6次。 将消毒好的种子铺于 1/2MS培养基上， 并在 26°C，光强为 80μιηΟ1/ιη2·3培养 7-9天，直至子叶长出。将子叶剪下置于 1/2MS培养基 (含 葡萄糖 30g/L， NAA l mg/L, BAP lmg/L)上。 在低光照条件下 （10 Em-2s-l) 25 °C预培 养 24小时。
2. 将 OD6( )=0.5的农杆菌 (转化有前述构建的 ρ3 .·£^£ ¾)液 （含 O. lmM AS)倒入 装有子叶的培养皿中， 室温放置 30分钟后吸干菌液， 25 °C黑暗下共培养 48小时。
3. 将共培养的子叶转入含有特定抗生素的筛选培养基 (1/2MS含蔗糖 30g/L， Zeatin lmg/L, IAA 0. lmg/L, Kan O. lg/L, Timentin 0.3g/L)上培养。
4. 两周后， 将带有芽原基的愈伤切成小片， 并转移到继代培养基 (1/2MS 含蔗糖 15g/L， Kan O. lg/L, Timentin 0.3g/L)上培养。
5. 待抗性芽长到 2-4cm后， 自芽基部切下插入到生根培养基 (1/2MS含 IAA5mg/L， Kan O. lg/L, Timentin 0.3g/L)中诱导生根， 2周后再生苗不定根长成后， 移栽至土壤。
2.11. 转基因阳性植株的分子鉴定
转基因拟南芥、 番茄、 油菜通过抗性筛选所得的阳性苗进一步通过 PCR反应进行分 子鉴定。 分别取野生型 (拟南芥 Col-0、 番茄 LA1589、 油菜浙双 758)以及所得的转基因 阳性苗的新生叶片组织进行常规的 DNA抽提。 所提 DNA作为模板用于以下程序进行 PCR反应： 94 °C 5分钟， 94 °C 30秒 -58 °C 30秒 -72 °C 45秒共计 30个循环， 最后 72 °C延伸 10分钟。 所用引物 35S-F: 5'-GAACTCGCCGTAAAGACTG-3'(SEQ ID NO: 6)， ERECTA-663-R: 5'-TGACTTCTTAATCTCCAGCAACG-3'(SEQ ID NO: 7)。
电泳结果显示， 作为 PCR反应的负对照， 野生型的拟南芥、 番茄、 油菜模板 DNA 无法扩增出条带； 拟南芥、 番茄和油菜的转基因阳性苗可分别特异性扩增出 l.lkb左右 的条带； 而非阳性苗同野生型一样无法扩增出条带。
2.12 蒸腾效率的测定
利用光合测定仪 (LI-6400)在光强 300 umol m_2s_2、 C02浓度 400mbar、 叶片温度 22
°。的条件下测定了植株的最大光合速率 (A)和蒸腾速率 (E)。数据测定在上午 10: 30-11:30 进行。 叶片选用短日照 (8小时光照)下新生的完全伸展叶片， 每个株系采用 6-8个植株。 叶片实时蒸腾效率的计算公式为 A/E。
2.13 转基因番茄、 油菜的高温抗性测定
番茄 TQ代转基因植株 (包括空载对照和 ERECTA过表达载体 (p3 . R£C ¾;)的转 基因植株)取其生长顶端至第四叶的部分 (包括第四叶下部的茎)进行扦插， 并使每个扦插 植株的土壤含量保持一致。 25 °C培养两周后， 材料置于光照培养箱 (MMM Climacell-111) 内开始高温处理。 油菜 TQ代转基因植株生长至 30天后直接进行高温处理。 处理方法采 用渐进处理法： 30°C 24小时→32°C 24小时→36°C 24小时→38°C 24小时→43°C 24 小时， 最终处理温度为 45°C。 处理期间统一浇水， 以保持每个植株的土壤含水量的一致 性。 处理结束后常温 25°C复水 2-3天， 观察表型。
II. 实施例
实施例 1、 基因信息
本发明人利用拟南芥生态型 Col-0与 Ler进行 QTL分析，鉴定出一个参与高温胁迫 的基因 ERECTA。
£R£C ¾基因 DNA序列如 SEQ ID NO: 1； 其中， £R£C∑4基因编码区序列如 SEQ ID NO:
2。
该基因编码的蛋白的氨基酸序列如下 (SEQ ID NO: 3)： HSVNCSSMSASDAQLFLRFGQVISQNSE 实施例 2、 EREC7 超表达促进了莲座期拟南芥植株的发育
本发明人将由 35S启动的 £R£C ¾基因 （ρ35 REC M )转入拟南芥 Col-0， 并获 得了 9 个 ERECTA 超表达转基因株系。 利用 Realtime PCR 检测这些转基因株系中 ERECTA的基因表达量， 其中株系 L2-3中 ERECTA基因表达量同野生型相比上调了 40 倍左右， 而 L7- 1上调了 80倍左右（图 1A；)。 于是选择这两个株系用于下面的形态学分析 以及后续实验。
在幼苗期 (1/2MS培养基生长 10天)，过量表达 ¾引起子叶和真叶增大， 叶柄 也有所增长 (图 1 B)。 当植株移到土中生长 20天至莲座叶期， 可发现所有莲座叶片均有 一定程度的增大， 并且这种增大与£^£ ¾基因的表达量呈正相关 (图 1 C)。 实施例 3、 EREC7 超表达通过促进细胞伸长影响叶片发育
为进一步观察超表达植株的形态学特征， 本发明人以第九片莲座叶为例 (图 2A)， 分 析了 ERECTA超表达植株叶片的细胞学结构。
本发明人分别测量了叶片的宽度和长度， 统计分析数据表明超表达株系叶片的宽 度、 长度均较野生型显著增加 (图 2C、 D)， 进一步的叶片横切面解剖学分析显示， 和野 生型相比， 超表达株系叶表皮细胞和叶肉细胞均变大， 说明叶片变大是由于细胞膨大引 起的（图 2 B；)。 实施例 4、 ERECTA超表达促进植株侧苔发育
进一步观察 £R£C ¾超表达植株抽苔后的形态学特征发现， 和野生型相比超表达株 系的株高并没有显著的变化 (图 3A)， 但是侧苔的数目和主苔的分支数均明显增多， 导 致花序数目显著增多（图 3A、 B)进而导致生物量的增大 (图 3A)。 实施例 5、 ERECTA超表达导致叶片气孔密度降低及蒸腾速率的提高
本发明人利用扫描电镜检测了超表达株系中气孔发育的变化。 电镜观察的结果如 图 4所示， 同野生型 Col-0相比， ERECTA功能缺失突变体 er 05的气孔密度增大了 2 倍左右（图 4A、 B)， 但是气孔系数并没有变化 (图 4C)。
相反， 在 £R£C ¾超表达株系中， 气孔密度明显变小。 35S::ERECTA L2-3 的气孔 密度较野生型相比下降了 36%， L7-1则下降了 55% (；图 4 A， B)。 但就气孔系数而言， 超表达植株同突变体一样， 与野生型 (WT)相比没有明显变化 (图 4C)。
气孔密度的减少往往伴随着蒸腾效率的改变。 因此， 本发明人测量了™ ¾超表 达株系的蒸腾效率。 如图 10所示， 拟南芥 L7-1株系的蒸腾效率显著高于野生型。 这说 明 ERECTA的过量表达可以提高植株的瞬时水分利用效率。
结果证明， ERECTA 是一个气孔分化的负调控因子， 但不影响气孔系数。 同时， J^CTM可以通过影响气孔的分化调控蒸腾效率 (瞬时水分利用效率)。 实施例 6、 ERECTA超表达植株高温胁迫抗性鉴定
为了进一步验证 J?£C ¾ 基因在植物抗高温胁迫中的作用， 本发明人将获得的 £R£C ¾超表达材料进行了高温胁迫处理。 当 40 °C处理进行到 48h时进行观察， 发现此 时 er-J05整株苗均呈暗绿至干枯， 几近死亡（图 5A)。 这时野生型 Col-0的一些叶片呈暗 绿并萎蔫， 叶柄及新生叶片则呈正常鲜绿状态 (图 5A)。 而超表达两个株系的状态均好于 野生型： L2-3除老叶及成熟叶片、 新生叶片的边缘有萎蔫干枯的情况外， 大部分组织均 呈鲜绿状态。 L7- 1 的抗性相比 L2-3更强一些， 叶片上几乎没有萎蔫坏死区域， 仅观察 到局部损伤（图 5A)。
高温处理 48h后常温复水 2-3天后统计成活率发现， 与复水前观察到的状态相符， ERECTA 超表达两个株系的成活率均较野生型高： Col-0 的成活率为 48%左右， er-J05 低于 20%， L2-3的成活率提高至 65%， 相比野生型提高了 30%; L7-1 的成活率为 75% 左右， 相比野生型提高了 50% (图 5B)。
上述结果证明，™ ¾确实参与了植物的高温耐受性， 其表达量的提高显著增强 高温抗性。 实施例 7、 EREC7 介导了高温引发的细胞死亡
本发明人还测定了高温胁迫下野生型、 突变体及超表达植株电导率。 电导率也称 离子渗透率。 当细胞受损时细胞膜透性增加离子开始外渗， 膜受损到一定程度即发生细 胞死亡。 因此电导率是反映细胞膜完整性的参数， 是表征细胞死亡的生理指标。 值越大 则细胞死亡程度越剧烈。
在高温胁迫 0h、 12h、 24h、 36h和 48h的电导率测定结果如图 6所示。 可见， 相对 于野生型或 突变体， £R£C ¾转基因植物的离子渗漏水平下降。 因此， ERECTA缓解 了高温引发的细胞死亡。 实施例 8、 ERECTA超表达株系具有 30°C高温胁迫抗性
拟南芥的正常生长温度为 21 °C至 23 °C， 40 °C对于拟南芥属于极端高温。 为进一步 鉴定腦 CTA是否参与高温胁迫， 本发明人检测了 30 °C下超表达株系的存活率。 结果如图 7A所示， 30 °C下生长的植株叶片较小， 叶柄呈细长状。 30 °C处理 30天后， 野生型叶片逐渐转黄， 整株植株萎蔫呈死亡状态。 而 £R£C ¾超表达株系 L7-1则大部 分叶片仍维持新绿。 复水 2-3天后统计成活率， 野生型不到 15%， 而 L7- 1超过 40% (图 7B)。
同时， 对于™ ¾转基因的番茄以及油菜植物， 也观察到抗热能力的显著增强。 因而， £R£C ¾可以增强植物对长期高温逆境的抗性。 实施例 9、 筛选或育种方法
起始植物为： 野生型拟南芥以及 Col-0。 对该种植物进行转基因操作， 转入 ERECTA 基因以鉴定是否可提高其抗热性。如前述方法制备转基因植株，获得 1#、 2#转基因植株。
通过常规的 Western 印迹方法或 Realtime PCR 方法， 检测 1#、 2#转基因植株中 £R£C ¾的表达； 其表达量高于出发品种 Col-0 50%以上， 因此可以确定 1#、 2#转基因 植株为潜在具有抗热能力的植物。 实施例 10、 ERECTA变异体
本发明人对 ERECTA蛋白的结构域进行了分析， 发现其羧基端部分是发挥功能的主 要区域， 而氨基端区域则并非为发挥功能的重要区域 (LRR domain) , 许多位点上可以进 行改变。
用一编码序列替换 的 Clal/BamHI中的序列， 所述编码序列编码的蛋 白具有 SEQ ID NO: 3类似的序列， 不同处仅在于第 33位为 Leu (野生型蛋白中为 Ile)。 lie和 Leu同属于脂肪族中性氨基酸且结构相似， 该位点变异对蛋白活性影响不大。
用一编码序列替换 的 Clal/BamHI中的序列， 所述编码序列编码的蛋 白具有 SEQ ID NO: 3类似的序列，不同处仅在于第 386位为 Ala (野生型蛋白中为 Val)。
Val和 Ala同属于脂肪族中性氨基酸且结构相似， 该位点变异对蛋白活性影响不大。
用一编码序列替换 的 Clal/BamHI中的序列， 所述编码序列编码的蛋 白具有 SEQ ID NO: 3类似的序列，不同处仅在于第 213位为 Pro (野生型蛋白中为 Gly)。
Pro是与 Gly相近的氨基酸， 该位点变异对蛋白活性影响不大。
用一编码序列替换 的 Clal/BamHI中的序列， 所述编码序列编码的蛋 白具有 SEQ ID NO: 3类似的序列， 不同处仅在于第 278和 279位中间插入氨基酸 Gly。
Gly为氨基酸中最小的且为中性， 在所述位点插入对蛋白的三维结构基本没有影响， 不 影响蛋白活性。
用一编码序列替换 的 Clal/BamHI中的序列， 所述编码序列编码的蛋 白具有 SEQ ID NO: 3类似的序列， 不同处仅在于第 502位 lie缺失。 所述位点缺失对蛋 白的三维结构基本没有影响， 不影响蛋白活性。 将上述获得的表达质粒如前述方法制备转基因拟南芥 (农杆菌法)，获得的植株鉴定耐 热性能， 也即如前述相同方法在 30 °C高温胁迫下测定耐热性能。 结果发现， 30 °C处理 30天后， 这些植株大部分叶片仍维持新绿。 实施例 11、 ERECTA过表达提高了番茄的耐热性
将 35S启动的 ERECTA超表达载体 REC M)转入一个对高温敏感的番茄品种 LA1589 , 并得到多于 20个独立的 TQ代转基因株系 35 _ ¾。空载体转基因植株作 为对照。 同拟南芥转基因植株相似， 番茄中的™ ¾过量表达同样导致了植株叶片的 显著变大， 如图 1 1Α。
所有的 TQ代植株 (包括空载对照)取同样大小的顶端进行扦插， 25 °C培养获得长势一 致的幼苗。 两周后， 幼苗放置于 30 °C培养箱中， 开始高温处理。 处理温度在 4天内逐渐 升至 38 °C。 最终处理温度达到 43-45 °C处理三天。 此时对照植株 (空载)完全死亡， 但是 转基因植株仍然存活 (图 1 1B); 复水后对照植株无法恢复， 而转基因植株可以一定程度 恢复生长， 表现出对极度高温的抗性， 如图 1 1 C。 这证明了在对高温敏感的作物中， ERECTA的过量表达可以提高其抗热性。 实施例 12、 ERECTA过表达提高了油菜的耐热性
本发明人将 35S 启动的 ERECTA 过表达载体 REC M)转入油菜的一个品系 "浙双 758 " 中， 并获得大于 15个独立的 TQ代转基因株系。 本发明人直接将 30天大的 转基因幼苗进行高温处理， 空载体转基因苗作为对照。温度在 4天之内由 30°C逐渐递增 为 38 °C， 之后开始 43-45 °C的极度高温处理。 高温处理进行到 48小时时， 可以观察到空 载对照转基因株系叶片严重萎蔫； 而 ERECTA 转基因植株 (L3、 L12)的叶片也有一定程 度的萎蔫， 但仍能维持一定的膨压。 复水后， 对照植株无法继续存活， 而 ERECTA转基 因植株则可以很大程度上恢复生长， 如图 12。
以上转基因番茄和转基因油菜的数据证明了在对高温敏感的作物中， ERECTA 的过 量表达可以提高其抗热性。 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考， 就如同每一篇文献被单独引 用作为参考那样。 此外应理解， 在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本领域技术人员 可以对本发明作各种改动或修改， 这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。

Claims

权 利 要 求
1. 一种 ERECTA蛋白或编码该蛋白的多核苷酸的用途， 用于提高植物耐热能力； 促 进植物的发育； 提高植物的产量； 增加植物的生物量； 降低植物的气孔密度； 或提高植株的 水分利用效率。
2. 一种 ERECTA蛋白或编码该蛋白的多核苷酸的用途， 用于制备耐热能力提高、 发 育快、 产量增加、 生物量增加、 气孔密度低或水份利用率高的植物。
3. 如权利要求 1或 2所述的用途， 其特征在于， 所述 ERECTA蛋白是：
(a) 如 SEQ ID NO: 3所示氨基酸序列的蛋白； 或
(b) 将 SEQ ID NO: 3所示氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、 缺失或添 加而形成的， 且具有提高植物抗热能力功能的由 (a)衍生的蛋白； 或
(c) 氨基酸序列与 (a)限定的氨基酸序列有 70%以上相同性且具有提高植物抗热能力 功能的多肽； 或
(d) 具有 (a) 蛋白功能的 SEQ ID NO: 3的蛋白片段。
4. 如权利要求 1或 2所述的用途， 其特征在于， 所述编码 ERECTA蛋白的多核苷酸 是：
(i) 具有 SEQ ID NO: 1所示序列的多核苷酸；
(ii) 核苷酸序列在严格条件下能够与 (i)限定的多核苷酸序列杂交且编码的蛋白具有 提高植物抗热能力功能的多核苷酸；
(iii) 核苷酸序列与 (i)限定的多核苷酸序列有 70%以上相同性且编码的蛋白具有提高 植物抗热能力功能的多核苷酸； 或
(iv) 具有与 SEQ ID NO: 1所示序列互补的序列的多核苷酸。
5. 如权利要求 1或 2所述的用途， 其特征在于， 所述编码 ERECTA蛋白的多核苷酸 是：
(!') 具有 SEQ ID NO: 2所示序列的多核苷酸；
(ϋ') 核苷酸序列在严格条件下能够与 (Γ)限定的多核苷酸序列杂交且编码的蛋白具 有提高植物抗热能力功能的多核苷酸；
(iii') 核苷酸序列与 (i')限定的多核苷酸序列有 70%以上相同性且编码的蛋白具有提 高植物抗热能力功能的多核苷酸； 或
(iv') 具有与 SEQ ID NO: 2所示序列互补的序列的多核苷酸。
6. 如权利要求 1-4任一所述的用途， 其特征在于， 所述的植物选自但不限于： 十字花科植物、 禾本科植物或茄科植物。
7. 如权利要求 6所述的用途， 其特征在于， 所述的植物选自但不限于： 油菜、 大白 菜、 小白菜、 甜菜、 水稻、 小麦、 大麦、 玉米、 黑麦、 高粱、 大豆、 番茄、 辣椒、 马铃 薯、 烟草、 枸杞。
8. 一种提高植物耐热能力、 促进植物发育、 提高植物的产量、 增加植物的生物量、 降 低植物的气孔密度或提高植株的水分利用效率的方法， 所述方法包括： 提高植物中 ERECTA蛋白的表达或活性。
9. 一种制备耐热能力提高、 发育快、 产量增加、 生物量增加、 气孔密度低或水份利用 率高的植物的方法， 所述方法包括： 提高植物中 ERECTA蛋白的表达或活性。
10. 如权利要求 8或 9所述的方法， 其特征在于， 所述的方法包括： 将编码 ERECTA 蛋白的多核苷酸转入植物中。
11. 如权利要求 10所述的方法， 其特征在于， 所述的方法包括步骤：
(i) 提供携带表达载体的农杆菌， 所述的表达载体含编码 ERECTA蛋白的多核苷酸；
(ii) 将植物细胞、 组织或器官与步骤 (i)中的农杆菌接触， 从而使所述编码 ERECTA 蛋白的多核苷酸转入植物。
12. 用权利要求 8-11任一所述的方法获得的转基因植物或其杂交后代， 与对照植物 相比， 所述的转基因植物或其杂交后代的耐热能力提高、 发育快、 产量增加、 生物量增 加、 气孔密度低或水份利用率高。
13. 用权利要求 8-11任一所述的方法制得的转基因植物的用途， 用于产生种子。
14. 一种 ERECTA蛋白或编码其的多核苷酸的用途， 用作鉴定植物的耐热能力、 发 育情况、 产量情况、 生物量情况、 气孔密度情况或水分利用效率的分子标记物。
15. 一种鉴定植物耐热能力、 发育情况、 产量情况、 生物量情况或气孔密度情况的方 法， 包括： 检测待测植物中 ERECTA蛋白的表达； 若待测植物中该多肽的表达量高于该 类植物中 ERECTA蛋白表达的常规值； 则该种植物是具有耐热能力、 发育良好、产量高、 生物量高或气孔密度低的植物； 若待测植物中该多肽的表达量低于该类植物中 ERECTA 蛋白表达的常规值； 则该种植物是不具有耐热能力、 产量低、 生物量低或气孔密度高的 植物。
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