CN115974992B - 枳转录因子PtrABR1及其在植物抗旱遗传改良中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物基因工程领域，公开了枳转录因子PtrABR1及其在植物抗旱遗传改良中的应用。PtrABR1基因是从枳（Poncirus trifoliata）中分离、克隆出的ERF家族转录因子，其序列为SEQ ID NO.1所示。利用该基因构建超表达载体后通过农杆菌介导的遗传转化分别转入烟草和柠檬植株，并且同时构建干涉载体后将其转入枳中。分别获得转基因植株后进行生物学功能验证，表明本发明所克隆的PtrABR1基因具有控制植物抗旱性的功能。该遗传资源的开发利用有利于降低农业生产成本和实现绿色，环境友好型农业目标。

Description

枳转录因子PtrABR1及其在植物抗旱遗传改良中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及枳转录因子PtrABR1及其在植物抗旱遗传改良中的应用，申请人从枳(Poncirus trifoliata)中分离、克隆得到PtrABR1，将该基因在烟草和柠檬中超表达后，获得转基因植株抗旱性明显增加；将该基因在枳中干涉后，转基因植株抗旱性则明显降低。

背景技术

植物在它们的一生中无一例外地遭受到源源不断的外部环境胁迫，包括生物胁迫(病虫害等)和非生物胁迫(干旱、低温、高盐、高渗、缺素或离子毒害等)。其中，干旱是最严重的胁迫之一，其严重制约着植物的生态地理分布，影响着植物的生产力，威胁着全球粮食安全和可持续农业的发展(Krasensky and Jonak 2012)。此外，全球气候变暖显著增加了世界范围内严重干旱气候条件发生的频率(Trenberth et al.2014)。植物体内约80-95％的新鲜生物量都说由水分组成的，水分在植物生长发育的各个环节都发挥着重要的作用(Osaka be et al.2014，Fathi and Tari 2016，Martignago et al.2020，Takahashi etal.2020a，Ch en et al.2021a，Rane et al.2022)。植物叶片在干旱环境下通过蒸腾作用散失水分的速度远远超过了根系吸收水分的速度，导致叶片含水量降低，气孔开度减小，阻止植物光合作用和水分蒸腾(Sah et al.2016，Martignago et al.2020，Takahashi etal.2020b，Seleiman et al.2021)；另一方面，植物分生组织正常分裂受阻，整体的营养生长受到严重抑制(Sah et al.2016，Martignago et al.2020)；此外，植物遭受干旱胁迫时导致叶片卷曲、黄化、呈烧焦状、萎蔫、生长迟缓，严重时引起树体开裂、干枯、坏死等现象(Grandgirard et al.2002，Xu et al.2010，Basu et al.2016)。

植物通过细胞膜上的受体蛋白和传感器接收并且感知胁迫，产生逆境信号，将其传递到细胞内，胁迫信号在细胞内进行传导和一系列级联放大，最终诱导干旱响应基因大量表达，从而抵御干旱胁迫(Chao et al.1997，Huang et al.2012，Chen et al.2021a)。目前对干旱下信号转导的研究，主要集中于以下四个途径：一是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)等蛋白激酶级联放大途径(Chao et al.1997，Zhu 2016)；二是作为最常见第二信使的钙离子信号途径(Sanyal et al.2017，Gong et al.2020，Plasencia et al.2021)；三是ABA参与的激素信号转导途径(Fujii et al.2010，Nakashima and Yamaguchi-Shinozaki 2013，Yoshida et al.2014，Liu et al.2019)；四是ROS信号途径(Dahro et al.2016，Molassiotis et al.2016，Wei et al.2019，Meng et al.2020)。

淀粉是一种不溶性葡聚糖，由葡萄糖、支链淀粉和直链淀粉形成的半晶体结构聚合物(Zeeman et al.2010)。淀粉在植物叶片中通过光合作用合成，一部分以蔗糖的形式从叶绿体运输到生长部位，另一部分作为短暂型淀粉保留在叶绿体中，在夜间降解，为植物呼吸作用供应能量(Gibon et al.2004b)。β-淀粉酶是叶绿体中淀粉降解过程中最主要的水解酶。近期研究在高等植物基因组中鉴定到大量的β-淀粉酶蛋白。拟南芥中鉴定到9个BAM基因(BAM1-9)(Monroe et al.2014)。其中BAM1、3具有明显的催化活性，并发挥主要的淀粉降解酶功能。BAM1和BAM3在淀粉降解方面具有不同功能，BAM1主要在保卫细胞中表达，控制保卫细胞的气孔运动(Prasch et al.2015)。BAM3编码一种定位于叶绿体并在叶肉细胞中特异性表达的淀粉酶，在夜间叶片淀粉降解中起作用(Lao et al.1999)。在猕猴桃中，BAM3通过CBF途径调节淀粉代谢参与低温(Sun et al.2021b)。从梨中分离的PbrBAM3在寒冷、脱水和ABA条件下被显著上调，但被麦芽糖处理抑制(Zhao et al.2019a)。此外，拟南芥AtBAM3在枳中的同源基因PtrBAM1通过调节淀粉水平在耐寒性中起重要作用(Peng etal.2014)。尽管如此，BAM3如何响应干旱胁迫的分子机制尚不清楚。

AP2/ERF家族蛋白通常含有AP2/ERF结构域，是植物中广泛存在的一类转录因子，参与了植物的生长发育及逆境胁迫响应(洪林2020)。ABA repressor 1(ABR1)是ERF转录因子ERF/AP2超家族的成员，在植物种子萌发过程和机械损伤中发挥着重要作用(Pandey etal.2005，Choi and Hwang 2011，Mishra et al.2013，Lee et al.2015，Tang et al.2016，Sanyal et al.2017，et al.2019，Ye et al.2020)。拟南芥abr1突变体在种子萌发过程中积累了更多的ABA，对ABA反应敏感度增加，作为ABA抑制子在种子萌发过程中发挥作用(Pandey et al.2005)。过表达ABR1在增强了番茄和拟南芥对丁香假单胞菌的抗性(Choiand Hwang 2011)。拟南芥C2H2家族AtYY1可以结合并激活ABR1启动子，负调节ABA和盐响应基因的表达(Li et al.2016b)。然而，ABR1是否通过参与淀粉代谢过程响应干旱胁迫尚不可知。

干旱是制约我国柑橘产业发展的一大因素。我国大部分柑橘产区处于南方丘陵地区，立地条件差、灌溉条件有限，并且伴随着近些年来全球变暖和南方季节性干旱频发，柑橘产量和品质受到严重影响。因此通过育种手段提高柑橘抗旱性对最大限度地降低干旱对柑橘产业带来的损失，促进我国柑橘产业可持续发展。然而，我国柑橘抗旱资源有限，并且大部分柑橘种类具有多胚的特性，通过有性杂交改良柑橘的抗旱性难以实现。枳(Poncirustrifoliata(L.)Raf)为柑橘的近缘种，喜光喜温，抗寒抗湿抗旱抗病等能力较强，不耐盐碱，因其综合抗性较好，嫁接亲和力强，结果早且丰产等特性，目前广泛应用于柑橘砧木的嫁接(马文涛2007)。因此研究枳干旱应答的分子机制及调控网络并发掘和鉴定重要的抗逆基因，是通过基因工程开展柑橘抗逆遗传改良的重要前提。

发明内容

本发明目的在于提供了枳转录因子PtrABR1，所述的枳转录因子PtrABR1为SEQ IDNO.2所示。

本发明的另一个目的在于提供了枳转录因子PtrABR1在植物抗旱遗传改良中的应用，将该转录因子的基因在烟草和柠檬中超表达后，获得转基因植株抗旱性明显增加；将该基因在枳中干涉后，转基因植株抗旱性则明显降低，所述基因对应的核苷酸序列为SEQ IDNO.1所示，编码的蛋白质序列为SEQ ID NO.2所示。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施

申请人基于植物基因克隆技术从枳中鉴定并克隆得到一个新基因PtrABR1，其序列为SEQ ID NO.1所示，其编码的蛋白为SEQ ID NO.2所示；该基因全长1095bp，编码364个氨基酸，序列为SEQ ID NO.2所示，编码该蛋白质的基因为SEQ ID NO.1所示。分子量预测显示，该蛋白分子量为39.93kDa，等电点pI为5.43。

申请人通过构建PtrABR1超表达及瞬时沉默株系，分析在干旱处理前后PtrABR1转基因植株的抗旱表型和相关生理指标，结果显示：相较于野生型柠檬植株，PtrABR1转基因柠檬植株抗旱性增加，同时光合强度，电导率，MDA含量和ROS含量较低，淀粉降解和可溶性糖含量明显增加。而PtrABR1沉默系枳植株则与之相反，表明PtrABR1是一个潜在的正向调控枳抗旱性的育种基因。

枳抗旱基因PtrABR1在植物抗旱中的应用，通包括利用本领域的常规方式，将PtrABR1基因在植株中进行超表达，可获得抗旱的转基因植株；沉默植株中PtrABR1基因的表达，则可获得干旱敏感的转基因植株，结果表明，转入超表达载体提高了植株抗旱性，而转入了干涉载体降低了植株干旱性。

所述的植株为柠檬或枳。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

新基因PtrABR1的发现及成功克隆，为植物抗逆分子设计育种提供新的基因资源，为实施绿色农业、节水农业提供新的遗传资源，该遗传资源的开发利用有利于降低农业生产成本和实现环境友好。

附图说明

图1是本发明的技术流程图。

图2是本发明PtrABR1亚细胞定位示意图；

其中：图2中A是本发明的PtrABR1亚细胞定位载体构建模式图；图2中B是本发明的PtrABR1亚细胞定位检测。

图3是本发明PtrABR1转录激活活性分析示意图；

其中：图3中A是本发明的PtrABR1缺失片段构建模式图；图3中B是本发明的PtrABR1转录激活活性检测。

图4是本发明PtrABR1基因转基因烟草鉴定及相对表达量分析示意图；

其中：图4中A是本发明的PtrABR1基因烟草鉴定；图4中B是PtrABR1的相对表达量。

图5是本发明PtrABR1转基因烟草干旱处理表型和生理指标测定示意图；

其中：图5中A是干旱处理前后转基因烟草(#3，#5)和野生型烟草的表型；图5中B是烟草干旱处理前后叶绿素荧光表型图；图5中C是烟草处理前后Fv/Fm值；图5中D是烟草处理前后MDA含量；图5中E是烟草干旱处理前后相对电导率；图5中F是烟草处理前后BAM活性；图5中G是烟草处理前后DAB和NBT染色图；图5中H是烟草处理前后淀粉含量；图5中I是烟草处理前后可溶性糖含量。

图6是本发明PtrABR1基因转基因柠檬鉴定及相对表达量分析示意图。

其中：图6中A是本发明的PtrABR1基因柠檬鉴定；图6中B是PtrABR1在超表达柠檬中的相对表达量。

图7是本发明转PtrABR1基因柠檬干旱处理表型和生理指标测定示意图；

其中：图7中A是干旱处理前后转基因柠檬(#2，#12)和野生型柠檬的表型；图7中B是柠檬干旱处理前后相对电导率；图7中C是柠檬处理前后MDA含量；图7中D是柠檬处理前后DAB和NBT染色图；图7中E是柠檬干旱处理前后叶绿素荧光表型图；图7中F是柠檬处理前后Fv/Fm值；图7中G是柠檬处理前后碘染色图；图7中H是是柠檬处理前后BAM活性；图7中I柠檬处理前后淀粉含量；图7中J是柠檬处理前后可溶性糖含量。

图8是本发明VIGS沉默材料鉴定及相对表达定量分析示意图；

其中：图8中A是PtrABR1干涉材料(TRV2-PtrABR1)的鉴定，“M”代表marker，“P”代表阳性质粒，“TRV”代表TRV空载枳；图8中B是随机选取TRV2-PtrABR1阳性材料鉴定PtrABR1表达量。

图9是枳沉默PtrABR1基因植株(TRV2-PtrABR1)抗旱性分析示意图；

其中：图9中A是干旱处理前后空载TRV和干涉植株TRV2-PtrABR1的表型；图9中B是干涉枳干旱处理前后的叶绿素荧光表型图；图9中C是干涉枳干旱处理前后DAB和NBT染色；图9中D是干涉枳干旱处理前后图Fv/Fm值；图9中E是干涉枳干旱处理前后相对电导率；图9中F是干涉枳处理后MDA含量；图9中G是干涉枳处理前后BAM活性；图9中H是干涉枳处理前后淀粉含量；图9中I是干涉枳处理前后可溶性糖含量。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明做出详细的描述。根据以下描述和实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。本发明实施例中，是将PtrABR1基因在烟草和柠檬中超表达，说明其均可提高植物的抗旱性。限于篇幅，将PtrABR1基因在枳中超表达，也能获得抗旱力增强的转基因植株枳，因此不在实施例中赘述。

实施例1：枳PtrABR1基因全长cDNA的克隆

以枳cDNA为模板，采用高保真酶进行扩增，扩增引物序列如下：正向引物：5’-ATGTGTTGCTGTATGCCAAAC-3’，反向引物：5’-TCCTGAAGAAGAAGAAGGATAATA-3’。

采用AxyPrep-96 DNA凝胶回收试剂盒(Axygene,USA)对扩增产物进行纯化回收，之后将纯化产物连接到pEASY-Blunt载体(全式金,中国)，连接体系见，室温孵育5min后转化大肠杆菌感受态DH5α。涂板，37℃倒置培养，挑斑摇菌，PCR阳性检测后将阳性克隆后送武汉擎科生物公司测序，根据测序结果，即为PtrABR1的基因全长序列。

测序结果发现该基因含有一个开放阅读框(ORF)，共1095bp，编码364个氨基酸。分子量预测显示，该蛋白分子量为39.93kDa，等电点为5.43。将该基因命名为PtrABR1，核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

实施例2：

PtrABR1基因亚细胞定位和转录激活分析

扩增PtrABR1的ORF区域(不含终止密码子)，引物序列为p101YFP-PtrABR1-F:5’-CGGGATCC ATGACGGACTACCGGTTACC-3’和p101YFP-PtrABR1-R:5’-CGGAATTCTTGGGTATCTCCAACTTTGG-3’，将目的基因构建到101LYFP载体上，YFP蛋白位于基因的3’端，表达由CaMV35S启动子驱动(图2中A)。35S:PtrABR1-YFP+mCherry与对照35S:YFP+mCherry分别瞬时转化到本氏烟草的叶片表皮细胞，激光共聚焦观察荧光发现对照的荧光充满整个表皮细胞，包括细胞质、细胞核，而转化35S:PtrABR1-YFP的荧光只集中在细胞核内。说明PtrABR1是一个核定位蛋白(图2中B)。

PtrABR1基因亚细胞定位结果显示PtrABR1是定位在核的转录因子，为了研究分析PtrABR1转录激活活性，将该基因分为全长、C端及N端，扩增引物为；C端，和N端。然后分别将PtrABR1基因编码区序列片段连接到酵母GAL4融合表达载体pGBKT7上构建好重组载体，之后分别转化酵母AH109感受态细胞(图3中A)，在相应的缺陷培养基上检验PtrABR1的转录激活活性。实验分别设置阳性对照和阴性对照。结果发现，所有的转化子都能在SD/-Trp缺失培养基上生长，而只有全长PtrABR1和中间PtrABR1-C能在缺失培养基SD-Trp/Ade/His和SD-Trp/Ade/His+X-α-Gal上正常生长，而含有N段的序列的转化体酵母不能生长，也不显蓝色(图3中B)。说明PtrABR1-C可以激活LacZ报告基因，然后引起β-半乳糖苷酶的分解，将X-α-Gal分解显蓝色。

实施例3：烟草的遗传转化及阳性鉴定

1)菌株准备：从-80℃取出保存好的转入过pGWB411-PtrABR1载体的农杆菌，用枪头吸取少量农杆菌液，置于不含抗生素的MS液体培养基中，28℃，200r/min培养至OD600值到0.6-0.8以备侵染用；

2)外植体准备：选取长势良好的无菌烟草，取最大的2-3片叶片，去掉主脉及叶边缘，切成0.5cm²左右大小的方块，放入无菌且加有少量MS液体培养基的三角瓶中，供侵染用；

3)侵染及共培养：将第一步中培养好的菌液倒入装有外植体的三角瓶中，侵染10min，侵染过程中不断轻摇。侵染后，用灭菌的滤纸吸干外植体带有的菌液,叶背面向下，放于铺有无菌滤纸的共培培养基(MS+2.25mg/L 6-BA+0.3mg/L NAA)上，培养室中暗培养3d；

4)筛选培养：共培养3d后的全部外植体收集放入无菌的三角瓶中，加入含400mg/LCef的无菌水清洗2-3次，然后再用无菌水清洗2-3次，最后用无菌滤纸吸干外植体表面的水，置于筛选培养基(MS+400mg/L Cef+100mg/L Km+2.25mg/L 6-BA+0.3mg/L NAA)上培养；

5)生根培养：将长至1-2cm长的抗性芽切下来，置于MS+400mg/L培养基中生根培养。

上述培养基中均含有3.0％蔗糖和0.8％琼脂，且pH值调至5.9-6.0。培养基高温高压灭菌后，待其冷却至60℃以下时，加入已过滤灭菌的抗生素，分装备用。

当抗性芽生根后，且长出2-3片叶片时，取少量叶片进行DNA提取，DNA提取步骤如下：

1)取少量烟草叶片放入1.5mL离心管中，液氮研磨至粉末状，加入600μL CATB提取液，CTAB提取液配制方法见表5；

2)充分混匀后放入65℃水浴锅水浴90min，期间每30min颠倒混匀一次；

3)水浴完成后，加入700μL 24:1(氯仿：异戊醇)混合抽提液，剧烈颠倒混匀，常温下12000r/min离心15min，吸取上层清液(约500μL)转移至新的1.5mL离心管中；

4)加入与上清等体积的预冷异丙醇，上下颠倒混匀后，放于-20℃冰箱沉淀(沉淀时间可延长)；

5)沉淀完成后取出，12000r/min离心10min。倒掉上清，加入1mL预冷的75％乙醇，清洗2-3两次，弃酒精，于通风橱内风干；

6)每管加入20-30μL ddH2O溶解DNA，溶解好的DNA保存-20℃冰箱。

浓度检测，每个样品取1μL，于NanoDrop2000超微量分光光度计(Thermo,USA)测量，其OD260/OD280比值为1.8-2.0范围内时，DNA纯度较高。同时也通过凝胶电泳检测。

利用鉴定引物，通过PCR鉴定获得了多株阳性植株(结果见图4中A)，鉴定引物序列为35S-F:5’-TCCTCGGATTCCATTGCCCAGC-3和gene-R:5’-TCCTGAAGAAGAAGAAGGATAATA-3’。实时荧光定量分析了阳性烟草植株中PtrABR1相对表达量，结果显示相对WT，PtrABR1表达量明显升高(图4中B)，依据阳性苗鉴定结果选取了#3和#5超表达植株T2代种子用于后续分析。

实施例4：转基因烟草抗旱性分析

干旱处理前，野生型烟草与超表达烟草(#3，#5)生长状态无明显差异，但是28d干旱处理后，野生型烟草几乎全部死亡，超表达系烟草植株仅表现出一定程度的叶片黄化、萎蔫死亡现象(图5中A)。超表达烟草的叶绿素荧光成像结果和Fv/Fm显著优于野生型(图5中B-C)。此外，转基因植株积累了更少的MDA含量(图5中D)，转基因植株的相对电导率也显著低于野生型(图5中E)。同时，干旱处理后转基因烟草BAM酶活活性增加程度高于野生型烟草(图5中F)。淀粉降解和可溶性糖积累受到明显促进(图5中H-I)。

实施例5：柠檬的遗传转化及阳性鉴定

1.柠檬遗传转化

1)植物材料准备

把柠檬种子浸泡于1mol/L NaOH中大约15min，去除果胶，然后用水洗净，将种子拿至超净工作台中，用2％的NaClO浸泡灭菌15min，倒掉NaClO用无菌水洗涤3-4次。将灭菌后的种子放置于已加入少许水的灭菌之后的三角瓶中，最后将种子放于4℃冰箱中保存。在超净工作台上用镊子剥掉种子的外种皮和内种皮，接种于MT固体培养基上，黑暗培养4-6周左右，转化前将其置于光照下10-14d直至实生苗转绿。在此期间制备农杆菌菌液。

2)农杆菌侵染液制备

在无菌操作台上，使用烧灼灭菌的接种环挑取-80℃保存的pGWB411-PtrERF9农杆菌，在含有50mg/L Spec抗生素的培养基上划线，将培养基放入28℃培养箱中暗培养2d。挑取单克隆接种于新的含有50mg/L Spec抗生素的培养基上，然后置于培养箱继续培养2d。取一个灭菌的100mL的小三角瓶倒入50mL含有20mg/L AS(Acetosyringone,乙酰丁香酮)的MT液体培养基。将已长好的农杆菌刮下溶于含有20mg/L AS的MT液体培养基，28℃条件下，200r/min振荡20min(此期间切取柠檬茎段)，向菌液中加入MT液体培养基调整浓度至OD₆₀₀值为0.6-0.8。

3)外植体准备

将柠檬实生苗取出放置于灭菌后的铺有滤纸的大培养皿中进行切段，将柠檬实生苗切成大约1.5cm左右长的茎段。向灭菌后的三角瓶中加少量MT液体培养基浸没切好的茎段以保湿。

4)侵染与共培养

向装有切好的茎段的三角瓶中加入制备好的农杆菌菌液，震荡大约20min之后完成侵染。倒掉菌液，将茎段取出放在无菌吸水纸上除去茎段表面的菌液。将表面清除菌液后的茎段均匀摆放到铺有滤纸的共培养培养基。之后遮光暗培养，放置于25℃条件下培养3d。

5)筛选培养与再生

将暗培养3d的茎段取出放入灭菌后的小三角瓶中，用无菌水浸泡清洗3-5次。把茎段放置于无菌吸水纸上直至吸干水分，然后用镊子将茎段转移到筛选培养基上，黑暗条件下培养至再生芽大于0.5cm时将其切下，放入生芽培养基中。至再生芽2cm大小时，转移到生根培养基上。当抗性芽生根后，且长出2-3片叶片时，取少量叶片进行DNA提取，DNA提取步骤如实施例3所示。

利用鉴定引物，通过PCR鉴定获得了多株阳性植株(结果见图6中A)，鉴定引物序列为35S-F:5’-TCCTCGGATTCCATTGCCCAGC-3和gene-R:5’-TCCTGAAGAAGAAGAAGGATAATA-3’。实时荧光定量分析了阳性烟草植株中PtrABR1相对表达量，结果显示相对WT，PtrABR1表达量明显升高(图6中B)，依据阳性苗鉴定结果选取了#2，#12超表达植株用于后续分析。

实施例6：转基因柠檬抗旱性分析

干旱处理前，野生型柠檬与超表达柠檬(#2，#12)生长状态无明显差异，但是14d干旱处理后，野生型柠檬干枯、萎蔫甚至死亡，超表达系柠檬植株仅表现出一定程度的叶片黄化(图7中A)。超表达柠檬的叶绿素荧光成像结果和Fv/Fm显著优于野生型图7中E-F)。此外，转基因植株的相对电导率显著低于野生型(图7中B)，同时转基因植株也积累了更少的MDA含量(图7中C)。干旱处理后转基因柠檬BAM酶活活性增加程度高于野生型柠檬(图7中H)。淀粉降解和可溶性糖积累受到明显促进(图7中G,I-J)。

综上，在干旱处理下转基因烟草通过促进植物淀粉降解和可溶性糖积累，调节转基因植株干旱响应。利用上述方法，将该基因在植株中进行超表达，可显著增强植株的抗旱能力。

实施例6：VIGS干涉枳及阳性苗鉴定

1.载体构建

以枳cDNA为模板，设计特异引物扩增PtrABR1基因CDS中非保守区域约477bp左右的片段，并采用Trelief^TMSoSoo Cloning Kit(擎科，中国)一步法插入连接到pTRV2载体上BamH I及SmaI两个酶切位点之间，构建好的载体经测序正确后转入GV3101感受态。构建载体的引物如下：

pTRV2-PtrABR1-F(BamH I):

5’-AGAAGGCCTCCATGGGGATCCATGTGTTGCTGTATGCCAAAC-3’；

pTRV2-PtrABR1-R(Sma I):

5’-TGTCTTCGGGACATGCCCGGGTTTCCTCCTCGGCTCTGGCAC-3’。

2.VIGS侵染

从枳果实中分离种子，用1mol/L NaOH溶液浸泡15min去除果胶，再用无菌水冲洗2遍后，平铺于润湿的洁净纱布上，放于28℃培养箱黑暗条件下催芽，待种子幼芽萌发至1-2cm长时即可用于VIGS侵染。操作如下：

1)将TRV1、TRV2、TRV2-PtrABR1等农杆菌分别划线于LB(含50mg/L Rif、50mg/LKan)固体培养基上，28℃倒置培养2-3天后获得单克隆；

2)各挑取一个单克隆于5mL含相同抗生素的LB液体培养基中，28℃，220r/min，小摇24-48h，充分活化菌体；

3)将活化好的农杆菌菌液按照1:100的比例接种到含有相同的LB液体培养基中，28℃，220r/min，扩大培养10-12h后，4000r/min离心，收集菌体，加入MES缓冲液(10mmol/LMES,10mmol/L MgCl₂,150μmol/L AS,pH＝5.6-5.7)悬浮菌体，OD₆₀₀调至1.0；

4)按照1:1的比例分别混合TRV1与TRV2，TRV1与TRV2-PtrABR1两个组合的重悬液，混匀后于28℃培养箱暗培养2-3h即制备好侵染液；

5)用注射器针头在萌发幼芽上轻扎一些小孔，完全浸泡于准备好的农杆菌侵染液中，真空抽气10min，迅速放气使农杆菌浸入萌发的种子，重复3次。而后静置15min，将侵染好的种子取出晾在干滤纸上，静置2-3min后平铺于用无菌水浸湿滤纸的大皿中，室温培养室遮光放置2-3d暗培养；

6)用清水冲洗完成暗培养的种子，去除残留菌液，播种于基质中(土壤：蛭石＝3:1)，室温光照培养箱中生长一个月左右后进行阳性鉴定。

3.阳性材料鉴定

对VIGS沉默的枳阳性植株进行鉴定，以提取出的枳DNA为模板，采用两对引物进行PCR鉴定阳性植株，一是TRV1正反向引物，二是TRV2正向引物与目地基因重组载体构建的反向引物，序列分别如下：

TRV1-F：5’-ATTGAGGCGAAGTACGATGG-3’

TRV1-R：5’-CCATCCACAATTATTTTCCGC-3’

TRV2-F：5’-ATTCACTGGGAGATGATACGCT-3’

PtrABR1-R：5’-TTTCCTCCTCGGCTCTGGCAC-3’

结果如图8中A所示。

同时也通过实时荧光定量对阳性植株中PtrABR1基因的表达量进行检测(图8中B)。

实施例7：干涉PtrABR1枳的抗旱性鉴定

选取TRV-PtrABR1沉默系植株表达量抑制程度高的阳性植株挑选出来，进行19d干旱处理，处理前空载植株和沉默系植株长势没有明显差异，而干旱处理后，空载植株出现了轻微的黄化萎蔫，而TRV2-PtrABR1沉默系植株则已经出现了严重的叶片卷曲、黄化干枯、甚至死亡的现象(图9中A)，说明TRV2-PtrABR1干涉枳受到干旱胁迫伤害的程度更高。同时叶绿素成像系统表明，干旱处理后TRV2-PtrABR1沉默系植株光合强度均显著低于空载植株(图9中B)，Fv/Fm值也显著降低(图9中D)，表明TRV2-PtrABR1沉默系植株在干旱胁迫下的光合反应受到了严重的抑制。TRV2-PtrABR1沉默系植株干旱后电导率(图9中E)和MDA含量(图9中F)也显著高于空载植株，表明TRV2-PtrABR1沉默系植株相比较空载受到更大的干旱伤害。组织化学染色结果也表明TRV2-PtrABR1沉默系植株叶片积累了更多的H₂O₂和O₂ ^.-(图9中C)。同时，干旱处理后干涉系BAM酶活活性增加程度低于野生型柠檬(图9中G)。淀粉降解和可溶性糖积累受到明显抑制(图9中H-J)。

以上结果证明，沉默PtrABR1均可显著降低枳植株抗旱性，进一步证明了PtrABR1在提高植物抗旱性中的重要调控作用。

Claims (7)

1. 一种分离的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

2.编码权利要求1所述蛋白质的基因。

3. 根据权利要求2所述的基因，所述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

4.权利要求1所述蛋白质或权利要求2所述的基因在提高植物的抗旱性中的应用，所述的植物为烟草或柠檬。

5.根据权利要求4所述的应用，其应用过程包括：构建权利要求2所述基因的植物超表达载体，将其导入柠檬或烟草中。

6.干涉或沉默权利要求1所述蛋白质或权利要求2所述的基因在降低枳的抗旱性中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其应用过程包括：构建权利要求2所述基因的植物干涉载体，将其导入枳中。