CN115786297A - 基于基因编辑技术的AhALS2突变型蛋白及其基因在花生育种中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基于基因编辑技术的AhALS2突变型蛋白，通过分别对花生Ah10ALS2基因序列第574位和Ah20ALS2基因序列第562位进行基因编辑，Ah10ALS2基因的核苷酸序列的第574位发生C→T突变，或第574‑575位发生CC→TT或CC→AA突变；或/和，Ah20ALS2基因的核苷酸序列的第562位发生C→T突变或第562‑563位发生CC→TT突变。导致Ah10ALS2第192位置上的氨基酸或/和Ah10ALS2第188位置上的氨基酸发生Pro197Ser、Pro197Phe或Pro197Asn，获得纯合编辑突变植株，即为抗苯磺隆类除草剂花生新种质。

Description

基于基因编辑技术的AhALS2突变型蛋白及其基因在花生育种 中的应用

技术领域

本发明涉及一种基于基因编辑技术的AhALS2突变型蛋白及其基因在花生育种中的应用，属于农作物遗传育种技术领域。

背景技术

花生广泛种植于热带和亚热带地区的100多个国家，是重要的油料作物和经济作物。杂草是制约花生生产的重要生物灾害之一，严重影响花生的产量和品质。提升草害防治效率对保障和稳定花生安全生产具有重要的意义。目前，我国缺乏商业化的除草剂花生品种及其配套的除草剂，这不利于我国花生产业的健康发展，因此创制具有自主知识产权、适合我国生产的抗除草剂花生品种对我国花生产业发展具有重要的意义。

ALS酶抑制类除草剂是指以乙酰乳酸合成酶(Acetolactate synthase,ALS)为靶标的一类除草剂。ALS酶存在于植物和微生物中，由核基因编码，是缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成的关键限速酶，喷施ALS酶抑制剂除草剂可使植物体内的ALS活力降低，导致上述3种支链氨基酸合成受阻，植株生长受到抑制，因此ALS酶抑制剂可以很好的杀灭杂草，不会对人和动物产生影响，具有较高的安全性。ALS酶抑制剂除草剂的选择性强，杀草谱广，能有效防除双子叶阔叶杂草，其中有些除草剂类型多单子叶禾本科植物也有较好的效果，使用的剂量较低，每亩仅需十克左右，被称作超高效除草剂，对环境友好，土壤残留期短，人畜安全，自开发以来得到了广泛的应用。ALS抑制剂类除草剂为内吸传导型，可被叶片和根系吸收，在植物内传导后在分生组织内积累，植物叶片逐渐白化或发紫，节间收缩，顶芽慢慢死亡，最终全株死亡。如今开发的ALS酶抑制剂类除草剂有13类50余种，按化学结构分为五大类：磺酰脲类(sulfonylureas,SU)、咪唑啉酮类(imidazolinones,IMI)、磺酰胺基三咪唑酮类(sulfonylamino carbonyl triazolinones,SCT)嘧啶水杨酸类(pyrimidyloxy-benzoates,PTB)和三唑嘧啶类(triazolopyrimidine,TP)。目前，商业化的SU类(ALS酶抑制剂类除草剂、磺酰脲类)除草剂是世界上开发品种最多，应用范围最广的一类除草剂，对花生具有强烈的抑制生长作用，花生药害明显，选育高效SU类除草剂抗性花生，为防除花生田杂草提供了一条新途径。然而，由于缺乏抗SU类除草剂抗性花生资源，国内至今没有培育出商业化的抗SU类除草剂抗性花生品种。因此创制有应用价值的花生抗性种质资源，对我国实现花生田间杂草化学防治具有重要的意义。

除草剂靶标ALS蛋白中氨基酸位点的替换，引起酶结构和空间构象的改变，导致蛋白和除草剂的亲和性改变，是植物产生除草剂抗性的主要原因，不同保守位点氨基酸的替换导致产生的除草剂抗性及类型有较大的的差异，决定了抗性类型和抗性水平。目前报道的ALS基因产生抗性的突变位点主要为以下几个：Ala-122、Pro-197、Ala205、Asp376、Arg377、Trp574、Ser653、Gly654(以拟南芥ALS氨基酸位置编号)。其中产生SU类除草剂抗性的突变位点有Ala-122、Pro-197、Ala205、Asp376、Trp574，Pro-197位点的氨基酸替换可导致植物对SU类除草剂具有较高的抗性。目前通过人工诱变该位点获得了抗SU类除草剂的油菜，如：华中农业大学和江苏农科院用EMS诱变处理油菜获得的抗苯磺隆油菜资源就产生了Pro-197-Ser变异，但该方法需要筛选大量突变体后代，工作量大，盲目性高。随着单碱基基因编辑技术在植物中的应用，通过单碱基突变编辑该位点，也获得了部分抗苯磺隆植物资源，如P197F、P197S的油菜、P171F的水稻、P186A的番茄。

目前，在普通花生品种或种质资源中未发现抗磺酰脲类除草剂花生资源。基因编辑技术在理论上可以对基因进行突变操作，实现对植物目标性状快速、精准改良，并且不存在传统回交育种常见的连锁等问题，大大提高育种效率。利用基因编辑手段，点突变AhALS2基因创制抗苯磺隆类除草剂花生，为花生遗传育种提供了新途径。经检索国内外现有技术，尚未发现利用CRISPR-Cas9技术创制抗磺酰脲类除草剂花生新种质的报道。

发明内容

针对目前没有抗苯磺隆类除草剂花生资源，无法培育抗苯磺隆类除草剂花生品种的不足，本发明的目的是提供基于基因编辑技术的AhALS2突变型蛋白及其基因在花生育种中的应用。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种基于基因编辑技术的AhALS2突变型蛋白，所述AhALS2突变型蛋白包括Ah10ALS2突变蛋白或/和Ah20ALS2突变蛋白；

Ah10ALS2突变蛋白的氨基酸序列存在以下突变：其对应于拟南芥ALS蛋白197位氨基酸的脯氨酸变为丝氨酸、苯丙氨酸或天冬氨酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO：6～8；

Ah20ALS2突变蛋白的氨基酸序列存在以下突变：其对应于拟南芥ALS蛋白197位氨基酸的脯氨酸变为丝氨酸、或苯丙氨酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO：9～10。

一种编码所述AhALS2突变型蛋白的基因。

SEQ ID NO：6～8所示的Ah10ALS2突变蛋白的编码基因的核苷酸序列分别如SEQID NO.1～3所示；SEQ ID NO：9～10所示的Ah20ALS2突变蛋白的编码基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4～5所示。

所述的编码AhALS2突变型蛋白的基因在花生育种中的应用。

利用所述的编码AhALS2突变型蛋白的基因建立抗苯磺隆类除草剂花生新种质的方法。

所述的方法，包括以下步骤：

(1)sgRNA靶点的确定：

sgRNA靶点覆盖Ah10ALS2基因的第574位碱基和Ah20ALS2基因的第562位碱基，靶点序列3′端为PAM序列，所述靶点序列为5’-CAGGTCCCCCGCCGCATGATTGG-3’；

(2)制备oligo二聚体：

设计oligo序列引物Target-Sense和Target-Antisense，引物离心后，分别将引物用去离子水稀释至浓度为10μM，各取1μL，加入18μL退火缓冲液，混匀；95℃保持3min后，以0.2℃/秒降温速度缓慢降至20℃，在此温度下保持5min，加水稀释至100μL，完成oligo二聚体的制备；

(3)CRISPR-Cas9重组载体的构建：

选用pCSGAP01载体，加入bsal内切酶1μL，bsal内切酶的buffer缓冲液5μL，加水补齐至50μL，37℃酶切1h；回收酶切后的线性化载体2μL及infusion Enzyme Mix 1μL，加入合成的oligo二聚体1μL，在25℃反应1h；将连接后的载体转化大肠杆菌感受态，挑取单克隆载体进行质粒测序，保存测序正确的阳性菌斑，得到CRISPR-Cas9重组载体质粒；

(4)花生的遗传转化：

以花生种子的胚芽为外植体，通过诱导获得胚性愈伤，用基因枪轰击法进行花生的遗传转化，经过潮霉素抗性筛选，获得再生抗性愈伤，经过成苗诱导，获得再生花生幼苗。

(5)突变植株鉴定：

鉴定再生花生幼苗植株是否发生预期位点的突变，保留突变株系，丢弃非突变株系；

(6)抗苯磺隆类除草剂的花生新种质的获得：

选择纯合突变或双等位突变的编辑植株进行繁殖，收获下一代种子，即为抗苯磺隆类除草剂花生新种质。

所述引物Target-Sense和Target-Antisense的序列为：

Target-Sense：5'-TGTGTCAGGTCCCCCGCCGCATGAT-3'；

Target-Antisense：5'-AAACATCATGCGGCGGGGGACCTG-3'。

所述质粒测序的引物序列为pCBSG-seq:5’-TCCCAGTCACGACGTTGTAA-3’。

所述预期位点为Ah10ALS2基因的核苷酸序列的第574位发生C→T突变，或第574-575位发生CC→TT或CC→AA突变；或/和，Ah20ALS2基因的核苷酸序列的第562位发生C→T突变或第562-563位发生CC→TT突变。

本发明有益效果：

1、本发明提供一种通过CRISPR-Cac9基因编辑手段创制株抗苯磺隆类除草剂花生新种质的方法，通过分别对花生Ah10ALS2基因序列第574位和Ah20ALS2基因序列第562位进行基因编辑，Ah10ALS2基因的核苷酸序列的第574位发生C→T突变，或第574-575位发生CC→TT或CC→AA突变；或/和，Ah20ALS2基因的核苷酸序列的第562位发生C→T突变或第562-563位发生CC→TT突变。导致Ah10ALS2第192位置上的氨基酸或/和Ah10ALS2第188位置上的氨基酸发生Pro197Ser、Pro197Phe或Pro197Asn，获得纯合编辑突变植株，即为抗苯磺隆类除草剂花生新种质。

2、本发明所提供的方法可以更快赋予普通花生抗苯磺隆类除草剂特性，本发明提供的方法较常规育种方法可以更好的保留新种质的原有农艺性状。

3、本发明公开了胞嘧啶碱基编辑载体，首次报道在花生中实现单碱基编辑。本发明提供的单碱基编辑方法可以定向改良花生性状，相对化学诱变等方法，更加精准、高效和快速。同时本发明所创制的抗苯磺隆类除草剂花生新种质是对目前花生种质资源的补充。

4、本发明可根据育种目标的实际需求创制不同本底背景的花生抗苯磺隆类除草剂品种或种质资源，用于花生的遗传育种中，其机理明确，抗苯磺隆类除草剂性状稳定。

附图说明

图1为CRISPR/Cas9基因编辑植物表达载体T-DNA区示意图。

其中，sgRNA的启动子为pAtU6；Cas9启动子为35S；筛选基因为Hyg。

图2为基因编辑植株的包含突变位点区段的PCR产物sanger测序峰图。

其中，左边为AhA10ALS2基因序列，右边为AhA20ALS2基因序列。

图3为部分基因编辑突变株系T₁代后代植株喷施苯磺隆除草剂3天、8天和12天后的性状表型鉴定。

其中，后代植株：#C_AhALS2-61-1、#C_AhALS2-109-5、#C_AhALS2-109-2。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步详细说明。如无特别说明，实施例中所涉及的仪器设备均为常规仪器设备；涉及试剂均为市售常规试剂；涉及试验方法均为常规方法。

材料：常规花生品种豫花9326；bsal内切酶；

pCSGAP01载体：未米生物科技(江苏)有限公司；

T载体：北京擎科生物科技有限公司(TSV-007)；

质粒DNA提取试剂盒：无内毒素质粒小提中量试剂盒(DP118)；

植物DNA提取试剂盒：天根生化科技(北京)有限公司(DP350)；

PCR引物合成及DNA测序由北京六合华大基因科技有限公司完成；

基因枪：宁波新芝生物科技股份有限公司(高压气体基因枪GJ-1000)。

实施例1 sgRNA靶标位点的确定

Ah10ALS2和Ah20ALS2基因的全长DNA序列同源性(identity)为99％，开放阅读框(identity)为99％，本实施例选择覆盖Ah10ALS2基因的第574位碱基和Ah20ALS2基因的562位碱基的同源序列进行靶点设计，靶点序列CAGGTCCCCCGCCGCATGATTGG(SEQ ID NO.11)，根据CRISPR-Cas9基因编辑靶点设计规则，选取原型间隔子相邻基序(protospacer-associated motif,PAM)上游18～20bp的碱基序列作为靶标序列(5'-N18-20NGG-3'，NGG为PAM保守序列，N18-20为18～20bp碱基识别序列)；

根据靶点序列设计引物Target-Sense和Target-Antisense，用以制备oligo二聚体；

Target-Sense：5'-TGTGTCAGGTCCCCCGCCGCATGAT-3'(SEQ ID NO.12)；

Target-Antisense：5'-AAACATCATGCGGCGGGGGACCTG-3'(SEQ ID NO.13)。

oligo二聚体的制备：将引物Target-Sense和Target-Antisense用ddH₂O分别稀释至终浓度为10μM，各取1μL，加入18μL退火缓冲液，混匀；95℃保持3min，之后以0.2℃/秒缓慢降至20℃，保持5min，加水稀释至100μL，完成oligo二聚体的制备。

实施例2 CRISPR-Cas9重组载体的构建

选用pCSGAP01载体，加入bsal内切酶1μL，bsal内切酶的buffer缓冲液5μL，加水补齐至50μL，37℃酶切1h；回收酶切后的线性化载体2μL及infusion Enzyme Mix 1μL，利用合成的oligo二聚体1μL，25℃反应1h。取连接后的载体2μL转化大肠杆菌感受态DH5a，涂板37℃过夜，挑取单菌落摇菌，提取质粒后，进行质粒测序，测序引物为pCBSG-seq:5’-TCCCAGTCACGACGTTGTAA-3’(SEQ ID NO.14)，保存测序正确的阳性菌斑，得到CRISPR-Cas9重组载体质粒，载体中的T-DNA区段示意图如图1所示。

实施例3花生的遗传转化

a，外植体的胚性愈伤诱导：取花生成熟的荚果，剥去果壳，挑取饱满光洁无菌斑的种子，75％的酒精浸泡1min，去除酒精，0.1％的升汞浸泡8min，去除升汞，用无菌水冲洗5-7次，浸泡过夜；

b，胚性愈伤的诱导：超净工作台中去除花生种子的子叶、胚小叶和下胚轴，取上胚轴置于MS诱导培养基上(表1)，28℃、每3-4周继代一次，4-12个月获得胚性愈伤；

表1 MS诱导培养基母液配方

c，基因枪轰击法准备：按照新芝基因枪(GJ-1000)说明书制备子弹。子弹的制备：称取60mg金粉加入100％无水乙醇1mL，于2mL离心管中，超声波分散至手感温度略发烫，离心，弃掉上清，加入1mL无水乙醇，涡旋振荡3-5min，静置1min，弃上清，加入1mL无菌蒸馏水，涡旋振荡后离心，弃上清，加入50％灭菌的甘油，制备60mg/mL的金粉悬浊液；

提取CRISPR-Cas9重组载体质粒，浓度为1μg/μL，取金粉悬浊液50μL，加入10μLCRISPR-Cas9重组载体质粒，振荡30s，加入50μL浓度为2.5M的氯化钙，振荡30s，加入20μL浓度为0.1M的亚精胺，振荡30s，离心后去上清，加入150μL70％乙醇，吹打沉淀至均匀散开，离心去上清后加入150μL无水乙醇，静置1min，去上清后加入60μL无水乙醇，吹散备用。

d，花生的遗传转化：将诱导后的花生胚性愈伤放置于MS培养基上，使用新芝基因枪(GJ-1000)进行愈伤的轰击，轰击后在28℃培养3d，转移至含20mg/L潮霉素的MS上筛选，共培养1个月后，挑选新生愈伤，转移至含20mg/L潮霉素的MS上继代2次，增值胚性愈伤用于植株再生。

e，花生植株的再生：将筛选后的愈伤转移至MS培养基上，放置在30℃16h光照/28℃8h黑暗的植物生长培养箱中，诱导花生幼苗，一个月后将约2cm花生幼苗切下，放置于生根培养基上，待幼苗生根后，将幼苗移至花土中。

以未经遗传转化的野生型花生为对照。

实施例4再生植株基因编辑突变位点的检测

提取再生幼苗的叶片DNA，对Ah10ALS2和Ah20ALS2基因的靶标位点进行检测。

Ah10ALS2的检测用扩增引物为：

AhALS-10A–s:5’-GCGAAATTATAGAGACCATCAG-3’(SEQ ID NO.15)，

AhALS-10A–a:5’-TCAATATTTTGTTCTGCCATCG-3’(SEQ ID NO.16)；

Ah20ALS2的检测用扩增引物为：

AhALS-20B–s:5’-GTCGAGCTATCCGACCTGG-3’(SEQ ID NO.17)，

AhALS-20B-a2:5’-CTTCAAATCCCCACAGACAGAC-3’(SEQ ID NO.18)；

反应体系为：基因组DNA模板1μL(约50ng)、10×Taq酶反应缓冲液2uL、25mMMgCL₂1.2uL、2mM dNTP 1.5uL、10uM引物各0.2uL、0.3个单位Taq酶，加无菌水至20μL。

反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性45s、55℃退火45s、72℃延伸2min，32个循环，72℃延伸5min。

Ah10ALS2和Ah20ALS2基因的扩增片段长度分别为2779和2434bp，对PCR扩增后的产物进行琼脂糖电泳检测，判断条带大小是否正确，选择条带正确的产物测序，测序引物序列为for-G00092：5’-TCCCGATTTGCTCCCAAC-3’(SEQ ID NO.19)。

上述测序产物序列与未经转化的野生型花生(WT)中的AhA10ALS2基因序列(图2左)和AhA20ALS2基因序列(图2右)相比对，检测基因编辑靶点序列的突变情况，图2所示为本实验的部分转化株系，其中编号为#C_AhALS2-6、#C_AhALS2-109、#C_AhALS2-61、#C_AhALS2-62、#C_AhALS2-128、#C_AhALS2-21、#C_AhALS2-120。

检测结果显示，本实验转化株系在编辑位点处发生了序列的变异，Ah10ALS2基因的核苷酸序列的第574位发生C→T突变，或第574-575位发生CC→TT或CC→AA突变；

或/和，Ah20ALS2基因的核苷酸序列的第562位发生C→T突变或第562-563位发生CC→TT突变。

根据上述内容，分析花生Ah10ALS2和Ah20ALS2的基因编辑：现有技术方案中的CRISPR-Cas9基因编辑手段可用于本研究对花生AhALS2基因的定点编辑，选择胞嘧啶碱基编辑器，所述胞嘧啶碱基编辑器是基于pCSGAP01载体构建获得的，包含35S驱动的潮霉素抗性基因、AtU6驱动的sgRNA以及拟南芥Ubiqintine1驱动的AP01-nCas9融合蛋白。

利用基因编辑技术对花生Ah10ALS2进行基因编辑，使其开放阅读框核苷酸序列的第574位发生C→T突变导致Ah10ALS2第192位置上的氨基酸发生Pro197Ser，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1。相应其对应于拟南芥ALS蛋白197位氨基酸的脯氨酸变为丝氨酸，Ah10ALS2突变蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：6；

利用基因编辑技术对花生Ah10ALS2进行基因编辑，使其开放阅读框核苷酸序列的第574-575位发生CC→TT突变导致Ah10ALS2第192位置上的氨基酸发生Pro197Phe，其核苷酸序列为SEQ ID NO：2。相应其对应于拟南芥ALS蛋白197位氨基酸的脯氨酸变为苯丙氨酸，Ah10ALS2突变蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：7；

利用基因编辑技术对花生Ah10ALS2进行基因编辑，使其开放阅读框核苷酸序列的第574-575位发生CC→AA突变导致Ah10ALS2第192位置上的氨基酸发生Pro197Asn，其核苷酸序列为SEQ ID NO：3。相应其对应于拟南芥ALS蛋白197位氨基酸的脯氨酸变为天冬氨酸，Ah10ALS2突变蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：8；

利用基因编辑技术对花生Ah20ALS2进行基因编辑，使其开放阅读框核苷酸序列的第562位发生C→T突变，导致Ah10ALS2第188位置上的氨基酸发生Pro197Ser，其核苷酸序列为SEQ ID NO：4。相应对应拟南芥ALS蛋白197位氨基酸的脯氨酸变为丝氨酸，Ah20ALS2突变蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：9；

利用基因编辑技术对花生Ah20ALS2进行基因编辑，使其开放阅读框核苷酸序列的第562-563位发生CC→TT突变，导致Ah20ALS2第188位置上的氨基酸发生Pro197Phe，其核苷酸序列为SEQ ID NO：5。相应对应拟南芥ALS蛋白197位氨基酸的脯氨酸变为苯丙氨酸，Ah20ALS2突变蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：10。

实施例5基因编辑植株抗苯磺隆类除草剂表型鉴定

温室培养，收获种子：温室中培养花生，30cm直径花盆中种植2株，常规培养，种子成熟后按单株收获，种子自然晾干。

花生T₁种子成熟后，单株收获，将种子单粒播种于温室，待T2代植株生长5-8叶期，喷施除草剂(5.00mg ai/L)，12天后进行抗除草剂的筛选鉴定，结果显示(图3、表2)。

表2基因编辑花生株系的抗苯磺隆类除草剂鉴定

结果表明，本发明中获得的突变材料#C_AhALS2-6、#C_AhALS2-109、#C_AhALS2-61、#C_AhALS2-62、#C_AhALS2-128、C_AhALS2-21和#C_AhALS2-120的后代植株(图3，#C_AhALS2-61-1、#C_AhALS2-109-5、#C_AhALS2-109-2)有较强的磺酰脲类除草剂苯磺隆抗性，在幼苗期喷施5.00mg ai/L浓度12天后，仅新叶略微发黄，未受到明显影响，而非转基因本底材料(图3，WT(豫花9326))表现为幼嫩茎部发黑，叶片枯萎，12天后，突变材料正常生长，本底材料全部死亡。说明通过该方法获得的基因编辑花生植株具有抗苯磺隆类除草剂表型。

综上所述，本发明提供了一种通过基因编辑创制抗苯磺隆类除草剂花生新种质的方法，通过对AhA10ALS2第574位碱基和AhA20ALS2基因的第562位碱基进行单碱基基因编辑，获得纯合基因编辑植株，即抗苯磺隆类除草剂的花生新种质。

Claims (9)

1.一种基于基因编辑技术的AhALS2突变型蛋白，其特征在于，所述AhALS2突变型蛋白包括Ah10ALS2突变蛋白或/和Ah20ALS2突变蛋白；

Ah10ALS2突变蛋白的氨基酸序列存在以下突变：其对应于拟南芥ALS蛋白197位氨基酸的脯氨酸变为丝氨酸、苯丙氨酸或天冬氨酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO：6～8；

Ah20ALS2突变蛋白的氨基酸序列存在以下突变：其对应于拟南芥ALS蛋白197位氨基酸的脯氨酸变为丝氨酸、或苯丙氨酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO：9～10。

2.一种编码权利要求1所述AhALS2突变型蛋白的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，SEQ ID NO：6～8所示的Ah10ALS2突变蛋白的编码基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～3所示；SEQ ID NO：9～10所示的Ah20ALS2突变蛋白的编码基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4～5所示。

4.如权利要求2或3所述的编码AhALS2突变型蛋白的基因在花生育种中的应用。

5.利用如权利要求2或3所述的编码AhALS2突变型蛋白的基因建立抗苯磺隆类除草剂花生新种质的方法。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)sgRNA靶点的确定：

sgRNA靶点覆盖Ah10ALS2基因的第574位碱基和Ah20ALS2基因的第562位碱基，靶点序列3′端为PAM序列，所述靶点序列为5’-CAGGTCCCCCGCCGCATGATTGG-3’；

(2)制备oligo二聚体：

设计oligo序列引物Target-Sense和Target-Antisense，引物离心后，分别将引物用去离子水稀释至浓度为10μM，各取1μL，加入18μL退火缓冲液，混匀；95℃保持3min后，以0.2℃/秒降温速度缓慢降至20℃，在此温度下保持5min，加水稀释至100μL，完成oligo二聚体的制备；

(3)CRISPR-Cas9重组载体的构建：

选用pCSGAP01载体，加入bsal内切酶1μL，bsal内切酶的buffer缓冲液5μL，加水补齐至50μL，37℃酶切1h；回收酶切后的线性化载体2μL及infusion Enzyme Mix 1μL，加入合成的oligo二聚体1μL，在25℃反应1h；将连接后的载体转化大肠杆菌感受态，挑取单克隆载体进行质粒测序，保存测序正确的阳性菌斑，得到CRISPR-Cas9重组载体质粒；

(4)花生的遗传转化：

以花生种子的胚芽为外植体，通过诱导获得胚性愈伤，用基因枪轰击法进行花生的遗传转化，经过潮霉素抗性筛选，获得再生抗性愈伤，经过成苗诱导，获得再生花生幼苗。

(5)突变植株鉴定：

鉴定再生花生幼苗植株是否发生预期位点的突变，保留突变株系，丢弃非突变株系；

(6)抗苯磺隆类除草剂的花生新种质的获得：

选择纯合突变或双等位突变的编辑植株进行繁殖，收获下一代种子，即为抗苯磺隆类除草剂花生新种质。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述引物Target-Sense和Target-Antisense的序列为：

Target-Sense：5'-TGTGTCAGGTCCCCCGCCGCATGAT-3'；

Target-Antisense：5'-AAACATCATGCGGCGGGGGACCTG-3'。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述质粒测序的引物序列为pCBSG-seq:5’-TCCCAGTCACGACGTTGTAA-3’。

9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述预期位点为Ah10ALS2基因的核苷酸序列的第574位发生C→T突变，或第574-575位发生CC→TT或CC→AA突变；或/和，Ah20ALS2基因的核苷酸序列的第562位发生C→T突变或第562-563位发生CC→TT突变。

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