CN105753956A

CN105753956A - 陆地棉GhB2蛋白及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN105753956A
Application number: CN201610319381.9A
Authority: CN
Inventors: 张文蔚; 张华崇; 简桂良; 齐放军
Original assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2016-05-13
Filing date: 2016-05-13
Publication date: 2016-07-13
Anticipated expiration: 2036-05-13
Also published as: CN105753956B

Abstract

本发明公开了陆地棉GhB2蛋白及其编码基因与应用。本发明所提供的GhB2蛋白，为如下(1)或(2)所示：(1)SEQ ID No.2所示的蛋白；(2)将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白。本发明以中植棉KV3转录组测序为基础，克隆棉花GhB2基因，为典型的DCD超蛋白家族基因，介导了细胞的程序性死亡，通过基因沉默和超表达分析，探讨其在陆地棉抗黄萎病中的作用，为下一步通过基因工程手段培育抗病品种提供候选基因。

Description

陆地棉GhB2蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及生物领域，特别涉及陆地棉GhB2蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

我国是世界上最大的产棉国之一，棉花作为纺织、化工、医药和国防工业的重要原料，在国民经济中占有重要地位。由大丽轮枝菌(VerticilliumdahliaeKleb.)引起的棉花黄萎病是一种土传性真菌维管束病害，自1914年在美国发现以来，已蔓延到世界各产棉国，是影响我国和世界棉花生产的最重要病害之一，被称为棉花的“癌症”。特别是20世纪90年代以后，棉花黄萎病在我国连续大面积流行，发病面积达全国棉花种植面积的三分之二以上，重病田可减产50-60％，严重时甚至导致棉田大面积绝收，损失惨重。黄萎病已成为我国棉花生产可持续发展的主要障碍之一。

大丽轮枝菌为重要的土壤习居性植物病原菌，其微菌核抗逆能力强，在土壤中可存活10年以上，在与寄主协同进化过程中,常受到病菌异核现象和环境条件的影响，导致病原菌致病力发生变化，产生新的生理类型，至今没有特效的化学防治药剂。因此，要实现对棉花黄萎病的有效防治，抗病品种的选育是最为经济有效的方法。

但陆地棉抗黄萎病遗传资源匮乏，在棉花上还未克隆到主效的抗病基因，而且抗病基因所介导的抗性只对特定的病原菌小种有效，易因病原菌的变异而丧失抗性作用，导致病害的重新爆发和流行，给农业生产造成巨大损失。因此，开发和利用新型针对棉花黄萎病的抗病相关基因显得尤为迫切和重要。

发明内容

为了弥补以上领域的不足，本发明提供了陆地棉GhB2蛋白及其编码基因与应用。

本发明的一个目的是提供一种蛋白，为如下(1)或(2)所示：

(1)SEQIDNo.2所示的蛋白；

(2)将SEQIDNo.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白。

所述蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。

所述编码基因为如下中至少一种：

1)其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示的DNA分子；

2)其核苷酸序列如SEQIDNo.3所示的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA分子杂交且编码与所述蛋白质具有相同功能的蛋白质的DNA分子；

4)与1)或2)或3)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述蛋白质的DNA分子。

含有所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

优选地，所述重组表达载体是指在pPZP111-eGFP多克隆位点插入所述编码基因得到的重组表达载体。

本发明的又一个目的是提供一种制备对黄萎病抗性增强的转基因植物的方法。

本发明所提供的制备对黄萎病抗性增强的转基因植物的方法，包括如下步骤：将所述蛋白的编码基因导入出发植物中，得到转基因植物；与出发植物相比，转基因植物对黄萎病抗性增强。

所述编码基因导入出发植物中是指将装载有所述编码基因的重组表达载体导入出发植物中，所述重组表达载体是将所述编码基因插入出发载体pPZP111-eGFP的多克隆位点得到的；所述出发植物为拟南芥。

本发明的又一个目的是一种制备对黄萎病抗性降低的转基因植物的方法。

本发明所提供制备对黄萎病抗性降低的转基因植物的方法，包括如下步骤：对出发植物转入能够将其编码所述的蛋白的基因进行基因沉默的沉默载体；

优选地，将连接有核苷酸序列如SEQIDNo.4所示的DNA分子的沉默载体导入到出发植物中，得到转基因植物；选出与出发植物相比黄萎病抗性降低的转基因植物个体。

所示沉默载体为棉花皱缩病毒沉默载体pCLCrVA和pCLCrVB。

所述出发植物为棉花；所述黄萎病为黄萎病强致病力落叶型菌株V991。

所述蛋白在提高植物对黄萎病抗性中的应用；

和/或，

所述蛋白的编码基因在提高植物对黄萎病抗性中的应用也属于本发明的保护范围；

所述植物为棉花。

本发明以中植棉KV3转录组测序为基础，首次克隆出棉花GhB2基因(SeqIDNo.1所示)。

通过NCBI上的在线ORFfinder程序查找GhB2ORF和编码的氨基酸，利用BLAST搜索和比对GhB2的同源序列，分析序列的保守结构域；通过MEGA软件构建不同物种GhB2的系统发育树，使用ExPASy中的ComputepI/Mw估算分子量、等电点等信息；利用在线软件SignalP和TMHMM预测该蛋白信号肽和蛋白序列跨膜区，结果显示，GhB2不含信号肽，不含跨膜结构。

利用ProtParam分析显示，GhB2的理论分子量为35.98kD，理论等电点为8.75。在NCBI在线查找其他物种B2氨基酸序列，采用DNAman分析保守结构域，发现N端存在FGLP和LFL保守序列，C端存在PAQV和PLxE保守序列，是典型的DCD超家族结构域(图1)，根据现有技术报道，DCD超蛋白家族基因，介导细胞的程序性死亡。通过MEGA软件采用邻接法BootStrap设为1000构建GhB2的进化系统发育树(图2)，结果显示GhB2与雷蒙德氏棉、亚洲棉和可可具有较高的同源性。

本发明进行了GhB2基因功能研究：基因沉默研究和基因超表达研究。

基因沉默研究发现相对于接种空载体的中植棉KV3，沉默GhB2基因的植株中GhB2基因的表达量下降了75％。对野生型棉株、转化空载体棉株和基因沉默棉株接菌3周后调查结果显示：野生型棉株病情指数为19.94，转化空载体棉株病情指数为26.04，GhB2基因沉默棉株病情指数为64.29，使中植棉KV3对黄萎病抗性丧失(图5)。

基因超表达研究发现超表达GhB2的拟南芥的病情指数为16.95，野生型和转化空载体拟南芥植株病情指数分别为34.56和40.04，转基因植株对黄萎病抗性显著增加(P<0.05)，表明GhB2在抗黄萎病过程中起重要作用，可进一步应用于基因工程技术转化陆地棉，获得抗黄萎病陆地棉材料。

本发明还进行了GhB2基因表达谱分析：在接种黄萎病强致病力落叶型菌株V991之后，棉花根部GhB2基因瞬时上调表达，抗病品种中植棉KV3中的表达量明显高于其在感病品种86-1中的表达量。在中植棉KV3中，接种后6h表达量最高，96h后表达量恢复到接种前的水平(图3)GhB2；

GhB2组织特异性分析表明GhB2表达不具有组织特异性(图4)。

基于上述发现，本发明请求保护GhB2基因以及该表达的具有氨基酸序列如SEQIDNo.2所示的蛋白。以及在SEQIDNo.2所示氨基酸序列基础上，进行微调后得到的仍然具有提高植物黄萎病抗性功能的蛋白。以及基于上述发现，本发明为下一步通过基因工程手段培育抗病品种提供候选基因。结合本领域一般技术手段就能实现的制备提高黄萎病抗性的转基因植物的方法，以及获得的用于转基因的中间产物，例如重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌等。

附图说明

图1为GhB2与同源基因编码蛋白氨基酸序列比对结果。

图2为GhB2与同源基因编码蛋白的系统进化树。

图3为接种大丽轮枝菌V991：0、6、12、24、48、72、96、144h的中植棉KV3和86-1根部GhB2基因的表达情况。

图4为各组织中GhB2表达量分析结果。

图5为沉默GhB2基因棉株抗病性鉴定结果。

图6为转基因植株筛选结果；其中，A为Col-0(野生型拟南芥植株)，B和C为T1代；D为T2代。

图7为叶片PCR技术扩增插入目的基因进一步筛选转基因单株结果；其中泳道1为野生型Col-0；泳道2-20为转基因植株。

图8为转基因植株半定量PCR检测结果，其中L1为转化pPZP111-eGFP-GhB2；L2为转化pPZP111-eGFP；WT为野生型植株。

图9为转化pPZP111-eGFP-GhB2、pPZP111-eGFP和野生型植株发病情况和病情指数分析结果；其中A为接菌两周后症状：L1为转化pPZP111-eGFP-GhB2；L2为转化pPZP111-eGFP；WT为野生型；B为接菌两周后病情指数统计。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。

植物材料：

陆地棉高抗黄萎病新品系中植棉KV3，在文献“ZhangW,ZhangH,QiF,JianG.GenerationoftranscriptomeprofilingandgenefunctionalanalysisinGossypiumhirsutumuponVerticilliumdahliaeinfection.BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications,2016,473:879-885”中公开过，公众可从中国农业科学院植物保护研究所获得。

陆地棉高抗枯萎病感黄萎病品种86-1，在文献“马存，刘洪涛，石磊岩，籍秀琴，王金美，王灿珠；棉花抗枯萎病、高产新品种“86-1号”的选育；中国农业科学，1980，2:31-36.”中公开过，公众可从中国农业科学院植物保护研究所获得。

拟南芥哥伦比亚型(Col-0)，在文献“SzabadosL,KovácsI,OberschallA,AbrahámE,KerekesI,ZsigmondL,NagyR,AlvaradoM,KrasovskajaI,GálM,BerenteA,RédeiGP,HaimAB,KonczC.Distributionof1000sequencedT-DNAtagsintheArabidopsisgenome.PlantJ.2002，32(2):233-42.”中公开过，公众可从中国农业科学院植物保护研究所获得。

载体和菌株：

pEASY-T1Simple载体购自于全式金生物公司；

棉花皱缩病毒沉默载体pCLCrVA和pCLCrVB，在文献“GuZ,HuangC,LiF,ZhouXP.AversatilesystemforfunctionalanalysisofgenesandmicroRNAsincotton.PlantBiotechnologyJournal,2014,12:1-12.”中记载过，公众可从中国农业科学院植物保护研究所获得。

超表达载体pPZP111-eGFP，为中科院微生物所夏桂先实验室馈赠，在文献“HajdukiewiczP,SvabZ,MaligaP.Thesmall,versatilepPZPfamilyofAgrobacteriumbinaryvectorsforplanttransformation.PlantMolecularBiology，1994，25,989-994.”中记载过，公众可从中国农业科学院植物保护研究所获得。

大肠杆菌DH5α购自于天根生化科技(北京)有限公司；

黄萎病强致病力落叶型菌株V991为本实验室保存，在文献“石磊岩，王莉梅。北方棉区棉花黄萎病菌RAPD分析。植物保护，1997，5:3-7.”中公开过，公众可从中国农业科学院植物保护研究所获得。

农杆菌菌株EHA105为本实验室保存，在文献“ChengM,JarretRL,LiZ,XingA,DemskiJW.Productionoffertiletransgenicpeanut(ArachishypogaeaL.)plantsusingAgrobacteriumtumefaciens.PlantCellRep.1996，15(9):653-657.”中公开过，公众可从中国农业科学院植物保护研究所获得。

实施例1、陆地棉GhB2基因的获得及功能验证

一、陆地棉GhB2基因的获得

1、棉花材料的种植：

棉花(棉花品种为中植棉KV3和86-1(来源见上)，GossypiumhirsutumL.))种子用硫酸脱绒。挑选饱满的棉种，用70％的酒精浸泡5min，再用5％的H₂O₂浸泡2h，无菌水冲洗3遍后，用无菌水浸泡催芽5h。将种子种植到花盆中，供试土壤为灭菌蛭石。培养条件：26/20℃，光照16h，黑暗8h，待棉株长出子叶后，移至含1/3MS培养液(参见文献：MurashigeTandSkoogF.Arevisedmediumforrapidgrowthandbioassayswithtobaccotissuecultures.PhysiolPlant,1962,15:473-497.)的大烧杯中培养，直至第二片真叶完全展开时进行病原菌接种。

2、病原菌的接种方法：

待棉苗第二片真叶完全展开时，进行病原菌接种。采用蘸根法接种大丽轮枝菌V991，孢子浓度为1.0×10⁷个孢子/ml。分别于接种后6、12、24、48、72h、96h和144h取棉株幼根，同时取未接种黄萎病菌的棉株幼根作为对照，经液氮冷冻后，保存于-80℃冰箱。

3、总RNA提取：

总RNA提取参照TIANGENRNAprepPure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒说明书。微量分光光度计进行浓度和质量检测，-80℃保存备用。

4、GhB2基因的克隆：

通过转录组测序得到部分序列，然后通过在线BLAST分析，查找陆地棉测序数据库中的同源序列，通过DNAMAN的SequenceAssembly功能进行序列拼接，设计的特异性引物进行扩增，获得中间片段。最终分别通过Clontech公司的SMARTerRACEcDNAAmplificationKit的5'RACE、Takara公司的3'RACE试剂盒3'RACE获得基因全长。中间片段的引物序列为GhB2-F、GhB2-R；5'RACE引物序列为5'RACEGSP1、UPM、5'RACENestedGSP、NUM；3'RACE引物序列为GSPOuter、3'RACEOuterPrimer、GSPOuter、GSPInner、3'RACEInnerPrimer；基因全长的引物序列为5'-F、3'-R(表1)。

表1.克隆GhB2基因的引物

中间片段克隆步骤：

扩增体系(25μL)

反应程序：94℃3min，36cycles：94℃30s,55℃30s，72℃1min；72℃10min。

3’末端克隆步骤：参考Takara公司的3'RACE试剂盒。

5’末端克隆步骤：参考Clontech公司的SMARTerRACEcDNAAmplificationKit的5'RACE试剂盒。

GhB2基因cDNA克隆的结果如下：

根据转录组测序序列拼接得到中间片段1173bp，3’RACE末端扩增得到147bp序列，5’RACE末端扩增得到155bp序列，最后通过高保真酶扩增获得GhB2基因的全长cDNA序列为1475bp。其中开放阅读框(ORF)为969bp，编码322个氨基酸，5’UTR182bp，3’UTR324bp。

GhB2的cDNA如SEQIDNo.1所示，其编码框为SEQIDNo.3所示(即SEQIDNo.1中自5’末端起第183位至第1151位核苷酸)，其编码的GhB2蛋白的氨基酸如SEQIDNo.2所示。

5、GhB2基因生物信息学分析：

通过NCBI上的在线ORFfinder程序查找GhB2ORF和编码的氨基酸，利用BLAST搜索和比对GhB2的同源序列，分析序列的保守结构域；通过MEGA软件构建不同物种GhB2的系统发育树，使用ExPASy中的ComputepI/Mw估算分子量、等电点等信息；利用在线软件SignalP和TMHMM预测该蛋白信号肽和蛋白序列跨膜区。

蛋白氨基酸序列分析、比对及进化树的构建结果如下：

利用ProtParam分析显示，GhB2的理论分子量为35.98kD，理论等电点为8.75。在NCBI在线查找其他物种B2氨基酸序列，采用DNAman分析保守结构域，发现N端存在FGLP和LFL保守序列，C端存在PAQV和PLxE保守序列，是典型的DCD超家族结构域(图1)。通过MEGA软件采用邻接法BootStrap设为1000构建GhB2的进化系统发育树(图2)，结果显示GhB2与雷蒙德氏棉、亚洲棉和可可具有较高的同源性。利用在线软件SignalP4.1Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)预测GhB2信号肽，结果显示，GhB2不含信号肽；利用TMHMMServerv.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)预测GhB2跨膜区，结果显示，GhB2不含跨膜结构。

6、GhB2基因表达谱分析：

将接种后0-144h的幼根(中植棉KV3、86-1)总RNA反转录合成cDNA(FastQuantcDNA第一链合成试剂盒，天根公司)，模板起始量均为100ng，陆地棉ubiquitin(GenBank:EU604080)为内标。荧光定量PCR反应试剂盒为天根公司的SuperRealPreMixPlus(SYBRGreen)试剂盒，反应在ABI7500Real-timePCRsystem荧光定量仪中进行，每种处理3次生物学重复，实验结果用相对定量2^-ΔΔCt法计算GhB2基因的表达量(LivakandSchmittgen,2001)。引物序列见表2。

反应体系：

反应程序：95℃,15min；40cycles:95℃,10sec,60℃,32sec

表2.荧光定量PCR引物

结果：在接种黄萎病强致病力落叶型菌株V991之后根部GhB2基因瞬时上调表达，在抗病品种中植棉KV3中的表达量明显高于其在感病品种86-1中的表达量。在中植棉KV3中，接种后6h表达量最高，96h后表达量恢复到接种前的水平(图3)。

7、GhB2组织特异性分析：

分别取高抗品种KV-3生长30d根、茎、叶和花，提取总RNA，反转录成cDNA，利用荧光定量技术检测不同组织基因的表达量(方法同上)。

结果：利用荧光定量PCR技术对GhB2组织特异性进行分析，结果显示GhB2在根、茎、叶和花均有表达，花中表达量与根、茎和叶相比，显著性降低(P<0.05)，而根、茎和叶中表达量没有显著性差异，表明GhB2表达不具有组织特异性(图4)。

三、GhB2基因功能研究

1、GhB2基因沉默

以陆地棉中植棉KV3cDNA为模板扩增GhB2基因片段，引物序列为：上游GGACTAGTAGGAGAAGATAATCATGG，下游AAGGCGCGCCTCCCAGGCAGTTGGGTCAAT，划线部分为酶切位点SpeⅠ：ACTAGT，AscⅠ：GGCGCGCC。

PCR产物是390bp的DNA分子，该分子含有的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示(即SEQIDNo.1中自5’末端起第575位至第946位所示)。

PCR产物连接到载体pEASY-T1Simple(载体购自全式金生物公司，产品目录号为：CT111-01)上，获得中间载体pEASY-T-GhB2。限制性内切酶SpeI和AscI双酶切中间载体pEASY-T-GhB2，OMEGA胶回收试剂盒回收GhB2基因片段，连接到相同酶切的基因沉默载体pCLCrVA上，将沉默载体pCLCrVA-GhB2转化至大肠杆菌DH5α，酶切及PCR验证后，转化至农杆菌EHA105中。同时将载体pCLCrVB转化至农杆菌EHA105中。

转化方法：冻融法将构建的VIGS沉默载体pCLCrVA-B2、pCLCrVA和pCLCrVAB分别转入农杆菌菌株EHA105。方法如下：

制备农杆菌感受态细胞：挑取EHA105单菌落，接种到含10mlYEP液体培养基(10g/l蛋白胨，10g/l酵母提取物，5g/lNaCl，15g/l琼脂)中，28℃，200rpm培养过夜。取0.5ml菌液加入50mlYEP液体培养基中，28℃，200rpm培养至OD600＝0.5。将菌液倒入50ml离心管中，冰浴10min，4℃，5000rpm离心10min。弃上清，加入10ml冰预冷的0.1mol/lCaCl2，轻轻悬浮沉淀。冰浴30min，4℃，5000rpm离心10min。弃上清，加入2ml冰预冷的0.1mol/lCaCl2，轻轻悬浮沉淀，分装备用。

冻融法转化：感受态细胞中加入1-2μl沉默载体，轻轻混匀，置于冰上30min。液氮中速冻1min，37℃放置5min。加入400μlYEP液体培养基，28℃，200rpm培养4h。将菌液涂布于YEP固体培养基(50mg/lKan，50mg/lRif)，28℃培养约36h。挑取单菌落，以特异性引物进行PCR鉴定，获得阳性转化子。

菌落PCR扩增体系(25μL)

引物(CLCrVA，CLCrVB)，引物序列参见Guetal文献：“GuZ,HuangC,LiF,ZhouXP.AversatilesystemforfunctionalanalysisofgenesandmicroRNAsincotton.PlantBiotechnologyJournal,2014,12:1-12.”)。

CLCrVAF：GGGAGCTCCACTTGGGATAGGTTAAGAA；

CLCrVAR：CCATCGATGTCCCTTATTAACTTTAGGGC

CLCrVBF：GGGCCATAGACATGGTAATGTTGGACTC

CLCrVBR：GTCGCTGCGCGGCCATATTTCTCTATAT

GhB2F:AGGAGAAGATAATCATGG

GhB2R：TCCCAGGCAGTTGGGTCAAT

待棉苗子叶完全展开时进行接种。取含有pCLCrVA-GhB2沉默载体的EHA105菌株，28℃培养至对数生长期，8000rpm离心5min，收集菌体，再用乙酰丁香酮溶液(10mmol/lMES，200μmol/lAcs,10mmol/lMgCl₂)重悬菌体，并调整菌液浓度至OD600＝1.0–1.5。将它们分别与含pCLCrVB的菌株1:1混合，室温静止放置3小时后用于植物接种。同时混合含pCLCrVA和pCLCrVB的EHA105菌株，作为空载体对照，用于植物接种。取一支1ml的一次性注射器，吸取菌液，在子叶背部注射接种。接种后植株置于培养箱中，25/20℃，光照16h，黑暗8h条件下，培养3周。采集叶片，提取总RNA，利用荧光定量PCR技术，检测基因表达量。分别对野生型棉株、转化空载体的棉株和沉默GhB2基因的棉株接种大丽轮枝菌V991，3周后调查发病情况，并计算病情指数。

病情指数＝[∑(各级病株数×相应病级)/调查总株数×最高病级(4)]×100。

结果：利用CLCrV沉默载体pCLCrVA构建了沉默GhB2基因的沉默载体。将它们与pCLCrVB共同接种棉花子叶，并以pCLCrVA和pCLCrVB空载体接种棉花子叶作为对照。为检测沉默载体的沉默效率，在接种3周后，利用荧光定量PCR技术检测接种后中植棉KV3中GhB2基因的表达量。发现相对于接种空载体的中植棉KV3，沉默GhB2基因的植株中GhB2基因的表达量下降了75％。

对野生型棉株、转化空载体棉株和基因沉默棉株接菌3周后调查结果显示：野生型棉株病情指数为19.94，转化空载体棉株病情指数为26.04，GhB2基因沉默棉株病情指数为64.29，使中植棉KV3对黄萎病抗性丧失(图5)。

2、GhB2基因超表达

扩增GhB2基因全长片段(引物及反应程序同上)，连接到载体pEASY-T1Simple上，获得中间载体，限制性内切酶SpeⅠ(ACTAGT)和SalⅠ(GTCGAC)双酶切中间载体，回收GhB2全长片段，连接到相同酶切的超表达载体pPZP111-eGFP上，转化至大肠杆菌DH5α，酶切及PCR验证后，将超表达质粒pPZP111-eGFP-GhB2转化至农杆菌EHA105中。

构建好的超表达载体pPZP111-eGFP-GhB2采用花浸法转化拟南芥，以转化pPZP111-eGFP空载体作为阴性对照。取含超表达载体的EHA105菌株，28℃培养至对数生长期，转接到新鲜培养基(LB)中，待菌液浓度为OD600＝0.8-1.0时，5000rpm离心5min，收集菌体，侵染缓冲液重悬，使终浓度OD600达到0.8。取3-4周龄拟南芥哥伦比亚型(Col-0)，剪掉已经开过的花，用滴管吸取菌液滴到即将开放的拟南芥花序上，确保液滴完全覆盖花序。将拟南芥转至黑暗中培养24h，转移到正常光照条件下，每隔5天重复侵染一次，侵染3-4次。将收获的T0代种子点种于含Kan的筛选培养基(含卡那霉素的MS培养基)中，将叶色浓绿、根系发达和植株健壮的拟南芥移栽于花盆，利用PlantLeafDirectPCRkit(购自成都福际生物技术公司，产品目录号为TP-02111)筛选转基因阳性植株。

反应体系(20μL)：

反应程序：

94℃3min，36cycles：94℃10s,55℃20s，72℃1.5min；72℃10min。

PCR扩增结束后，琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物，阳性克隆，切胶回收送生工测序。

利用半定量PCR对转基因拟南芥植株进行GhB2基因表达分析，以拟南芥Actin(AY064043)为内参，引物见表3。

表3.半定量PCR引物

注：划线部分为酶切位点SpeⅠ：ACTAGT，SalⅠ：GTCGAC

半定量PCR反应体系(25μL)

反应程序：

94℃3min，20cycles：94℃10s,55℃20s，72℃1min；72℃10min。

用卡那霉素浓度为70mg/L的MS培养基初筛转基因阳性株(图6中B和图6中C)，将叶片浓绿和植株健壮的拟南芥幼苗移栽于花盆中，通过叶片PCR技术扩增插入目的基因进一步筛选转基因单株(图7)，共获得10株阳性株T1，收单株种子，继续筛选，获得T2代转基因系(图6中D)。

通过半定量PCR检测GhB2在转录水平表达量，结果显示在转化空载体和野生型拟南芥植株中未检测到GhB2，而在T2代转基因拟南芥中成功表达(图8)。

超表达植株抗病性鉴定：超表达植株采用蘸根法接种黄萎病菌V991，转化空载体和Col-0型拟南芥接种V991分别作为阳性和阴性对照，15d后调查发病情况，并计算病情指数。

采用蘸根法接种黄萎病菌V991，2周后调查转化pPZP111-eGFP-GhB2、pPZP111-eGFP和野生型植株发病情况，统计病情指数，结果见图9。结果显示超表达GhB2拟南芥的病情指数为16.95，野生型和转化空载体拟南芥植株病情指数分别为34.56和40.04相比，转基因植株对黄萎病抗性显著增加(P<0.05)，表明GhB2在抗黄萎病过程中起重要作用，可进一步应用于基因工程技术转化陆地棉，获得抗黄萎病陆地棉材料。

Claims

1.一种蛋白，为如下(1)或(2)所示：

(1)SEQIDNo.2所示的蛋白；

2.权利要求1所述蛋白的编码基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因为如下中至少一种：

1)其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示的DNA分子；

2)其核苷酸序列如SEQIDNo.3所示的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA分子杂交且编码与权利要求1所述蛋白质具有相同功能的蛋白质的DNA分子；

4)与1)或2)或3)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌；优选地，所述重组表达载体是指在pPZP111-eGFP多克隆位点插入所述编码基因得到的重组表达载体。

5.一种制备对黄萎病抗性增强的转基因植物的方法，包括如下步骤：将权利要求2或3所述的编码基因导入出发植物中，得到转基因植物；与出发植物相比，转基因植物对黄萎病抗性增强。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述编码基因导入出发植物中是指将装载有所述编码基因的重组表达载体导入出发植物中，所述重组表达载体是将所述编码基因插入出发载体pPZP111-eGFP的多克隆位点得到的；所述出发植物为拟南芥。

7.一种制备对黄萎病抗性降低的转基因植物的方法，包括如下步骤：对出发植物转入能够将其编码权利要求1所述的蛋白的基因进行基因沉默的沉默载体；

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所示沉默载体的出发载体为棉花皱缩病毒沉默载体pCLCrVA和pCLCrVB。

9.根据权利要求7或8中所述的方法，其特征在于：所述出发植物为棉花；所述黄萎病为黄萎病强致病力落叶型菌株V991。

10.权利要求1所述的蛋白在提高植物对黄萎病抗性中的应用；

和/或，

权利要求2或3所述的编码基因在提高植物对黄萎病抗性中的应用；

所述植物为棉花。