CN116732053A - 菜心耐热调控基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及菜心耐热调控基因及其应用，所述菜心耐热调控基因为减数分裂相关基因BrASY2和天冬氨酸激酶基因BrAK3。所述BrASY2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述BrAK3的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明公开的BrASY2基因和BrAK3基因在调控菜心耐热性方面具有非常重要的作用，能够有效调节菜心对高温的耐受力，可应用于调控菜心耐热性，本发明为研究植物应答高温信号的机制奠定理论基础，也为培育耐热菜心新品种提供了基因资源，具有较好的潜在应用价值。

Description

菜心耐热调控基因及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及菜心耐热调控基因及其应用。

背景技术

菜心(BrassicacampestrisL.ssp.chinensisvar.utilisTsenetLee)，又名菜薹，为十字花科芸薹属一、二年生草本植物，由大白菜亚种和白菜亚种长期选择和栽培驯化而来，是我国华南地区的特产。菜心性喜凉，生长适温15～25℃，在30℃以上的高温天气下，菜心的生长发育就会受到影响，导致菜苔细小、质劣，单株重和商品产量大幅下降。特别是在华南地区，夏季高温持续时间长，超过40℃极端的高温频频出现，高温已成为限制该地区菜心正常生长的重要因素之一。

目前，菜心耐高温胁迫方面的研究大多集中在菜心经济性状指标或生理生化变化方面，而菜心响应高温胁迫的分子机制相关研究还比较少，大多数高温响应基因的功能尚不清楚。因此，解析菜心耐热调控机制，挖掘耐热基因，可为培育菜心耐热新品种提供分子基础。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供菜心耐热调控基因及其应用。

本发明的目的通过以下技术方案来实现：菜心耐热调控基因，为减数分裂相关基因BrASY2和天冬氨酸激酶基因BrAK3，所述减数分裂相关基因BrASY2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述天冬氨酸激酶基因BrAK3的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步地，所述减数分裂相关基因BrASY2编码的蛋白具有SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列，天冬氨酸激酶基因BrAK3编码的蛋白具有SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列。

上述的基因在调控菜心耐热性方面的应用。

进一步地，所述基因通过调控耐热基因表达和ROS信号转导来影响菜心的耐热性。

本发明还提供一种耐热菜心过表达体系，含有上述的菜心耐热调控基因减数分裂相关基因BrASY2或天冬氨酸激酶基因BrAK3。

本发明还提供一种耐热菜心过表达体系的构建方法，BrASY2基因过表达体系的构建方法为：

将减数分裂相关基因BrASY2全长CDS序列构建到pYES2-NTB载体，得到过表达载体pYES2-NTB-BrASY2；将过表达载体pYES2-NTB-BrASY2转入酵母INVSC1中，获得BrASY2基因过表达酵母菌。

BrAK3基因过表达体系的构建方法为：

使用同源重组方法，将天冬氨酸激酶基因BrAK3的CDS全长序列构建到pEarleyGate 101载体，从而得到BrAK3基因过表达载体pEarleyGate 101-BrAK3；将pEarleyGate 101-BrAK3过表达载体转到农杆菌GV3101，获得BrAK3基因过表达植株。

本发明还提供一种耐热菜心沉默体系的构建方法，使用同源重组方法，分别将BrASY2基因的CDS非保守区段255bp长度的片段及其互补片段和BrAK3基因的CDS非保守区段90bp长度的片段及其互补片段构建到pK7GWIWG2(I)载体，从而得到BrASY2基因沉默载体pK7GWIWG2(I)-BrASY2和BrAK3基因沉默载体pK7GWIWG2(I)-BrAK3；分别将pK7GWIWG2(I)-BrASY2和pK7GWIWG2(I)-BrAK3沉默载体转到农杆菌GV3101，获得BrASY2基因沉默植株和BrAK3基因沉默植株。

进一步地，BrASY2基因的CDS非保守区段255bp长度片段的核苷酸序列如SEQ IDNO.9所示，BrAK3基因的CDS非保守区段90bp长度片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

本发明具有以下优点：

(1)本发明提供的菜心高温响应基因BrASY2，BrASY2基因过表达酵母菌证实该基因具有耐高温作用，是一个响应高温胁迫的正向调控因子；同时高温下沉默BrASY2基因，伴随着BrASY2基因的表达量降低，BrASY2基因沉默植株的耐热标记基因BrHsfA2、BrHsp90和ROS清除酶基因BrMn-SOD的表达也受到抑制，叶片颜色变浅，叶绿色含量和SOD活性降低，相对电导率和H₂O₂含量升高，BrASY2基因沉默植株的耐热性降低，实现了BrASY2基因对菜心高温耐受性的调控。

(2)本发明提供的菜心高温响应基因BrAK3，在高温条件下，BrAK3基因过表达的菜心材料更耐高温，过表达植株的BrHsfA2、BrHsp90和BrMn-SOD基因表达量及抗氧化酶SOD活性显著高于空白对照植株，而相对电导率和H₂O₂含量较空白对照植株明显降低。而BrAK3基因沉默则相反，高温胁迫后，BrAK3基因沉默植株的BrHsfA2、BrHsp90和BrMn-SOD基因表达量以及SOD活性、叶绿素含量较空白对照植株相比明显降低，相对电导率和H₂O₂含量则显著增加。

(3)本发明公开的BrASY2基因和BrAK3基因在调控菜心耐热性方面具有非常重要的作用，能够有效调节菜心对高温的耐受力，为研究植物应答高温信号的机制奠定理论基础，也为培育耐热菜心新品种提供了基因资源，具有较好的潜在应用价值。

附图说明

图1为BrASY2基因在耐热材料CX1-7和热敏材料CX7-3的转录表达分析图。

图2为BrASY2基因顺式作用元件分析图。

图3为pYES2-NTB载体及BrASY2基因插入位点图。

图4为高温胁迫下BrASY2基因过表达酵母菌的表型图。

图5为pK7GWIWG2(I)质粒图谱。

图6为BrASY2基因沉默和对照的菜心叶片中BrASY2基因的表达情况图。

图7为BrASY2基因沉默和对照菜心叶片中耐热标记基因和ROS信号应答基因的表达分析图。

图8为BrASY2基因沉默植株和对照菜心植株高温胁迫前后表型变化图。

图9为BrASY2基因沉默植株和对照菜心叶片中叶绿素含量、相对电导率、H₂O₂含量、SOD活性测定结果图。

图10为BrAK3基因在耐热材料CX1-7和热敏材料CX7-3的转录表达分析图。

图11为BrAK3基因顺式作用元件分析图。

图12为pEarleyGate 101质粒图谱。

图13为BrAK3基因过表达和空白对照菜心叶片中BrAK3基因的表达情况图。

图14为BrAK3基因过表达和空白对照菜心叶片中高温胁迫前后耐热标记基因、ROS信号应答基因的表达情况图。

图15为BrCK3基因过表达和空白对照菜心植株高温胁迫前后表型变化图。

图16为BrAK3基因过表达植株和空白对照菜心叶片中叶绿素含量、相对电导率、H₂O₂含量、SOD活性测定结果图。

图17为BrAK3基因沉默和空白对照菜心叶片中BrAK3基因的表达情况图。

图18为BrAK3基因沉默和空白对照菜心叶片中高温胁迫前后耐热标记基因、ROS信号应答基因的表达情况图。

图19为BrAK3基因沉默植株和空白对照菜心植株高温胁迫前后表型变化图。

图20为BrAK3基因沉默植株和空白对照菜心叶片中叶绿素含量、相对电导率、H₂O₂含量、SOD活性测定结果图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的描述，本发明的保护范围不局限于以下所述：

实施例1：耐热和热敏菜心材料中BrASY2基因和BrAK3基因的转录表达检测

菜心BrASY2基因和BrAK3基因是发明人通过对菜心高温胁迫转录组数据进行分析发现的。转录组数据库所用菜心耐热材料CX1-7和热敏材料CX7-3(CX1-7和CX7-3已在专利公开文件CN113348992A中公开，现保存于海南省农业科学院蔬菜研究所)，均经过苗期高温胁迫鉴定及田间自然高温鉴定。转录组测序由北京百迈客生物科技有限公司负责完成，所用高温胁迫处理温度为37℃，处理时间是6h，具体处理参考“(庞强强等.菜心叶片响应高温胁迫的转录组分析及转录因子筛选[J/OL].分子植物育种:1-23[2023-05-24].)。菜心BrASY2基因在菜心高温胁迫前后的转录表达水平如图1所示，菜心BrAK3基因在高温胁迫前后的转录表达水平如图10所示。

可以发现，在高温胁迫前(0h)，菜心BrASY2基因和BrAK3基因在热敏材料CX7-3和耐热材料CX1-7中的转录表达水平均较低；在高温胁迫6h后，BrASY2基因和BrAK3基因在CX1-7中的转录表达水平均迅速上升，分别是高温胁迫前的20.21倍和15.58倍，而在CX7-3中的表达量仅是高温胁迫前的1.83倍和2.30倍；另外，高温胁迫6h后的BrASY2基因和BrAK3基因在CX1-7中的表达量分别是其在CX7-3中表达量的25.73倍和22.02倍。以上结果说明，菜心BrAK3基因和BrASY2基因是潜在的高温响应调控基因。

实施例2：顺式作用元件分析

利用在线工具PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)分析BrASY2基因和BrAK3基因的顺式作用元件发现，结果如图2和图11所示。由图2可以发现，BrASY2基因包含9个高温胁迫响应元件CAAT-box；由图11可以发现，BrAK3基因包含11个高温胁迫响应元件CAAT-box。

实施例3：BrASY2基因和BrAK3基因过表达体系构建及耐热性分析

1.BrASY2基因过表达体系构建及耐热性分析结果为：

将目的基因BrASY2全长CDS序列构建到pYES2-NTB载体(购自南京金斯瑞生物科技股份有限公司)，酶切位点为BamHI和EcoRI，载体图谱及插入位点如图3所示，得到过表达载体pYES2-NTB-BrASY2。所用BrASY2基因的全长CDS序列长度为852bp，如SEQ ID NO.1所示，具体核苷酸序列为：

5‘-ATGAAGCAATTGCCCGACCTTAGCCTTATTGTGGCTGAAAAGATAGGCGCCAAGCGA GGCGCTTCTGGGAGCAGGGTTGGCCCTTCGGGGTTGGAAGCGGTAGAGGCGACCCCAATTGCTGCTGAGCAAACGCGTACTGGTGGCTCCTCGAAGAAAAGCAAGAAAAAGGCCGAGGATCCGAAGGAATCTTCTGAGCCCGGGCAAACTGGGGCAGACGGTTCCTCTAAAAAAGGGGGGAAGAAACGGAAAGCCGGAGATTTGCCCGCCGAGGACGCTCCTAAGAAGAAAAAGATGAAGAAGAAAGAATTGGCTATGCCCCGCTCATCCTCGGTCTGCGAAGAGGAACT TCAGGCTCTAGTTCCTGAAGCTATCCCTGAGGTTGGGACCTCGGAGGATGATGAGAATGAGACTATCGCCCTCCGCCGACGGAGACGGGAGAGTCGAGTCACCGAGGAGGTATCCCGTGGAACCTTGGCCGGTGATCTACCTTCTACTGAGGTTCCGAGGGGAATATCGACTTTGGGAGGACAGCGGGACCGCTCGAGGAATGAGTCCCCTGCTCATGTCACGGAGGGATCTGAGACCCGAGTATCCGGTCGCCCTAAGGAAACCCCGGCAGATGGGTTCAGATTCGAGTTTAACCGTGAGCTTCCGCTGGCTTGCTACCCGGAAGATTGTGCTCGCCTGTTACGGTTGGTCAAAGGCGGTCCCGATCAACTCCCTTCAGTGGGAGATCTCATCTTCAAAGATGAGTATGAGCACGCCTCTTGCTCGTCTGTAAAGGTAAGCGGTTGTTCGTTCCCTTCTTTTCCGAACCTTAAATTATTTTGGCTAAGTCTTTTTGTGTTTTGA-3’

其编码的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，具体为：

MKQLPDLSLIVAEKIGAKRGASGSRVGPSGLEAVEATPIAAEQTRTGGSSKKSKKKAEDPKE

SSEPGQTGADGSSKKGGKKRKAGDLPAEDAPKKKKMKKKELAMPRSSSVCEEELQALVPE

AIPEVGTSEDDENETIALRRRRRESRVTEEVSRGTLAGDLPSTEVPRGISTLGGQRDRSRNES

PAHVTEGSETRVSGRPKETPADGFRFEFNRELPLACYPEDCARLLRLVKGGPDQLPSVGDLI

FKDEYEHASCSSVKVSGCSFPSFPNLKLFWLSLFVF

(2)将载体pYES2-NTB-BrASY2和阴性对照pYES2-NTB分别转入酵母INVSC1中，YPDA平板30℃培养2d。

(3)挑取INVSC1单菌落接种于YPDA液体培养基(体积为4mL)，30℃，225rpm，振荡培养18-20h，直至OD₆₀₀值＞1.5。

(4)取菌液，然后转接至YPDA液体培养基(体积为50mL)，调整OD₆₀₀值约为0.2，30℃，225rpm，振荡培养4-5h，直至OD₆₀₀值约为0.6。

(5)室温，4000rpm离心5min，弃上清。用20mL无菌水重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4000rpm，5min，弃上清。

(6)用5mL的LiAc(0.1M，pH7.5)重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4000rpm，5min，弃上清。

(7)用500μL的LiAc(0.1M，pH7.5)重悬菌体，混匀，分装至1.5mL离心管，每个50μL，备用。

(8)每个1.5mL离心管中依次加入240μLPEG3350(50％)、36μL LiAc(1M)、5μLssDNA(20mg/mL)、5μL质粒DNA，用枪头吹打混匀，或剧烈振荡1min左右，至完全混匀。

(9)依次进行以下操作，30℃水浴孵育30min，42℃水浴热激25min，30℃水浴复苏30min。

(10)离心收菌，室温，4000rpm，5min，弃上清。

(11)每个转化用200μL无菌水悬浮菌体，尽量温和地混匀，涂布相应的酵母缺陷型筛选平板，30℃恒温培养4d。

(12)挑选pYES2-NTB-BrASY2和阴性对照pYES2-NTB的阳性克隆，用2mL无菌水重悬，稀释点至SG-U(缺失尿嘧啶的SG培养基，含有半乳糖)平板上，分别放置到温度为30℃、37℃、39℃、41℃、45℃培养箱中培养，3d后观察平板并拍照，结果如图4所示。

结果发现，阴性对照pYES2-NTB在30℃条件下酵母菌能够生长，但在37℃、39℃、41℃、45℃条件下酵母菌不生长或部分生长；而BrASY2基因过表达酵母菌在30℃、37℃、39℃、41℃条件下能够正常生长，仅在45℃条件下表现为部分生长，说明pYES2-NTB-BrASY2耐高温，能够帮助酵母菌度过高温逆境，这证明了BrASY2基因在高温胁迫中起正向调控作用。

2.BrAK3基因过表达体系构建及耐热性分析结果为：

使用同源重组方法，将BrAK3基因的CDS全长序列构建到pEarleyGate 101载体(购自上海泽叶生物科技有限公司)，载体大小为12454bp，BrAK3基因的插入位置具体为质粒35S启动子后的attR1和attR2之间的ccdB基因，从而得到了BrAK3基因过表达载体pEarleyGate101-BrAK3，载体图谱及插入位点如图12所示。

所用BrAK3基因的全长CDS序列长度为681bp，如SEQ ID NO.2所示，具体序列为：5‘-ATGCGGCCAGCTAGCGAAGGGAACATTCCTGTAAGGGTTAAGAACTCTTACAATCCC ACTGCACCAGGAACTCTCATCACTAGATCAAGAGACATGAGCAAGGCTGTACTGACCAGCATCGTTCTGAAACGTAATGTTACCATGTTGGACATCACTAGCAACCGTATGCTCGGTCAATATGGTTTCCTTTCCAAGGTGCTCTCCACATTTGAAAAGATGGGCATATCTGTAGATGTTGTTGCAACCAGCGAAGTTAGCGTTTCCTTGACATTGGATCCTTCAAAGTTCTGCAGCAAAGAGTTAATTCAACAGGAGATTAATCACATGGTAGAGGAACTGGAGAAGATTGCTTCGGTAAACCTGCTTCAGCACAGATCAATTATCTCACTCATTGGAAATTTTCAGAGATCATCATCTTTCATATTAGAGAAGGGCTTCCGAGTTCTTAGAACCAATGGAATCAATGTCCAGATGATCTCTCAGGGTGCATCTAAGGTAAACATCTCGCTGATAGTGAATGATGATGAGGCAGAGCATTGTGTGAAGGCTCTCCATTCAGCCTTCTTCGAGACAGGAACCTCCAAAGCTGTTCCTCAGATAGGGCGTCTAGCTACTACACCTCTGCCTTGTCGTGAAAACCTCTTGGTGCAACCTGACCTGCGAGATCTACAAGTAGTTTGA-3’

其编码的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，具体为：

MRPASEGNIPVRVKNSYNPTAPGTLITRSRDMSKAVLTSIVLKRNVTMLDITSNRMLGQYGF

LSKVLSTFEKMGISVDVVATSEVSVSLTLDPSKFCSKELIQQEINHMVEELEKIASVNLLQHRSIISLIGNFQRSSSFILEKGFRVLRTNGINVQMISQGASKVNISLIVNDDEAEHCVKALHSAFFETGTSKAVPQIGRLATTPLPCRENLLVQPDLRDLQVV

参考前人在菜心上的方法，具体参考公开号为CN114934054A的发明专利“菜心乳胶蛋白基因BraMLP1在抗霜霉病中的应用”中的瞬时过量表达/基因沉默的菜心叶片基因表达模型的构建方法(1)-(7)，将pEarleyGate 101-BrAK3过表达载体转到农杆菌GV3101，获得BrAK3基因过表达植株后，设计BrAK3基因扩增引物进行阳性鉴定。本部分所用实验材料为热敏材料CX7-3。

将BrAK3基因过表达和空白对照植株用37℃高温处理0h和6h，拍照记录处理前后植株表型变化，并收集菜心叶片，进行生理指标及相关基因表达分析。其中基因表达分析方法如下：利用TRIzol试剂盒(Invitrogen TRIzol)提取RNA，SuperScript IV第一链cDNA合成系统试剂盒(Invitroge)完成cDNA合成和纯化，进行相关基因表达分析。以cDNA产物稀释3倍后作为PCR扩增的模板进行qRT-PCR扩增，qRT-PCR扩增所用到的试剂为PremixEx TaqTM试剂盒(TAKARA)，实时荧光定量PCR仪为BioRad CFX96^TM(BioRad伯乐，美国)。qRT-PCR扩增反应体系为5μL 2×SYBR Premix Ex TaqTM，0.5μL正向引物(10μmol/L)，0.5μL反向引物(10μmol/L)，4μL cDNA模板(稀释3倍)，10μL灭菌蒸馏水。qRT-PCR反应程序：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退20s，72℃延伸20s，40个循环。每次反应均重复3次。基因表达情况分析采用2^-△△Ct法计算并作图，以BrCKⅠ基因为内参基因(核苷酸序列见公开号为：CN115927296A的中国专利)。

其中BrCKⅠ基因的表达扩增引物为：

F:5’-GTCTAACTTCCTCGCCACCT-3’ SEQ ID NO.11

R:5’-GATTCGACGACAAGCCAGAC-3’ SEQ ID NO.12

BrAK3基因的表达扩增引物为：

F:5’-GGCAGATGGGTTCAGATTCG-3’ SEQ ID NO.5

R:5’-AAGAGGCGTGCTCATACTCA-3’ SEQ ID NO.6

BrHsfA2基因的表达扩增引物为：

F:5’-GACCATTGCTCCAAGACACC-3’ SEQ ID NO.13

R:5’-GGAAGAGACGGTGACCTACG-3’ SEQ ID NO.14

BrHsp90基因的表达扩增引物为：

F:5’-CTGCAACAGTCTCACCCTCT-3’ SEQ ID NO.15

R:5’-CTGAGAGCAAGTGGTGGAAC-3’ SEQ ID NO.16

BrMn-SOD基因的表达扩增引物为：

F:5’-AGATGAGTGCTGAAGGTGCT-3’SEQ ID NO.17

R:5’-CTGATTGGCGGTTGTGTCAA-3’SEQ ID NO.18

生理指标测定方法为：叶绿素含量测定采用SPDA法，相对电导率测定采用电导仪法，H₂O₂含量测定采用分光光度计法，SOD活性测定采用氮蓝四唑法，以上指标测定均进行3次重复。

BrAK3基因过表达植株阳性鉴定结果如图13所示，在高温胁迫6h后，BrAK3基因过表达植株的BrAK3基因表达量显著高于空白对照植株，说明BrAK3基因过表达体系构建成功。

基因表达结果如图14所示，与空白对照植株相比，高温胁迫后，耐热标记基因BrHsfA2、BrHsp90和ROS清除酶基因BrMn-SOD的表达量均显著提高，且在BrAK3基因过表达植株中的表达量显著高于空白对照植株，表明BrAK3基因可以通过调控高温和ROS信号转导来影响菜心的耐热性。

表型观察和生理生化指标测定结果如图15和图16所示。高温胁迫后，空白对照植株表型发生明显变化，叶色变浅，而BrCK3基因过表达植株表型变化不明显。从生理生化指标上来看，高温胁迫6h后，BrAK3基因过表达植株的相对电导率和H₂O₂含量降低，SOD活性升高，叶绿素含量无显著变化，耐热性较空白对照植株明显增强。

实施例4：BrASY2基因和BrAK3基因沉默体系构建及耐热性分析

BrASY2基因沉默体系构建具体步骤和取得结果如下：

(1)BrASY2基因和BrAK3基因沉默体系构建所用质粒为pK7GWIWG2(I)(购自上海泽叶生物科技有限公司)，质粒大小为13599bp，质粒图谱如图5所示。通过基因重组交换方式，分别将BrASY2基因的非保守区段255bp长度的片段(CDS598-852bp)及其互补片段和BrCK3基因的CDS非保守区段90bp(CDS 592-681bp)长度的片段及其互补片段替代质粒ccdB基因，ccdB基因具体位置为35S启动子后attR1和attR2之间，从而分别得到BrASY2基因沉默载体pK7GWIWG2(I)-BrASY2和BrAK3基因沉默载体pK7GWIWG2(I)-BrAK3。

本发明所用BrASY2基因的非保守区段的长度为255bp，如SEQ ID NO.9所示，具体核苷酸序列为：

5‘-CGCCCTAAGGAAACCCCGGCAGATGGGTTCAGATTCGAGTTTAACCGTGAGCTTCCG CTGGCTTGCTACCCGGAAGATTGTGCTCGCCTGTTACGGTTGGTCAAAGGCGGTCCCGATCAACTCCCTTCAGTGGGAGATCTCATCTTCAAAGATGAGTATGAGCACGCCTCTTGCTCGTCTGTAAAGGTAAGCGGTTGTTCGTTCCCTTCTTTTCCGAACCTTAAATTATTTTGGCTAAGTCTTTTTGTGTTTTGA-3’

所用BrCK3基因的CDS非保守区段长度为90bp(592-681)，如SEQ ID NO.10所示，具体序列为：

5‘-CCTCAGATAGGGCGTCTAGCTACTACACCTCTGCCTTGTCGTGAAAACCTCTTGGTGC AACCTGACCTGCGAGATCTACAAGTAGTTTGA-3’

BrASY2基因和BrCK3基因沉默植株获得方法同实施例3。获得沉默植株后，设计引物进行阳性鉴定。本部分所用实验材料为耐热材料CX1-7。

其中BrASY2基因的表达扩增引物为：

F:5’-GGCAGATGGGTTCAGATTCG-3’ SEQ ID NO.3

R:5’-AAGAGGCGTGCTCATACTCA-3’ SEQ ID NO.4

其他引物序列同实施例3。

分别将BrASY2和BrAK3基因沉默植株及其空白对照植株用37℃高温处理0h和6h，拍照记录处理前后植株表型变化，并收集菜心幼苗叶片，进行生理指标及相关基因表达分析。基因表达分析和生理指标测定方法同实例3。

基因检测结果如图6、图7、图17和图18所示。BrASY2基因和BrAK3基因在沉默菜心叶片中的表达量显著低于对照植株，说明BrASY2基因和BrAK3基因的沉默体系均构建成功。与对照植株相比，耐热标记基因BrHsfA2、BrHsp90和ROS清除酶基因BrMn-SOD的表达均受到抑制，表明BrASY2基因和BrAK3基因均可通过调控高温和ROS信号转导来影响菜心的耐热性。

表型观察和生理生化指标测定结果如图8、图9、图19和图20所示。高温胁迫下，与对照植株相比，BrASY2基因和BrAK3基因沉默植株的耐热性降低，表现为叶片颜色变浅，叶绿色含量降低，相对电导率和H₂O₂含量升高，SOD活性下降，耐热性较空白对照明显降低。以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.菜心耐热调控基因，其特征在于，为减数分裂相关基因BrASY2和天冬氨酸激酶基因BrAK3，所述减数分裂相关基因BrASY2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述天冬氨酸激酶基因BrAK3的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.如权利要求1所述的菜心耐热调控基因，其特征在于，所述减数分裂相关基因BrASY2编码的蛋白具有SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列，天冬氨酸激酶基因BrAK3编码的蛋白具有SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列。

3.如权利要求1或2所述的基因在调控菜心耐热性方面的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述基因通过调控耐热基因表达和ROS信号转导来影响菜心的耐热性。

5.一种耐热菜心过表达体系，其特征在于，含有权利要求1或2所述的菜心耐热调控基因减数分裂相关基因BrASY2或天冬氨酸激酶基因BrAK3。

6.如权利要求5所述的一种耐热菜心过表达体系的构建方法，其特征在于，

BrASY2基因过表达体系的构建方法为：

将减数分裂相关基因BrASY2全长CDS序列构建到pYES2-NTB载体，得到过表达载体pYES2-NTB-BrASY2；将过表达载体pYES2-NTB-BrASY2转入酵母INVSC1中，获得BrASY2基因过表达酵母菌。

BrAK3基因过表达体系的构建方法为：

使用同源重组方法，将天冬氨酸激酶基因BrAK3的CDS全长序列构建到pEarleyGate101载体，从而得到BrAK3基因过表达载体pEarleyGate 101-BrAK3；将pEarleyGate 101-BrAK3过表达载体转到农杆菌GV3101，获得BrAK3基因过表达植株。

7.一种耐热菜心沉默体系的构建方法，其特征在于，使用同源重组方法，分别将BrASY2基因的CDS非保守区段255bp长度的片段及其互补片段和BrAK3基因的CDS非保守区段90bp长度的片段其互补片段构建到pK7GWIWG2(I)载体，从而得到BrASY2基因沉默载体pK7GWIWG2(I)BrASY2和BrAK3基因沉默载体pK7GWIWG2(I)BrAK3；分别将pK7GWIWG2(I)-BrAK3和pK7GWIWG2(I)-BrASY2沉默载体转到农杆菌GV3101，获得BrAK3基因沉默植株和BrASY2基因沉默植株。

8.如权利要求7所述的一种耐热菜心沉默体系的构建方法，其特征在于，BrASY2基因的CDS非保守区段255bp长度片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，BrAK3基因的CDS非保守区段90bp长度片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。