CN111961122A - 一种棉花tbl34基因的优势等位基因及其编码蛋白和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种棉花TBL34基因的优势等位基因及其编码蛋白和应用，该基因包含如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的基因序列，分别命名为GhTBL34‑2或GhTBL34‑3。其编码蛋白含有SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。该优势等位基因可用于控制植物抗黄萎病。

Description

一种棉花TBL34基因的优势等位基因及其编码蛋白和应用

技术领域

本发明涉及生物工程领域，特别是涉及一种棉花TBL34基因的优势等位基因及其SNP及InDel变异，以及该优势等位基因的编码蛋白和应用。

背景技术

棉花黄萎病是棉花生产中的主要病害之一，对棉花生产造成严重的影响和损失，病原体从植物的根部或根茎中入侵，并寄生在维管束中。被感染的棉株叶片发黄、枯萎、脱落，根和茎的维管束也均变褐色，棉铃变小，脱铃率高，甚至导致整个植株枯死，严重影响棉花的产量和品质。

1891年，棉花黄萎病首次在美国被发现。随后，此病害迅速传播到全世界的主要棉花产区。1935年，我国通过引入美国棉种而引入该病原菌，然后随着棉花种子的运输而继续传播。目前，该病已经扩展到中国18个省、自治区的478个县(市)。许多棉花产区均出现该病害，并且中国北方产区比南方产区发病情况严重。该病导致棉花产量损失占多年平均产量的15-20％，在发病严重年份损失量可达50％，甚至造成绝产。上世纪90年代，该病的蔓延速度加剧。据调查估测，1995和1996年，每年大约2667000hm²的棉田遭受病害，皮棉产量损失约100000吨。2002年发病棉田已超过30000000hm²。因此，棉花黄萎病已成为影响我国棉花高产稳产的主要障碍。

目前，该病害的控制管理方法主要以防为主，有化学防治、利用农业措施、生物防治、选用抗病品种等。经过长期实践表明，利用化学、生物等方法防治棉花黄萎病均存在一定的局限性，选育和种植抗病品种才是最直接、最经济、最有效的措施。但是经过多年抗性鉴定结果表明，国内现存的棉花种质资源中对黄萎病高抗的材料较少，并且大都为海岛棉，陆地棉材料中70％以上为感病材料，达到高抗的材料不足1％。因此，高抗材料的缺乏是限制抗棉花黄萎病育种的主要因素。利用常规育种方法对棉花抗病性进行遗传改良，不仅育种周期长，而且效率低。

发明内容

本发明的目的是提供一种棉花TBL34基因的优势等位基因及其编码蛋白和应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案具体如下：

一种棉花TBL34基因的优势等位基因，包含如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的gDNA序列，长度分别为2129bp和2134bp，分别命名为GhTBL34-2或GhTBL34-3。

其中，所述GhTBL34-2基因或GhTBL34-3基因对应的非优势等基因为GhTBL34-1，序列如SEQ ID NO:1所示。

具体通过以下途径获得：

以16份抗感陆地棉种质材料的DNA为实验材料，扩增TBL34基因在16个品种中的gDNA序列，对获得的TBL34基因的gDNA序列比对分析，发现gDNA序列存在18处SNPs及1处Indel，形成了长度分别为2126bp、2129bp和2134bp的三个等位基因，其分别在216bp处存在10bp、4bp的缺失和不缺失，因此分别命名为GhTBL34-1、GhTBL34-2和GhTBL34-3(如图1)。

表1 16个抗(耐)感材料的病情指数

对三个等位基因在16份材料中的基因型分布和平均病情指数分析，发现GhTBL34-2和GhTBL34-3主要出现在抗(耐)病材料中，统计分析表明，含有GhTBL34-2基因型或GhTBL34-3基因型的材料在温室条件下和在病圃条件下的平均病情指数分别为28.20±5.62和27.04±3.28，而含有GhTBL34-1基因型的材料在温室条件下和在病圃条件下的平均病情指数分别为51.20±20.26和50.76±16.21，T测验表明含有GhTBL34-2基因型或GhTBL34-3基因型的材料的平均病情指数要显著低于含有GhTBL34-1基因型的材料(P＜0.001)，如图2。因此，推测GhTBL34-2和GhTBL34-3为目的基因的优势等位基因，而GhTBL34-1为非优势等位基因。

根据GhTBL34-1、GhTBL34-2、GhTBL34-3的gDNA序列获得这三个等位基因编码的蛋白序列分别如SEQ ID NO：4-6所示。

对gDNA序列进行基因结构分析发现，该基因含有5个外显子，4个内含子，10个SNPs及1处Indel变异位于内含子，8个SNPs变异位于外显子，位于外显子的8个SNPs中有两个发生有义突变，分别为位于gDNA序列第40位的SNP(碱基差异为A/G)导致gDNA编码蛋白第14位氨基酸由天冬酰胺(Asn，N)变为天冬氨酸(Asp,D)，位于gDNA序列第48位的SNP(碱基差异为C/A)导致gDNA编码蛋白第16位氨基酸由天冬酰胺(Asn,N)变为赖氨酸(Lys,K)。其中，优势等位基因GhTBL34-2和GhTBL34-3编码蛋白的氨基酸序列相同，在编码蛋白第14位氨基酸均为天冬氨酸(Asp,D),在编码蛋白第16位氨基酸均为赖氨酸(Lys,K)，说明编码蛋白第14位和第16位氨基酸分别为天冬氨酸(Asp,D)和赖氨酸(Lys,K)的棉花TBL34编码蛋白为抗黄萎病优势等位基因编码蛋白。

通过多序列比对分析，发现抗病品种海岛棉海7124的蛋白序列与抗病品种中植棉2号的蛋白序列同源性更高，其14位氨基酸都为天冬氨酸、16位氨基酸都为赖氨酸，推断海岛棉可能也具有陆地棉中的GhTBL34-2优势等位基因。对蛋白结构域进行预测发现都含有PMR5N与PC-Esterase结构域，及保守的GDS基序及DXXH基序。已有研究表明PC-Esterase及PMR5N结构域与植株耐冷抗冻等抗逆性有关。因而推测TBL34基因，尤其是GhTBL34-2及GhTBL34-3基因，可能是影响棉花抗病的优势等位基因，而这个基因在优异抗病品种海岛棉海7124中也发挥着作用。因此，以海岛棉海7124为实验材料，克隆得到GbTBL34的CDS序列，其全长为972bp，编码产生323个氨基酸，含有较多的亮氨酸(Leu)，属于不稳定的亲水性蛋白。含有27个磷酸化位点，主要存在无规则卷曲、α螺旋和部分β折叠，无其它特殊结构。

本发明所述的优势等位基因的编码蛋白，该所述编码蛋白含有SEQ ID NO:5或SEQID NO:6所示的氨基酸序列。

本发明所述优势等位基因的表达载体。

本发明所述优势等位基因的宿主细胞。

本发明所述优势等位基因的转化植物细胞。

本发明所述优势等位基因在控制植物抗黄萎病中的应用。

其中，所述植物为棉花。

其中，所述植物为拟南芥。

棉花是常异花授粉作物，同时又是异源四倍体，大部分功能基因在基因组中都具有2个以上的同源序列，这些同源序列之间高度同源，并且存在大量的SNP变异；另一方面，同一个基因的序列变异产生的多个等位基因之间也存在许多SNP变异，这些序列变异导致了显性基因和隐性基因的差别。由于常异花授粉导致大部分棉花品种很难达到100％的纯合率，从而使得许多基因在棉花中实际上处于杂合状态。因此，在进行基因克隆的时候，如何正确区分显性基因、隐性基因，以及如何正确区分显隐性基因和同源基因，是成功克隆到控制表型的优势等位基因的关键。然而目前传统的基因克隆，大部分利用同源序列法直接从现有棉花品种克隆功能基因，在克隆之前根本没有考虑品种中显性基因和隐性基因的序列差异，也没有考虑品种中这些基因位点是否处于纯合状态，这样利用同源序列法有可能克隆到目标基因的同源序列而不是目标序列本身，从而导致后期的转基因功能验证出现偏差。

本发明的优势等位基因可以在棉花抗黄萎病中发挥重要的作用。本发明首先克隆目标基因的gDNA序列，通过序列变异分析获得目标基因的优势等位基因，进一步针对优势等位基因进行基因克隆，从而就可以克隆到真正的优势等位基因，避免了传统基因克隆有可能克隆出非优势等位基因的弊端。

另外，本发明还发现了优势等位基因GhTBL34-2和GhTBL34-3主要出现在抗病材料中，而非优势等位基因主要出现在感病材料中，因此就可以利用附图1中的18处SNPs及1处Indel进行材料抗病性的快速鉴定，即凡是含有附图2中的优势等基因基因型(AATTGGAAAATTTTGGNNCCAAAAAACCCCTTIN)的材料均为抗病材料，凡是含有附图2中的非优势等位基因型(CCCCAACCGGCCCCAAGGTTGGGGCCTTTTAANN)的材料均为感病材料。

通过对组织表达特异性分析发现TBL34基因在接菌的抗(耐)黄萎病的实验材料中显著上调表达，尤其是在抗病材料海7124中更为显著，而在感病材料的根部组织中下调表达。推测TBL34在抗病材料中更易被激活表达。

利用VIGS技术，在海7124中沉默GbTBL34基因，接菌处理后发现，沉默目的基因的实验组植株叶片变黄、脱落甚至枯死；接菌15d和30d后，实验组的病情指数为29.4和43.6，均显著高于对照植株的9.8和23.2。通过基因沉默效率检测、大丽轮枝菌恢复、台盼蓝染色等实验进一步证明沉默GbTBL34基因的棉株抗黄萎病能力被明显削弱，侧面验证了GbTBL34基因可能参与棉花的抗黄萎病调控。

下面结合附图说明和具体实施例对本发明所述的棉花TBL34基因的优势等位基因及其编码蛋白和应用作进一步说明。

附图说明

图1中(a)～(d)为本发明的优势等位基因中的SNP位点及InDel位点。

图2是本发明的三个等位基因在不同抗感材料中分布的散点图(a)及不同环境中的平均病情指数差异(b)、(c)。其中，GhTBL34-2和GhTBL34-3基因型为AATTGGAAAATTTTGGNNCCAAAAAACCCCTTIN；GhTBL34-1基因型为CCCCAACCGGCCCCAAGGTTGGGGCCTTTTAANN；

(a)种质编号见表1；

(b)、(c)的中线表示中位数；箱的上下限表示数据的上下四分位；两条延伸线表示数据的极值；离群点表示异常值；**表示0.01水平的极显著。

图3为棉花根部组织总RNA电泳图，图中M为分子量Marker，1自上到下分别为RNA的28S、18S、5S带型。

图4为利用GbTBL34两端的5’非编码区和3’非编码区的特异性引物对海岛棉7124的cDNA进行基因扩增图，其中，1为扩增出的目的片段，即GbTBL34编码基因片段，M为分子量Marker。

图5为GbTBL34目的基因片段与克隆T载体连接后，大肠杆菌在含有卡那霉素的LB培养基中培养过夜后长出的阳性白色克隆。

图6为GbTBL34在黄萎病菌诱导后在海岛棉和陆地棉中的荧光定量PCR分析；

图7为GbTBL34蛋白质的磷酸化位点预测；

图8为GbTBL34蛋白质的跨膜结构域分析，其中，图中三根线由上至下依次表示transmembrane、outside和inside；

图9为GbTBL34基因的同源基因在A组和D组染色体上的位置；

图10为GbTBL34及其同源基因的保守结构域分析；

图11为GbTBL34目的基因与超表达载体PBI121连接后在含有卡那霉素的LB固体培养基中长出的白色克隆。

图12为PBI121-GbTBL34植物重组表达载体的PCR检测；其中，1和2为PCR产物，M为分子量Marker；

图13为含有GbTBL34的重组质粒为模板，扩增获得目的基因VIGS片段；其中，M为分子量Marker，1-2为目的基因VIGS片段；

图14为GbTBL34目的基因VIGS片段与病毒载体TRV连接后在含有卡那霉素的LB培养基中长出白色克隆；

图15为注入含pYL156-PDS载体VIGS悬浮液的棉花阳性对照植株在注射一周后变化图；

图16为注入含不同载体VIGS悬浮液的棉花植株在黄萎病菌处理一周后的发病情况；pTRV2:00为注入含pYL156空载体VIGS悬浮液的棉花植株，pTRV2:GbTBL34为注入含pYL156-GbTBL34载体VIGS悬浮液的棉花植株。

具体实施方式

实施例1

1、总DNA及RNA提取和反转录

采用天根公司的植物基因组DNA提取试剂盒用于提取DNA，实验样品为陆地棉抗/感种质，已冻存于-80℃，具体步骤参照试剂盒说明书。提取合格后将gDNA样品于-20℃保存。

采用天根公司的植物多糖多酚总RNA提取试剂盒提取RNA，实验样品为中植棉2号、冀棉11和海岛棉7124，实验按说明进行(如图3)。

cDNA的合成采用反转录试剂盒

II Q Select RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)(Vazyme公司)。操作方法如下：

1)基因组DNA去除

表2

试剂	使用量
		RNase-free ddH<sub>2</sub>O	To 16μl
4×gDNA wiper Mix	4μl
		Oligo(dT)23VN(10μM)	1μl
or/and Random hexamers(50ng/μl)	1μl
		or Gene specific primers(2μM)	1μl
模板RNA	Total RNA 1pg-1ug

用移液器轻轻吹打混匀。42℃2min。

2)配置反转录反应体系

试剂	使用量
		步骤1的反应液	16μl
5×HiScript II Select qRT SuperMix II	4μl
		Total	20μl

移液器轻轻吹打混匀。

3)进行反转录反应

用PCR仪控温，52℃反应15min,85℃反应5sec，后置于-20摄氏度保存。

如果模板具有复杂二级结构或高GC区域，可将反应温度提高至55℃，有助于提高产量。

2、基因片段的分离与获得

为了克隆TBL34完整的编码序列(Coding sequence，CDS)，将转录组数据库中TBL34序列与雷蒙德氏棉的CDS数据库进行本地比对，获得与之序列相似性最大的序列，然后以其两端的5’非编码区和3’非编码区设计特异性引物，利用Primer 5.0设计引物，由金唯智公司合成。引物如下(序列如SEQ ID NO：7-8所示)：

表3TBL34引物序列

以海岛棉7124的cDNA为模板，使用新合成的特异引物进行基因扩增，合成目的片段，即TBL34完整的编码序列CDS。

PCR反应体系为20μl：ddH₂O 11.6μl，10xPCR Buffer for KOD-Plus-Neo 2μl，2mMdNTP2μl，25mM MgSO₄ 0.8μl，模板cDNA 2μl，Primer(10μmol·L^-1)各0.6μl，KOD-Plus-Neo(1U/μL)0.4μl。

PCR反应程序为：94℃预变性10min；98℃变性30s，60℃30s，72℃90s，反应34个循环；72℃延伸10min，4℃保存；如图4所示，扩增出的目的基因片段大小为1000bp，与估测的大小相符。

3、目的片段胶回收

若上述步骤获得的PCR产物无非特异性扩增，进行DNA纯化后可直接与克隆T载体连接。若PCR扩增获得的目的片段有非特异性片段，则需先进行胶回收，去除杂带后再与T载体连接。胶回收具体步骤如下：

1)使用TAE缓冲液制作1.0％的琼脂糖凝胶，然后对目的DNA进行琼脂糖凝胶电泳。

2)DNA电泳结束后，在紫外灯下快速切下含目的DNA片段的凝胶，建议用纸巾吸尽凝胶表面液体并切碎，并尽量去除多余的凝胶。称取凝胶重量(去除空管重量)，100mg凝胶等同于100μl体积，作为一个凝胶体积。

3)加入等倍体积Buffer GDP。50-55℃水浴7-10min，根据凝胶大小适当调整时间，确保凝胶块完全溶解。水浴期间颠倒混匀2次加速溶胶。

Buffer GDP加入1-3倍体积不影响DNA回收率。若回收小于或等于100bp DNA片段时，加入3倍体积Buffer GDP，水浴溶胶后，再加入1倍凝胶体积异丙醇，混匀后再按第3步进行操作。

4)短暂离心收集管壁上的液滴。将FastPure DNA Mini Columns-G吸附柱置于Collection Tubes 2ml收集管中，把≤700μl溶胶液转移至吸附柱中，12,000×g离心30-60sec。若溶胶体积大于700μl，把吸附柱置回收集管中，剩余的溶胶液转移至吸附柱中，12000×g离心30-60sec。

5)弃滤液，把吸附柱置于收集管中。加入300μl Buffer GDP至吸附柱中。静置1min。12,000×g离心30-60sec。

6)弃滤液，把吸附柱置于收集管中。加入600μl Buffer GW(已加入无水乙醇)至吸附柱中。12,000×g离心30-60sec。

7)重复步骤6。

两次使用Buffer GW冲洗能确保盐份被完全清除，消除对后续实验的影响。

8)弃滤液，把吸附柱置回收集管中。12,000×g离心2min。

9)将吸附柱置于在1.5ml灭菌的离心管中，加入7-30μl Elution Buffer至吸附柱中央，放置2min。12,000×g离心1min。弃去吸附柱，把DNA保存于-20℃。

若需要获得最高产量，建议将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，重复第8步进行二次洗脱。回收大于3KB的片段时，建议将Elution Buffer预热至55℃以提升回收效率。

10)胶回收后的目的片段进行琼脂糖凝胶电泳，检测胶回收效率。

4、目的片段与克隆T载体连接

克隆T载体选用的是pEASY-Blunt Zero Cloning Kit使用TAE缓冲液制作1.0％的琼脂糖凝胶，然后对目的DNA进行琼脂糖凝胶电泳。该载体通过自杀基因表达与否筛选阳性重组子，当目的片段与载体连接成功时，自杀基因无法正常表达，包含重组载体的细胞就可以正常生长；当目的片段与载体未连接成功时，自杀基因就会正常表达，包含该载体的细胞就无法正常生长，即“zero”背景，适用于平末端克隆。该载体包含卡那霉素和氨苄青霉素两种筛选标记。

1)克隆反应体系

连接体系：

表4

Compoent	Volume
		PCR product	0.5-4μl
pEASY-Blunt Zero Cloning vector	1μl

轻轻混合，室温(20℃-37℃)反应5分钟。反应结束后，将离心管置于冰上。

2)推荐克隆反应条件

A.最佳插入片段DNA量载体与片段摩尔比＝1：7，可以粗略的按照“1kb 20ng”的比例计算。(如1kb加20ng、1.5kb加30ng等)；

B.最佳载体使用量：1μl；

C.最佳反应体系3-5μl，体积不足时可以补充无菌水。

D.连接反应时间：

表5

片段大小	时间
		0.1-1kb	5-10min
1-2kb	10-15min
		2-3kb	15-20min
>3kb	20-30min

注：片段为胶回收产物时，反应时间取最大值。

E.连接反应的温度：最佳连接温度为25℃，最好采用PCR仪控温(上盖温度设为40℃)。

5、重组T载体向大肠杆菌DH5α感受态转化

1)加连接产物于50μl DH5α感受态细胞中(在感受态细胞刚刚解冻时加入连接产物)，轻弹混匀，冰浴30分钟。

2)42℃水浴热激30秒，然后快速转移至冰浴2分钟，注意该过程不要摇动离心管。

3)向离心管中加入500μl无菌的SOC或LB培养基(不含抗生素)，混匀后置于37℃，200rpm培养1小时，使细菌复苏。

4)4000rpm离心1min，弃掉部分上清，保留100-150μl，轻弹悬浮菌体，取全部菌液涂板(含氨苄霉素的固体LB培养基)，37℃恒温培养箱中培养过夜。

注：1L LB培养基需加10g蛋白胨，5g酵母粉，10g NaCl；若配制固体培养基需再加入15g琼脂粉。

6、阳性克隆的鉴定和测序

1)用灭菌枪头挑取白色菌落于500μl含氨苄霉素的LB液体培养基中(终浓度为50mg/L)，吹打混匀后，置于37℃，200rpm培养4-6小时。

2)取1μl混合菌液于20μl PCR反应体系中，用特异引物TBL34-F/R鉴定阳性克隆。

反应体系如下：

表6

3)PCR反应条件：94℃预变性10分钟，94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸(根据片段的大小确定延伸时间)30个循环，72℃后延伸10分钟，4℃保存。

4)PCR产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测。

5)在检测正确的菌液，取200μl至1.5ml离心管(用封口膜封好)送至公司测序，测序引物用通用引物M13 Forward Primer和M13 Reverse Primer。

目的片段与克隆T载体连接成功后，阻止T载体上自杀基因的表达，大肠杆菌则可以正常生长繁殖，如图5为大肠杆菌在含有氨苄霉素的LB培养基中培养过夜后长出的白色克隆。挑取上述白色克隆进行PCR检测其是否为阳性克隆，选取阳性克隆送去金唯智公司测序，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1-3所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4-6所示。

7、组织特异性分析

1)研究黄萎病菌诱导后棉花子叶中基因表达特异性，总RNA的提取及cDNA的合成方法同上。

2)荧光定量引物(SEQ ID NO：9-10所示)如表7：

表7 GbTBL34基因荧光定量引物序列

3)荧光定量分析

以Actin基因为内参基因，分别利用特异性引物进行荧光定量PCR分析四个品种叶片组织的抗性相关基因在黄萎病病原菌诱导下的表达量。

通过荧光定量PCR分析TBL34的组织表达特异性，结果如附图6所示：GbTBL34在黄萎病菌诱导12h后，在陆地棉抗病种质中植棉2号中显著上调表达；诱导24h后，在海岛棉抗病种质海7124中显著上调表达；而在陆地棉感病种质冀棉11中显著下调表达。

TBL(trichome birefringrnce-like)家族与细胞壁半纤维素乙酰化有关，有研究表明TBL蛋白可能是木聚糖乙酰化所需的特定乙酰转移酶。而TBL34基因荧光定量分析表明，该基因接菌处理诱导后，在抗病种质中表达量显著上升，而在感病种质中表达量显著下调表达。在此推测，该基因在抗病材料中表达较多从而利于抗病，而在感病材料中表达较少，从而抗病性被削弱。

综上所述，该基因能在棉花抗黄萎病中发挥重要的作用，因此，本实验克隆其完整的基因编码区，为进一步验证该基因功能打下基础。通过荧光定量PCR分析这该基因的组织特异性表达情况，结果表明，该基因在不同品种中的叶中的表达量不同。

实施例2棉花TBL34基因的生物信息学分析

1、TBL34蛋白序列的理化特性分析

利用Compute PI/MW软件和Protparam软件(http://web.expasy.org/protparam/)预测棉花TBL34蛋白序列的等电点和分子量及相关理化性质，利用NetPhos2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)预测磷酸化位点，采用TMHMM软件预测蛋白的跨膜螺旋区，采用TargetP对蛋白进行亚细胞定位预测。

用Protparam软件(http://web.expasy.org/protparam/)分析蛋白质的理化性质，在TBL34蛋白中的Leu、Val、Glu、Ser这四种氨基酸的含量最高，分别达到9.0％、7.4％、6.5％、6.5％。预测结果表明带正电荷的氨基酸残基数为39个，带负电荷的氨基酸残基数为38个，因此该蛋白质带正电。蛋白的不稳定系数为54.65，该蛋白属于不稳定蛋白。该蛋白的亲疏水性平均系数(GRAVY)为-0.498，负值说明蛋白亲水性较强。

利用NetPhos 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)预测蛋白质的磷酸化位点，结果如图7所示，Ser磷酸化位点有16个、Thr磷酸化位点有6个、Tyr磷酸化位点5个。

通过TMHMM软件分析跨膜结构域，如图8所示，该蛋白没有跨膜结构域，不是跨膜蛋白。

通过TargetP软件，分析其所在的亚细胞位置，未发现信号肽，也不存在叶绿体和线绿体内，因此，推测该蛋白可能在细胞质中发挥作用。

2、染色体物理分布定位

利用GbTBL34比对棉花基因数据库(https://cottonfgd.org/)，获得与之同源四个棉种的TBL34基因，然后利用Perl程序对比对获得的基因组数据的信息文件(gff3)进行解析，然后根据TBL34基因在染色体上的位置信息及染色体的长度信息，利用MapChart2.1绘制基因在染色体上的物理分布图。

GbTBL34基因通过与棉花数据库比对，分别找到3个同源基因，如表8所示，通过Compute PI/MW tool软件预测其蛋白质的分子量和等电点。利用MapChart2.1软件绘制其同源基因在A组和D组染色体上的位置，如图9所示。

表8 GbTBL34基因比对棉花基因组数据库

3、保守结构域分析及进化树的构建

利用SMART软件对棉花TBL34蛋白的结构域进行分析，然后利用DNAMAN对棉花TBL34蛋白及与之同源中的TBL34蛋白进行联配。在UniProt KB蛋白数据库中搜寻不同棉属及其他植物中的TBL蛋白，并利用MEGA5.1构建进化树，分析其进化关系。

利用SMART软件分析棉花TBL34及同源基因的保守结构域，结果表明，该类蛋白均含有TBL基因家族含有的PMR5N(PF14416)与PC-Esterase(PF13839)结构域，并含有其所特有的GDS基序DCXHWCLPGXXDXWN(DXXH)基序，通过DNAMAN对这组同源基因进行联配，结果如图10所示。结果表明，这组同源基因序列高度相似。

实施例3GbTBL34转基因植株相关分析

1、重组表达载体的构建

1)引物的设计

采用In-Fusion技术构建重组植物表达载体，该技术是在克隆引物的两端分别引入与表达载体插入位点两端各15个碱基，然后通过同源融合，使目的基因正确插入植物表达载体中。根据GbTBL34基因的非编码区设计特异引物，在特异性上下游引物5’端各加上15个碱基，15个碱基分别为BamHI和SacI酶切位点两侧的15个碱基。在线设计引物网址为http://bioinfo.clontech.com/infusion/convertPcrPrimersInit.do引物序列(如SEQID NO：11-12所示)见下表9。

表9用于扩增GbTBL34基因编码区的引物序列

2)GbTBL34基因编码区的获得

以海岛棉7124的cDNA为模板，以上步骤设计的引物进行PCR，扩增出TBL34基因的CDS编码区。PCR反应体系及反应程序同第三章基因克隆。

PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳，若没有杂带，则可以经过纯化后直接进行下一步实验；若有杂带，则需要先进行胶回收。步骤与同源序列克隆时胶回收过程。

3)PBI121-GbTBL34植物重组表达载体的构建

A.酶切：首先用限制性内切酶BamHI和SacI双酶切植物表达载体pBI121，将载体中GUS基因酶切下来。酶切体系共50μL如下：SacI 2.5μL，BamHI 2.5μL，PBI121 2.5μL，10xK2.5μL，dd H₂O 40μL，后37℃水浴3h或过夜。

B.连接：将2)中扩增出的目的片段同酶切后的表达载体进行连接，连接体系共10μL如下：酶切PBI 121载体3μL，目的片段4μL，5×CEII 2μL，ExnaseII 1μL，ddH₂O补足至10μL。反应条件：37℃PCR仪控温30min，然后置于冰上。

C.转化：转化至大肠杆菌DH5α，经卡那霉素(Kan)筛选后，挑取生长良好的克隆进行PCR检测。PCR检测时用的引物为35S和NOSR，构建的植物表达载体命名为PBI121-TBL34。

4)重组表达载体PBI121-TBL34转化农杆菌

转化步骤如下：

A.取感受态细胞LBA4404 50ul，于融溶状态加入10-100ng重组质粒(1-2ul),吹打混匀。

B.冰浴5min，液氮冷却5min，37℃水浴5min，冰浴5min。

C.加入700μL不含抗生素的LB液体培养基，28℃200rpm培养4-6h。

D.6000rpm离心后去掉上清，保留200ul，悬浮菌体，涂含卡那霉素和利福平的LB板，28℃暗培养48-72h。

E.挑取单克隆，用通用引物35S和NOSR进行PCR检测。

5)PBI121-GbTBL34植物重组表达载体的构建

目的片段与酶切好的PBI 121载体进行融合连接，转入大肠杆菌DH5α后，在含有卡那的LB固体培养基中过夜培养后长出白色克隆，如图11所示。

挑取单克隆进行阳性鉴定，结果如图12所示，片段大小均为预期大小。可以进行后续转化农杆菌实验。

2、VIGS载体pYL156-42734的构建

本发明选择的病毒载体为烟草脆裂病毒TRV，载体选用pYL156载体。

1)引物设计：

引物设计要求目的片段大小100-400bp，且选择的酶切位点必须是病毒载体上含有，但目的片段上不含有，本实验选择的酶切位点为BamHI和SacI。引物(如SEQ ID NO：13-14所示)见表10。

表10用于扩增目的基因VIGS片段的引物序列

2)扩增目的基因VIGS片段

以含GbTBL34 CDS序列的重组质粒模板，及合成的特异性引物PCR扩增出目的片段。PCR反应体系及反应程序同上述获得目的基因时的程序。PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳，若没有杂带，则可以经过纯化后直接进行下一步实验；若有杂带，则需要先进行胶回收。步骤同上。

3)pYL156-TBL34载体的构建

A.酶切：首先用限制性内切酶BamHI和SacI双酶切植物表达载体pYL156，酶切体系共50μL如下：SacI 2.5μL，BamHI 2.5μL，pYL156 2.5μL，10xK 2.5μL，dd H₂O 40μL，后37℃水浴3h或过夜。

B.连接：将2)中扩增出的目的片段同酶切后的表达载体进行连接，连接体系共10μL如下：酶切pYL156载体3μL，目的片段4μL，5×CEII 2μL，ExnaseII 1μL，ddH₂O补足至10μL。反应条件：37℃PCR仪控温30min，然后置于冰上。

C.转化：转化至大肠杆菌DH5α，经卡那霉素(Kan)筛选后，挑取生长良好的克隆进行PCR检测。PCR检测时用的引物为35S和NOSR，构建的植物表达载体命名为pYL156-TBL34。

3、pYL156-TBL34载体转化农杆菌GV3101

A.取感受态细胞GV3101 50ul，于融溶状态加入10-100ng重组质粒(1-2ul)，吹打混匀。

B.冰浴5min，液氮冷却5min，37℃水浴5min，冰浴5min。

C.加入700μL不含抗生素的LB液体培养基，28℃200rpm培养4-6h。

D.6000rpm离心后去掉上清，保留200ul，悬浮菌体，涂含卡那霉素和利福平的LB板，28℃暗培养48-72h。

E.挑取单克隆，用通用引物35S和NOSR进行PCR检测。

以含有GbTBL34 CDS序列的重组质粒为模板，扩增获得目的片段，经过检测，如图13所示，可知其片段大小符合要求，胶回收后可以进行下一步的连接转化实验。

先将VIGS目的片段与T载构建中间重组载体，转入大肠杆菌DH5α后，将阳性克隆送去公司测序检测，将含有目的片段的重组质粒提取出来，用SacI和BamH I分别双酶切重组质粒和病毒载体TRV，然后将二者用T4连接酶连接起来，转入大肠杆菌DH5α，在含有卡那霉素的LB中过夜培养，长出白色克隆如图14所示。

4、VIGS棉花植株的获得

本发明采用pYL156-PDS载体使植物中的叶绿体基因沉默表达，出现白化叶片，作为阳性对照。pYL156空载体作为阴性对照。

1)悬浮液的配置

悬浮液母液：MgCl₂ 1mol/L，MES 1mol/L,AS 50mmol/L

MgCl₂ 1mol/L:50ml水溶解4.75g MgCl₂，高压灭菌

MES 1mol/L:50ml水溶解9.75g MES，0.2微米孔径滤膜过滤除菌

AS 50mmol/L:5ml DMSO溶解0.04g AS，通风厨内进行

2)vigs具体操作步骤

A.包含pYL156-TBL34、pYL156-PDS、pYL156-192及pYL156空载体的农杆菌分别在含有卡那霉素及利福平的LB液体培养基卡那霉素(终浓度分别为50ug/ml及25ug/ml)中培养，28℃，200rpm培养至OD＝1.5。

B.4000rpm离心5min，弃上清。

C.用悬浮液等体积悬浮菌体至OD＝1.5，25℃静置4h后，将pYL156-TBL34、pYL156-PDS、pYL156空载体VIGS悬浮液分别于pYL156-192的VIGS悬浮液1:1混合。

D.用无菌注射器对生长10天左右的棉花幼苗子叶下表皮注射

E.黑暗处理24h后，将注射后的棉花幼苗在25℃光照培养箱中培养。

5、GbTBL34基因功能的鉴定

1)棉花注射VIGS液体约10天后，阳性对照出现白化叶片时，对棉花幼苗进行接菌处理。

2)黄萎病菌选用大丽轮枝菌Vd080，在查氏液体培养基中25℃，200rpm暗培养10d。

3)显微镜观察，并用血小板计数法计算孢子浓度，稀释至孢子数2×10⁷个·mL^-1。

4)待棉花发病，根据棉花的发病情况，初步鉴定目的基因在棉花黄萎病抗性中发挥的作用。

注射含pYL156-PDS载体VIGS悬浮液的棉花植株在注射一周后真叶逐渐白化，如图15所示，黄萎病菌处理一周后，初显病症，棉花子叶开始萎焉脱落，真叶的叶缘开始变黄、变脆，并向下卷曲。发病情况如图所示。图16分别为含pYL156空载体、pYL156-TBL34的VIGS海岛棉7124植株，可以看出，pYL156-42734的VIGS植株中个别真叶开始显病症，而pYL156空载体植株未发现病症。后续将注射pYL156空载体及pYL156-TBL34的VIGS海岛棉7124植株种植在同一实验钵内，并接菌，发现发病情况于前期一致。

表明通过构建VIGS载体注射棉花子叶后，待阳性对照出现白化性状时开始进行黄萎病菌诱导处理，接菌一周后逐渐开始显病症。从棉花的发病情况可以看出，在抗病材料海岛棉7124中，pYL156-TBL34的VIGS植株发病情况均比pYL156空载体VIGS植株严重。说明GbTBL34基因沉默表达后对黄萎病菌抗性减弱，初步验证GbTBL34基因对棉花黄萎病的抗性有一定的作用。

以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 中国农业科学院棉花研究所

<120> 一种棉花TBL34基因的优势等位基因及其编码蛋白和应用

<130> TQZX2020-ZL0322

<141> 2020-06-10

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2126

<212> DNA

<213> GhTBL34-1(GhTBL34-1)

<400> 1

atgtctgatc agttagcttg tgagaaattt gggagaaaaa accttaacta tcagttttgg 60

cgatggcaac ctcaccaatg tgacctcccc aggtctgttt tttccatata tatatatgtg 120

tgtatgcatg catgtattga agtattgaac catataaaga caaagagggg atggttatta 180

aatttgcatt tttgggaatg ctttaaaagt tttgtggaat gtttgcttgt tttatgttaa 240

taaggttcaa tgccacagca ttgctggaga agcttaggaa caagagactt gtttacgttg 300

gtgactcact caatagaaac caatgggttt caatggtttg cctggttgac tcagtcatct 360

ctccaacctt taaatcaatg cataacaatg gttcaatcaa cattttcaaa gccattgtga 420

gcctttttaa tattttccaa gttcagttta acagtggttt aatcatttat tgatctcatc 480

attttacatt ttgtgatata ttaaggaata taatgcaaca attgaattct actggtctcc 540

attgttggtg gaatcaaact ccgatgatcc aattagccat cgtgtaccgg atcggattgt 600

gagagttcag gcaatcgaaa agcatgcaag acattggact gatgctgatt atcttgtttt 660

taacacttat ctttggtgga gaagacgtca aatgaaggtc ttgtaagtac attttctgac 720

ctagctaaat taattagcac ctttatgtcg tccaagtttt aatttgatgt gggttttgag 780

tattaggtgg ggatcttttg aaagccccga agatggggta tttaaagcag taaagttgcc 840

gagagtatac gagatggcct tacagacatg ggcacaatgg ctggaggttc atgttgatag 900

aaacaagacc cagttgttct ttatcagcat gtcaccaact caccaaaagt atatatataa 960

tcttatctct tatttgttca tcaagagtaa tgaatttaga ttaaattaca gttttcgcct 1020

ctcaattatg ctcaaattag ctatctgatt catatatttt aatttagcat tatttgatcc 1080

ttaattttac aatgttgaag tgggattttt tttttctttc aaaaactccc ttctaactca 1140

tcatatggat attaattgtt ctttttgtgc attggaaggg tgtttttaag aaaaatcccc 1200

ctcaacattt agttaaatgt gttaactatt tgaactaggc caaattgtag ttttggtccc 1260

tctaggatgc ttaaatttgg gatttagcct tatacttttt tttgatgcaa tgttaacctc 1320

tcatctatca ttaaatagga ggaaaatatg tttaagcata cttgaactga cgcaatgtca 1380

gtcgaactat gacttaaaac aataattagc ccttatattt taattaacac aatttgatct 1440

ctctactttt ataatatatg ccattagtta attcaaatag ttaacataat caatcattct 1500

tattgaaatg ctaatgtaga ttttttctta aatacaagtt gtggaactcg tttgacgatg 1560

attttgcgtt ggaaggggtg ttttaagaaa accccccacg ttagcatttc aaccataata 1620

aagctattaa ctaattgaaa ctagttcaaa ttttgatttt ggtcctttta ctatgctcaa 1680

attttgactt tagtttttat attttaatag tacactttga tctctctatt tttataatgt 1740

tgttagttta aatagttaac acaatcaatc atttcagggc aaataaatgg ggcggaatca 1800

aaggtgaaaa ttgttatagt gaaactgaac cggttaccga agaagaatac gttggagacg 1860

gagcgagtcc gaggatgatg cgcgtagttg atagcgtact tggtgaactg aaaacaagag 1920

ggttgaacgt ccaaatgatt aacattacac agctatcaga ttacaggaaa gaaggccatc 1980

catcaatata taggaagcat tgggaaacaa taacggaaga acaattattg aatcccaaaa 2040

attactcgga ttgtatccat tggtgcctcc ccggagtgcc tgatgtgtgg aacgagttgc 2100

tctacgctta cattcttgaa ctttga 2126

<210> 2

<211> 2129

<212> DNA

<213> GhTBL34-2(GhTBL34-2)

<400> 2

atgtctgatc agttagcttg tgagaaattt gggagaaaag accttaaata tcagttttgg 60

cgatggcaac ctcaccaatg tgacctcccc aggtctgttt tttccatata tatatgtatg 120

tatgtatgta tgtatgtatg tattgaagtg ttgaaccata taaagacaaa gaggggatgt 180

tattaaattt gcatttttgg gaatgcttta aaagttttgt ggaatgtttg cttgttttat 240

gttaataagg ttcaatgcca cagcattgct ggagaagctt aggaacaaga gacttgttta 300

cgttggtgac tcactcaata gaaaccaatg ggtttcaatg gtttgcctgg ttgactcagt 360

catctctcca acctttaaat caatgcacaa caatggttca atcaacattt tcaaagccat 420

tgtgagcctt tttaatattt tccaagttca gtttaacagt gatttaatca tttattgatc 480

tcatcatttt acattttgtg atatattaag gaatataatg caacaattga attctactgg 540

tctccattgt tggtggaatc aaactccgat gatccaatta gccatcgtgt accggatcga 600

attgtgagag ttcaggcaat agaaaagcat gcaagacatt ggactgacgc tgattatctt 660

gtttttaaca cttatctttg gtggagaaga cgtcaaatga aggtcttgta agtacatttt 720

ccgacctagc tatattaatt agcaccttta tgtcgtccaa gttttaattt gatgtgggtt 780

ttgattatta ggtggggatc ttttgaaagc cccgaagatg gggtatttaa agcagtaaag 840

ttgccgagag tatacgagat ggccttacag acatgggcac aatggctgga ggttcatgtt 900

gatagaaaca agacccagtt gttctttatc agcatgtcac caactcacca aaagtatata 960

tataatctta tctcttattt gttcatcaag agtaatgaat ttagattaaa ttacagtttt 1020

cgcctctcaa ttatgctcaa attagctatc tgattcatat attttaattt agcattattt 1080

gatccttaat tttacaatgt tgaagtggga tttttttttc tttcaaaaac tcccttctaa 1140

ctcatcatat ggatattaat tgttcttttt gtgcattgga agggtgtttt taagaaaaat 1200

ccccctcaac atttagttaa atgtgttaac tatttgaact aggccaaatt gtagttttgg 1260

tccctctagg atgcttaaat ttgggattta gccttatact ttttttgatg caatgttaac 1320

ctctcatcta tcattaaata ggaggaaaat atgtttaagc atacttgaac tgacgcaatg 1380

tcagtcgaac tatgacttaa aacaataatt agcccttata ttttaattaa cacaatttga 1440

tctctctact tttataatat atgccattag ttaattcaaa tagttaacat aatcaatcat 1500

tcttattgaa atgctaatgt agattttttc ttaaatacaa gttgtggaac tcgtttgacg 1560

atgattttgc gttggaaggg gtgttttaag aaaacccccc acgttagcat ttcaaccata 1620

ataaagctat taactaattg aaactagttc aaattttgat tttggtcctt ttactatgct 1680

caaattttga ctttagtttt tatattttaa tagtacaatt tgatctctct atttttataa 1740

tgttgttagt ttaaatagtt aacacaatca atcatttcag ggcaaataaa tggggcggaa 1800

tcaaaggtga aaattgttat agtgaaactg aaccggttac cgaagaagaa tacgttggag 1860

acggagcgag tccgaggatg atgcgcgtag ttgatagcgt acttggtgaa ctgaaaacaa 1920

gagggttgaa cgtccaaatg attaacatta cacagctatc agattacagg aaagaaggcc 1980

atccatcaat atataggaag cattgggaaa caataacgga agaacaatta ttgaatccca 2040

aaaattactc ggattgtatc cattggtgcc tccccggagt gcctgatgtg tggaacgagt 2100

tgctctacgc ttacattctt gaactttga 2129

<210> 3

<211> 2134

<212> DNA

<213> GhTBL34-3(GhTBL34-3)

<400> 3

atgtctgatc agttagcttg tgagaaattt gggagaaaag accttaaata tcagttttgg 60

cgatggcaac ctcaccaatg tgacctcccc aggtctgttt tttccatata tatatgtatg 120

tatgtatgta tgtatgtatg tatgtattga agtgttgaac catataaaga caaagagggg 180

atgttattaa atttgcattt ttgggaatgc tttaaaagtt ttgtggaatg tttgcttgtt 240

ttatgttaat aaggttcaat gccacagcat tgctggagaa gcttaggaac aagagacttg 300

tttacgttgg tgactcactc aatagaaacc aatgggtttc aatggtttgc ctggttgact 360

cagtcatctc tccaaccttt aaatcaatgc acaacaatgg ttcaatcaac attttcaaag 420

ccattgtgag cctttttaat attttccaag ttcagtttaa cagtgattta atcatttatt 480

gatctcatca ttttacattt tgtgatatat taaggaatat aatgcaacaa ttgaattcta 540

ctggtctcca ttgttggtgg aatcaaactc cgatgatcca attagccatc gtgtaccgga 600

tcgaattgtg agagttcagg caatagaaaa gcatgcaaga cattggactg acgctgatta 660

tcttgttttt aacacttatc tttggtggag aagacgtcaa atgaaggtct tgtaagtaca 720

ttttccgacc tagctatatt aattagcacc tttatgtcgt ccaagtttta atttgatgtg 780

ggttttgagt attaggtggg gatcttttga aagccccgaa gatggggtat ttaaagcagt 840

aaagttgccg agagtatacg agatggcctt acagacatgg gcacaatggc tggaggttca 900

tgttgataga aacaagaccc agttgttctt tatcagcatg tcaccaactc accaaaagta 960

tatatataat cttatctctt atttgttcat caagagtaat gaatttagat taaattacag 1020

ttttcgcctc tcaattatgc tcaaattagc tatctgattc atatatttta atttagcatt 1080

atttgatcct taattttaca atgttgaagt gggatttttt tttctttcaa aaactccctt 1140

ctaactcatc atatggatat taattgttct ttttgtgcat tggaagggtg tttttaagaa 1200

aaatccccct caacatttag ttaaatgtgt taactatttg aactaggcca aattgtagtt 1260

ttggtccctc taggatgctt aaatttggga tttagcctta tacttttttt tgatgcaatg 1320

ttaacctctc atctatcatt aaataggagg aaaatatgtt taagcatact tgaactgacg 1380

caatgtcagt cgaactatga cttaaaacaa taattagccc ttatatttta attaacacaa 1440

tttgatctct ctacttttat aatatatgcc attagttaat tcaaatagtt aacataatca 1500

atcattctta ttgaaatgct aatgtagatt ttttcttaaa tacaagttgt ggaactcgtt 1560

tgacgatgat tttgcgttgg aaggggtgtt ttaagaaaac cccccacgtt agcatttcaa 1620

ccataataaa gctattaact aattgaaact agttcaaatt ttgattttgg tccttttact 1680

atgctcaaat tttgacttta gtttttatat tttaatagta caatttgatc tctctatttt 1740

tataatgttg ttagtttaaa tagttaacac aatcaatcat ttcagggcaa ataaatgggg 1800

cggaatcaaa ggtgaaaatt gttatagtga aactgaaccg gttaccgaag aagaatacgt 1860

tggagacgga gcgagtccga ggatgatgcg cgtagttgat agcgtacttg gtgaactgaa 1920

aacaagaggg ttgaacgtcc aaatgattaa cattacacag ctatcagatt acaggaaaga 1980

aggccatcca tcaatatata ggaagcattg ggaaacaata acggaagaac aattattgaa 2040

tcccaaaaat tactcggatt gtatccattg gtgcctcccc ggagtgcctg atgtgtggaa 2100

cgagttgctc tacgcttaca ttcttgaact ttga 2134

<210> 4

<211> 323

<212> PRT

<213> GhTBL34-1蛋白序列(GhTBL34-1蛋白)

<400> 4

Met Ser Asp Gln Leu Ala Cys Glu Lys Phe Gly Arg Lys Asn Leu Asn

1 5 10 15

Tyr Gln Phe Trp Arg Trp Gln Pro His Gln Cys Asp Leu Pro Arg Phe

20 25 30

Asn Ala Thr Ala Leu Leu Glu Lys Leu Arg Asn Lys Arg Leu Val Tyr

35 40 45

Val Gly Asp Ser Leu Asn Arg Asn Gln Trp Val Ser Met Val Cys Leu

50 55 60

Val Asp Ser Val Ile Ser Pro Thr Phe Lys Ser Met His Asn Asn Gly

65 70 75 80

Ser Ile Asn Ile Phe Lys Ala Ile Glu Tyr Asn Ala Thr Ile Glu Phe

85 90 95

Tyr Trp Ser Pro Leu Leu Val Glu Ser Asn Ser Asp Asp Pro Ile Ser

100 105 110

His Arg Val Pro Asp Arg Ile Val Arg Val Gln Ala Ile Glu Lys His

115 120 125

Ala Arg His Trp Thr Asp Ala Asp Tyr Leu Val Phe Asn Thr Tyr Leu

130 135 140

Trp Trp Arg Arg Arg Gln Met Lys Val Leu Trp Gly Ser Phe Glu Ser

145 150 155 160

Pro Glu Asp Gly Val Phe Lys Ala Val Lys Leu Pro Arg Val Tyr Glu

165 170 175

Met Ala Leu Gln Thr Trp Ala Gln Trp Leu Glu Val His Val Asp Arg

180 185 190

Asn Lys Thr Gln Leu Phe Phe Ile Ser Met Ser Pro Thr His Gln Lys

195 200 205

Ala Asn Lys Trp Gly Gly Ile Lys Gly Glu Asn Cys Tyr Ser Glu Thr

210 215 220

Glu Pro Val Thr Glu Glu Glu Tyr Val Gly Asp Gly Ala Ser Pro Arg

225 230 235 240

Met Met Arg Val Val Asp Ser Val Leu Gly Glu Leu Lys Thr Arg Gly

245 250 255

Leu Asn Val Gln Met Ile Asn Ile Thr Gln Leu Ser Asp Tyr Arg Lys

260 265 270

Glu Gly His Pro Ser Ile Tyr Arg Lys His Trp Glu Thr Ile Thr Glu

275 280 285

Glu Gln Leu Leu Asn Pro Lys Asn Tyr Ser Asp Cys Ile His Trp Cys

290 295 300

Leu Pro Gly Val Pro Asp Val Trp Asn Glu Leu Leu Tyr Ala Tyr Ile

305 310 315 320

Leu Glu Leu

<210> 5

<211> 323

<212> PRT

<213> GhTBL34-2蛋白序列(GhTBL34-2蛋白)

<400> 5

Met Ser Asp Gln Leu Ala Cys Glu Lys Phe Gly Arg Lys Asp Leu Lys

1 5 10 15

Tyr Gln Phe Trp Arg Trp Gln Pro His Gln Cys Asp Leu Pro Arg Phe

20 25 30

Asn Ala Thr Ala Leu Leu Glu Lys Leu Arg Asn Lys Arg Leu Val Tyr

35 40 45

Val Gly Asp Ser Leu Asn Arg Asn Gln Trp Val Ser Met Val Cys Leu

50 55 60

Val Asp Ser Val Ile Ser Pro Thr Phe Lys Ser Met His Asn Asn Gly

65 70 75 80

Ser Ile Asn Ile Phe Lys Ala Ile Glu Tyr Asn Ala Thr Ile Glu Phe

85 90 95

Tyr Trp Ser Pro Leu Leu Val Glu Ser Asn Ser Asp Asp Pro Ile Ser

100 105 110

His Arg Val Pro Asp Arg Ile Val Arg Val Gln Ala Ile Glu Lys His

115 120 125

Ala Arg His Trp Thr Asp Ala Asp Tyr Leu Val Phe Asn Thr Tyr Leu

130 135 140

Trp Trp Arg Arg Arg Gln Met Lys Val Leu Trp Gly Ser Phe Glu Ser

145 150 155 160

Pro Glu Asp Gly Val Phe Lys Ala Val Lys Leu Pro Arg Val Tyr Glu

165 170 175

Met Ala Leu Gln Thr Trp Ala Gln Trp Leu Glu Val His Val Asp Arg

180 185 190

Asn Lys Thr Gln Leu Phe Phe Ile Ser Met Ser Pro Thr His Gln Lys

195 200 205

Ala Asn Lys Trp Gly Gly Ile Lys Gly Glu Asn Cys Tyr Ser Glu Thr

210 215 220

Glu Pro Val Thr Glu Glu Glu Tyr Val Gly Asp Gly Ala Ser Pro Arg

225 230 235 240

Met Met Arg Val Val Asp Ser Val Leu Gly Glu Leu Lys Thr Arg Gly

245 250 255

Leu Asn Val Gln Met Ile Asn Ile Thr Gln Leu Ser Asp Tyr Arg Lys

260 265 270

Glu Gly His Pro Ser Ile Tyr Arg Lys His Trp Glu Thr Ile Thr Glu

275 280 285

Glu Gln Leu Leu Asn Pro Lys Asn Tyr Ser Asp Cys Ile His Trp Cys

290 295 300

Leu Pro Gly Val Pro Asp Val Trp Asn Glu Leu Leu Tyr Ala Tyr Ile

305 310 315 320

Leu Glu Leu

<210> 6

<211> 323

<212> PRT

<213> GhTBL34-3蛋白序列(GhTBL34-3蛋白)

<400> 6

Met Ser Asp Gln Leu Ala Cys Glu Lys Phe Gly Arg Lys Asp Leu Lys

1 5 10 15

Tyr Gln Phe Trp Arg Trp Gln Pro His Gln Cys Asp Leu Pro Arg Phe

20 25 30

Asn Ala Thr Ala Leu Leu Glu Lys Leu Arg Asn Lys Arg Leu Val Tyr

35 40 45

Val Gly Asp Ser Leu Asn Arg Asn Gln Trp Val Ser Met Val Cys Leu

50 55 60

Val Asp Ser Val Ile Ser Pro Thr Phe Lys Ser Met His Asn Asn Gly

65 70 75 80

Ser Ile Asn Ile Phe Lys Ala Ile Glu Tyr Asn Ala Thr Ile Glu Phe

85 90 95

Tyr Trp Ser Pro Leu Leu Val Glu Ser Asn Ser Asp Asp Pro Ile Ser

100 105 110

His Arg Val Pro Asp Arg Ile Val Arg Val Gln Ala Ile Glu Lys His

115 120 125

Ala Arg His Trp Thr Asp Ala Asp Tyr Leu Val Phe Asn Thr Tyr Leu

130 135 140

Trp Trp Arg Arg Arg Gln Met Lys Val Leu Trp Gly Ser Phe Glu Ser

145 150 155 160

Pro Glu Asp Gly Val Phe Lys Ala Val Lys Leu Pro Arg Val Tyr Glu

165 170 175

Met Ala Leu Gln Thr Trp Ala Gln Trp Leu Glu Val His Val Asp Arg

180 185 190

Asn Lys Thr Gln Leu Phe Phe Ile Ser Met Ser Pro Thr His Gln Lys

195 200 205

Ala Asn Lys Trp Gly Gly Ile Lys Gly Glu Asn Cys Tyr Ser Glu Thr

210 215 220

Glu Pro Val Thr Glu Glu Glu Tyr Val Gly Asp Gly Ala Ser Pro Arg

225 230 235 240

Met Met Arg Val Val Asp Ser Val Leu Gly Glu Leu Lys Thr Arg Gly

245 250 255

Leu Asn Val Gln Met Ile Asn Ile Thr Gln Leu Ser Asp Tyr Arg Lys

260 265 270

Glu Gly His Pro Ser Ile Tyr Arg Lys His Trp Glu Thr Ile Thr Glu

275 280 285

Glu Gln Leu Leu Asn Pro Lys Asn Tyr Ser Asp Cys Ile His Trp Cys

290 295 300

Leu Pro Gly Val Pro Asp Val Trp Asn Glu Leu Leu Tyr Ala Tyr Ile

305 310 315 320

Leu Glu Leu

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cgacgacaag ccggtgat 18

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ccccagtttt cataaacaca tattt 25

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

agagatttgg caggtttgag gat 23

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gtttgtcagc ttgtaaaagg cat 23

<210> 11

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

acgggggact ctagaggatc cccatcaccg gcttgtcgtc 40

<210> 12

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cgatcgggga aattcgagct cttcaagaat gtaagcgtag agcaac 46

<210> 13

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ggcctcgaga cgcgtgagct cttagtggtt ttggcgatgg c 41

<210> 14

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

agaaggcctc catggggatc ccgatccggt acacgatggc 40

Claims (9)

1.一种棉花TBL34基因的优势等位基因，其特征在于：包含如SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:3所示的基因序列，分别命名为GhTBL34-2或GhTBL34-3。

2.根据权利要求1所述的棉花TBL34基因的优势等位基因，其特征在于：所述GhTBL34-2基因或GhTBL34-3基因对应的非优势等基因为GhTBL34-1，序列如SEQ ID NO:1所示。

3.权利要求1所述的优势等位基因的编码蛋白，其特征在于：所述编码蛋白含有SEQ IDNO:5或SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。

4.含有如权利要求1所述优势等位基因的表达载体。

5.含有如权利要求1所述优势等位基因的宿主细胞。

6.含有如权利要求1所述优势等位基因的转化植物细胞。

7.权利要求1所述优势等位基因在控制植物抗黄萎病中的应用。

8.根据权利要求7所述的优势等位基因在控制植物抗黄萎病中的应用，其特征在于：所述植物为棉花。

9.根据权利要求7所述的优势等位基因在控制植物抗黄萎病中的应用，其特征在于：所述植物为拟南芥。

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