ES2188400B1 - Secuencia reguladora de la expresion especifica en fruto de un gen y sus aplicaciones. - Google Patents
Secuencia reguladora de la expresion especifica en fruto de un gen y sus aplicaciones.Info
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Abstract
Secuencia reguladora de la expresión específica en fruto de un gen y sus aplicaciones. La secuencia reguladora (promotor) es útil para la expresión específica en fruto de una secuencia de ADN codificante de un producto de interés, por ejemplo, un péptido, polipéptido, proteína, actividad o ARN de interés. La secuencia puede ser utilizada en construcciones de ADN que contienen dicha secuencia operativamente unida a una secuencia de ADN codificante de un producto de interés, y dichas construcciones pueden ser utilizadas en la construcción de plantas transgénicas.
Description
Secuencia reguladora de la expresión específica
en fruto de un gen y sus aplicaciones.
La invención se relaciona, en general, con la
obtención de secuencias de ADN reguladoras de la expresión
específica de tejidos o de células diana de genes, por ejemplo,
genes heterólogos en plantas, en particular, con una secuencia de
ADN reguladora (promotor) específico de fruto, por ejemplo, de
fresa, que determina la expresión en ese órgano de cualquier gen que
se introduzca en dicha especie por ingeniería genética.
Uno de los objetivos de la ingeniería genética es
el de obtener plantas con características mejoradas. En relación con
plantas que producen fruto, estas características incluyen, entre
otras, el control de la maduración del fruto, mejoras en las
características nutricionales de las partes comestibles del fruto,
resistencia a plagas y enfermedades de plantas, etc.
Para manipular y controlar de forma estable una
determinada característica de una planta se requiere, por una parte,
identificar y aislar el gen o genes que codifican o regulan dicha
característica particular, y, además, identificar y aislar los
elementos genéticos esenciales para la expresión y/o control del gen
o genes aislados para que la planta manifieste dicha característica
de forma controlada o controlable. Entre dichos elementos genéticos
esenciales se encuentran los elementos de control de la
transcripción conocidos como promotores.
Se han descrito algunos promotores que dirigen la
expresión de genes heterólogos específicos de fruto de fresa
silvestre (Fragaria vesca), por ejemplo, los promotores
identificados como SAR5 y RJ39 (US 6.043.410). El ARNm SAR5 se
expresa durante el desarrollo del fruto y la maduración, exhibe una
expresión decreciente durante la maduración del fruto de fresa, y es
reprimido por auxina. El ARNm RJ39 se expresa abundantemente durante
la maduración, de forma creciente a medida que avanza la maduración
del fruto. No obstante, no se aportan pruebas funcionales de la
acción promotora de los mismos, por ejemplo, mediante estudios
funcionales de expresión transitoria.
Aunque se han identificado promotores que dirigen
la expresión de genes heterólogos en plantas, por ejemplo, de fresa,
algunos de ellos específicos de fruto, siguen existiendo promotores
específicos de fruto que todavía no han sido descritos. La
identificación de dichos promotores específicos de fruto es crítica
para la introducción de las mejoras específicas previamente
mencionadas en plantas que producen fruto.
La invención se enfrenta, en general, con el
problema de desarrollar un sistema que sea capaz de expresar un gen
heterólogo específicamente en fruto, por ejemplo, en fruto de
fresa.
La solución proporcionada por esta invención se
basa en el aislamiento y caracterización de un promotor capaz de
dirigir la expresión específica de frutos en plantas de fresa, en
particular, el promotor del gen FaALKE de fresa (Fragaria x
ananassa). La especificidad de dicho promotor se ha puesto de
manifiesto mediante un ensayo que comprende la expresión del gen de
la luciferasa en frutos de fresa bajo el control de dicho promotor
(Ejemplo 2).
El empleo de un promotor como el proporcionado
por esta invención permite manipular genéticamente frutos, por
ejemplo, el fruto de fresa y obtener plantas, por ejemplo, plantas
de fresa, con características mejoradas, a la vez que se evitan los
efectos deletéreos de una expresión del gen heterólogo en la
totalidad o en parte de la planta. Una de las ventajas de disponer
de un promotor como el proporcionado por esta invención es que
permite circunscribir la expresión del gen heterólogo al cual
antecede para que éste se exprese sólo en el lugar y momento deseado
para obtener el efecto esperado. Otra de las ventajas radica en que
la secuencia de nucleótidos correspondiente al promotor no es
foránea en la especie (para el caso de la fresa), lo que garantiza
su especificidad y evita su identificación como molécula extraña por
la célula.
Por consiguiente, un objeto de esta invención lo
constituye una secuencia de nucleótidos reguladora de la expresión
específica en fruto de un gen que comprende la secuencia de
nucleótidos mostrada en la SEC. ID. Nº: 1, o un fragmento de la
misma, o una secuencia de nucleótidos sustancialmente análoga a
dichas secuencias. El empleo de dicha secuencia de nucleótidos para
la obtención de plantas transgénicas constituye un objeto adicional
de esta invención.
Otro objeto adicional de esta invención lo
constituye una construcción de ADN que comprende la totalidad o
parte de dicha secuencia de nucleótidos y una secuencia de ADN
codificante de un producto de interés, así como un vector que
contiene dicha secuencia o construcción de ADN y una célula
transformada con dicho vector.
Otro objeto adicional de esta invención lo
constituye el empleo de dicha secuencia de ADN, o de dicha
construcción de ADN, en la producción de plantas transgénicas que
expresan específicamente en fruto una secuencia de ADN de interés.
Las plantas transgénicas resultantes constituyen otro objeto
adicional de esta invención.
Otro objeto adicional de esta invención lo
constituye un método para modificar el fenotipo de un fruto en una
planta transgénica que comprende crecer dicha planta transgénica
para que produzca frutos, en el que las células de dichos frutos
comprenden en su genoma, al menos, una de dichas construcciones de
ADN.
Otro objeto adicional de esta invención lo
constituye un método para expresar un gen heterólogo en un fruto que
comprende introducir en una planta dicha construcción de ADN.
La Figura 1 muestra una representación
esquemática del vector plasmídico pGL3-Basic
(Promega).
La Figura 2 es una gráfica que muestra la
actividad luciferasa de los extractos de frutos maduros de fresa que
habían sido disparados con ADN correspondientes a plásmidos pGL3 sin
promotor, con promotor FaALKE, e incubados los frutos en luz y en
obscuridad.
La invención proporciona una secuencia de
nucleótidos reguladora de la expresión específica en fruto de una
secuencia de ácido nucleico, en adelante secuencia de nucleótidos de
la invención, seleccionada entre:
- a)
- una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC. ID. Nº: 1
- b)
- un fragmento de dicha SEC. ID. Nº: 1 que mantiene la capacidad reguladora de la expresión específica en fruto; y
- c)
- una secuencia de nucleótidos que es sustancialmente análoga a la secuencia de nucleótidos definida en a) o en b).
En el sentido utilizado en esta descripción, el
término ``análoga'' pretende incluir a cualquier secuencia de
nucleótidos que posee, al menos, la capacidad reguladora de la
expresión específica en frutos. Típicamente la secuencia de ADN
análoga se puede aislar de cualquier organismo productor de dicha
secuencia análoga en base a la secuencia de nucleótidos mostrada en
la SEC. ID. Nº: 1; o bien se construye en base a la secuencia de
nucleótidos mostrada en la SEC. ID. Nº: 1 mediante la sustitución de
uno o más nucleótidos, la inserción de uno o más nucleótidos en la
secuencia, la adición de uno o más nucleótidos en cualquiera de los
extremos de la secuencia, o la deleción de uno o más nucleótidos en
cualquier extremo o en el interior de la secuencia. Por ejemplo, la
secuencia de ADN análoga puede ser una sub-secuencia
de la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC. ID. Nº 1.
En general, la secuencia de ADN análoga es
sustancialmente homóloga a la secuencia de nucleótidos identificada
como la SEC. ID. Nº: 1. En el sentido utilizado en esta descripción,
la expresión ``sustancialmente homóloga'' significa que las
secuencias de nucleótidos en cuestión tienen un grado de identidad,
a nivel de nucleótidos, de, al menos, un 60%, preferentemente de, al
menos un 85%, o más preferentemente de, al menos, un 95%.
La secuencia de nucleótidos de la invención puede
proceder de cualquier organismo que la contiene, por ejemplo, fresa
(Fragaria x ananassa) o de un organismo hospedador
transformado con dicha secuencia de ADN. La secuencia de nucleótidos
de la invención, puede ser aislada, mediante técnicas
convencionales, a partir del ADN de cualquier especie que la
contiene mediante el empleo de sondas o de oligonucleótidos
preparadas a partir de la información sobre la secuencia de
nucleótidos de la invención.
En una realización particular, la secuencia de
nucleótidos de la invención es la secuencia mostrada en la SEC. ID.
Nº: 1, que corresponde a la secuencia de nucleótidos del promotor
del gen FaALKE de fresa (Fragaria x ananassa). Ensayos
funcionales realizados por los inventores han puesto de manifiesto
que dicha secuencia es una secuencia reguladora de la expresión
específica en fruto de fresa de una secuencia de un ácido nucleico
heterólogo (Ejemplo 2).
El aislamiento e identificación de dicho promotor
se ha realizado mediante su clonación a partir de una genoteca de
clones genómicos de fresa (Fragaria x ananassa, cv.
Chandler). Para la clonación se procedió como se indica a
continuación. Brevemente, se preparó una genoteca de clones
genómicos de fresa en el vector Lambda FIXII (Stratagene) por
métodos convencionales descritos en los manuales de Biología
Molecular y siguiendo las especificaciones de la casa comercial
(Stratagene) para el vector Lambda FIXII. La genoteca fue plaqueada
en placas de Petri sobre un soporte de agar, analizándose hasta un
total de 10^{6} placas de lisis. Como sonda se utilizó la región
5' de un clon parcial de ADN complementario (ADNc), que fue
denominado FaALKE por la homología en la secuencia codificada de
aminoácidos a proteínas de la familia aldo-ceto
reductasas. Dicho clon parcial, que se utilizó como molde para la
sonda, se obtuvo a partir de una genoteca de sustracción (rojos
menos verdes) preparada a partir de frutos de fresa. De la
hibridación de la sonda con el ADN de las placas de lisis
transferidos a membranas se identificó un único clon genómico que
hibridaba con la sonda de FaALKE, en condiciones de alta
astringencia. El clon genómico identificado, de 4,2 kilobases (kb),
se amplificó mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
utilizando la enzima Pwo polimerasa termoestable (Boehringer) y un
programa de PCR estándar. El fragmento amplificado se digirió con la
enzima de restricción BamHI, y uno de los fragmentos de la
digestión, de 2,7 kb, hibridó con la sonda de FaALKE, por lo que se
identificó como el fragmento que tenía la región promotora de
FaALKE. Este fragmento que contenía la región promotora, fue
subclonado en el vector PBSKII (Stratagene), en el sitio
BamHI-EcoRV de la región de clonaje múltiple de dicho
vector. El fragmento de ADN correspondiente a la región promotora de
FaALKE fue secuenciado en su totalidad, por el método de didesoxi.
En la secuencia del fragmento se identificó la región 5'
correspondiente al ADNc de FaALKE. De esta forma se obtuvo la
secuencia definitiva de 1,2 kb del promotor, obtenida al quitar de
la secuencia de ADN clonada la correspondiente a la región 5' del
ADNc de FaALKE. La secuencia de nucleótidos resultante es la
identificada como SEC. ID. Nº: 1.
La secuencia de nucleótidos de la invención puede
actuar como secuencia reguladora de la expresión de una secuencia de
un ácido nucleico heterólogo en frutos, por ejemplo, frutos cuya
parte comestible sea fundamentalmente tejido de receptáculo, tales
como fresas, manzanas, peras, etc., frutos de la vid, hortalizas,
tales como tomates, pimientos, etc.
La secuencia de nucleótidos de la invención puede
utilizarse en el desarrollo de construcciones de ADN que incluyan,
además, secuencias codificantes de productos de interés que, a su
vez, pueden integrarse en vectores recombinantes de expresión. Para
ello, se pueden utilizar distintas técnicas ampliamente conocidas en
el estado de la técnica [Sambrook et al, ``Molecular cloning, a
Laboratory Manual'', 2^{nd} ed., Cold Spring Harbor Laboratory
Press, N.Y., 1989 Vol 1-3] algunas de los cuales se
muestran en la presente invención. Estos vectores recombinantes
permiten la expresión de distintos productos de interés en frutos,
por ejemplo, en fruto de fresa. Estas construcciones pueden contener
otros elementos reguladores de la expresión específica del fruto en
cuestión dependiendo del vector recombinante utilizado, etc. Todas
estas posibles construcciones de ADN conteniendo como denominador
común la secuencia de nucleótidos de la invención así como el uso de
las mismas para la transformación de plantas forman parte de la
presente invención.
Por tanto, la invención proporciona una
construcción de ADN que comprende la secuencia de nucleótidos de la
invención operativamente unida a una secuencia de ADN heterólogo
codificante de un producto de interés, por ejemplo, un péptido,
polipéptido, proteína, actividad o ARN de interés. En una
realización particular, se preparó una construcción de ADN que
comprendía una secuencia de ADN codificante de actividad luciferasa
bajo el control de la secuencia de nucleótidos de la invención para
evaluar la especificidad de la expresión de dicho gen en frutos de
fresa. La construcción de ADN proporcionada por esta invención
también puede contener, operativamente unidos, unos elementos
reguladores de la expresión funcionales en plantas, por ejemplo, una
secuencia de terminación de la transcripción, etc.
La secuencia de nucleótidos de la invención, o la
construcción de ADN proporcionada por esta invención, puede ser
insertada en un vector apropiado. Por tanto, la invención también se
refiere a un vector, tal como un vector de expresión, que comprende
dicha secuencia de nucleótidos de la invención, o dicha construcción
de DNA. La elección del vector dependerá de la célula hospedadora en
la que se va a introducir posteriormente. A modo de ejemplo, el
vector donde se introduce dicha secuencia de ADN puede ser un
plásmido o un vector que, cuando se introduce en una célula
hospedadora, se integra en el genoma de dicha célula y se replica
junto con el cromosoma (o cromosomas) en el que (o en los que) se ha
integrado. La obtención de dicho vector puede realizarse por métodos
convencionales conocidos por los técnicos en la materia [Sambrok et
al., 1989, citado supra].
La invención también proporciona una célula que
comprende una secuencia de nucleótidos de la invención, o una
construcción de ADN que contiene a dicha secuencia de nucleótidos o
dicho vector mencionado más arriba. Las células hospedadoras que se
pueden transformar con la secuencia de nucleótidos de la invención
pueden ser procarióticas o, preferentemente, eucarióticas, tales
como células de tejidos vegetales. La transformación de células de
tejidos vegetales también puede realizarse por métodos
convencionales. Para una revisión de la transferencia génica a
plantas, incluyendo vectores, métodos de transferencia de ADN, etc.,
véase, por ejemplo, el libro titulado ``Ingeniería genética y
transferencia génica'', de Marta Izquierdo, Ed. Pirámide (1999), en
particular, el capítulo 9, titulado ``Transferencia génica a
plantas'', páginas 283-316.
La secuencia de nucleótidos de la invención puede
ser utilizada para transformar plantas, por ejemplo, de fresa,
manzana, pera, vid, tomate, pimiento, etc., y obtener plantas
transformadas. La transformación de plantas está ampliamente
descrita en el estado de la técnica. Como es bien conocido, pueden
utilizarse múltiples sistemas, por ejemplo, vectores plasmídicos,
liposomas, electroporación, microinyección, difusión, bombardeo de
partículas (gene gun), coprecipitación con fosfato de calcio, empleo
de vectores virales, etc.
La secuencia de nucleótidos de la invención puede
utilizarse para regular la expresión específica en fruto de una
secuencia codificante de un péptido, polipéptido, proteína,
actividad o ARN de interés en una planta. En este sentido, la
secuencia de nucleótidos de la invención puede utilizarse para
manipular plantas con el fin de introducir en ellas alguna
característica comercial o agrícolamente deseable, por ejemplo,
retardo en la maduración del fruto, incremento del contenido en
azúcares, resistencia a patógenos, cambio en las propiedades
organolépticas del fruto, desarrollo de color, cambios de aroma,
cambios en el tamaño del fruto, dureza de los frutos, vida
post-cosecha, etc. A modo ilustrativo, la secuencia
de nucleótidos de la invención puede utilizarse para aumentar el
contenido en azúcares del fruto de fresa, por ejemplo, inhibiendo la
acción del gen de la
glucosa-6-fosfatasa mediante el
control de la transcripción de una secuencia antisentido
correspondiente a una o ambas subunidades de dicha enzima. Otros
genes involucrados en el control del contenido en azúcares en frutos
incluyen el gen de la sacarosa sintasa, el de la sacarosa fosfato
sintasa, el de la ADP glucosa pirofosforilasa o el de la invertasa.
Alternativamente, en las construcciones de ADN proporcionadas por
esta invención se podrían utilizar genes o secuencias de ADN que
proporcionan resistencia frente a patógenos, por ejemplo, genes que
estimulan la producción de fitoalexinas, genes de resistencia a
enfermedades, genes de inducción de defensas, genes de resistencia a
insectos.
La invención también proporciona un procedimiento
para producir una planta transgénica que comprende transformar dicha
planta con una construcción de ADN proporcionada por esta invención,
comprendiendo dicha construcción de ADN una secuencia de ADN
codificante de un producto de interés que proporciona al fruto de
dicha planta una característica mejorada, bajo el control de la
secuencia de nucleótidos de la invención, de manera que la expresión
de la secuencia de ADN codificante contenida en dicha construcción
provoca una característica mejorada en el fruto de dicha planta. La
planta resultante puede ser utilizada para la producción de frutos
con características mejoradas. Ejemplos no limitativos de plantas a
transformar incluyen, plantas de fresa, manzana, pera, vid, tomate,
pimiento, etc. Asimismo, ejemplos no limitativos de dichas
características mejoradas incluyen el control de la maduración del
fruto, la mejora en las características nutricionales de las partes
comestibles del fruto, la resistencia a plagas y enfermedades de
plantas, el cambio en las propiedades organolépticas del fruto, el
desarrollo de color, cambios de aroma, cambios en el tamaño del
fruto, dureza de los frutos, vida post-cosecha,
etc.
En una realización particular, la secuencia de
nucleótidos de la invención puede ser utilizada para producir
plantas de fresa transgénicas mediante un procedimiento que
comprende transformar dicha planta de fresa con una construcción de
ADN proporcionada por esta invención, comprendiendo dicha
construcción de ADN una secuencia de ADN codificante de un producto
de interés que proporciona al fruto de fresa una característica
mejorada, bajo el control de la secuencia de nucleótidos de la
invención, de manera que la expresión de la secuencia de ADN
codificante contenida en dicha construcción provoca una
característica mejorada en el fruto de fresa. La planta resultante
puede ser utilizada para la producción de fresa (frutos) con
características mejoradas.
Por tanto, la invención también proporciona un
método para modificar el fenotipo de un fruto en una planta
transgénica que comprende crecer una planta transgénica para que
produzca frutos, en el que las células de dichos frutos comprenden
en su genoma, al menos, una de las construcciones de ADN
proporcionadas por esta invención. En una realización particular,
dicho fruto se selecciona entre fresa, manzana, pera, uva, tomate y
pimiento.
Asimismo, la invención proporciona un método para
expresar un gen heterólogo en un fruto de una planta que comprende
transformar dicha planta con una construcción de ADN proporcionada
por esta invención que comprende una secuencia de ADN codificante de
un producto de interés.
En otra realización particular, la invención
proporciona una célula transgénica que comprende una secuencia de
nucleótidos de la invención integrada en su genoma, así como una
planta transgénica que comprende, al menos, una de dichas células
transgénicas. Dichas plantas transgénicas, que constituyen un objeto
adicional de la invención, se pueden obtener mediante el empleo de
técnicas convencionales, por ejemplo, mediante el empleo de técnicas
convencionales de ARNm antisentido y/o sobreexpresión
(silenciamiento en sentido), u otras, por ejemplo, utilizando
vectores binarios u otros vectores disponibles para las diferentes
técnicas de transformación de plantas existentes en la
actualidad.
Los siguientes ejemplos ilustran la invención y
no deben ser considerados como limitativos del alcance de la
misma.
Para clonar la región promotora se utilizó una
librería de ADN de fresa clonada en el vector Lambda FIXII
(Stratagene). Se analizaron 10^{6} placas de lisis y solo se
obtuvo un clon positivo. Como sonda se utilizaron 900 pb
correspondientes a la región 5' del clon parcial aislado de la
librería sustractiva de ADNc de fruto rojo. Una vez identificado el
clon positivo se aisló el ADN del fago (Sambrook et al., ``Molecular
cloning, a Laboratory Manual'', 2^{nd} ed., Cold Spring Harbor
Laboratory Press, N.Y., 1989 Vol 1-3) y se realizó
un análisis de restricción e hibridación con la misma sonda, para
identificar el fragmento correspondiente a la región promotora. El
clon genómico identificado, de 4,2 kb no se pudo subclonar y, como
alternativa, se realizó una amplificación enzimática mediante la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de dicho clon utilizando
los cebadores identificados como T7 (SEC. ID. Nº: 2)
[TAATACGACTCACTATAGGG] y ROC4 (SEC. ID. Nº: 3) [GCTTGGCAATCTCTTCG]
utilizando la enzima Pwo taq polimerasa (Boehringer) termoestable.
Las condiciones de la PCR fueron la siguientes: un ciclo de
desnaturalización inicial de 2 minutos 95ºC, seguido de 35 ciclos de
desnaturalización a 95ºC durante 30 segundos, anillamiento a 50ºC
durante 30 segundos y extensión a 72ºC durante 4 minutos, y
finalmente, un ciclo de extensión final a 72ºC durante 5 minutos.
Posteriormente se realizó un análisis de restricción e hibridación
del fragmento amplificado y se identificó una banda de 2,7 kb (en el
fragmento amplificado digerido con BamHI) que contenía la
región promotora del gen FaALKE que se subclonó en el vector PBSKII
(Stratagene).
El análisis de la secuencia de este clon puso de
manifiesto que de las 2,7 kb solo 1,2 kb correspondían a la región
promotora. Dicha secuencia, analizada utilizando varios programas
informáticos, reveló la presencia de cajas reguladoras presentes en
genes de plantas que se inducen por luz y daño mecánico. El
fragmento que contenía la región promotora, fue subclonado en el
vector PBSKII (Stratagene), en el sitio BamHI-EcoRV de
la región de clonaje múltiple de dicho vector. El fragmento de ADN
correspondiente a la región promotora de FaALKE fue secuenciado en
su totalidad, por el método de didesoxi [Servicio de Secuenciación
del Centro de Investigaciones Biológicas (CIB), Consejo Superior de
Investigaciones Científicas (CSIC), Madrid]. En la secuencia del
fragmento se identificó la región 5' correspondiente al ADNc de
FaALKE. De esta forma se obtuvo la secuencia definitiva de 1,2 kb
del promotor, obtenida al quitar de la secuencia de ADN clonada la
correspondiente a la región 5' del ADNc de FaALKE. La secuencia de
nucleótidos resultante es la identificada como SEC. ID. Nº: 1.
Se realizó este ensayo para comprobar que el
promotor de FAALKE controla la expresión de un gen en el fruto de
fresa. El gen de la luciferasa se utilizó como gen testigo.
Se utilizaron frutos maduros de fresa
(Fragaria x ananassa, cv. Chandler) que habían sido crecidos
en macetas en condiciones estándar correspondiente a las ambientales
en la provincia de Huelva en el período Febrero-Mayo
de 2000. Para las pruebas biolísticas se prepararon secciones
transversales del fruto (2-3 mm de espesor),
inmediatamente antes de ser ensayados.
El equipo utilizado para hacer los disparos fue
Biolistic PSD-1000/He (Dupont, BioRad).
El ADN utilizado para el recubrimiento de las
partículas de oro coloidal se preparó tal como se indica a
continuación. El fragmento correspondiente al ADN del promotor de
FAALKE se amplificó por PCR utilizando los cebadores identificados
como KpnI f (SEC. ID. Nº: 4) [AGGTACCCCATCACATCACCAGT] y HindIII r
(SEC. ID. Nº: 5) [AAAGCTTTGAGCTAGTTTACAAT], que tenían sitios de
restricción KpnI y HindIII. La ADN polimerasa
termoestable utilizada fue la Pwo (Boehringer). El programa de PCR
empleado fue estándar y las condiciones de la realización de la PCR
fueron la siguientes: un ciclo de desnaturalización inicial de 2
minutos 94ºC, seguido de 35 ciclos de desnaturalización a 94ºC
durante 30 segundos, anillamiento a 57ºC durante 30 segundos y
extensión a 72ºC durante 3 minutos, y finalmente, un ciclo de
extensión final a 72ºC durante 5 minutos. El fragmento amplificado
se subclonó en el vector plasmídico pBSKII-EcoRV. El
fragmento subclonado en pBSKII-EcoRV fue liberado
por digestión con KpnI y HindIII, y subclonado en el
vector plasmídico pGL3-Basic (Promega), que contiene
el gen luciferasa [Figura 1], en los sitios KpnI -
HindIII de la región de clonaje múltiple de este vector.
Células DH5\alpha fueron transformadas con la construcción
pGL3-promotor. El ADN de la construcción
pGL3-promotor fue amplificado in vivo
mediante cultivo nocturno de las células transformadas y el ADN fue
purificado utilizando el kit comercial Midiprep (Promega).
Posteriormente, 3 mg de partículas de oro fueron
recubiertas con 5 \mug de ADN plasmídico obtenido tal como se ha
descrito previamente. Para el recubrimiento se siguió el protocolo
descrito por BioRad para aplicación en el equipo Biolistic
PSD-1000/He. El método utiliza Cl_{2}Ca y
espermidina.
Las condiciones del ensayo biolístico fueron las
siguientes:
\dotable{\tabskip6pt#\hfil\+\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
Presión de disparo \+ 1.800 psi\cr Distancia ente disco de ruptura
y\+\cr macrocarrier (nivel 2) \+ 4 cm\cr Distancia entre
macrocarrier y la\+\cr muestra (nivel 4) \+ 4 cm\cr Tamaño de
partículas de oro \+ 1,6 \mu g\cr Cantidad de ADN por disparo \+
0,167 \mu g\cr Tamaño del corte del fruto \+ 2 - 3
mm\cr Disparos por muestra. \+ 2\cr Medio de
pre - incubación 5 min \+ CPW12\cr Medio de
post - incubación\+\cr 24 horas \+ CPW12,\cr \+ agar
0,7%\cr}
El medio CPW (Banks & Evans, 1976, Plant
Science Letters, 7:409-416) se suplementa con 12%
(w/v) de manitol y con ácido
3-N-morfolinpropano sulfónico (MOPs)
20 mM pH 7.
Para medir la actividad luciferasa, los frutos
disparados fueron macerados en nitrógeno líquido, añadiendo 1 ml de
tampón de lisis [CCLR (del inglés Cell Culture Lysis Reagent) 1X
(Promega) suplementado con Tris/fosfato 0,3 M pH 7,8] por cada 0,5 g
de tejido de fruto. Se centrifugó a 4ºC durante 10 minutos en
microcentrífuga de mesa a máxima velocidad. Posteriormente, se
añadieron 20 \mul del sobrenadante a 100 \mul del reactivo
luciferasa (kit Luciferase Assay System, Promega), y se midió en un
luminómetro el desarrollo de la reacción.
Los resultados obtenidos se muestran en la Figura
2, donde se representa la actividad luciferasa de los extractos de
frutos maduros de fresa que habían sido disparados con DNA
correspondientes a plásmidos pGL3 sin promotor FAALKE (pGL3), con
promotor FAALKE e incubados los frutos en luz
(Pro-Luc Luz) y en obscuridad
(Pro-Luc Osc).
Los resultados muestran que la región clonada
identificada como promotor FAALKE es capaz de inducir la expresión
de un gen indicador, el gen de la luciferasa (gen luc), en frutos
maduros de fresa. Para que ocurra dicha inducción, los frutos han de
ser incubados en la luz continua durante 24 horas.
La necesidad de la luz no es sorprendente puesto
que en la secuencia de nucleótidos correspondiente a la región
promotora se han identificado cajas reguladoras que responden a la
exposición a la luz.
La expresión en frutos de fresa refuerza los
resultados previos obtenidos sobre la expresión del gen FAALKE en
frutos de fresa durante la maduración. Dichos resultados se
obtuvieron por hibridación tipo Northern utilizando como sonda el
ADNc correspondiente al FaALKE.
\vskip0.333000\baselineskip
<110> Universidad de Málaga
\vskip0.333000\baselineskip
<120> Secuencia reguladora de la expresión
específica en fruto de un gen y sus aplicaciones
\vskip0.333000\baselineskip
<130> región promotora de expresión en
fruto de fresa
\vskip0.333000\baselineskip
<160> 5
\vskip0.333000\baselineskip
<170> PatentIn Ver.2.1
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 1198
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Fragaria x ananassa
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador T7
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip12mmTAATACGACTCACTATAGGG
\hfill20
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Oligonucléotido iniciador ROC4
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip12mmGCTTGGCAATCTCTTCG
\hfill17
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador KpnI f
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 4
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip12mmAGGTACCCCATCACATCACCAGT
\hfill23
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador HindIII
r
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 5
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip12mmAAAGCTTTGA GCTAGTTTAC AAT
\hfill23
Claims (10)
1. Una secuencia de nucleótidos reguladora de la
expresión específica en frutos de un gen heterólogo seleccionada
entre:
- a)
- una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC. ID. N°: 1;
- b)
- un fragmento cualquiera de dicha SEC. ID. N°: 1 que mantiene la capacidad reguladora de la expresión específica en fruto; y
- c)
- una secuencia de nucleótidos que es sustancialmente análoga a la secuencia de nucleótidos definida en a) o en b).
2. Una construcción de ADN que comprende una
secuencia de nucleótidos según la reivindicación 1, operativamente
unida a una secuencia de ADN codificante de un producto de
interés.
3. Un vector recombinante que comprende una
secuencia de nucleótidos según la reivindicación 1, o una
construcción de ADN según la reivindicación 2.
4. Una célula transformada que comprende una
secuencia de nucleótidos según la reivindicación 1, o una
construcción de ADN según la reivindicación 2, o un vector
recombinante según la reivindicación 3.
5. Una célula transgénica que comprende,
insertada en su genoma, una secuencia de nucleótidos según la
reivindicación 1, o una construcción de ADN según la reivindicación
2, o un vector recombinante según la reivindicación 3.
6. Una planta transgénica que comprende, al
menos, una célula transgénica según la reivindicación 5.
7. Un método para expresar un gen heterólogo en
una planta, que comprende transformar dicha planta con una
construcción de ADN según la reivindicación 2.
8. Método según la reivindicación 7, en el que
dicha planta se selecciona entre plantas de fresa, manzana, pera,
vid, tomate y pimiento.
9. Un método para modificar el fenotipo del fruto
de una planta transgénica que comprende crecer una planta
transgénica para que produzca frutos, en el que las células de
dichos frutos comprenden en su genoma, al menos, una construcción de
ADN según la reivindicación 2.
10. Método según la reivindicación 9, en el que
dicha planta transgénica se selecciona entre plantas de fresa,
manzana, pera, vid, tomate y pimiento.
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200102215A ES2188400B1 (es) | 2001-10-03 | 2001-10-03 | Secuencia reguladora de la expresion especifica en fruto de un gen y sus aplicaciones. |
| PCT/ES2002/000465 WO2003029399A2 (es) | 2001-10-03 | 2002-10-03 | Secuencia reguladora de la expresión específica en fruto de un gen y sus aplicaciones |
| AU2002340520A AU2002340520A1 (en) | 2001-10-03 | 2002-10-03 | Regulatory sequence for the specific expression in fruit of a gene and the applications thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200102215A ES2188400B1 (es) | 2001-10-03 | 2001-10-03 | Secuencia reguladora de la expresion especifica en fruto de un gen y sus aplicaciones. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2188400A1 ES2188400A1 (es) | 2003-06-16 |
| ES2188400B1 true ES2188400B1 (es) | 2004-05-16 |
Family
ID=8499093
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES200102215A Expired - Fee Related ES2188400B1 (es) | 2001-10-03 | 2001-10-03 | Secuencia reguladora de la expresion especifica en fruto de un gen y sus aplicaciones. |
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|---|---|
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| ES (1) | ES2188400B1 (es) |
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Family Cites Families (3)
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|---|---|---|---|---|
| CA2278796A1 (en) * | 1997-01-21 | 1998-07-23 | Monsanto Company | Strawberry promoters and genes |
| US6043410A (en) * | 1998-02-06 | 2000-03-28 | Calgene Llc | Strawberry fruit promoters for gene expression |
| FR2803600B1 (fr) * | 2000-01-10 | 2002-04-05 | Agronomique Inst Nat Rech | Promoteur de plante fruit specifique |
-
2001
- 2001-10-03 ES ES200102215A patent/ES2188400B1/es not_active Expired - Fee Related
-
2002
- 2002-10-03 WO PCT/ES2002/000465 patent/WO2003029399A2/es not_active Application Discontinuation
- 2002-10-03 AU AU2002340520A patent/AU2002340520A1/en not_active Abandoned
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| GONZALEZ-LAMOTHE et al. "Analysis and characterization of cDNAs with differential expression during fruit ripening" 20 enero 1998 EMBL/GENEBANK DATABASES [en línea] [recuperado el 13 diciembre 2002] Accesion nº AF039182, Sequence identification AF039182.1 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2188400A1 (es) | 2003-06-16 |
| WO2003029399A3 (es) | 2004-03-04 |
| WO2003029399A2 (es) | 2003-04-10 |
| AU2002340520A1 (en) | 2003-04-14 |
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