EP1248845A1 - Promoteur de plante fruit specifique - Google Patents

Promoteur de plante fruit specifique

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Publication number
EP1248845A1
EP1248845A1 EP01905853A EP01905853A EP1248845A1 EP 1248845 A1 EP1248845 A1 EP 1248845A1 EP 01905853 A EP01905853 A EP 01905853A EP 01905853 A EP01905853 A EP 01905853A EP 1248845 A1 EP1248845 A1 EP 1248845A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
promoter
sequence
gene
nucleic acid
fruit
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP01905853A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Isabelle Marty
Line Tichit
Corinne Douat
Guy Albagnac
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Original Assignee
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut National de la Recherche Agronomique INRA filed Critical Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Publication of EP1248845A1 publication Critical patent/EP1248845A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
    • C12N15/823—Reproductive tissue-specific promoters
    • C12N15/8235—Fruit-specific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants

Definitions

  • the present invention relates to a DNA sequence having a transcriptional promoter activity directing the expression of the gene or genes placed under its control in the fruits of a plant.
  • the invention also relates to a recombinant nucleic acid molecule as a vector comprising said promoter, as well as plant cells and transgenic plants which have incorporated this promoter into their genome.
  • the work carried out within the framework of the present invention has made it possible to isolate a new promoter from the wild strawberry genome (Fragaria vesca cv Reine des vallées) having remarkable specificity properties in the fruit, effectiveness, inducibility from the first stages of fruit ripening, as well as adaptability to other fruit species, such as tomatoes or grapes.
  • the subject of the invention is a promoter which selectively directs the expression of the DNA sequences placed under its control in the fruits of plants, characterized in that it comprises all or part of the sequence No. 1 of the attached sequence list, its complementary strand or a derivative thereof. More particularly, the invention relates to the promoter sequence comprised between the nucleotides at positions 1 and 1393, its complementary strand or a derivative thereof exhibiting promoter activity which selectively directs the expression of DNA sequences placed under his control in the fruits of plants.
  • derivative of a promoter sequence according to the invention is intended to mean the above sequences modified by deletion, substitution or insertion of one or more nucleotides, and retaining a promoter activity which selectively directs the expression of DNA sequences. placed under their control in the fruits of plants. These are for example sequences having at least 60% and preferably at least 80% homology with the sequence No. 1 of the sequence list in the appendix. Such derivatives are more particularly the promoter sequences of other rosacea homologs to that of the wild strawberry genome (Fragaria vesca cv Reine des vallées) isolated in the context of the present invention.
  • a person skilled in the art is able to determine, from tests of the type of those reported in the experimental part below, whether said derivatives exhibit a promoter activity which selectively directs the expression of the DNA sequences placed under their control. in the fruits of plants according to the present invention.
  • a promoter according to the invention opens up very important prospects in the industrial field by the creation of new varieties but also in the field of research both fundamental and applied.
  • the creation of transgenic strawberries carrying the construction of this promoter associated with a gene either of agronomic interest or of ill-defined function makes it possible to understand the role of these genes in the processes of fruit ripening. It is the only current tool that allows us to understand the role of genes and their product in vivo and their effects on fruit ripening.
  • the genes known to influence the organoleptic qualities of fruits can be integrated into strawberry plants downstream of this promoter in order to exacerbate ( gene in the sense position) or reduce (gene in the antisense position) the effects associated with these genes.
  • Genes supposed to influence the quality are currently known and their impact on the maturation processes can be analyzed in vivo like certain parietal hydrolases implied in the loss of firmness of the fruits (cellulase, Pectin Methyl Transferase, Polygalacturonase, ⁇ -galactosidase, expansins, etc. .), carotenoid and anthocyanin biosynthetic enzymes
  • the promoter according to the invention makes it possible to target the expression of a gene spatio-temporally in the fruit from the turning stage (corresponding to the initiation of the maturation processes) and gradually during the maturation. It differs from the promoters currently used as: - the 35S CAMV promoter which directs the expression of genes constitutively in the plant, or
  • the promoter according to the invention directs the expression of genes in the fruit at a marketable stage (stage turning to the mature stage).
  • the invention therefore also relates to a recombinant nucleic acid molecule comprising a promoter sequence as defined above linked operatively to a DNA sequence comprising one or more genes, optionally a selection gene placed under the control of its own promoter or of the same promoter as said nucleic acid sequence, and advantageously a terminator sequence placed downstream of said DNA sequence.
  • the said gene (s), other than the selection gene are advantageously genes, in the sense or antisense position, encoding a protein of agronomic interest. As indicated previously, it is for example a protein capable of influencing the organoleptic qualities of fruits, preferably strawberries.
  • a recombinant nucleic acid molecule according to the invention can be a cassette or a vector for the expression of one or more genes of interest in a plant cell.
  • a vector useful for the transformation of a plant-like host includes:
  • the invention therefore also relates to plant cells in the genome of which is stably incorporated a recombinant nucleic acid molecule comprising the previously defined promoter operably linked to a DNA sequence comprising at least one gene which is thus expressed only under the control of the promoter.
  • the invention also relates to a plant which has stably incorporated into its genome a recombinant nucleic acid molecule comprising the previously defined promoter operably linked to a DNA sequence comprising at least one gene which is thus expressed only in fruits. of the plant.
  • Transgenic plants according to the invention can be prepared in a conventional manner by transforming a plant cell with said nucleic acid molecule and then by regenerating a plant from the transformed cell.
  • FIG. 1 represents the expression of the gene linked to the FPl promoter during the development of wild strawberries and of commercial strawberries (northern blot technique),
  • FIG. 2 shows the presence of the gene linked to the FPL promoter in wild strawberries and in other fruit species (Southern blot technique). 1) Isolation of the specific FPL fruit promoter.
  • the gene presents 3239 bp with 2 exons of 810 and 558 bp interspersed with an intron of 230 bp and terminated by a 3 'region of 220 bp.
  • the promoter region consists of 1421 bp.
  • this gene was analyzed during the development of the strawberry and in various tissues of the mother plant. As shown in Figure 1, the messengers accumulate in the fruit from the turning stage (white strawberry) and are abundantly present during the ripening phases. No expression of the gene is detected in various plant tissues such as the leaf, stem, flower, root and seeds of the strawberry (achenes). This gene is expressed similarly in commercial strawberries as shown in Figure 1. 3) Presence of the gene in strawberries and other species.
  • FIG. 2 presents the results of the southern blot, the intense hybridization bands (relative to the background noise) reveal the presence of homologous genes.
  • the gus gene has the property of coding for the ⁇ -glucuronidase enzyme, the activity of which is easily detectable either by direct staining of the tissues (histochemical technique) or by enzymology (fluorimetric assay technique).
  • the binary plasmid used is the plasmid pBilOl, derived from the vector pBIN19 (2). This vector has
  • an origin of RK2 replication with a low copy number (i) an origin of RK2 replication with a low copy number, (ii) an np tll gene allowing the selection of bacteria transformed on kanamycin, (iii) the RB and LB terminals ensuring the transfer of the DNA placed between these terminals.
  • This transfer DNA consists of an nptll gene framed by the promoter and terminator NOS (NOS-Pr and NOS-Ter) allowing the selection of transformed plants, a gus gene of 1.87 Kb without promoter (gene derived from the plasmid pRAJ260) inserted at the Kpn1 site in the multicloning region, the 260pb NOS terminator clones Sstl-EcoRI in the multicloning region (2).
  • 3 plasmids pBIlOl were constructed distinct from 1 bp (pBHOl.l, pBil01.2, pBil01.3).
  • the plasmid pBil01.2 was used to achieve the fusion between the FPl promoter and the gus gene.
  • the promoter sequence was amplified with specific primers to which the restriction site sequences were added:
  • This amplified DNA of 1511 bp corresponds to 1393 bp from the promoter region and to 118 bp from the first exon.
  • the ligation of this DNA into the plasmid cassette was carried out from blunt ends generated by the Smal digestion of the plasmid pBil01.2 and after digestion of the DNA by Smal and EcoRV made blunt ends.
  • the plasmid thus obtained is called pBiFP1 and contains between the LB and RB terminals:
  • AGL1 chromosome C58 (resistance to Rifampicin), plasmid Ti of the strain B0542 (resistance to ampicillin).
  • C58GV2260 chromosome C58 (resistance to Rifampicin), plasmid Ti of the strain B6806 (resistance to ampicillin).
  • strains were named A and B respectively.
  • Leaf explants of about 0.5 cm 2 are cut from leaves about 6 to 8 weeks old on strawberry plants grown in vitro. They are transferred to a regeneration medium (Murashige and Skoog medium, 3% sucrose, 0.1% Gamborg vitamin (B5), 18 ⁇ M of Benzyl Amino Purine, 2.5 ⁇ M of Indol-3 butyric acid). Twenty-four hours later, the explants are brought into contact with solutions of Agrobacteria (A or B). The concentration of Agrobacteria is evaluated at 1.10 9 cells / ml. Co-culture is carried out at 28 ° C for 1 hour with stirring at 100 rpm.
  • the explants are then drained on sterile filter paper and placed on the regeneration medium in the presence of 100 ⁇ M of acetosyringone. Forty-eight hours later, the explants are transferred to the regeneration medium with 500 mg / l of timentin. The explants with swelling and callous formations are subcultured every 3 weeks on new regeneration medium with 500 mg / l of timentin.
  • the first shoots appear 2 months after transformation and are transplanted individually on elongation medium (Murashige and Skoog medium, 3% sucrose, 0.1% Gamborg vitamin (B5), 2.5 ⁇ M of Benzyl Amino Purine, 1 , 25 ⁇ M of Indol-3 butyric acid) in the presence of 500 mg / 1 of timentin and 25 mg / 1 of kanamycin.
  • elongation medium Merashige and Skoog medium, 3% sucrose, 0.1% Gamborg vitamin (B5), 2.5 ⁇ M of Benzyl Amino Purine, 1 , 25 ⁇ M of Indol-3 butyric acid

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Abstract

L'invention a pour objet un promoteur qui dirige sélectivement l'expression des séquences d'ADN placées sous son contrôle dans les fruits des plantes, caractérisé en ce qu'il comprend tout ou partie de la séquence No.1 de la liste de séquence en annexe, son brin complémentaire ou un dérivé de celles-ci. L'invention concerne aussi une molécule d'acide nucléique, une cellule végétale ou une plante comprenant ledit promoteur.

Description

PROMOTEUR DE PLANTE FRUIT SPÉCIFIQUE.
La présente invention concerne une séquence d'ADN possédant une activité de promoteur transcriptionnel dirigeant 1 ' expression du ou des gènes placés sous son contrôle dans les fruits d'une plante. L'invention concerne également une molécule d'acide nucléique recombinant comme un vecteur comprenant ledit promoteur, ainsi que des cellules de plantes et des plantes transgéniques ayant incorporé dans leur génome ce promoteur.
Les progrès réalisés en matière d'ingénierie génétique ont permis d'introduire des gènes exogènes dans le génome de plantes. Grâce à ce procédé de transformation génétique, désigné aussi transgenèse, il est actuellement possible de produire des plantes avec des caractéristiques agronomiques bien déterminées. Les fruits et légumes présentant un secteur d'une grande importance économique et sociale, l'optimisation des qualités gustative (arômes, texture), nutritionnelle (vitamines, teneur en sucres et fibres) et esthétique (calibre, forme, couleur) des fruits est une des priorités actuelles. La transgenèse appliquée aux espèces fruitières permet à un niveau fondamental, de mieux comprendre les mécanismes moléculaires associés aux processus de maturation, et à un niveau plus appliqué, de moduler certaines propriétés du fruit. Cette modulation peut s'effectuer au niveau de l'expression de certains gènes dont les fonctions sont impliquées dans la qualité du fruit. Il est important de cibler la régulation de ces gènes dans l'organe concerné, en l'occurrence le fruit, car une dé-régulation dans la plante entière peut avoir des répercutions néfastes tant au niveau physiologique (développement, résistance aux maladies, etc..) qu'au niveau de la productivité du plant. La régulation de l'expression des gènes est contrôlée notamment par les promoteurs qui sont des régions régulatrices inhérentes aux gènes. Ainsi, afin de mieux comprendre mais aussi d'améliorer la qualité des fruits par une approche moléculaire, il s'avère indispensable d'isoler des promoteurs qui dirigent l'expression de gènes spécifiquement dans le fruit et à un moment précis de leur développement. Quelques promoteurs ont été isolés chez la tomate, le fruit le plus communément étudié, présentant chacun des caractéristiques bien spécifiques. On peut citer par exemple : - le promoteur 2A11 (6, 7) décrit dans la brevet US No. 4,943,674 , qui dirige l'expression de gènes lors des premiers stades de développement du fruit avec une efficacité réduite,
- les promoteurs TFM7 et TFM , décrits dans le brevets US No. 5,608,150, qui dirigent fortement l'expression des gènes au cours des premiers stades de développement du fruit,
- les promoteurs E4 (4), E8 (5) et le promoteur de la polygalacturonase (1) qui dirigent l'expression au cours du développement tardif du fruit et de manière spécifique .
Il apparaît donc utile de disposer d'autres promoteurs avec des caractéristiques différentes et notamment des promoteurs qui dirigent l'expression de gènes de manière spécifique dans le fruit, de manière efficace, et à un moment précis du développement. Il convient aussi de réguler l'expression de gènes dès les premiers stades de maturation, car c'est pendant cette phase de transition que certains processus moléculaires en liaison avec la qualité du fruit se mettent en place.
Les travaux réalisés dans le cadre de la présente invention ont précisément permis d'isoler un nouveau promoteur à partir du génome de fraise sauvage ( Fragaria vesca cv Reine des vallées) présentant des propriétés remarquables de spécificité dans le fruit, d'efficacité, d' inductibilité dés les premiers stades de maturation du fruit, ainsi que d' adaptabilité à d'autres espèces fruitières, comme la tomate ou le raisin.
En conséquence, l'invention a pour objet un promoteur qui dirige sélectivement 1 ' expression des séquences d'ADN placées sous son contrôle dans les fruits de plantes, caractérisé en ce qu'il comprend tout ou partie de la séquence No. 1 de la liste de séquence en annexe, son brin complémentaire ou un dérivé de celles-ci. Plus particulièrement, l'invention se rapporte à la séquence de promoteur comprise entre les nucléotides aux positions 1 et 1393, son brin complémentaire ou un dérivé de celles-ci présentant une activité de promoteur qui dirige sélectivement l'expression des séquences d'ADN placées sous son contrôle dans les fruits de plantes.
On entend par dérivé d'une séquence de promoteur selon l'invention, les séquences ci-dessus modifiées par délétion, substitution ou insertion d'un ou plusieurs nucléotides, et conservant une activité de promoteur orientant sélectivement l'expression des séquences d'ADN placées sous leur contrôle dans les fruits de plantes. Il s'agit par exemple de séquences ayant au moins 60 % et de préférence au moins 80 % d'homologie avec la séquence No. 1 de la liste de séquence en annexe. De tels dérivés sont plus particulièrement les séquences des promoteurs d'autres rosacées homologues à celui du génome de fraise sauvage ( Fragaria vesca cv Reine des vallées) isolé dans le cadre de la présente invention. L'homme du métier est à même de déterminer, à partir de tests du type de ceux rapportés dans la partie expérimentale ci-après, si lesdits dérivés présentent une activité de promoteur orientant sélectivement l'expression des séquence d'ADN placées sous leur contrôle dans les fruits de plantes conformément à la présente invention. Un promoteur selon 1 ' invention ouvre des perspectives très importantes dans le domaine Industriel par la création de nouvelles variétés mais aussi dans le domaine de la Recherche tant fondamentale qu'appliquée. Dans le domaine de la recherche, la création de fraisiers transgéniques portant la construction de ce promoteur associé à un gène soit d'intérêt agronomique soit de fonction mal définie, permet de comprendre le rôle de ces gènes dans les processus de maturation des fruits. C'est le seul outil actuel qui permette de comprendre le rôle de gènes et de leur produit in vivo et leurs effets sur la maturation des fruits.
Au niveau industriel, les gènes connus pour influencer les qualités organoleptiques des fruits (perte de fermeté, évolution de la couleur, dégagement d'arômes, acquisition de la saveur) peuvent être intégrés dans des fraisiers en aval de ce promoteur afin d'exacerber (gène en position sens) ou de réduire (gène en position anti-sens) les effets associés à ces gènes. Des gènes supposés influer la qualité sont actuellement connus et leur impact sur les processus de maturation peuvent être analysé in vivo comme certaines hydrolases pariétales impliquées dans la perte de fermeté des fruits (cellulase, Pectine Methyl Transferase, Polygalacturonase, β-galactosidase, expansines, etc.), des enzymes de biosynthèse des caroténoïdes et d' anthocyanes
(phytoène synthase, zeaxantine oxydase, etc ...) , des enzymes intervenant dans le métabolisme des sucres (invertase, sucrose phosphate synthase, sucrose synthase, etc ...) etc ....
Ainsi, le promoteur selon l'invention permet de cibler l'expression d'un gène de manière spatio-temporelle dans le fruit dès le stade tournant (correspondant au déclenchement des processus de maturation) et de manière progressive au cours de la maturation. Il diffère des promoteurs actuellement utilisés comme : - le promoteur 35S CAMV qui dirige l'expression des gènes de manière constitutive dans la plante, ou
- certains promoteurs de tomate qui dirigent l'expression des gènes dans les stades précoces ou tardifs du développement du fruit et parfois avec un rendement faible .
Ces différences sont fondamentales car le promoteur selon l'invention dirige l'expression des gènes dans le fruit à un stade commercialisable (stade tournant jusqu'au stade mûr) .
L'invention concerne donc aussi une molécule d'acide nucléique recombinant comprenant une séquence de promoteur comme défini précédemment lié de manière fonctionnelle à une séquence d'ADN comprenant un ou plusieurs gènes, éventuellement un gène de sélection placé sous le contrôle de son propre promoteur ou du même promoteur que ladite séquence d'acide nucléique, et avantageusement une séquence de terminateur placé en aval de ladite séquence d'ADN. Le ou lesdits gène(s), autre que le gène de sélection, sont avantageusement des gènes, en position sens ou antisens, codant une protéine d'intérêt agronomique. Comme indiqué précédemment, il s'agit par exemple de protéine capable d'influencer les qualités organoleptiques des fruits, de préférence des fraisiers.
Une molécule d'acide nucléique recombinant selon 1 ' invention peut être une cassette ou un vecteur pour l'expression d'un ou plusieurs gènes d'intérêt dans une cellule végétale. Un vecteur utile pour la transformation d'un hôte de type plante comprend :
- un ou plusieurs gènes qui code(nt) pour une ou plusieurs protéines d'intérêt, placé (s) sous le contrôle du promoteur de l'invention, - un gène pour une sélection génétique dans des cellules de plante, placé sous le contrôle du même promoteur ou d'un promoteur différent de celui ci-dessus.
L'invention concerne donc également des cellules végétales dans le génome desquelles est incorporé de façon stable une molécule d'acide nucléique recombinant comprenant le promoteur défini précédemment lié de manière fonctionnelle à une séquence d'ADN comprenant au moins un gène qui est ainsi exprimé seulement sous le contrôle du promoteur.
L'invention concerne encore une plante ayant incorporé de manière stable dans son génome une molécule d'acide nucléique recombinant comprenant le promoteur défini précédemment lié de manière fonctionnelle à une séquence d'ADN comprenant au moins un gène qui est ainsi exprimé seulement dans les fruits de la plante. Des plantes transgéniques selon 1 ' invention peuvent être préparées de façon classique en transformant une cellule végétale avec ladite molécule d'acide nucléique puis en régénérant une plante a partir de la cellule transformée.
D'autres avantages et caractéristiques de 1 ' invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent concernant l'isolement du promoteur de l'invention désigné FPl et la transformation de plantes avec des constructions le contenant, et où il sera fait référence aux dessins en annexe dans lesquels :
- la figure 1 représente l'expression du gène lié au promoteur FPl au cours du développement de la fraise sauvage et de la fraise commerciale (technique de northern- blot) ,
- la figure 2 représente la présence du gène lié au promoteur FPl chez la fraise sauvage et chez d'autres espèces fruitières (technique de Southern-blot) . 1 ) Isolement du promoteur spécifique de fruit FPl.
Un criblage différentiel d'une banque d'ADNc de fraise mûre a été réalisé avec des sondes d'ADNc issus de fraises vertes ou mûres . Les ADNc présents en abondance chez la fraise mûre et aucunement chez le fruit vert ont été sélectionnés. L'expression des gènes associés à ces ADNc a été analysée sur des populations d'ARN totaux (technique de Northern-blot ) issus de 3 stades de développement du fruit. Parmi ces clones, un correspond à un gène qui s'exprime de manière progressive et abondante au cours de la maturation du fruit. L'analyse de la séquence de l'ADNc avec les banques de données ne montre aucune homologie avec des séquences connues. L'isolement du gène et de la région promotrice a été effectué par PCR inverse. Le gène présente 3239 pb avec 2 exons de 810 et 558 pb intercalés d'un intron de 230pb et terminé par une région 3' de 220 pb. La région promotrice est constituée de 1421 pb.
2 ) Expression fruit-spécifique (technique de Northern-blot) .
L'expression de ce gène a été analysée au cours du développement de la fraise et dans divers tissus de la plante-mère. Comme le montre la figure 1, les messagers s'accumulent dans le fruit dés le stade tournant (fraise blanche) et sont abondamment présents pendant les phases de maturation. Aucune expression du gène n'est détectée dans divers tissus de la plante comme la feuille, la tige, la fleur, la racine et les graines de la fraise (les achènes) . Ce gène est exprimé de manière similaire chez la fraise commerciale comme il est illustré dans la figure 1. 3 ) Présence du gène chez la fraise et d'autres espèces .
La technique de southern-blot a mis en évidence l'existence de deux gènes chez la fraise sauvage. Cette technique appliquée à d'autres espèces fruitières a montré que ce gène est conservé chez d'autres rosacées (pommier, abricotier, pêcher) . La figure 2 présente les résultats du southern-blot dont les bandes d'hybridation intenses (par rapport au bruit de fond) révèlent la présence de gènes homologues.
4) Fusion de promoteur FPl et du gène gus .
La transformation génétique s'effectue par le biais d ' Agrobacterium tumefaciens et de vecteurs binaires contenant la construction chimérique du promoteur fusionné avec le gène gus .
Le gène gus a la propriété de coder pour l'enzyme β-glucuronidase dont l'activité est facilement détectable soit par coloration directe des tissus (technique histochimique) , soit par enzymologie (technique de dosage fluorimétrique) .
Le plasmide binaire utilisé est le plasmide pBilOl, dérivé du vecteur pBINl9 (2). Ce vecteur possède
(i) une origine de réplication RK2 à faible nombre de copies, (ii) un gène np tll permettant la sélection des bactéries transformées sur kanamycine, (iii) les bornes RB et LB assurant le transfert de 1 ' ADN placé entre ces bornes. Cet ADN de transfert est constitué d'un gène nptll encadré du promoteur et terminateur NOS (NOS-Pr et NOS-Ter) permettant la sélection des plantes transformées, d'un gène gus de 1,87 Kb sans promoteur (gène issu du plasmide pRAJ260) inséré au site Kpnl dans la région de multiclonage, le terminateur NOS de 260pb clone Sstl-EcoRI dans la région de multiclonage (2) . Suivant la taille des promoteurs à insérer dans cette cassette et la conservation du cadre de lecture ouvert du gène gus, 3 plasmides pBIlOl ont été construit distincts de 1 pb (pBHOl.l, pBil01.2, pBil01.3). Le plasmide pBil01.2 a été utilisé pour réaliser la fusion entre le promoteur FPl et le gène gus. La séquence promotrice a été amplifiée avec des amorces spécifiques auxquelles ont été ajoutées les séquences des sites de restriction :
- amorce 5', où le site Smal est souligné: AAACCCGGGCCTTGGTTCAGTGTTCTG, - amorce 3 ' , où le site EcoRV est souligné :
AAAGATATCCATACGATGGAGGAGTG ) .
Cet ADN amplifié de 1511pb correspond à 1393 pb de la région promotrice et à 118 pb du premier exon. La ligation de cet ADN dans la cassette du plasmide s'est effectuée à partir de bouts francs générés par la digestion Smal du plasmide pBil01.2 et après digestion de l'ADN par Smal et EcoRV rendu bouts francs. Le plasmide ainsi obtenu est appelé pBiFPl et contient entre les bornes LB et RB:
- le fragment d'ADN de 1511 pb dont 1393 pb du promoteur FPl et 118 pb du premier exon
- le gène gus et NOS-Ter
- le gène nptll encadré de NOS-Pr et NOS-Ter.
5 ) Virulence des Agrobactéries C58GV2260 et AGLl
Quatre souches d ' agrobactéries , AGLl, C58GV2260, C58pMP90 et LBA4404 ont été testées pour leur virulence sur fraisiers. Deux souches, AGLl et C58GV2260, ont donné des rendements d'infection et de transfert d'ADN considérables et ont été sélectionnées pour être transformées par la construction plasmidique décrite précédemment .
AGLl : chromosome C58 (résistance à la Rifampicine) , plasmide Ti de la souche B0542 (résistance à 1 ' ampicilline) . C58GV2260 : chromosome C58 (résistance à la Rifampicine) , plasmide Ti de la souche B6806 (résistance à 1 ' ampicilline) .
Une fois transformées par le vecteur, les souches ont été dénommées A et B respectivement.
6 ) Transformation de fraisiers avec la construction chimérique.
Un protocole efficace de transformation génétique par Agrobacterium tumefaciens a été mis au point sur le fraisier sauvage. Des expiants foliaires d'environ 0,5 cm2 sont découpés à partir de feuilles âgées d'environ 6 à 8 semaines sur des plants de fraisiers cultivés in vitro. Ils sont transférés sur un milieu de régénération (milieu Murashige et Skoog, 3% de sucrose, 0.1% vitamine de Gamborg (B5), 18 μM de Benzyle Amino Purine, 2.5μM d'Acide Indol-3 butyrique). Vingt-quatre heures après, les explants sont mis au contact des solutions d' Agrobactéries (A ou B) . La concentration des Agrobactéries est évaluée à 1.109 cellules/ml. La co-culture est réalisée à 28°C pendant 1 heure avec agitation à 100 rpm. Les explants sont ensuite égouttés sur du papier filtre stérile et disposés sur le milieu de régénération en présence de 100 μM d' acétosyringone . Quarante-huit heures après, les explants sont transférés sur le milieu de régénération avec 500mg/l de timentin. Les explants présentant des boursouflements et des formations calleuses sont repiqués toutes les 3 semaines sur du milieu de régénération neuf avec 500mg/l de timentin. Les premières pousses apparaissent 2 mois après transformation et sont repiquées individuellement sur du milieu d'élongation (milieu Murashige et Skoog, 3% de sucrose, 0,1% vitamine de Gamborg (B5), 2,5 μM de Benzyle Amino Purine, 1,25 μM d'Acide Indol-3 butyrique) en présence de 500 mg/1 de timentin et 25 mg/1 de kanamycine. Six semaines plus tard, les pousses suffisamment développées sont disposées sur un milieu d'enracinement
(milieu MS/2, 3% de sucrose, 0,1 % vitamine de Gamborg
(B5)) en présence de 100 mg/1 de timentin et 25 mg/1 de kanamycine. Les plantes transformées produisent des racines environ 2 à 4 semaines après repiquage. Les plantules présentant de racines longues d'environ 2 cm sont acclimatées dans des pots avec du terreau dans des chambres de culture à 22 °C avec une photopériode de 18 heures de lumière et 6 heures d'obscurité avant leur transfert dans des serres.
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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Claims

RE ENDICA IONS
1) Un promoteur qui dirige sélectivement l'expression des séquences d'ADN placées sous son contrôle dans les fruits des plantes, caractérisé en ce qu'il comprend tout ou partie de la séquence No. 1 de la liste de séquence en annexe, son brin complémentaire ou un dérivé de celles-ci .
2) Un promoteur selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend la séquence comprise entre les nucléotides aux positions 1 et 1393 de la séquence No. 1 de la liste de séquence en annexe, son brin complémentaire ou un dérivé de celles-ci.
3) Une molécule d'acide nucléique recombinant comprenant un promoteur selon l'une des revendications 1 ou 2 lié de manière fonctionnelle à une séquence d'ADN comprenant un ou plusieurs gènes, éventuellement un gène de sélection placé sous le contrôle de son propre promoteur ou du même promoteur que ladite séquence d'acide nucléique, et avantageusement une séquence de terminateur placé en aval de ladite séquence d'ADN.
4) Une molécule d'acide nucléique selon la revendication 3 , caractérisée en ce que le ou lesdits gène(s), autre que le gène de sélection, sont des gènes, en position sens ou antisens, codant une protéine ou plusieurs protéines d'intérêt agronomique.
5) Une cellule végétale dans le génome de laquelle est incorporé de façon stable une molécule d'acide nucléique recombinant comprenant un promoteur selon l'une des revendications 1 ou 2 lié de manière fonctionnelle à une séquence d'ADN comprenant au moins un gène qui est ainsi exprimé seulement sous le contrôle dudit promoteur.
6) Une plante ayant incorporé de manière stable dans son génome une molécule d'acide nucléique recombinant comprenant le promoteur selon l'une des revendications 1 ou 2 lié de manière fonctionnelle à une séquence d'ADN comprenant au moins un gène qui est ainsi exprimé seulement dans les fruits de la plante.
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