CN114774462A

CN114774462A - 一种大豆双组分系统响应调节器基因GmRR1的应用

Info

Publication number: CN114774462A
Application number: CN202210428736.3A
Authority: CN
Inventors: 喻德跃; 杨宇明; 王莉; 程浩; 王晴
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2022-04-22
Filing date: 2022-04-22
Publication date: 2022-07-22
Anticipated expiration: 2042-04-22
Also published as: CN114774462B

Abstract

本发明提供了一种大豆双组分系统响应调节器基因GmRR1的应用，属于植物基因工程技术领域。本发明通过PCR克隆大豆GmRR1基因，通过转基因和基因编辑技术获得GmRR1超量表达和GmRR1敲除转基因植株，GmRR1超量表达的转基因大豆的磷吸收利用效率、生物量及产量均显著下降，基因敲除大豆植株的磷吸收利用效率、生物量及产量显著提高。本发明所述大豆响应调节器基因GmRR1可作为目的基因导入植物，调节转基因植物体内磷代谢平衡能力，对培育磷高效大豆新品种有重要意义。

Description

一种大豆双组分系统响应调节器基因GmRR1的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，尤其涉及一种大豆双组分系统响应调节器基因GmRR1的应用。

背景技术

大豆是世界上重要的粮食和油料作物之一，是人类获得优质蛋白和植物油及畜牧业饲料蛋白的主要来源。大豆属于喜磷作物，当土壤中的有效磷含量不能满足其需求时，大豆将表现出植株生长缓慢、植株矮小、叶片变小、易脱荚和不实籽粒变多等症状，最终降低产量(郭再华等，2005；王树起等,2010；李喜焕等，2011；Fredeen et al.,1990)。目前，土壤缺磷已成为限制我国大豆产量的重要因素(刘海旭等，2017)。所以为解决我国大豆需磷量高和土壤中有效磷低的矛盾，利用遗传学和分子生物学技术鉴定新的耐低磷关键基因的功能并开展磷高效分子育种，是大豆磷营养和产量研究的重要课题，对实现农业的可持续发展具有重要意义。

双组分系统(Two-component systems，TCSs)在调节包括响应环境胁迫在内的多种生物过程方面发挥重要作用，由组氨酸激酶(His-kinases)和反应调节器(responseregulator，RR)组成，其中B型RR在细胞分裂素信号传导中发挥重要作用(Hwang et al.,2012；Kieber et al.,2014)。在拟南芥中，B型ARR1作为转录因子响应细胞分裂素信号并通过激活SHY2来调节根分生组织区大小(Ioio et al.,2008)。ARR1、ARR10和ARR12(arr1arr10 arr12突变体)的缺失导致拟南芥叶片面积减小并对细胞分裂素不敏感，主根长度也显著短于野生型(Zubo et al.,2017)。另外，缺乏B型ARR可以增强植物对铝胁迫和盐胁迫等非生物胁迫的抗性(Mason et al.,2010；Yang et al.,2017)。大豆中B型响应调节器基因GmRR1的研究迄今尚未见报道。

发明内容

鉴于此，本发明的目的是针对土壤有效磷含量低限制大豆产量提高的现状，提供基因GmRR1响应低磷胁迫和调节大豆体内磷稳态的应用，用于增强大豆对磷的吸收利用，从而实现磷高效育种和产量的提高。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

大豆响应调节器基因GmRR1在调节大豆磷吸收利用效率和/或产量中的应用，所述大豆响应调节器基因GmRR1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

作为本发明的一种优选，在大豆中过表达所述的基因GmRR1以降低大豆磷吸收利用效率和产量，或者在大豆中敲除所述的基因GmRR1以提高大豆磷吸收利用效率和产量。

一种调节大豆磷吸收利用效率和产量的方法，将大豆响应调节器基因GmRR1在大豆植物中过量表达或敲除，所述大豆响应调节器基因GmRR1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

作为本发明的一种优选，将过表达大豆响应调节器基因GmRR1的载体或敲除该基因的基因编辑系统导入目的植物，所述大豆响应调节器基因GmRR1的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

作为本发明的一种优选，所述基因编辑系统为通过Cas9基因编辑技术对GmRR1进行编辑的系统。

作为本发明的进一步优选，所述基因编辑系统的gRNA如SEQ ID NO.5所示。

所述GmRR1敲除转基因后代的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和/或SEQ ID NO.4所示。

一种敲除大豆响应调节器基因GmRR1的重组载体、细胞在提高大豆磷吸收利用效率和产量中的应用，所述大豆响应调节器基因GmRR1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

一种敲除大豆响应调节器基因GmRR1的重组载体、细胞在培育高磷吸收利用率和高产大豆品种中的应用，所述大豆响应调节器基因GmRR1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明所述的敲除基因指通过基因编辑的方式降低或沉默该基因的表达。

本发明有益效果：

本发明发现将大豆中GmRR1基因过量表达或敲除，可显著改变转基因植株的根系构型，调节磷吸收利用效率、生物量和产量。其中通过基因编辑技术和大豆遗传转化技术获得敲除GmRR1的转基因大豆材料，其磷利用效率、生物量和产量均显著高于对照，该材料在大豆磷高效和高产育种中具有良好的应用前景。

附图说明

图1为GmRR1基因的过表达载体图，其中载体用Bar基因作为转基因筛选标记，PBA-GmRR1载体用35S启动子后接全长GmRR1CDS，用于转基因后可获得过量表达GmRR1的转基因植株；

图2为GmRR1基因的敲除载体图，其中载体用Bar基因作为转基因筛选标记，用GmUbi6启动子后接Cas9的靶标序列和Cas9基因，用于转基因可以获得敲除GmRR1的转基因植株。

图3为阳性转基因大豆植株的检测结果。注：A和B分别为转基因大豆中Bar和GmRR1基因的PCR验证，A中M为2000bp Marker，B中M为5000bp Marker，W为野生型对照，C为质粒阳性对照，1-9代表独立转基因株系1-9号样品。

图4为GmRR1基因编辑类型。WT为野生型的靶标序列；KO-1，KO-2，KO-3代表三个不同的被编辑的转基因株系的序列。

图5为GmRR1转基因后代(T₄)表型鉴定。NP和LP分别代表正常磷水平和低磷水平；WT代表野生型对照；OE-1、OE-2和OE-3代表超表达转基因株系；KO-1、KO-2和KO-3代表不同的GmRR1敲除转基因株系。

图6为GmRR1转基因后代(T₄)根系构型。NP和LP分别代表正常磷水平和低磷水平；WT代表野生型；OE-1、OE-2和OE-3代表不同的GmRR1超表达转基因株系；KO-1、KO-2和KO-3代表不同的GmRR1敲除转基因株系。

图7为GmRR1转基因后代(T₄)磷吸收效率和产量性状。NP和LP分别代表正常磷水平和低磷水平；WT代表野生型；OE-1、OE-2和OE-3代表不同的GmRR1超表达转基因株系；KO-1、KO-2和KO-3代表不同的GmRR1敲除转基因株系。

具体实施方式

本发明提供了一种大豆响应调节器基因GmRR1在调节大豆磷吸收利用效率中的应用。优选的，所述大豆响应调节器基因GmRR1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，大豆响应调节器基因GmRR1编码的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明中，将大豆响应调节器基因GmRR1应用于调节大豆磷吸收利用效率时，包括将携带有本发明GmRR1的植物表达载体转化植物细胞或组织步骤，本发明对于转化的方法没有特殊限定，优选的为通过生物转化法转化植物细胞或组织。本发明对于生物转化法没有特殊限定，如可采用直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织。本发明对于植物表达载体的种类没有特殊限定，可利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，如Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体等。在本发明具体实施例中，将所述GmRR1基因在大豆植物中过量表达时，优选的为将所述响应调节器基因GmRR1通过重组质粒导入目的植物，所述重组质粒优选为含有大豆响应调节器基因GmRR1的植物过表达载体，所述植物过表达载体优选的为PBA-GmRR1。

使用本发明的GmRR1基因构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型的启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如可加入植物中表达的选择性标记基因(GUS基因、萤光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)。从转基因植物的安全性考虑，也可不加入任何选择性标记基因，直接以表型筛选转化植株。

在本发明具体实施例中，将所述GmRR1基因在大豆中敲除时，对于敲除的具体方式没有特殊限定，优选的为通过基因编辑技术使GmRR1基因在大豆中被敲除，更优选的为通过Cas9基因编辑技术对GmRR1进行编辑，获得GmRR1基因敲除转基因后代，所述GmRR1基因敲除转基因后代的核苷酸序列优选的如SEQ ID NO.3和/或SEQ ID NO.4所示。

本发明还提供了一种含有大豆响应调节器基因GmRR1的重组载体、细胞在提高大豆磷吸收利用效率中的应用。本发明对于重组载体、细胞的类型没有特殊限定，采用本领域常规重组载体、细胞均可，本发明所述含有大豆响应调节器基因GmRR1的重组载体可转化宿主，被转化的宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物。

本发明还提供了一种大豆响应调节器基因GmRR1及其重组载体和细胞在大豆育种及栽培中的应用。

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用到的引物，均在首次出现时标明，其后所用相同引物，均以首次标明的内容相同。下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。

实施例1

大豆GmRR1基因的克隆和植物表达载体的构建

(1)设计引物，提取RNA，反转录cDNA：

用植物总RNA提取试剂盒(DP432，天根)提取大豆Jack的叶片总RNA，经1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。

cDNA的合成参照TaKaRa Primer Script TMRT reagent kit with gDNA Eraser试剂盒说明操作。

(2)PCR扩增：

步骤一：按照以下组份顺序配制PCR反应液(50μl体系)：25μl2×Planta MaxBuffer，引物GmRR1-F和GmRR1-R各2μl，1μl dNTP Mix，2μl叶片cDNA模板，1μl Super-Fidelity DNA Polymerase，17μlddH₂O补充体积到50μl；

设计引物为：

GmRR1-F：

5’-GGATCTTCCAGAGATATGTGAAGTTGTTGTGTGT-3’

GmRR1-R：

5’-CTGCCGTTCGACGATCTAAACTGGAATGTTGTCTA-3’

步骤二：反应在BIO-RAD PTC-200型PCR仪上进行，设定反应程序为：95℃预变性3min；再95℃15sec，58℃15sec，72℃2min 10sec，共35个循环；然后72℃彻底延伸5min；4℃保存；

步骤三：PCR产物回收后经连接pUC19-T载体(诺唯赞)、转化大肠杆菌TOP10、氨苄青霉素(Amp)筛选、摇菌、测序，序列如SEQ ID NO.1所示。

(3)植物过表达载体的构建

设计同源重组接头引物，以上述(2)获得的含GmRR1基因的T载体质粒为模板，扩增出带重组接头的GmRR1全长片段，通过同源重组技术将GmRR1基因正向导入到大豆表达载体pBA002中，构建成重组植物过表达载体PBA-GmRR1，如图1所示，其中载体用Bar基因作为转基因筛选标记，PBA-GmRR1载体用35S启动子后接全长GmRR1 CDS，用于转基因后可获得过表达GmRR1的转基因植株。

PBA-GmRR1过表达载体上还含有标记基因Bar，该基因是从链霉菌分离出的编码PPT乙酰基转化酶(phosphinothricin acetyl-transferase)的基因，具有对除草剂草铵膦的抗性，可用于转基因植株的阳性鉴定，是应用安全的标记基因之一。

同源重组所用的引物序列为：

上游引物：

5’-GGGCCCAGGCCTACGCGT ATGAATCTCAGCCACGGCAA-3’

下游引物：

5’-TCGGGGAAATTCGAGCTC CTAAACTGGAATGTTGTCTA-3’。

(4)植物敲除表达载体的构建

参考大豆基因组数据库中(https://www.soybase.org)大豆参考基因组中GmRR1基因信息，利用在线网站(http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/)设计该基因的目标靶点。靶点设计原则如下：1)敲除位点处于编码(CDS)区且尽量在蛋白前端或重要功能domain区；2)尽量涵盖更高比例的转录本；3)没有脱靶或脱靶位于基因间区；4)优选编辑效率较高的靶点；5)序列有较为平衡的GC含量且不易形成二级结构。靶标序列如下：

SEQ ID NO.5gRNA：GAAGGAGATCGGCCTCCAAA；

按照CRISPR/Cas9敲除载体构建说明，将gRNA插入到基因编辑载体中构建出含有GmRR1靶标序列的CRISPR/Cas9载体，如图2所示，其中载体用Bar基因作为转基因筛选标记，用GmUbi6启动子后接Cas9的靶标序列和Cas9基因，用于转基因后可以获得敲除GmRR1的转基因植株。

实施例2

GmRR1基因过表达和敲除转基因大豆的培育

(1)种子的消毒与萌发

采用氯气干法对大豆种子的表面进行消毒灭菌。挑选成熟饱满、无病斑、无硬实的干净种子，单层排列在90×15mm的培养皿中。将培养皿开盖放入干燥器中，干燥器内放置一个500ml的玻璃烧杯，用100ml量筒量取75ml的商用漂白水加入烧杯中，10ml量筒量取3ml12M HCl，沿着杯壁缓缓加入。盖上干燥器的盖子，保证器皿密封，静置过夜，10～16h，灭菌完成后，将培养皿加盖转移到无菌超净台上，打开培养皿的盖子，强风吹25～40min除去残留氯气。将消毒后的种子种脐朝下播种在萌发培养基(GM)上，将培养皿叠放，用保鲜膜包好，放在生物培养箱中24℃，黑暗培养16～24h。

(2)农杆菌的准备

利用电击转化法将过表达载体pBA-GmRR1质粒和敲除载体质粒转入根癌农杆菌菌株EHA105中，贮藏于60％甘油中。进行遗传转化前两天，吸取50μl含载体的农杆菌至5ml添加了抗生素(1/1000)的YEB液体培养基中，28℃，220rpm，振荡培养24～36h。吸取0.2～1ml饱和菌液至添加了抗生素(1/2000)的250ml YEB液体培养基中扩大培养，至OD₆₀₀＝0.85～0.9。将菌液分装到两个50ml无菌离心管中，离心(4000rpm，10min，25℃)，收集菌落，用25～50ml液体共培养基(LCCM)轻轻吹打，重悬沉淀后备用。

(3)外植体的准备与共培养

将吸胀的大豆种子置于无菌吸水纸上，沿着种脐用手术刀纵向切割种子，将子叶和下胚轴均匀分开两瓣，去除种皮后备用。将农杆菌重悬液倒入洁净的无菌培养罐中，放入50个外植体，室温侵染20～30min，期间经常搅动菌液，使外植体充分接触新鲜菌液。侵染结束后，将外植体取出，用无菌吸水纸吸干后置于放有无菌滤纸的共培养基(CCM)上，每皿7～10个外植体，近轴面朝上，水平放置，以上操作均在超净工作台中进行。将培养皿叠放，用保鲜膜封好后放在Percival培养箱中，23℃，黑暗共培养3～5天。

(4)筛选与再生

共培养3～5天后，切去伸长的下胚轴留取约0.5cm，30～45°斜角插在加有筛选剂的芽诱导(SIM)培养基上。用3M透气胶带封口并转移到培养室(24℃，18/6h光周期，光照强度140μmoles/m²/sec)，培养4周，每两周更换一次新鲜的SIM培养基。丛生芽诱导筛选4周后，切除残余子叶，并转移到芽伸长(SEM)培养基上，培养条件同丛生芽诱导过程，培养2～8周，每2周更换一次新鲜的SEM培养基。将伸长3～4厘米的幼芽切下，在吲哚丁酸(IBA)中蘸30sec～1min后插入生根培养基(RM)中。1～2周后待根长约2～3厘米时，将生根苗从培养基中取出，洗净根部残留的培养基，转入土中移至温室培养。培养条件为24℃，18/6h光周期，光照强度为140μmoles/m²/sec。

实施例3

转基因材料验证

由于过表达转基因所用载体中有编码PPT乙酰基转化酶基因Bar，该酶可以阻断草铵膦对生物合成途径的干扰，从而不被草铵膦杀灭。待再生植株长出第三片新叶后，用剪刀剪取上中下三层叶片并将其混合，按照上海普迪生物科技有限公司植物总DNA提取试剂盒的说明书进行DNA的提取。然后以DNA样品为模板，利用2×Rapid Taq Master Mix(诺唯赞)试剂盒说明书进行PCR扩增，包括对目的基因GmRR1和筛选基因Bar在DNA水平上的鉴定。

目的基因GmRR1的特异性片段扩增引物如：

上游引物：5’-GGGCCCAGGCCTACGCGTATGAATCTCAGCCACGGCAA-3’

下游引物：5’-TCGGGGAAATTCGAGCTCCTAAACTGGAATGTTGTCTA-3’

Bar基因的特异性片段扩增引物如：

上游引物：5’-CGAGACAAGCACGGTCAACTT-3’

下游引物：5’-AAACCCACGTCATGCCAGTTC-3’

最终获得9个T₀代独立转基因株系。将收获的转基因材料T₁代种子种植于含有混合营养土(营养土:蛭石＝2:1)的花盆中，放置于温室培养，培养条件为24℃，18/6h光周期，光照强度为140μmoles/m²/sec。等到V2期时(长出两个三出复叶时)，取半个叶片液氮速冻后提取DNA，利用PCR扩增Bar基因片段进一步筛选阳性材料。根据图3A显示，转基因材料能够检测到Bar基因。

敲除转基因所用载体中也含有Bar标记基因，利用PCR检测标记Bar基因进一步筛选阳性材料。鉴定方法同过表达阳性植株检测。

编辑类型的检测以上述沉默植株的DNA为模板进行PCR扩增，对PCR产物测序，所用引物对为：

上游引物：5’-AGGTTGCATTGTCGCTTCTG-3’

下游引物：5’-AACATTTTTGTTTTGCAAGGAGGT-3’

靶序列附近的序列变化如图4所示，其中KO-1所代表的被编辑的转基因株系所对应的GmRR1敲除转基因后代的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，其中KO-2和KO-3所代表的被编辑的转基因株系所对应的GmRR1敲除转基因后代的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

实施例4

大豆耐低磷相关表型鉴定测定(根系构型，生物量，磷含量，磷效率，产量)

根构型的鉴定

步骤一：采用水培的方法，将T₃代转基因种子和野生型种子种于蛭石中，萌发五天后分别移入1/2Hoagland营养液中，低磷处理组磷浓度为5μmol/L，对照组磷浓度为500μmol/L，低磷处理组缺少的钾用等量的氯化钾补充，其他营养元素不变。

步骤二：水培处理中每三天换一次营养液，处理10天后，如图5所示：过表达转基因株系与其野生型相比在低磷胁迫条件下表现出更好的长势；敲除转基因株系与野生型相比在低磷胁迫条件下生长情况明显变差。

步骤三：处理10天后，取样用根系扫描仪进行根系构型分析。分析结果如图6所示：与野生型相比不管是在正常磷还是在低磷条件下，过表达转基因株系的总根长、根表面积、根尖数和根体积都显著降低；相反，敲除转基因株系的总根长、根表面积、根尖数和根体积都显著增加。

磷含量和磷吸收效率的测定

将根系构型分析后的样品(包括Root和Shoot)装入牛皮纸袋中放入烘箱，105℃杀青1h，然后60℃烘干后测定生物量用作磷吸收效率的计算。

步骤一：称取烘干、磨细的植物样品(过0.25-0.5mm筛)约0.1g，置于消煮管中(勿将样品粘附在瓶颈上)滴入少量水湿润样品，加浓硫酸5mL，摇匀(最好放置过夜)

步骤二：在电炉上先缓缓加热，待浓硫酸分解冒大量白烟时再升高温度。

步骤三：消煮至溶液呈均匀的棕黑色时，取下消煮管，稍冷后提起弯颈漏斗，滴加300g/L H₂O₂ 10滴，并不断摇动消煮管。

步骤四：再加热(微沸)约5min，取下，稍冷后重复滴加30％H₂O₂5～10滴，再消煮。

步骤五：消煮至溶液呈无色或清亮后，再加热5～10min(以去除剩余的H₂O₂)，取下消煮管冷却，用少量水冲洗漏斗，洗液流入消煮管中。

步骤六：将消煮液无损地移入100ml容量瓶中，用水定容并摇匀。

步骤七：取5ml消解液用AA3连续流动分析仪进行磷浓度的测定。

步骤八：根据公式：磷吸收效率＝磷浓度/样品质量×生物量(root)+磷浓度/样品质量×生物量(shoot)，计算磷吸收效率。结果如图7所示：与野生型相比不管是在正常磷还是在低磷条件下过表达转基因株系的磷吸收效率都显著下降；敲除转基因株系磷吸收效率显著提高。

产量的测定

待成熟后单株收获，晒干后脱粒，用万分之一天平称量籽粒重量作为单株产量。结果如图7所示：与野生型对照相比，在正常供磷条件下，过表达转基因株系的单株产量显著降低降低，而敲除转基因株系单株产量显著提高；在低磷条件下，与野生型对照相比，过表达转基因株系的单株产量显著降低，而敲除转基因株系单株产量显著提高。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一种大豆双组分系统响应调节器基因GmRR1的应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2022

<212> DNA

<213> 大豆(Glycine max (Linn.) Merr)

<400> 1

atgaatctca gccacggcaa gggatccact tcgagttctc ctctgaaagc cggagacacc 60

gtctccgacc agttcccggc gggtctccgg gtactggttg tggatgatga ccccacttgc 120

cttatgatcc ttgagaggat gctgcgtgct tgtctctatg aagtgacgaa atgcaagcga 180

gcggaggttg cattgtcgct tctgagagag aacaaaaatg ggtttgatat cgttttaagt 240

gatgtgcata tgccagatat ggatggattt aagcttttgg agcatattgg gttggagatg 300

gaccttccag ttattatgat gtcagctgat gatggaaaac aagttgtgat gaaaggggtg 360

acacatggtg cctgtgatta cctgattaaa cctgttcgga ttgaggcttt gaagaatata 420

tggcagcatg tggttcggat gagaaagaat ggtttgagag atgtggagca atctggtagc 480

atggaagaag gagatcggcc tccaaaggga tcagatgacg gaaattactc gtcttcggtg 540

aatgaagcca aaagctcaaa gaagaggagg gatgaggacg aggaaggaga tgagagggat 600

gattcctcca cgttgaagaa gccgcgagtt gtttggtctg ttgagcttca tcaacagttt 660

atggctgttg tgaatcaact tggaattgat aaggctgttc ctaaaaagat tttggaattg 720

atgaatgttc ctgggcttac tagagaaaat gttgctagcc atcttcagaa ataccgtttg 780

tatcttagaa ggctgagtgg agtttcacag cagcagggta acttgagcaa ctccttcatg 840

agctcacaag aagcaacatt tgggggaacc tcaatcaatg gaattgatct tcaaaccctt 900

tcagctgctg gccagttccc atcacaaagt ctagccaagt ttcaagctgc tggacttggc 960

aggacaactg ccaaagcagg tatgcctatg tctctatccg atcaaaagaa ccttttcagt 1020

tttgagaacc caagattaag atttggagaa gggtcactac aacatttaag caacagtaag 1080

ccaataaact tgcttcatgg aattcttacc aacatggagc caaagcaact tgccaatttg 1140

caccaatcta cccaacccct tggtagcttg aatatgcgag tcaattctcc tgccacgcag 1200

aacaaaccct tgctgatgca gatgactcag tctcaaccaa gaggtcagtt gctaagtgaa 1260

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ggtatttcta gtggtgtttt gggaaatgca attgctggaa ccagcaacat aactactact 1380

tataaccctg ttcaacaaaa ctcttcattg ttgagttttc ccatgaacca aaccaatgaa 1440

atgtctgcca gtaatttcca tcttagaagc actccaggta taactagtat cccaaataaa 1500

ggtatgtttc atgaagaagg tacctctggt gttaaaggat ctggtggatt tgttcaaggt 1560

tatgacatgt ttaatgacct tcaccatcag aagtcccatg attgggactt aacaaacaca 1620

ggcatgacat atgatgcttc tcagcatgca aatcctttac aaggtaacat tgatgtctca 1680

ccatcagttt tggttcatca gagttttccc tctatgcaac agactgtaca aaatagagat 1740

actacttcaa ttggaaaagc tatgttctcc acaggtgaag gcatgcatca gagtagtctc 1800

caaaatattg gtcaacacca caataacctt cttcttgaca attcagtaag ggttaaggct 1860

gaaagaattc ctgatcctag ctgtcagatt aataacctct tctctgacca atatggtcag 1920

gaggatcttg tcagtgcatt tctgaaacag caagaaggcg ttggaacagc tgaaaatgag 1980

tttgactttg atggatattc cttagacaac attccagttt ag 2022

<210> 2

<211> 673

<212> PRT

<213> 大豆(Glycine max (Linn.) Merr)

<400> 2

Met Asn Leu Ser His Gly Lys Gly Ser Thr Ser Ser Ser Pro Leu Lys

1 5 10 15

Ala Gly Asp Thr Val Ser Asp Gln Phe Pro Ala Gly Leu Arg Val Leu

20 25 30

Val Val Asp Asp Asp Pro Thr Cys Leu Met Ile Leu Glu Arg Met Leu

35 40 45

Arg Ala Cys Leu Tyr Glu Val Thr Lys Cys Lys Arg Ala Glu Val Ala

50 55 60

Leu Ser Leu Leu Arg Glu Asn Lys Asn Gly Phe Asp Ile Val Leu Ser

65 70 75 80

Asp Val His Met Pro Asp Met Asp Gly Phe Lys Leu Leu Glu His Ile

85 90 95

Gly Leu Glu Met Asp Leu Pro Val Ile Met Met Ser Ala Asp Asp Gly

100 105 110

Lys Gln Val Val Met Lys Gly Val Thr His Gly Ala Cys Asp Tyr Leu

115 120 125

Ile Lys Pro Val Arg Ile Glu Ala Leu Lys Asn Ile Trp Gln His Val

130 135 140

Val Arg Met Arg Lys Asn Gly Leu Arg Asp Val Glu Gln Ser Gly Ser

145 150 155 160

Met Glu Glu Gly Asp Arg Pro Pro Lys Gly Ser Asp Asp Gly Asn Tyr

165 170 175

Ser Ser Ser Val Asn Glu Ala Lys Ser Ser Lys Lys Arg Arg Asp Glu

180 185 190

Asp Glu Glu Gly Asp Glu Arg Asp Asp Ser Ser Thr Leu Lys Lys Pro

195 200 205

Arg Val Val Trp Ser Val Glu Leu His Gln Gln Phe Met Ala Val Val

210 215 220

Asn Gln Leu Gly Ile Asp Lys Ala Val Pro Lys Lys Ile Leu Glu Leu

225 230 235 240

Met Asn Val Pro Gly Leu Thr Arg Glu Asn Val Ala Ser His Leu Gln

245 250 255

Lys Tyr Arg Leu Tyr Leu Arg Arg Leu Ser Gly Val Ser Gln Gln Gln

260 265 270

Gly Asn Leu Ser Asn Ser Phe Met Ser Ser Gln Glu Ala Thr Phe Gly

275 280 285

Gly Thr Ser Ile Asn Gly Ile Asp Leu Gln Thr Leu Ser Ala Ala Gly

290 295 300

Gln Phe Pro Ser Gln Ser Leu Ala Lys Phe Gln Ala Ala Gly Leu Gly

305 310 315 320

Arg Thr Thr Ala Lys Ala Gly Met Pro Met Ser Leu Ser Asp Gln Lys

325 330 335

Asn Leu Phe Ser Phe Glu Asn Pro Arg Leu Arg Phe Gly Glu Gly Ser

340 345 350

Leu Gln His Leu Ser Asn Ser Lys Pro Ile Asn Leu Leu His Gly Ile

355 360 365

Leu Thr Asn Met Glu Pro Lys Gln Leu Ala Asn Leu His Gln Ser Thr

370 375 380

Gln Pro Leu Gly Ser Leu Asn Met Arg Val Asn Ser Pro Ala Thr Gln

385 390 395 400

Asn Lys Pro Leu Leu Met Gln Met Thr Gln Ser Gln Pro Arg Gly Gln

405 410 415

Leu Leu Ser Glu Asn Ala Ser Ser His Val Thr Arg Tyr Pro Ser Ser

420 425 430

Leu Val Gln Pro Thr Val Pro Asn Gly Ile Ser Ser Gly Val Leu Gly

435 440 445

Asn Ala Ile Ala Gly Thr Ser Asn Ile Thr Thr Thr Tyr Asn Pro Val

450 455 460

Gln Gln Asn Ser Ser Leu Leu Ser Phe Pro Met Asn Gln Thr Asn Glu

465 470 475 480

Met Ser Ala Ser Asn Phe His Leu Arg Ser Thr Pro Gly Ile Thr Ser

485 490 495

Ile Pro Asn Lys Gly Met Phe His Glu Glu Gly Thr Ser Gly Val Lys

500 505 510

Gly Ser Gly Gly Phe Val Gln Gly Tyr Asp Met Phe Asn Asp Leu His

515 520 525

His Gln Lys Ser His Asp Trp Asp Leu Thr Asn Thr Gly Met Thr Tyr

530 535 540

Asp Ala Ser Gln His Ala Asn Pro Leu Gln Gly Asn Ile Asp Val Ser

545 550 555 560

Pro Ser Val Leu Val His Gln Ser Phe Pro Ser Met Gln Gln Thr Val

565 570 575

Gln Asn Arg Asp Thr Thr Ser Ile Gly Lys Ala Met Phe Ser Thr Gly

580 585 590

Glu Gly Met His Gln Ser Ser Leu Gln Asn Ile Gly Gln His His Asn

595 600 605

Asn Leu Leu Leu Asp Asn Ser Val Arg Val Lys Ala Glu Arg Ile Pro

610 615 620

Asp Pro Ser Cys Gln Ile Asn Asn Leu Phe Ser Asp Gln Tyr Gly Gln

625 630 635 640

Glu Asp Leu Val Ser Ala Phe Leu Lys Gln Gln Glu Gly Val Gly Thr

645 650 655

Ala Glu Asn Glu Phe Asp Phe Asp Gly Tyr Ser Leu Asp Asn Ile Pro

660 665 670

Val

<210> 3

<211> 2021

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgaatctca gccacggcaa gggatccact tcgagttctc ctctgaaagc cggagacacc 60

gtctccgacc agttcccggc gggtctccgg gtactggttg tggatgatga ccccacttgc 120

cttatgatcc ttgagaggat gctgcgtgct tgtctctatg aagtgacgaa atgcaagcga 180

gcggaggttg cattgtcgct tctgagagag aacaaaaatg ggtttgatat cgttttaagt 240

gatgtgcata tgccagatat ggatggattt aagcttttgg agcatattgg gttggagatg 300

gaccttccag ttattatgat gtcagctgat gatggaaaac aagttgtgat gaaaggggtg 360

acacatggtg cctgtgatta cctgattaaa cctgttcgga ttgaggcttt gaagaatata 420

tggcagcatg tggttcggat gagaaagaat ggtttgagag atgtggagca atctggtagc 480

atggaagaag gagatcggcc tccaagggat cagatgacgg aaattactcg tcttcggtga 540

atgaagccaa aagctcaaag aagaggaggg atgaggacga ggaaggagat gagagggatg 600

attcctccac gttgaagaag ccgcgagttg tttggtctgt tgagcttcat caacagttta 660

tggctgttgt gaatcaactt ggaattgata aggctgttcc taaaaagatt ttggaattga 720

tgaatgttcc tgggcttact agagaaaatg ttgctagcca tcttcagaaa taccgtttgt 780

atcttagaag gctgagtgga gtttcacagc agcagggtaa cttgagcaac tccttcatga 840

gctcacaaga agcaacattt gggggaacct caatcaatgg aattgatctt caaacccttt 900

cagctgctgg ccagttccca tcacaaagtc tagccaagtt tcaagctgct ggacttggca 960

ggacaactgc caaagcaggt atgcctatgt ctctatccga tcaaaagaac cttttcagtt 1020

ttgagaaccc aagattaaga tttggagaag ggtcactaca acatttaagc aacagtaagc 1080

caataaactt gcttcatgga attcttacca acatggagcc aaagcaactt gccaatttgc 1140

accaatctac ccaacccctt ggtagcttga atatgcgagt caattctcct gccacgcaga 1200

acaaaccctt gctgatgcag atgactcagt ctcaaccaag aggtcagttg ctaagtgaaa 1260

atgccagttc tcatgtaacc aggtatccgt catctttggt gcagcctaca gtaccaaatg 1320

gtatttctag tggtgttttg ggaaatgcaa ttgctggaac cagcaacata actactactt 1380

ataaccctgt tcaacaaaac tcttcattgt tgagttttcc catgaaccaa accaatgaaa 1440

tgtctgccag taatttccat cttagaagca ctccaggtat aactagtatc ccaaataaag 1500

gtatgtttca tgaagaaggt acctctggtg ttaaaggatc tggtggattt gttcaaggtt 1560

atgacatgtt taatgacctt caccatcaga agtcccatga ttgggactta acaaacacag 1620

gcatgacata tgatgcttct cagcatgcaa atcctttaca aggtaacatt gatgtctcac 1680

catcagtttt ggttcatcag agttttccct ctatgcaaca gactgtacaa aatagagata 1740

ctacttcaat tggaaaagct atgttctcca caggtgaagg catgcatcag agtagtctcc 1800

aaaatattgg tcaacaccac aataaccttc ttcttgacaa ttcagtaagg gttaaggctg 1860

aaagaattcc tgatcctagc tgtcagatta ataacctctt ctctgaccaa tatggtcagg 1920

aggatcttgt cagtgcattt ctgaaacagc aagaaggcgt tggaacagct gaaaatgagt 1980

ttgactttga tggatattcc ttagacaaca ttccagttta g 2021

<210> 4

<211> 2018

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgaatctca gccacggcaa gggatccact tcgagttctc ctctgaaagc cggagacacc 60

gtctccgacc agttcccggc gggtctccgg gtactggttg tggatgatga ccccacttgc 120

cttatgatcc ttgagaggat gctgcgtgct tgtctctatg aagtgacgaa atgcaagcga 180

gcggaggttg cattgtcgct tctgagagag aacaaaaatg ggtttgatat cgttttaagt 240

gatgtgcata tgccagatat ggatggattt aagcttttgg agcatattgg gttggagatg 300

gaccttccag ttattatgat gtcagctgat gatggaaaac aagttgtgat gaaaggggtg 360

acacatggtg cctgtgatta cctgattaaa cctgttcgga ttgaggcttt gaagaatata 420

tggcagcatg tggttcggat gagaaagaat ggtttgagag atgtggagca atctggtagc 480

atggaagaag gagatcggca aagggatcag atgacggaaa ttactcgtct tcggtgaatg 540

aagccaaaag ctcaaagaag aggagggatg aggacgagga aggagatgag agggatgatt 600

cctccacgtt gaagaagccg cgagttgttt ggtctgttga gcttcatcaa cagtttatgg 660

ctgttgtgaa tcaacttgga attgataagg ctgttcctaa aaagattttg gaattgatga 720

atgttcctgg gcttactaga gaaaatgttg ctagccatct tcagaaatac cgtttgtatc 780

ttagaaggct gagtggagtt tcacagcagc agggtaactt gagcaactcc ttcatgagct 840

cacaagaagc aacatttggg ggaacctcaa tcaatggaat tgatcttcaa accctttcag 900

ctgctggcca gttcccatca caaagtctag ccaagtttca agctgctgga cttggcagga 960

caactgccaa agcaggtatg cctatgtctc tatccgatca aaagaacctt ttcagttttg 1020

agaacccaag attaagattt ggagaagggt cactacaaca tttaagcaac agtaagccaa 1080

taaacttgct tcatggaatt cttaccaaca tggagccaaa gcaacttgcc aatttgcacc 1140

aatctaccca accccttggt agcttgaata tgcgagtcaa ttctcctgcc acgcagaaca 1200

aacccttgct gatgcagatg actcagtctc aaccaagagg tcagttgcta agtgaaaatg 1260

ccagttctca tgtaaccagg tatccgtcat ctttggtgca gcctacagta ccaaatggta 1320

tttctagtgg tgttttggga aatgcaattg ctggaaccag caacataact actacttata 1380

accctgttca acaaaactct tcattgttga gttttcccat gaaccaaacc aatgaaatgt 1440

ctgccagtaa tttccatctt agaagcactc caggtataac tagtatccca aataaaggta 1500

tgtttcatga agaaggtacc tctggtgtta aaggatctgg tggatttgtt caaggttatg 1560

acatgtttaa tgaccttcac catcagaagt cccatgattg ggacttaaca aacacaggca 1620

tgacatatga tgcttctcag catgcaaatc ctttacaagg taacattgat gtctcaccat 1680

cagttttggt tcatcagagt tttccctcta tgcaacagac tgtacaaaat agagatacta 1740

cttcaattgg aaaagctatg ttctccacag gtgaaggcat gcatcagagt agtctccaaa 1800

atattggtca acaccacaat aaccttcttc ttgacaattc agtaagggtt aaggctgaaa 1860

gaattcctga tcctagctgt cagattaata acctcttctc tgaccaatat ggtcaggagg 1920

atcttgtcag tgcatttctg aaacagcaag aaggcgttgg aacagctgaa aatgagtttg 1980

actttgatgg atattcctta gacaacattc cagtttag 2018

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gaaggagatc ggcctccaaa 20

Claims

1.大豆响应调节器基因GmRR1在调节大豆磷吸收利用效率和/或产量中的应用，所述大豆响应调节器基因GmRR1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于在大豆中过表达所述的基因GmRR1以降低大豆磷吸收利用效率和产量，或者在大豆中敲除所述的基因GmRR1以提高大豆磷吸收利用效率和产量。

3.一种调节大豆磷吸收利用效率和产量的方法，其特征在于，将大豆响应调节器基因GmRR1在大豆植物中过量表达或敲除，所述大豆响应调节器基因GmRR1的核苷酸序列如SEQID NO.1所示。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，将过表达大豆响应调节器基因GmRR1的载体或敲除该基因的基因编辑系统导入目的植物，所述大豆响应调节器基因GmRR1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述基因编辑系统为通过Cas9基因编辑技术对GmRR1进行编辑的系统。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述基因编辑系统的gRNA如SEQ ID NO.5所示。

7.一种敲除大豆响应调节器基因GmRR1的重组载体、细胞在提高大豆磷吸收利用效率和产量中的应用，所述大豆响应调节器基因GmRR1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

8.一种敲除大豆响应调节器基因GmRR1的重组载体、细胞在培育高磷吸收利用率和高产大豆品种中的应用，所述大豆响应调节器基因GmRR1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。