WO2003029399A2 - Secuencia reguladora de la expresión específica en fruto de un gen y sus aplicaciones - Google Patents

Secuencia reguladora de la expresión específica en fruto de un gen y sus aplicaciones Download PDF

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WO2003029399A2
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fruit
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plant
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Maria Fernanda Agius Guadalupe
Miguel Angel Botella Mesa
Victoriano Valpuesta Fernandez
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Universidad De Malaga
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
    • C12N15/823—Reproductive tissue-specific promoters
    • C12N15/8235—Fruit-specific

Definitions

  • the invention relates, in general, to the obtaining of DNA sequences that regulate the specific expression of tissues or target cells of genes, for example, heterologous genes in plants, in particular, with a specific regulatory DNA sequence (promoter) of fruit, for example, of strawberry, which determines the expression in that organ of any gene that is introduced into said species by genetic engineering.
  • a specific regulatory DNA sequence promoter of fruit, for example, of strawberry
  • One of the objectives of genetic engineering is to obtain plants with improved characteristics.
  • these characteristics include, among others, the control of fruit ripening, improvements in the nutritional characteristics of the edible parts of the fruit, resistance to pests and plant diseases, etc.
  • promoters that direct the expression of heterologous genes specific to wild strawberry fruit have been described, for example, promoters identified as SAR5 and RJ39 (US 6,043,410).
  • SAR5 mRNA is expressed during fruit development and ripening, exhibits a decreasing expression during ripening of strawberry fruit, and is repressed by auxin.
  • RJ39 mRNA is abundantly expressed during ripening, increasing as fruit ripening progresses.
  • no functional evidence of their promoter action is provided, for example, through functional studies of transient expression.
  • promoters have been identified that direct the expression of heterologous genes in plants, for example, strawberry, some of them fruit specific, there are still specific fruit promoters that have not yet been described. The identification of said specific fruit promoters is critical for the introduction of the specific improvements previously mentioned in plants that produce fruit.
  • the invention generally faces the problem of developing a system that is capable of expressing a heterologous gene specifically in fruit, for example, in strawberry fruit.
  • the solution provided by this invention is based on the isolation and characterization of a promoter capable of directing the specific expression of fruits in strawberry plants, in particular, the promoter of the FaALKE strawberry gene (Fragaria x ananassa).
  • the specificity of said promoter has been revealed by an assay that includes the expression of the luciferase gene in strawberry fruits under the control of said promoter (Ex. 2).
  • a promoter such as that provided by this invention makes it possible to genetically manipulate fruits, for example, strawberry fruit and obtain plants, for example, strawberry plants, with improved characteristics, while avoiding the deleterious effects of an expression of the heterologous gene in whole or in part of the plant.
  • One of the advantages of having a promoter such as that provided by this invention is that it allows circumscribing the expression of the heterologous gene to which it precedes so that it is expressed only at the desired place and time to obtain the expected effect.
  • Another advantage is that the nucleotide sequence corresponding to the promoter is not foreign in the species (in the case of the strawberry), which guarantees its specificity and prevents its identification as a molecule, missed by the cell.
  • an object of this invention is a nucleotide sequence regulating the specific expression in fruit of a gene comprising the nucleotide sequence shown in the SEC. ID. N ° 1, or a fragment thereof, or a nucleotide sequence substantially analogous to said sequences.
  • the use of said nucleotide sequence to obtain transgenic plants constitutes an additional object of this invention.
  • Another additional object of this invention is a DNA construct comprising 1 all or part of said nucleotide sequence and a DNA sequence encoding a product of interest, as well as a vector containing said DNA sequence or construct and a cell transformed with said vector.
  • Another additional object of this invention is the use of said sequence of
  • transgenic plants in the production of transgenic plants that specifically express in fruit a DNA sequence of interest.
  • the resulting transgenic plants constitute another additional object of this invention.
  • Another additional object of this invention is a method for modifying the phenotype of a fruit in a transgenic plant that comprises growing said transgenic plant to produce fruits, in which the cells of said fruits comprise at least one of their genomes. said DNA constructs.
  • Another additional object of this invention is a method for expressing a heterologous gene in a fruit that comprises introducing said DNA construct into a plant.
  • Figure 1 shows a schematic representation of the plasmid vector pGL3-Basic (Promega).
  • Figure 2 is a graph showing the luciferase activity of extracts of ripe strawberry fruits that had been fired with DNA corresponding to plasmids pGL3 without promoter, with FaALKE promoter, and incubated the fruits in light and dark.
  • nucleic acid sequence hereinafter nucleotide sequence of the invention, selected from:
  • analogous is intended to include any nucleotide sequence that has at least the regulatory capacity of specific expression in fruits.
  • the analogous DNA sequence can be isolated from any organism producing such an analogous sequence based on the nucleotide sequence shown in the SEC. ID. N °: 1; or it is constructed based on the nucleotide sequence shown in the SEC. ID. N °: 1 by substituting one or more nucleotides, inserting one or more nucleotides in the sequence, adding one or more nucleotides at any end of the sequence, or deleting one or more nucleotides at any end or inside the sequence.
  • the analog DNA sequence may be a sub-sequence of the nucleotide sequence shown in the SEC. ID. No. 1.
  • the analog DNA sequence is substantially homologous to the nucleotide sequence identified as SEQ. ID. N °: 1.
  • the term "substantially homologous" means that the nucleotide sequences in question have a degree of identity, at the nucleotide level, of at least 60%, preferably of, at least 85%, or more preferably, at least 95%.
  • the nucleotide sequence of the invention may come from any organism that contains it, for example, strawberry (Fragaria x ananassa) or from a host organism transformed with said DNA sequence.
  • the nucleotide sequence of the invention can be isolated, by conventional techniques, from the DNA of any species that contains it by the use of probes or oligonucleotides prepared from the information on the nucleotide sequence of the invention.
  • the nucleotide sequence of the invention is the sequence shown in the SEC. ID. N °: 1, which corresponds to the nucleotide sequence of the strawberry FaALKE gene promoter (Fragaria x ananassa). Functional tests carried out by the inventors have shown that said sequencing is a sequence regulating the specific expression in strawberry fruit of a sequence of a heterologous nucleic acid (Example 2). The isolation and identification of said promoter has been carried out by cloning it from a genomic strawberry clone library (Fragaria x ananassa, cv. Chandler). For cloning, proceed as indicated below.
  • a genomic strawberry clone library in the Lambda FLXII vector was prepared by conventional methods described in the Molecular Biology manuals and following the commercial house (Stratagene) specifications for the Lambda FLXII vector.
  • the library was plated in Petri dishes on an agar support, analyzing up to a total of 10 6 lysis plates.
  • the 5 'region of a partial clone of complementary DNA (cDNA) was used as a probe, which was called FaALKE by the homology in the encoded sequence of amino acids to proteins of the aldo-keto reductases family.
  • Said partial clone which was used as a template for the probe, was obtained from a subtraction library (less green reds) prepared from strawberry fruits. From the hybridization of the probe with the DNA of the lysis plates transferred to membranes, a single genomic clone was identified that hybridized with the FaALKE probe, under high astringency conditions.
  • the identified genomic clone 4.2 kilobases (kb) was amplified by polymerase chain reaction (PCR) using the thermostable Pwo polymerase enzyme (Boehringer) and a standard PCR program.
  • the amplified fragment was digested with the restriction enzyme BamHI, and one of the fragments of the digestion, 2.7 kb, hybridized with the FaALKE probe, so it was identified as the fragment that had the FaALKE promoter region.
  • This fragment which contained the promoter region, was subcloned into the PBSKII vector (Stratagene), in the BamHI-EcoRV site of the multiple cloning region of said vector.
  • the DNA fragment corresponding to the FaALKE promoter region was sequenced in its entirety, by the dideoxy method. In the fragment sequence, the 5 'region corresponding to the FaALKE cDNA was identified.
  • the definitive 1.2 kb sequence of the promoter was obtained, obtained by removing from the cloned DNA sequence the one corresponding to the 5 'region of the FaALKE cDNA.
  • the resulting nucleotide sequence is that identified as SEC. ID. N °: 1.
  • the nucleotide sequence of the invention can act as a regulatory sequence for the expression of a sequence of a heterologous nucleic acid in fruits, for example, fruits whose edible part is primarily tissue tissue, such as strawberries, apples, pears, etc., vine fruits, vegetables, such as tomatoes, peppers, etc.
  • the nucleotide sequence of the invention can be used in the development of DNA constructs that also include sequences encoding products of interest. which, in turn, can be integrated into recombinant expression vectors. For this purpose, they can be used various widely known in the state of the art [Sambrook et to the, "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1989 Vol 1-3] some of which are shown in the present invention. These recombinant vectors allow the expression of different products of interest in fruits, for example, in strawberry fruit. These constructs may contain other regulatory elements of the specific expression of the fruit in question depending on the recombinant vector used, etc. All these possible DNA constructs containing as a common denominator the nucleotide sequence of the invention as well as the use thereof for plant transformation form part of the present invention.
  • the invention provides a DNA construct comprising the nucleotide sequence of the invention operably linked to a heterologous DNA sequence encoding a product of interest, for example, a peptide, polypeptide, protein, activity or RNA of interest.
  • a DNA construct comprising a DNA sequence encoding luciferase activity was prepared under the control of the nucleotide sequence of the invention to assess the specificity of expression of said gene in strawberry fruits.
  • the DNA construct provided by this invention may also contain, operably linked, functional expression regulating elements in plants, for example, a transcription termination sequence, etc.
  • the invention also relates to a vector, such as an expression vector, comprising said nucleotide sequence of the. invention, or said DNA construct.
  • a vector such as an expression vector
  • the choice of the vector will depend on the host cell into which it will be subsequently introduced.
  • the vector where said DNA sequence is introduced can be a plasmid or a vector that, when introduced into a host cell, is integrated into the genome of said cell and replicated together with the chromosome (or chromosomes) in which (or in which) it has been integrated.
  • the obtaining of said vector can be carried out by conventional methods known to those skilled in the art [Sambrok et al., 1989, cited supra].
  • the invention also provides a cell comprising a nucleotide sequence of the invention, or a DNA construct containing said sequence of nucleotides or said vector mentioned above.
  • Host cells that can be transformed with the nucleotide sequence of the invention can be prokaryotic or, preferably, eukaryotic, such as plant tissue cells.
  • the transformation of plant tissue cells can also be carried out by conventional methods.
  • the nucleotide sequence of the invention can be used to transform plants, for example, strawberry, apple, pear, vine, tomato, pepper, etc., and to obtain transformed plants.
  • the transformation of plants is widely described in the state of the art.
  • multiple systems can be used, for example, plasmid vectors, liposomes, electroporation, microinjection, diffusion, particle bombardment (gene gun), calcium phosphate coprecipitation, use of viral vectors, etc.
  • the nucleotide sequence of the invention can be used to regulate the specific expression in fruit of a coding sequence of a peptide, polypeptide, protein, activity or RNA of interest in a plant.
  • the nucleotide sequence of the invention can be used to manipulate plants in order to introduce in them some commercially or agriculturally desirable characteristic, for example, delay in fruit ripening, increase in sugar content, pathogen resistance, change in the organoleptic properties of the fruit, color development, aroma changes, changes in fruit size, fruit hardness, post-harvest life, etc.
  • the nucleotide sequence of the invention can be used to increase the sugar content of the strawberry fruit, for example, by inhibiting the action of the glucose-6-phosphatase gene by controlling the transcription of a corresponding antisense sequence. to one or both subunits of said enzyme.
  • genes involved in the control of the sugar content in fruits include the sucrose synthase gene, the sucrose phosphate synthase gene, the ADP glucose pyrophosphorylase or the invertase gene.
  • genes or DNA sequences that provide resistance to pathogens could be used, for example, genes that stimulate phytoalexin production, disease resistance genes, defense induction genes, genes of resistance to insects.
  • the invention also provides a method for producing a transgenic plant comprising transforming said plant with a DNA construct provided by this invention, said DNA construct comprising a DNA sequence encoding a product of interest that provides the fruit of said plant with a characteristic improved, under the control of the nucleotide sequence of the invention, so that the expression of the coding DNA sequence contained in said construct causes an improved characteristic in the fruit of said plant.
  • the resulting plant can be used for the production of fruits with improved characteristics.
  • Non-limiting examples of plants to transform include, strawberry, apple, pear, vine, tomato, pepper, etc.
  • non-limiting examples of such improved characteristics include the control of fruit ripening, the improvement in the nutritional characteristics of the edible parts of the fruit, resistance to pests and plant diseases, the change in the organoleptic properties of the fruit, the color development, aroma changes, changes in fruit size, hardness of fruits, post-harvest life, etc.
  • a nucleotide sequence of 1 invention can be used to produce transgenic strawberry plants by a method comprising transforming said strawberry plant with a DNA construct provided by this invention, said construction comprising of DNA a DNA sequence coding for a product of interest that provides the strawberry fruit with an improved characteristic, under the control of the nucleotide sequence of the invention, so that the expression of the DNA sequence encoding contained in said construction causes an improved feature in strawberry fruit.
  • the resulting plant can be used for strawberry production (fruits) with improved characteristics.
  • the invention also provides a method for modifying the phenotype of a fruit in a transgenic plant that comprises growing a transgenic plant to produce fruits, in which the cells of said fruits comprise at least one of the genomes in their genome.
  • said fruit is selected from strawberry, apple, pear, grape, tomato and pepper.
  • the invention provides a method for expressing a heterologous gene in a fruit of a plant which comprises transforming said plant with a DNA construct provided by the invention which comprises a DNA sequence c odifying a product of interest.
  • the invention provides a transgenic cell comprising a nucleotide sequence of the invention integrated into its genome, as well as a transgenic plant comprising at least one of said transgenic cells.
  • Said transgenic plants, which constitute a further object of the invention can be obtained by using conventional techniques, for example, by using conventional techniques of antisense mRNA and / or overexpression (sense silencing), or others, for example , using binary vectors or other vectors available for the different plant transformation techniques currently in existence.
  • the identified genomic clone of 4.2 kb could not be subcloned and, alternatively, an enzymatic amplification was performed by polymerase chain reaction (PCR) of said clone using primers identified as T7 (SEQ. ID. N °: 2) [TAATACGACTCACTATAGGG] and ROC4 (SEQ ID NO: 3) [GCTTGGCAATCTCTTCG] using the thermostable Pwo taq polymerase (Boehringer) enzyme.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the PCR conditions were as follows: an initial denaturation cycle of 2 minutes 95 ° C, followed by 35 cycles of denaturation at 95 ° C for 30 seconds, banding at 50 ° C for 30 seconds and extension at 72 ° C for 4 minutes, and finally, a final extension cycle at 72 ° C for 5 minutes. Subsequently, a restriction and hybridization analysis of the amplified fragment was performed and a 2.7 kb band was identified (in the amplified fragment digested with BamHT) containing the promoter region of the FaALKE gene that was subcloned into the vector pBSKII (Stratagene). Sequence analysis of this clone showed that of the 2.7 kb only 1.2 kb corresponded to the promoter region.
  • This sequence analyzed using several computer programs, revealed the presence of regulatory boxes present in plant genes that are induced by light and mechanical damage.
  • the fragment containing the promoter region was subcloned into the PBSKII vector (Stratagene), at the BamHI-EcoRV site of the multiple cloning region of said vector.
  • the DNA fragment corresponding to the FaALKE promoter region was sequenced in its entirety, by the dideoxy method [Sequencing Service of the Center for Biological Research (CIB), Higher Council for Scientific Research (CSIC), Madrid]. In the fragment sequence, the 5 'region corresponding to the FaALKE cDNA was identified.
  • the definitive 1.2 kb sequence of the promoter was obtained, obtained by removing from the cloned DNA sequence the one corresponding to the 5 'region of the FaALKE cDNA.
  • the resulting nucleotide sequence is that identified as SEC. ID. N °: 1.
  • Ripe strawberry fruits (Fragaria x ananassa, cv. Chandler) were used that had been grown in pots under standard conditions corresponding to the environmental conditions in the province of Huelva in the period February-May 2000.
  • cross sections were prepared of the fruit (2-3 mm thick), immediately before being tested.
  • the equipment used to make the shots was Biolistic PSD-1000 / He (Dupont, BioRad).
  • the DNA used for coating the colloidal gold particles was prepared as indicated below.
  • the fragment corresponding to the promoter DNA of FaALKE was amplified by PCR using primers identified as Kpnl f (SEQ ID NO: 4) [AGGTACCCCATCACATCACCAGT] and HindIII r (SEQ ID NO: 5) [AAAGCTTTGAGCTAGTTTACAAT], which had Kpnl and HindIII restriction sites .
  • the thermostable DNA polymerase used was Pwo (Boehringer).
  • the PCR program used was standard and the conditions for carrying out the PCR were as follows: an initial denaturation cycle of 2 minutes 94 ° C, followed by 35 cycles of denaturation at 94 ° C for 30 seconds, banding at 57 ° C for 30 seconds and extension at 72 ° C for 3 minutes, and finally, a final extension cycle at 72 ° C for 5 minutes.
  • the amplified fragment was subcloned into the plasmid vector pBSKII-EcoRV.
  • the subcloned fragment in pBSKII-EcoRV was released by digestion with Kpnl and HindIII, and subcloned into the plasmid vector pGL3-Basic (Promega), which contains the luciferase gene [ Figure 1], at the Kpnl-HindIII sites of the cloning region Multiple of this vector.
  • DH5 ⁇ cells were transformed with the pGL3 -promotor construct.
  • the DNA of the pGL3-promoter construct was amplified in vivo by night culture of the transformed cells and the DNA was purified using the commercial kit Midiprep (Promega).
  • Trigger pressure 1,800 psi Distance between rupture disc and macrocarrier (level 2) 4 cm
  • Pre-incubation medium 5 min CPW12 Post-incubation medium 24 hours CPW12, agar 0.7% CPW medium (Banks & Evans, 1976, Plant Science Letters, 7: 409-416) is supplemented with 12% (w / v) mannitol and with 20 mM 3-N-morpholinpropane sulfonic acid (MOPs) pH 7.
  • MOPs 3-N-morpholinpropane sulfonic acid
  • luciferase activity To measure luciferase activity, the shot fruits were macerated in liquid nitrogen, adding 1 ml of lysis buffer [CCLR (Cell Culture Lysis Reagent) IX (Promega) supplemented with 0.3 M Tris / phosphate pH 7.8] for every 0.5 g of fruit tissue. It was centrifuged at 4 ° C for 10 minutes in a tabletop microcentrifuge at maximum speed. Subsequently, 20 ⁇ l of the supernatant was added to 100 ⁇ l of the luciferase reagent (Luciferase Assay System kit, Promega), and the reaction development was measured in a luminometer.
  • CCLR Cell Culture Lysis Reagent
  • IX Cell Culture Lysis Reagent
  • the cloned region identified as a FaALKE promoter is capable of inducing the expression of an indicator gene, the luciferase gene (luc gene), in ripe strawberry fruits. For this induction to occur, the fruits must be incubated in continuous light for 24 hours.

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Abstract

La secuencia reguladora (promotor) es útil para la expresión específica en fruto de una secuencia de ADN codificante de un producto de interés, pro ejemplo, un péptido, polipéptido, proteína, actividad o ARN de interés. La secuencia puede ser utilizada en construcciones de ADN que contienen dicha secuencia operativamente unida a una secuencia de ADN codificante de un producto de interés, y dichas construcciones pueden ser utilizadas en la construcción de plantas transgénicas.

Description

SECUENCIA REGULADORA DE LA EXPRESIÓN ESPECÍFICA EN FRUTO DE UN GEN Y SUS APLICACIONES
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La invención se relaciona, en general, con la obtención de secuencias de ADN reguladoras de la expresión específica de tejidos o de células diana de genes, por ejemplo, genes heterólogos en plantas, en particular, con una secuencia de ADN reguladora (promotor) específico de fruto, por ejemplo, de fresa, que determina la expresión en ese órgano de cualquier gen que se introduzca en dicha especie por ingeniería genética.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Uno de los objetivos de la ingeniería genética es el de obtener plantas con características mejoradas. En relación con plantas que producen fruto, estas características incluyen, entre otras, el control de la maduración del fruto, mejoras en las características nutricionales de las partes comestibles del fruto, resistencia a plagas y enfermedades de plantas, etc.
Para manipular y controlar de forma estable una determinada característica de una planta se requiere, por una parte, identificar y aislar el gen o genes que codifican o regulan dicha característica particular, y, además, identificar y aislar los elementos genéticos esenciales para la expresión y/o control del gen o genes aislados para que la planta manifieste dicha característica de forma controlada o controlable. Entre dichos elementos genéticos esenciales se encuentran los elementos de control de la transcripción conocidos como promotores.
Se han descrito algunos promotores que dirigen la expresión de genes heterólogos específicos de fruto de fresa silvestre (Fragaria vesca), por ejemplo, los promotores identificados como SAR5 y RJ39 (US 6.043.410). El ARNm SAR5 se expresa durante el desarrollo del fruto y la maduración, exhibe una expresión decreciente durante la maduración del fruto de fresa, y es reprimido por auxina. El ARNm RJ39 se expresa abundamenternente durante la maduración, de forma creciente a medida que avanza la maduración del fruto. No obstante, no se aportan pruebas funcionales de la acción promotora de los mismos, por ejemplo, mediante estudios funcionales de expresión transitoria. Aunque se han identificado promotores que dirigen la expresión de genes heterólogos en plantas, por ejemplo, de fresa, algunos de ellos específicos de fruto, siguen existiendo promotores específicos de fruto que todavía no han sido descritos. La identificación de dichos promotores específicos de fruto es crítica para la introducción de las mejoras específicas previamente mencionadas en plantas que producen fruto.
COMPENDIO DE LA INVENCIÓN
La invención se enfrenta, en general, con el problema de desarrollar un sistema que sea capaz de expresar un gen heterólogo específicamente en fruto, por ejemplo, en fruto de fresa. La solución proporcionada por esta invención se basa en el aislamiento y caracterización de un promotor capaz de dirigir la expresión específica de frutos en plantas de fresa, en particular, el promotor del gen FaALKE de fresa (Fragaria x ananassa). La especificidad de dicho promotor se ha puesto de manifiesto mediante un ensayo que comprende la expresión del gen de la luciferasa en frutos de fresa bajo el control de dicho promotor (Ej emplo 2) .
El empleo de un promotor como el proporcionado por esta invención permite manipular genéticamente frutos, por ejemplo, el fruto de fresa y obtener plantas, por ejemplo, plantas de fresa, con características mejoradas, a la vez que se evitan los efectos deletéreos de una expresión del gen heterólogo en la totalidad o en parte de la planta. Una de las ventajas de disponer de un promotor como el proporcionado por esta invención es que permite circunscribir la expresión del gen heterólogo al cual antecede para que éste se exprese sólo en el lugar y momento deseado para obtener el efecto esperado. Otra de las ventajas radica en que la secuencia de nucleótidos correspondiente al promotor no es foránea en la especie (para el caso de la fresa), lo que garantiza su especificidad y evita su identificación como molécula, extraña por la célula.
Por consiguiente, un objeto de esta invención lo constituye una secuencia de nucleótidos reguladora de la expresión específica en fruto de un gen que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC. ID. N°: 1, o un fragmento de la misma, o una secuencia de nucleótidos sustancialmente análoga a dichas secuencias. El empleo de dicha secuencia de nucleótidos para la obtención de plantas transgénicas constituye un objeto adicional de esta invención. Otro objeto adicional de esta invención lo constituye una construcción de ADN que comprende 1 a totalidad o parte de dicha secuencia de nucleótidos y una secuencia de ADN codificante de un producto de interés, así como un vector que contiene dicha secuencia o construcción de ADN y una célula transformada con dicho vector. Otro objeto adicional de esta invención lo constituye el empleo de dicha secuencia de
ADN, o de dicha construcción de ADN, en la producción de plantas transgénicas que expresan específicamente en fruto una secuencia de ADN de interés. Las plantas transgénicas resultantes constituyen otro objeto adicional de esta invención.
Otro objeto adicional de esta invención lo constituye un método para modificar el fenotipo de un fruto en una planta transgénica que comprende crecer dicha planta transgénica para que produzca frutos, en el que las células de dichos frutos comprenden en su genoma, al menos, una de dichas construcciones de ADN.
Otro objeto adicional de esta invención lo constituye un método para expresar un gen heterólogo en un fruto que comprende introducir en una planta dicha construcción de ADN.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
La Figura 1 muestra una representación esquemática del vector plasmídico pGL3-Basic (Promega).
La Figura 2 es una gráfica que muestra la actividad luciferasa de los extractos de frutos maduros de fresa que habían sido disparados con ADN correspondientes a plásmidos pGL3 sin promotor, con promotor FaALKE, e incubados los frutos en luz y en obscuridad.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La invención proporciona una secuencia de nucleótidos reguladora de la expresión específica en fruto de una secuencia de ácido nucleico, en adelante secuencia de nucleótidos de la invención, seleccionada entre:
a) una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC. ID. N°: 1
b) un fragmento de dicha SEC. ID. N°: 1 que mantiene la capacidadreguladora de la expresión específica en fruto; y c) una secuencia de nucleótidos que es sustancialmente análoga a la secuencia de nucleótidos definida en a) o en b).
En el sentido utilizado en esta descripción, el término "análoga" pretende incluir a cualquier secuencia de nucleótidos que posee, al menos, la capacidad reguladora de la expresión específica en frutos. Típicamente la secuencia de ADN análoga se puede aislar de cualquier organismo productor de dicha secuencia análoga en base a la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC. ID. N°: 1; o bien se construye en base a la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC. ID. N°: 1 mediante la sustitución de uno o más nucleótidos, la inserción de uno o más nucleótidos en la secuencia, la adición de uno o más nucleótidos en cualquiera de los extremos de la secuencia, o la deleción de uno o más nucleótidos en cualquier extremo o en el interior de la secuencia. Por ejemplo, la secuencia de ADN análoga puede ser una sub-secuencia de la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC. ID. N° 1. En general, la secuencia de ADN análoga es sustancialmente homologa a la secuencia de nucleótidos identificada como la SEC. ID. N°: 1. En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "sustancialmente homologa" significa que las secuencias de nucleótidos en cuestión tienen un grado de identidad, a nivel de nucleótidos, de, al menos, un 60%, preferentemente de, al menos un 85%, o más preferentemente de, al menos, un 95%. La secuencia de nucleótidos de la invención puede proceder de cualquier organismo que la contiene, por ejemplo, fresa (Fragaria x ananassa) o de un organismo hospedador transformado con dicha secuencia de ADN. La secuencia de nucleótidos de la invención, puede ser aislada, mediante técnicas convencionales, a partir del ADN de cualquier especie que la contiene mediante el empleo de sondas o de oligonucleótidos preparadas a partir de la información sobre la secuencia de nucleótidos de la invención.
En una realización particular, la secuencia de nucleótidos de la invención es la secuencia mostrada en la SEC. ID. N°: 1, que corresponde a la secuencia de nucleótidos del promotor del gen FaALKE de fresa (Fragaria x ananassa). Ensayos funcionales realizados por los inventores han puesto de manifiesto que dicha secucencia es una secuencia reguladora de la expresión específica en fruto de fresa de una secuencia de un ácido nucleico heterólogo (Ejemplo 2). El aislamiento e identificación de dicho promotor se ha realizado mediante su clonación a partir de una genoteca de clones genómicos de fresa (Fragaria x ananassa, cv. Chandler). Para la clonación se procedió como se indica a continuación. Brevemente, se preparó una genoteca de clones genómicos de fresa en el vector Lambda FLXII (Stratagene) por métodos convencionales descritos en los manuales de Biología Molecular y siguiendo las espcificaciones de la casa comercial (Stratagene) para el vector Lambda FLXII. La genoteca fue plaqueada en placas de Petri sobre un soporte de agar, analizándose hasta un total de 106 placas de lisis. Como sonda se utilizó la región 5' de un clon parcial de ADN complementario (ADNc), que fue denominado FaALKE por la homología en la secuencia codificada de aminoácidos a proteínas de la familia aldo-ceto reductasas. Dicho clon parcial, que se utilizó como molde para la sonda, se obtuvo a partir de una genoteca de sustracción (rojos menos verdes) preparada a partir de frutos de fresa. De la hibridación de la sonda con el ADN de las placas de lisis transferidos a membranas se identificó un único clon genómico que hibridaba con la sonda de FaALKE, en condiciones de alta astringencia. El clon genómico identificado, de 4,2 kilobases (kb), se amplificó mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando la enzima Pwo polimerasa termoestable (Boehringer) y un programa de PCR estándar. El fragmento amplificado se digirió con la enzima de restricción BamHI, y uno de los fragmentos de la digestión, de 2 ,7 kb, híbrido con la sonda de FaALKE, por lo que se identificó como el fragmento que tenía la región promotora de FaALKE. Este fragmento que contenía la región promotora, fue subclonado en el vector PBSKII ( Stratagene), en el sitio BamHI-EcoRV de la región de clonaje múltiple de dicho vector. El fragmento de ADN correspondiente a la región promotora de FaALKE fue secuenciado en su totalidad, por el método de didesoxi. En la secuencia del fragmento se identificó la región 5' correspondiente al ADNc de FaALKE. De esta forma se obtuvo la secuencia definitiva de 1,2 kb del promotor, obtenida al quitar de la secuencia de ADN clonada la correspondiente a la región 5' del ADNc de FaALKE. La secuencia de nucleótidos resultante es la identificada como SEC. ID. N°: 1.
La secuencia de nucleótidos de la invención puede actuar como secuencia reguladora de la expresión de una secuencia de un ácido nucleico heterólogo en frutos, por ejemplo, frutos cuya parte comestible sea fundamentalmente tejido de receptáculo, tales como fresas, manzanas, peras, etc., frutos de la vid, hortalizas, tales como tomates, pimientos, etc.
La secuencia de nucleótidos de la invención puede utilizarse en el desarrollo de construcciones de ADN que incluyan, además, secuencias codificantes de productos de interés que, a su vez, pueden integrarse en vectores recombinantes de expresión. Para ello, se pueden utilizar distintas técnicas ampliamente conocidas en el estado de la técnica [Sambrook et al, "Molecular cloning, a Laboratory Manual", 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., 1989 Vol 1-3] algunas de los cuales se muestran en la presente invención. Estos vectores recombinantes permiten la expresión de distintos productos de interés en frutos, por ejemplo, en fruto de fresa. Estas construcciones pueden contener otros elementos reguladores de la expresión específica del fruto en cuestión dependiendo del vector recombinante utilizado, etc. Todas estas posibles construcciones de ADN conteniendo como denominador común la secuencia de nucleótidos de la invención así como el uso de las mismas para la transformación de plantas forman parte de la presente invención.
Por tanto, la invención proporciona una construcción de ADN que comprende la secuencia de nucleótidos de la invención operativamente unida a una secuencia de ADN heterólogo codificante de un producto de interés, por ejemplo, un péptido, polipéptido, proteína, actividad o ARN de interés. En una realización particular, se preparó una construcción de ADN que comprendía una secuencia de ADN codificante de actividad luciferasa bajo el control de la secuencia de nucleótidos de la invención para evaluar la especificidad de la expresión de dicho gen en frutos de fresa. La construcción de ADN proporcionada por esta invención también puede contener, operativamente unidos, unos elementos reguladores de la expresión funcionales en plantas, por ejemplo, una secuencia de terminación de la transcripción, etc.
La secuencia de nucleótidos de la invención, o la construcción de ADN proporcionada por esta invención, puede ser insertada en un vector apropiado. Por tanto, la invención también se refiere a un vector, tal como un vector de expresión, que comprende dicha secuencia de nucleótidos de la. invención, o dicha construcción de DNA. La elección del vector dependerá de la célula hospedadora en la que se va a introducir posteriormente. A modo de ejemplo, el vector donde se introduce dicha secuencia de ADN puede ser un plásmido o un vector que, cuando se introduce en una célula hospedadora, se integra en el genoma de dicha célula y se replica junto con el cromosoma (o cromosomas) en el que (o en los que) se ha integrado. La obtención de dicho vector puede realizarse por métodos convencionales conocidos por los técnicos en la materia [Sambrok et al., 1989, citado supra].
La invención también proporciona una célula que comprende una secuencia de nucleótidos de la invención, o una construcción de ADN que contiene a dicha secuencia de nucleótidos o dicho vector mencionado más arriba. Las células hospedadoras que se pueden transformar con la secuencia de nucleótidos de la invención pueden ser procarióticas o, preferentemente, eucarióticas, tales como células de tejidos vegetales. La transformación de células de tejidos vegetales también puede realizarse por métodos convencionales. Para una revisión de la transferencia génica a plantas, incluyendo vectores, métodos de transferencia de ADN, etc., véase, por ejemplo, el libro titulado "Ingeniería genética y transferencia génica", de Marta Izquierdo, Ed. Pirámide (1999), en particular, el capítulo 9, titulado "Transferencia génica a plantas", páginas 283-316.
La secuencia de nucleótidos de la invención puede ser utilizada para transformar plantas, por ejemplo, de fresa, manzana, pera, vid, tomate, pimiento, etc., y obtener plantas transformadas. La transformación de plantas está ampliamente descrita en el estado de la técnica. Como es bien conocido, pueden utilizarse múltiples sistemas, por ejemplo, vectores plasmídicos, liposomas, electroporación, microinyección, difusión, bombardeo de partículas (gene gun), coprecipitación con fosfato de calcio, empleo de vectores virales, etc. La secuencia de nucleótidos de la invención puede utilizarse para regular la expresión específica en fruto de una secuencia codificante de un péptido, polipéptido, proteína, actividad o ARN de interés en una planta. En este sentido, la secuencia de nucleótidos de la invención puede utilizarse para manipular plantas con el fin de introducir en ellas alguna característica comercial o agrícolamente deseable, por ejemplo, retardo en la maduración del fruto, incremento del contenido en azúcares, resistencia a patógenos, cambio en las propiedades organolépticas del fruto, desarrollo de color, cambios de aroma, cambios en el tamaño del fruto, dureza de los frutos, vida post-cosecha, etc. A modo ilustrativo, la secuencia de nucleótidos de la invención puede utilizarse para aumentar el contenido en azúcares del fruto de fresa, por ejemplo, inhibiendo la acción del gen de la glucosa-6-fosfatasa mediante el control de la transcripción de una secuencia antisentido correspondiente a una o ambas subunidades de dicha enzima. Otros genes involucrados en el control del contenido en azúcares en frutos incluyen el gen de la sacarosa sintasa, el de la sacarosa fosfato sintasa, el de la ADP glucosa pirofosforilasa o el de la invertasa. Alternativamente, en las construcciones de ADN proporcionadas por esta invención se podrían utilizar genes o secuencias de ADN que proporcionan resistencia frente a patógenos, por ejemplo, genes que estimulan la producción de fitoalexinas, genes de resistencia a enfermedades, genes de inducción de defensas, genes de resistencia a insectos. La invención también proporciona un procedimiento para producir una planta transgénica que comprende transformar dicha planta con una construcción de ADN proporcionada por esta invención, comprendiendo dicha construcción de ADN una secuencia de ADN codificante de un producto de interés que proporciona al fruto de dicha planta una característica mejorada, bajo el control de la secuencia de nucleótidos de la invención, de manera que la expresión de la secuencia de ADN codificante contenida en dicha construcción provoca una característica mejorada en el fruto de dicha planta. La planta resultante puede ser utilizada para la producción de frutos con características mejoradas. Ejemplos no limitativos de plantas a transformar incluyen, plantas de fresa, manzana, pera, vid, tomate, pimiento, etc. Asimismo, ejemplos no limitativos de dichas características mejoradas incluyen el control de la maduración del fruto, la mejora en las características nutricionales de las partes comestibles del fruto, la resistencia a plagas y enfermedades de plantas, el cambio en las propiedades organolépticas del fruto, el desarrollo de color, cambios de aroma, cambios en el tamaño del fruto, dureza de los frutos, vida post-cosecha, etc. En una r ealización p articular, 1 a secuencia d e nucleótidos d e 1 a i nvención p uede s er utilizada para producir plantas de fresa transgénicas mediante un procedimiento que comprende transformar dicha planta de fresa con una construcción de ADN proporcionada por esta invención, comprendiendo dicha construcción de ADN una secuencia de ADN codificante de un producto de interés que proporciona al fruto de fresa una característica mejorada, bajo el control de la secuencia de nucleótidos de la invención, de manera que la expresión de la secuencia de ADN codificante contenida en dicha construcción provoca una característica mejorada en el fruto de fresa. La planta resultante puede ser utilizada para la producción de fresa (frutos) con características mejoradas.
Por tanto, la invención también proporciona un método para modificar el fenotipo de un fruto en una planta transgénica que comprende crecer una planta transgénica para que produzca frutos, en el que las células de dichos frutos comprenden en su genoma, al menos, una de las construcciones de ADN proporcionadas por esta invención. En una realización particular, dicho fruto se selecciona entre fresa, manzana, pera, uva, tomate y pimiento.
Asimismo, la invención proporciona un método para expresar un gen heterólogo en un fruto de una planta que comprende transformar dicha planta con una construcción de ADN proporcionada p or e sta invención que c omprende una s ecuencia de ADN c odificante de un producto de interés. En otra realización particular, la invención proporciona una célula transgénica que comprende una secuencia de nucleótidos de la invención integrada en su genoma, así como una planta transgénica que comprende, al menos, una de dichas células transgénicas. Dichas plantas transgénicas, que constituyen un objeto adicional de la invención, se pueden obtener mediante el empleo de técnicas convencionales, por ejemplo, mediante el empleo de técnicas convencionales de ARNm antisentido y/o sobreexpresión (silenciamiento en sentido), u otras, por ejemplo, utilizando vectores binarios u otros vectores disponibles para las diferentes técnicas de transformación de plantas existentes en la actualidad.
Los siguientes ejemplos ilustran la invención y no deben ser considerados como limitativos del alcance de la misma.
EJEMPLO 1 Obtención del promotor de FaALKE
Para clonar la región promotora se utilizó una librería de ADN de fresa clonada en el vector Lambda FLXII (Stratagene). Se analizaron 106 placas de lisis y solo se obtuvo un clon positivo. Como sonda se utilizaron 900 pb correspondientes a la región 5 ' del clon parcial aislado de la librería sustractiva de ADNc de fruto rojo. Una vez identificado el clon positivo se aisló el ADN del fago (Sambrook et al., "Molecular cloning, a Laboratory Manual", 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., 1989 Vol 1-3) y se realizó un análisis de restricción e hibridación con la misma sonda, para identificar el fragmento correspondiente a la región promotora. El clon genómico identificado, de 4,2 kb no se pudo subclonar y, como alternativa, se realizó una amplificación enzimática mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de dicho clon utilizando los cebadores identificados como T7 (SEC. ID. N°: 2) [TAATACGACTCACTATAGGG] y ROC4 (SEC. ID. N°: 3) [GCTTGGCAATCTCTTCG] utilizando la enzima Pwo taq polimerasa (Boehringer) termoestable. Las condiciones de la PCR fueron la siguientes: un ciclo de desnaturalización inicial de 2 minutos 95°C, seguido de 35 ciclos de desnaturalización a 95°C durante 30 segundos, anillamiento a 50°C durante 30 segundos y extensión a 72°C durante 4 minutos, y finalmente, un ciclo de extensión final a 72°C durante 5 minutos. Posteriormente se realizó un análisis de restricción e hibridación del fragmento amplificado y se identificó una banda de 2,7 kb (en el fragmento amplificado digerido con BamHT) que contenía la región promotora del gen FaALKE que se subclonó en el vector pBSKII (Stratagene). El análisis de la secuencia de este clon puso de manifiesto que de las 2,7 kb solo 1,2 kb correspondían a la región promotora. Dicha secuencia, analizada utilizando varios programas informáticos, reveló la presencia de cajas reguladoras presentes en genes de plantas que se inducen por luz y daño mecánico. El fragmento que contenía la región promotora, fue subclonado en el vector PBSKII (Stratagene), en el sitio BamHI-EcoRV de la región de clonaje múltiple de dicho vector. El fragmento de ADN correspondiente a la región promotora de FaALKE fue secuenciado en su totalidad, por el método de didesoxi [Servicio de Secuenciación del Centro de Investigaciones Biológicas (CIB), Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC), Madrid]. En la secuencia del fragmento se identificó la región 5' correspondiente al ADNc de FaALKE. De esta forma se obtuvo la secuencia definitiva de 1,2 kb del promotor, obtenida al quitar de la secuencia de ADN clonada la correspondiente a la región 5' del ADNc de FaALKE. La secuencia de nucleótidos resultante es la identificada como SEC. ID. N°: 1.
EJEMPLO 2
Expresión del gen de la luciferasa en fruto de fresa bajo el control del promotor de FaALKE
Se realizó este ensayo para comprobar que el promotor de FAALKE controla la expresión de un gen en el fruto de fresa. El gen de la luciferasa se utilizó como gen testigo.
2.1 Materiales
Se utilizaron frutos maduros de fresa (Fragaria x ananassa, cv. Chandler) que habían sido crecidos en macetas en condiciones estándar correspondiente a las ambientales en la provincia de Huelva en el periodo Febrero-Mayo de 2000. Para las pruebas biolísticas se prepararon secciones transversales del fruto (2-3 mm de espesor), inmediatamente antes de- ser ensayados.
El equipo utilizado para hacer los disparos fue Biolistic PSD-1000/He (Dupont, BioRad).
2.2 Métodos
El ADN utilizado para el recubrimiento de las partículas de oro coloidal se preparó tal como se indica a continuación. El fragmento correspondiente al ADN del promotor de FaALKE se amplificó por PCR utilizando los cebadores identificados como Kpnl f (SEC. ID. N°: 4) [AGGTACCCCATCACATCACCAGT] y HindIII r (SEC. ID. N°: 5) [AAAGCTTTGAGCTAGTTTACAAT], que tenían sitios de restricción Kpnl y HindIII. La ADN polimerasa termoestable utilizada fue la Pwo (Boehringer). El programa de PCR empleado fue estándar y las condiciones de la realización de la PCR fueron la siguientes: un ciclo de desnaturalización inicial de 2 minutos 94°C, seguido de 35 ciclos de desnaturalización a 94°C durante 30 segundos, anillamiento a 57°C durante 30 segundos y extensión a 72°C durante 3 minutos, y finalmente, un ciclo de extensión final a 72°C durante 5 minutos. El fragmento amplificado se subclonó en el vector plasmídico pBSKII-EcoRV. El fragmento subclonado en pBSKII-EcoRV fue liberado por digestión con Kpnl y HindIII, y subclonado en el vector plasmídico pGL3-Basic (Promega), que contiene el gen luciferasa [Figura 1], en los sitios Kpnl - HindIII de la región de clonaje múltiple de este vector. Células DH5α fueron transformadas con la construcción pGL3 -promotor. El ADN de la construcción pGL3- promotor fue amplificado in vivo mediante cultivo nocturno de las células transformadas y el ADN fue purificado utilizando el kit comercial Midiprep (Promega).
Posteriormente, 3 mg de partículas de oro fueron recubiertas con 5 μg de ADN plasmídico obtenido tal como se ha descrito previamente. Para el recubrimiento se siguió el protocolo descrito por BioRad para aplicación en el equipo Biolistic PSD-1000/He. El método utiliza Cl2Ca y espermidina. Las condiciones del ensayo biolístico fueron las siguientes:
Presión de disparo 1.800 psi Distancia entre disco de ruptura y macrocarrier (nivel 2) 4 cm
Distancia entre macocarrier y al muestra ( nivel 4) 4 cm Tamaño de partículas de oro 1,6 μgold
Cantidad de ADN por disparo 0, 167 μg
Tamaño del corte del fruto 2-3 mm
Disparos por muestra. 2
Medio de pre-incubación 5 min CPW12 Mediopost post- incubación 24 horas CPW12, agar 0,7% El medio CPW (Banks & Evans, 1976, Plant Science Letters, 7:409-416) se suplementa con 12% (w/v) de manitol y con ácido 3-N-morfolinpropano sulfónico (MOPs) 20 mM pH 7.
Para medir la actividad luciferasa, los frutos disparados fueron macerados en nitrógeno líquido, añadiendo 1 mi de tampón de lisis [CCLR (del inglés Cell Culture Lysis Reagent) IX (Promega) suplementado con Tris/fosfato 0,3 M pH 7,8] por cada 0,5 g de tejido de fruto. Se centrifugó a 4°C durante 10 minutos en microcentrífuga de mesa a máxima velocidad. Posteriormente, se añadieron 20 μl del sobrenadante a 100 μl del reactivo luciferasa (kit Luciferase Assay System, Promega), y se midió en un luminómetro el desarrollo de la reacción.
2.3 Resultados
Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 2, donde se representa la actividad luciferasa de los extractos de frutos maduros de fresa que habían sido disparados con DNA correspondientes a plásmidos pGL3 sin promotor FaALKE (pGL3), con promotor FaALKE e incubados los frutos en luz (Pro-Luc Luz) y en obscuridad (Pro-Luc Ose).
2.4 Discusión
Los resulados muestran que la región clonada identificada como promotor FaALKE es capaz de inducir la expresión de un gen indicador, el gen de la luciferasa (gen luc), en frutos maduros de fresa. Para que ocurra dicha inducción, los frutos han de ser incubados en la luz continua durante 24 horas.
La necesidad de la luz no es sorprendente puesto que en la secuencia de nucleótidos correspondiente a la región promotora se han identificado cajas reguladoras que responden a la exposición a la luz.
La expresión en frutos de fresa refuerza los resultados previos obtenidos sobre la expresión del gen FaALKE en frutos de fresa durante la maduración. Dichos resultados se obtuvieron por hibridación tipo Northern utilizando como sonda el ADNc correspondiente al FaALKE.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Una secuencia de nucleótidos reguladora de la expresión específica en frutos de un gen heterólogo seleccionada entre:
a) una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC. ID. N°: 1;
b) un fragmento cualquiera de dicha SEC. ID. N°: 1 que mantiene la capacidad reguladora de la expresión específica en fruto; y
c) una secuencia de nucleótidos que es sustancialmente análoga a la secuencia de nucleótidos definida en a) o en b).
2. Una construcción de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos según la reivindicación 1, operativamente unida a una secuencia de ADN codificante de un producto de interés.
3. Un vector recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos según la reivindicación 1 , o una construcción de ADN según la reivindicación 3.
4. Una célula transformada que comprende una secuencia de nucleótidos según la reivindicación 1, o una construcción de ADN según la reivindicación 2, o un vector recombinante según la reivindicación 3.
5. Una célula transgénica que comprende, insertada en su genoma, una secuencia de nucleótidos según la reivindicación 1, o una construcción de ADN según la reivindicación 2, o un vector recombinante según la reivindicación 3.
6. Una planta transgénica que comprende, al menos, una célula transgénica según la reivindicación 5.
7. Un método para expresar un gen heterólogo en una planta, que comprende transformar dicha planta con una construcción de ADN según la reivindicación 2.
8. Método según la reivindicación 7, en el que dicha planta se selecciona entre plantas de fresa, manzana, pera, vid, tomate y pimiento.
9. Un método para modificar el fenotipo del fruto de una planta transgénica que comprende crecer una planta transgénica para que produzca frutos, en el que las células de dichos frutos comprenden en su genoma, al menos, una construcción de ADN según la reivindicación 2.
10. Método según la reivindicación 9 , en el que dicha planta transgénica se selecciona entre plantas de fresa, manzana, pera, vid, tomate y pimiento.
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