WO2002034894A2 - Promoteur de plante dirigeant fortement l'expression des genes dans les fruits - Google Patents

Promoteur de plante dirigeant fortement l'expression des genes dans les fruits Download PDF

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WO2002034894A2
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nucleic acid
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Corinne Douat
Guy Albagnac
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    • C12N9/88—Lyases (4.)

Definitions

  • the present invention relates to a DNA sequence having a transcriptional promoter activity strongly directing the expression of the gene or genes placed under its control in the fruits of a plant during the development of its fruits and more particularly in the maturation phases.
  • the invention also relates to a recombinant nucleic acid molecule as a vector comprising said promoter, as well as cells of transgenic plants and transgenic plants which have stably incorporated this promoter into their genome.
  • the regulation of gene expression is in particular modulated by regulatory regions inherent in genes, the promoters. Promoters directing the expression of genes specifically in the fruit and at a specific time in their development have been isolated, in tomatoes, the most commonly studied fruit. Thus, the 2A11 promoter directs the expression of genes during the early stages of fruit development with reduced efficiency (Van Haaren and Houck, 1991, Plant Mol. Biol., Vol. 17, pages 615-30; Van Haaren and Houck, 1993, Plant Mol. Biol., Vol. 21, pages 625-40; U.S. Patent No. 4,943,674). The TFM7 and TFM9 promoters strongly direct gene expression during the early stages of fruit development (US Patent No. 5,608,150).
  • Promoters E4 Cordes et al., 1989, Plant Cell, vol. 1, pages 1025-34
  • E8 Deik an and Fisher, 1988, EMBO J., vol. 7, pages 3315-20
  • the promoter of polygalacturonase (Atkinson et al., 1998, Plant Mol. Biol., vol. 38, pages 449-60) direct expression during late fruit development and specifically.
  • the small number of patents currently listed shows the need to obtain a wider range of promoters.
  • the FP2 promoter of the invention is remarkable in that it strongly directs the expression of genes in fruits, while this expression is weak or nonexistent in other organs. Indeed, under the same detection conditions, the expression is extremely weak in the leaves and flowers, and not detectable in other organs such as roots, stems and seeds.
  • the promoter of the invention has remarkable properties of adaptability to other fruit species, such as tomatoes or grapes.
  • the subject of the invention is therefore a promoter which strongly directs the expression of the DNA sequences placed under its control in fruit, characterized in that it comprises or consists of the sequence SEQ ID No. 1 in the list of sequences attached, a fragment or a derivative thereof constituting a promoter modulated by a hormone and / or anaerobiosis.
  • the promoter of the invention exhibits remarkable inducibility properties during the development of the fruit and this inducibility is, more particularly, increasing in the ripening phases.
  • the invention relates to the nucleic acid molecule comprised between the nucleotides in positions 7 and 948 of the sequence SEQ ID No. 1 from the list of sequences in the appendix.
  • a promoter according to the invention can be constituted or comprise a fragment of the sequence SEQ ID No. 1 since this fragment is modulated by a hormone and / or anaerobiosis and exhibits inducibility properties during the development of the fruit and more particularly in the maturation phase.
  • Such a promoter therefore comprises at least one site for responding to a hormone and / or at least one site for responding to anaerobic conditions.
  • a promoter according to the invention advantageously comprises a site of response to one of the hormones chosen from auxin and abscissic acid.
  • an auxin response site can, for example, respond to a sequence chosen from the following sequences: TGACX with X equal to A or to G, TGTCTG and AATATGTCAAAT.
  • a response site for abscissic acid can, for example, respond to a sequence chosen from the following sequences: TXACACCYY with X equal to G and Y equal to A or with X and Y equal to T, CCATGCATGC and ACTCGTGTCT.
  • auxin acts as a repressor at the level of the FP2 promoter and that anaerobiosis acts as a strong repressor at the level of the FP2 promoter.
  • derivative of a promoter sequence means the sequence SEQ ID No. 1 or a fragment thereof, modified by deletion, substitution or insertion of one or more nucleotides, and retaining promoter activity strongly directing the expression of the DNA sequences placed under its control in the fruits during their development and more particularly during the maturation phase.
  • sequences having at least 60% and, preferably, at least 80% homology with the sequence No. 1 of the sequence list in the appendix.
  • Such derivatives are more particularly the promoter sequences of other rosacea homologs to that of the wild strawberry genome (Fragaria vesca cv Reine des vallées) isolated in the context of the present invention.
  • a person skilled in the art is able to determine, from tests of the type of those reported in the experimental part below, whether said derivatives exhibit a promoter activity strongly orienting the expression of the DNA sequences placed under his control. in fruits during their development and more particularly during the ripening phase in accordance with the present invention.
  • the genes known to influence resistance to pathogens such as the genes coding for defense proteins or known to influence the development and organoleptic qualities of fruits such as the genes coding for enzymes involved in the loss of firmness, the evolution of the color, the release of aromas, the acquisition of the flavor
  • the genes known to influence resistance to pathogens such as the genes coding for defense proteins or known to influence the development and organoleptic qualities of fruits
  • the genes coding for enzymes involved in the loss of firmness, the evolution of the color, the release of aromas, the acquisition of the flavor can be integrated in strawberry plants downstream from the promoter according to the invention in order to exacerbate, for the genes in sense position, or to reduce, for genes in an anti-sense position, the effects associated with these genes.
  • transgenic strawberries carrying the construction of this promoter associated with a gene will make it possible to understand the role of said gene in the development or development processes.
  • fruit ripening It is the only current tool which makes it possible to understand the role of proteins in vivo.
  • this type of promoter makes it possible to target the expression of a gene spatio-temporally in the fruit and increasingly during the maturation processes.
  • the invention therefore also relates to a recombinant nucleic acid molecule comprising a promoter sequence as defined above linked in a functional manner to a DNA sequence comprising one or more genes, optionally a selection gene placed under the control of its own promoter or of the same promoter as said nucleic acid sequence, and advantageously a terminator sequence placed downstream of said DNA sequence.
  • the terminator sequence can advantageously be the NOS terminal region.
  • the said gene (s), other than the selection gene are advantageously genes, in the sense or antisense position, encoding a protein of agronomic interest. As indicated above, these are, for example, proteins capable of influencing the organoleptic qualities of fruits, preferably those of strawberries.
  • a recombinant nucleic acid molecule according to the invention can be a cassette or a vector for the expression of one or more genes of interest in a plant cell.
  • a vector useful for the transformation of a plant-like host includes:
  • the invention therefore also relates to plant cells in the genome of which is stably incorporated a recombinant nucleic acid molecule comprising the previously defined promoter operably linked to a DNA sequence comprising at least one gene which is thus expressed only under the control of the promoter.
  • the invention also relates to a plant which has stably incorporated into its genome a recombinant nucleic acid molecule comprising the previously defined promoter operably linked to a DNA sequence comprising at least one gene which is thus strongly expressed in fruits. of the plant during their development and more particularly during the phase of maturation.
  • Transgenic plants according to the invention can be prepared in a conventional manner by transforming a plant cell with said nucleic acid molecule and then by regenerating a plant from the transformed cell.
  • the genetic transformation is optimized for wild strawberry by using two strains of Agrobacterium tumefaciens tested for their virulence (AGL1 and C58GV2260).
  • FIG. 1 shows the expression of the CGS gene during the development of wild and commercial strawberry Fragaria vesca and Fragaria ananassa respectively.
  • the total RNAs are hybridized with the CGS and 25S rDNA probes.
  • SG, LG, W, B, BR, R, OR respectively mean small green strawberry, large green strawberry, white strawberry, strawberry at the turning stage, strawberry at the turning stage - ripe, ripe strawberry, chard strawberry.
  • - Figure 2 shows the expression of the CGS gene in different organs of wild strawberries.
  • the total RNAs are hybridized with the CGS and 25S rDNA probes.
  • AL, YL, S, R, Fl, FvR, FaR mean adult leaves, young leaves, stem, roots, flowers, mature receptacles of F. vesca and mature receptacles of F. ananassa respectively.
  • Akl, Ak2 and Ak3 correspond to three stages of development of the achene.
  • - Figure 3 shows the effect of auxin on the expression of the CGS gene. Hormonal treatments are applied to wild strawberry receptacles at the rotating stage. The total RNAs are hybridized with the CGS and 25S rDNA probes.
  • T, TNAA, D and DNAA mean total fruit, total fruit treated with 1 ⁇ M auxin, desachinated fruit and desachenated fruit treated with 1 ⁇ M auxin.
  • FIG. 4 represents the genomic organization of the CGS gene in wild strawberries and other plants. Wild strawberry genomic DNA was digested with EcoRI (E1), EcoRV (EV), HindIII (H) and XhoT (X), while genomic DNA from other plants was digested with EcoRV.
  • E1 EcoRI
  • EcoRV EcoRV
  • H HindIII
  • XhoT X
  • FIG. 5 shows the detection of CGS polypeptides in wild strawberry receptacles.
  • FIG. 6 represents the histochemical revelation of organs (leaf, stem, root) of transformed wild strawberry seedlings:
  • the organs show no coloration since FP2 directs expression strongly in the fruits and not in the other organs.
  • the organs show a strong blue color due to the transcription of the gus gene and to the activity of the enzyme since the 35S promoter directs expression in a constitutive manner in all the organs. 1) Isolation of the gene and analysis of the expression and accumulation of proteins during the development of the strawberry (wild and commercial).
  • a ripe strawberry cDNA library was performed with cDNA probes from green or ripe strawberries.
  • the cDNAs present in abundance in ripe strawberries and weakly or not at all in green fruit were selected.
  • Preliminary analysis of the expression of one of these cDNAs shows an abundant and increasing expression during the development of the fruit.
  • Analysis of the cDNA sequence with the databases shows strong homology (more than 90% homology in terms of the protein sequence) with a CGS gene from Arabidopsis thafiana (Kim and Leustek, 1996 , Plant Mol. Biol., Vol. 32, pages 1117-24). This protein participates in the biosynthesis of methionine, an essential amino acid in basic cellular metabolism but also in certain regulatory pathways.
  • the isolation of the gene and the promoter region was carried out by reverse PCR.
  • the gene presents 4.330 bp with 11 exons interspersed with 10 introns.
  • the promoter region consists of 948 bp from the translation site (ATG site coding for the start of the protein). The sequence of this promoter region corresponds to the sequence SEQ ID No. 1 in the sequence list in the appendix.
  • gus gene a) Fusion of the promoter and the gus gene. Genetic transformation takes place through Agrobacterium tumefaciens and binary vectors containing the chimeric construction of the promoter fused with the gus gene. This gus gene has the property of coding for the ⁇ -glucuronidase enzyme, the activity of which is easily detectable either by direct staining of the tissues (histochemical technique), or by enzymology (fluoretric assay technique).
  • the binary plasmid used for the transformations is the plasmid pBilOl, derived from the vector pBIN19 (Bevan et al., 1983, Nucleic Acids Res., Vol. 11, pages 369-85).
  • This vector has (i) an origin of RK2 replication with low copy number, (ii) an nptll gene allowing the selection of bacteria transformed on kana ycine, (iii) the RB and LB terminals ensuring the transfer of DNA placed between these terminals.
  • This transfer DNA consists of an nptll gene framed by the promoter and terminator NOS (NOS-Pr and NOS-Ter) allowing the selection of transformed plants, a gus gene of 1.87 Kb without promoter (gene derived from the plasmid pRAJ260) inserted at the KpnI site in the multicloning region, the 260 bp NOS terminator clone Sstl-EcoRI in the multicloning region (Bevan, 1984, Nucleic Acids Res., vol. 12, pages 8711-21).
  • Plasmid pBil01.2 was used to effect the fusion between the FP2 promoter and the gus gene.
  • the promoter sequence was amplified with specific primers to which the restriction site sequences were added [primer 5 'with Xbal site underlined: AAATCTAGATCATACGTGACTCTCCAG (SEQ ID No.2 in the sequence list in the appendix), primer 3' with site Smal underlined: AAACCCGGGAAGCGGAGAATGAGTGAC (SEQ ID No.3 in the sequence list in the appendix)].
  • This amplified DNA of 1133 bp corresponds to 942 bp of the promoter region and to 179 bp of the first exon.
  • This DNA digested with Xbal-Smal is inserted into the cassette of the plasmid pBil01.2 itself digested with Xbal-Smal.
  • the plasmid thus obtained is called pBi-FP2-gus and contains between the LB and RB terminals:
  • AGL1 chromosome C58 (resistance to Rifampicin), plasmid Ti of the strain B0542 (resistance to ampicillin).
  • C58GV2260 chromosome C58 (resistance to Rifampicin)
  • Leaf explants of about 0.5 cm 2 are cut from leaves of about 6 to 8 weeks old on strawberry plants grown in vitro. They are transferred to a regeneration medium (Murashige and Skoog medium, 3% sucrose, 0.1% vitamin from Gamborg (B5), 18 ⁇ M of Benzyl Amino Purine, 2.5 ⁇ M of Indol-3 butyric acid). Twenty four hours later, the explants are brought into contact with Agrobacteria solutions (C or D). The concentration of Agrobacteria is evaluated at 1.10 3 cells / ml. Co-culture is carried out at 28 ° C for 1 hour with stirring at 100 rpm.
  • the explants are then drained on sterile filter paper and placed on the regeneration medium in the presence of 100 ⁇ M of acetosyringone. Forty eight hours later, the explants are transferred to the regeneration medium with 500 mg / 1 of timentin. The explants with swelling and callous formations are subcultured every 3 weeks on new regeneration medium with 500 mg / 1 of timentin.
  • the first shoots appear 2 months after transformation and are transplanted individually on elongation medium (Murashige and Skoog medium, 3% sucrose, 0.1% Gamborg vitamin (B5), 2.5 ⁇ M of Benzyl Amino Purine, 1 , 25 ⁇ M of Indol-3 butyric acid) in the presence of 500 mg / 1 of timentin and 25 mg / 1 of kanamycin.
  • elongation medium Merashige and Skoog medium, 3% sucrose, 0.1% Gamborg vitamin (B5)
  • Benzyl Amino Purine 1 , 25 ⁇ M of Indol-3 butyric acid
  • the sufficiently developed shoots are placed on a rooting medium (MS / 2 medium, 3% sucrose, 0.1% Gamborg vitamin (B5)) in the presence of 100 mg / 1 of timentin and 25 mg / 1 of kanamycin.
  • the transformed plants produce roots approximately 2 to 4 weeks after transplanting. Seedlings with roots about 2 cm long are acclimated in pot
  • PCR analysis showed the presence of the gus gene in a few plants whose histochemical analysis performed on currently available organs (root, stem and leaf) did not reveal any GUS activity (Fig. 6). This histochemical revelation was carried out in parallel on transformed plants possessing the constitutive promoter 35S whose organs have an intense blue coloration revealing the constitutive functionality of the promoter 35S in comparison with the promoter (FP2) considered as strong fruit.
  • the GUS activity will be assayed (by enzymology) on different stages of fruit development and in particular on fruits at the turning and mature stages in which the FP2 promoter should be functional.

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Abstract

La présente invention concerne un promoteur qui dirige fortement l'expression des séquences d'AND placées sous son contrôle dans les fruits, caractérisé en ce qu'il comprend ou est constitué par la séquence SEQ ID No. 1 de la liste de séquences en annexe, un fragment ou un dérivé de celle-ci constituant un promoteur modulé par une hormone et/ou l'anaérobiose.

Description

PROMOTEUR DE PLANTE DIRIGEANT FORTEMENT L'EXPRESSION DES GENES DANS LES FRUITS.
La présente invention concerne une séquence d'ADN possédant une activité de promoteur transcriptionnel dirigeant fortement l'expression du ou des gènes placés sous son contrôle dans les fruits d'une plante au cours du développement de ses fruits et plus particulièrement dans les phases de maturation. L'invention concerne également une molécule d'acide nucléique recombinant comme un vecteur comprenant ledit promoteur, ainsi que des cellules de plantes transgéniques et des plantes transgéniques ayant incorporé de manière stable dans leur génome ce promoteur .
Les progrès réalisés en matière d'ingénierie génétique ont conduit à créer des outils pour introduire des gènes exogènes dans le génome de plantes. Grâce à ce procédé de transformation génétique, il est actuellement possible de produire des plantes avec des caractéristiques agronomiques déterminées. Les fruits et légumes présentant un secteur d'une grande importance économique et sociale, l'optimisation de leur résistance aux pathogènes, de leur développement et de leurs qualités organoleptiques est une des préoccupations actuelles. Cette optimisation peut s'effectuer par le biais de la transgenèse en modulant l'expression de gènes cibles dans le fruit. Il est important de cibler, ou tout au plus de concentrer la régulation de ces gènes dans le fruit car une dérégulation dans la plante entière peut avoir des répercutions néfastes tant au niveau de la physiologie qu'au niveau de la productivité du plant.
La régulation de l'expression des gènes est notamment modulée par des régions régulatrices inhérentes aux gènes, les promoteurs. Des promoteurs dirigeant l'expression de gènes spécifiquement dans le fruit et à un moment précis de leur développement ont été isolés, chez la tomate, le fruit le plus communément étudié. Ainsi, le promoteur 2A11 dirige l'expression de gènes lors des premiers stades de développement du fruit avec une efficacité réduite (Van Haaren et Houck, 1991, Plant Mol. Biol., vol. 17, pages 615-30 ; Van Haaren et Houck, 1993, Plant Mol. Biol., vol. 21, pages 625-40 ; Brevet US No. 4 943 674). Les promoteurs TFM7 et TFM9 dirigent fortement l'expression des gènes au cours des premiers stades de développement du fruit (Brevet US No. 5 608 150). Les promoteurs E4 (Cordes et al . , 1989, Plant Cell, vol. 1, pages 1025-34), E8 (Deik an et Fisher, 1988, EMBO J. , vol. 7, pages 3315-20) et le promoteur de la polygalacturonase (Atkinson et al . , 1998, Plant Mol. Biol., vol. 38, pages 449-60) dirigent l'expression au cours du développement tardif du fruit et de manière spécifique. Le faible nombre de brevets actuellement recensés montre la nécessité d'obtenir une palette plus large de promoteurs.
Il apparaît donc utile de disposer d'autres promoteurs avec des caractéristiques différentes et notamment des promoteurs dirigeant fortement l'expression des gènes dans les fruits au cours de leur développement et plus particulièrement dans la phase de maturation.
Ce but est atteint grâce aux travaux de la
Demanderesse sur le génome de fraises sauvages (Fragaria vesca cv Reine des vallées) qui lui ont permis d'identifier, d'isoler et de caractériser un nouveau promoteur aussi désigné ci-après FP2. Dans cette fraise sauvage, le promoteur FP2 contrôle l'expression du gène de la Cystathionine Gamma Synthase (CGS) impliquée dans la biosynthèse de la méthionine (Marty et al., 2000, Theor. Appl. Genêt., vol. 100, pages 1129-36).
Le promoteur FP2 de l'invention est remarquable en ce qu'il dirige fortement l'expression des gènes dans les fruits, alors que cette expression est faible ou inexistante dans les autres organes. En effet, dans les mêmes conditions de détection, l'expression est extrêmement faible dans les feuilles et les fleurs, et non détectable dans d'autres organes comme les racines, les tiges et les graines. De plus, le promoteur de l'invention présente des propriétés remarquables d' adaptabilité à d'autres espèces fruitières, comme la tomate ou le raisin. L'invention a donc pour objet un promoteur qui dirige fortement l'expression des séquences d'ADN placées sous son contrôle dans les fruits, caractérisé en ce qu'il comprend ou est constitué par la séquence SEQ ID No.l dans la liste de séquences en annexe, un fragment ou un dérivé de celle-ci constituant un promoteur modulé par une hormone et/ou l' anaérobiose.
Le promoteur de l'invention présente des propriétés remarquables d'inductibilité au cours du développement du fruit et cette inductibilité est, plus particulièrement, croissante dans les phases de maturation.
Tout particulièrement, l'invention se rapporte à la molécule d'acide nucléique comprise entre les nucléotides aux positions 7 et 948 de la séquence SEQ ID No.l de la liste de séquences en annexe.
Un promoteur selon l'invention peut être constitué ou comprendre un fragment de la séquence SEQ ID No.l dès lors que ce fragment est modulé par une hormone et/ou l' anaérobiose et présente des propriétés d'inductibilité au cours du développement du fruit et plus particulièrement dans la phase de maturation. Un tel promoteur comprend donc au moins un site de réponse à une hormone et/ou au moins un site de réponse à l' anaérobiose .
Un promoteur selon 1 ' invention comprend avantageusement un site de réponse à l'une des hormones choisies parmi l'auxine et l'acide abscissique.
Parmi les séquences correspondant à des sites de réponse à l' anaérobiose, nous pouvons par exemple citer les séquences suivantes : AAACCA, TGGTTT et GGTTT. Un site de réponse à l'auxine peut, par exemple, répondre à une séquence choisie parmi les séquences suivantes : TGACX avec X égal à A ou à G, TGTCTG et AATATGTCAAAT . De la même façon, un site de réponse à l'acide abscissique peut, par exemple, répondre à une séquence choisie parmi les séquences suivantes : TXACACCYY avec X égal à G et Y égal à A ou avec X et Y égaux à T, CCATGCATGC et ACTCGTGTCT. Toute séquence correspondant à un site de réponse à l' anaérobiose ou à un site de réponse à une hormone telle que l'auxine ou l'acide abscissique connue de l'homme du métier entre dans le cadre de la présente invention. De plus, les travaux des inventeurs ont permis de montrer que 1 ' auxine agit comme un répresseur au niveau du promoteur FP2 et que l' anaérobiose agit comme un répresseur fort au niveau du promoteur FP2.
On entend par dérivé d'une séquence de promoteur selon l'invention, la séquence SEQ ID No.l ou un fragment de celle-ci, modifiées par délétion, substitution ou insertion d'un ou plusieurs nucléotides, et conservant une activité de promoteur dirigeant fortement l'expression des séquences d'ADN placées sous son contrôle dans les fruits au cours de leur développement et plus particulièrement au cours de la phase de maturation. Il s'agit par exemple de séquences ayant au moins 60% et, de préférence, au moins 80% d'homologie avec la séquence No.l de la liste de séquence en annexe. De tels dérivés sont plus particulièrement les séquences des promoteurs d'autres rosacées homologues à celui du génome de fraise sauvage ( Fragaria vesca cv Reine des vallées) isolé dans le cadre de la présente invention. L'homme du métier est à même de déterminer, à partir des tests du type de ceux rapportés dans la partie expérimentale ci-après, si lesdits dérivés présentent une activité de promoteur orientant fortement l'expression des séquences d'ADN placées sous son contrôle dans les fruits au cours de leur développement et plus particulièrement au cours de la phase de maturation conformément à la présente invention.
Il a été rapporté par les inventeurs dans l'art antérieur (Marty et al., 2000, Theor. Appl. Genêt., vol. 100, pages 1129-36) la séquence du gène de la CGS impliquée dans la biosynthèse de la méthionine et en 5' de ce gène un fragment du promoteur FP2 contrôlant ce gène dans la fraise sauvage ( Fragaria vesca cv Reine des vallées), il s'agit du fragment situé entre les nucléotides aux positions 615 à 948 dans la séquence SEQ ID No.l. Or, cet article ne décrit, ni ne suggère les propriétés de ce promoteur ou d'un fragment de celui-ci telles que définies précédemment. Le promoteur selon l'invention ouvre des perspectives intéressantes dans le domaine industriel (pour la création de nouvelles variétés) mais aussi dans le domaine de la recherche fondamentale (étude de fonctions in vivo) .
Ainsi, au niveau industriel, les gènes connus pour influencer la résistance aux pathogènes comme les gènes codant pour des protéines de défense ou connus pour influencer le développement et les qualités organoleptiques des fruits comme les gènes codant pour des enzymes impliquées dans la perte de fermeté, l'évolution de la couleur, le dégagement d'arômes, l'acquisition de la saveur peuvent être intégrés dans des fraisiers en aval du promoteur selon l'invention afin d'exacerber, pour les gènes en position sens, ou de réduire, pour les gènes en position anti-sens, les effets associés à ces gènes.
Au niveau de la recherche, la création de fraisiers transgéniques portant la construction de ce promoteur associé à un gène, soit supposé d'intérêt agronomique, soit de fonction mal définie, va permettre de comprendre le rôle dudit gène dans les processus de développement ou de maturation des fruits. C'est le seul outil actuel qui permette de comprendre le rôle de protéines in vivo. En conclusion, ce type de promoteur permet de cibler l'expression d'un gène de manière spatio-temporelle dans le fruit et de manière croissante au cours des processus de maturation. Il diffère des promoteurs actuellement utilisés comme (i) le promoteur 35S CAMV qui dirige l'expression des gènes de manière constitutive dans la plante ou (ii) certains promoteurs de tomate (précités) qui dirigent l'expression des gènes dans les stades précoces ou tardifs du développement du fruit et parfois avec un rendement faible. L'invention concerne donc aussi une molécule d'acide nucléique recombinant comprenant une séquence de promoteur comme défini précédemment liée de manière fonctionnelle à une séquence d'ADN comprenant un ou plusieurs gènes, éventuellement un gène de sélection placé sous le contrôle de son propre promoteur ou du même promoteur que ladite séquence d'acide nucléique, et avantageusement une séquence de terminateur placée en aval de ladite séquence d'ADN. La séquence de terminateur peut avantageusement être la région terminale NOS. Tous les gènes de sélection bien connus de l'homme du métier et notamment le gène nptll peuvent être utilisés dans le cadre de l'invention. Le ou lesdits gène(s), autre(s) que le gène de sélection, sont avantageusement des gènes, en position sens ou antisens, codant une protéine d'intérêt agronomique. Comme indiqué précédemment, il s'agit, par exemple, de protéines capables d'influencer les qualités organoleptiques des fruits, de préférence celles des fraisiers.
Une molécule d'acide nucléique recombinant selon l'invention peut être une cassette ou un vecteur pour l'expression d'un ou plusieurs gènes d'intérêt dans une cellule végétale. Un vecteur utile pour la transformation d'un hôte de type plante comprend :
- un ou plusieurs gènes qui code(nt) une ou plusieurs protéines d'intérêt, placé(s) sous le contrôle du promoteur de l'invention,
- un gène pour une sélection génétique dans des cellules de plante, placé sous le contrôle du même promoteur ou d'un promoteur différent de celui ci-dessus.
L'invention concerne donc également des cellules végétales dans le génome desquelles est incorporée de façon stable une molécule d'acide nucléique recombinant comprenant le promoteur défini précédemment lié de manière fonctionnelle à une séquence d'ADN comprenant au moins un gène qui est ainsi exprimé seulement sous le contrôle du promoteur.
L'invention concerne encore une plante ayant incorporé de manière stable dans son génome une molécule d'acide nucléique recombinant comprenant le promoteur défini précédemment lié de manière fonctionnelle à une séquence d'ADN comprenant au moins un gène qui est ainsi fortement exprimé dans les fruits de la plante au cours de leur développement et plus particulièrement au cours de la phase de maturation. Des plantes transgéniques selon l'invention peuvent être préparées de façon classique en transformant une cellule végétale avec ladite molécule d'acide nucléique puis en régénérant une plante à partir de la cellule transformée. Ainsi, toutes les techniques de transformation de cellules de plantes connues de l'homme du métier peuvent être mises en œuvre dans le cadre de l'invention. De préférence, la transformation génétique est optimisée pour le fraisier sauvage en utilisant deux souches d' Agrobacterium tumefaciens testées pour leur virulence (AGL1 et C58GV2260).
D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent concernant l'isolement du promoteur de l'invention FP2 et la transformation de plantes avec des constructions la contenant, et où il sera fait référence aux figures en annexe dans lesquelles :
- la figure 1 représente l'expression du gène de la CGS au cours du développement de la fraise sauvage et commerciale respectivement Fragaria vesca et Fragaria ananassa . Les ARN totaux sont hybrides avec les sondes CGS et ADNr 25S. SG, LG, W, B, BR, R, OR signifient respectivement fraise petite verte, fraise grosse verte, fraise blanche, fraise au stade tournant, fraise au stade tournant- mûre, fraise mûre, fraise blette.
- la figure 2 représente l'expression du gène de la CGS dans différents organes de la fraise sauvage. Les ARN totaux sont hybrides avec les sondes CGS et ADNr 25S. AL, YL, S, R, Fl , FvR, FaR signifient respectivement feuilles adultes, feuilles jeunes, tige, racines, fleurs, réceptacles mûrs de F. vesca et réceptacles mûrs de F. ananassa . Akl, Ak2 et Ak3 correspondent à trois stades de développement des achènes . - la figure 3 représente l'effet de l'auxine sur l'expression du gène de la CGS. Les traitements hormonaux sont appliqués sur les réceptacles de fraise sauvage au stade tournant. Les ARN totaux sont hybrides avec les sondes CGS et ADNr 25S. T, TNAA, D et DNAA signifient fruit total, fruit total traité avec 1 μM d'auxine, fruit désachéné et fruit désachéné traité avec 1 μM d'auxine. la figure 4 représente l'organisation genomique du gène de la CGS chez la fraise sauvage et d'autres plantes. L'ADN genomique de fraise sauvage a été digéré par EcoRI (El), par EcoRV (EV) , par HindIII (H) et par XhoT (X), alors que les ADN génomiques d'autres plantes ont été digérés par EcoRV. Fv, Fa, Pa et Pp signifient
Fragaria vesca (fraise sauvage), Fragaria ananassa (fraise commerciale), Prunus armeniaca (abricot) et Prunus persica
(pêche) . la figure 5 représente la détection de polypeptides de CGS dans les réceptacles de fraise sauvage.
La CGS pure d' Arabidopsis thaliana et les protéines issues de réceptacles de fraise sauvage à différents stades de développement ont été traitées avec des anticorps dirigés contre la CGS d ' Arabidopsis thafiana . SG, LG, , B, BR, R,
OR signifient respectivement fraise petite verte, fraise grosse verte, fraise blanche, fraise au stade tournant, fraise au stade tournant- mûre, fraise mûre, fraise blette. la figure 6 représente la révélation histochimique d'organes (feuille, tige, racine) de plantules de fraisiers sauvages transformés :
A : par pBi-FP2-gus (promoteur fruit-fort FP2 ) . Les organes ne présentent aucune coloration puisque FP2 dirige l'expression de manière forte dans les fruits et non dans les autres organes.
B : par pGIN (promoteur constitutif 35S). Les organes présentent une forte coloration bleue due à la transcription du gène gus et à l'activité de l'enzyme puisque le promoteur 35S dirige l'expression de manière constitutive dans tous les organes. 1) Isolement du gène et analyse de l'expression et de l'accumulation des protéines au cours du développement de la fraise (sauvage et commerciale).
a) Isolement du gène spécifique de fruit.
Un criblage différentiel d'une banque d'ADNc de fraise mûre a été réalisé avec des sondes d'ADNc issus de fraises vertes ou mûres. Les ADNc présents en abondance chez la fraise mûre et faiblement ou aucunement chez le fruit vert ont été sélectionnés. L'analyse préliminaire de l'expression d'un de ces ADNc montre une expression abondante et croissante au cours du développement du fruit. L'analyse de la séquence de l'ADNc avec les banques de données montre une forte homologie (plus de 90% d'homologie au niveau de la séquence protéique) avec un gène de CGS issu d ' Arabidopsis thafiana (Kim et Leustek, 1996, Plant Mol. Biol., vol. 32, pages 1117-24). Cette protéine participe à la biosynthèse de la méthionine, acide aminé essentiel dans le métabolisme cellulaire de base mais aussi dans certaines voies de régulation. L'isolement du gène et de la région promotrice a été effectué par PCR inverse. Le gène présente 4.330 pb avec 11 exons intercalés de 10 introns . La région promotrice est constituée de 948 pb à partir du site de traduction (site ATG codant pour le début de la protéine). La séquence de cette région promotrice correspond à la séquence SEQ ID No.l dans la liste de séquences en annexe.
b) Expression dans divers organes (technique de Northern-Blot) . L'expression de ce gène a été analysée au cours du développement de la fraise sauvage et commerciale (respectivement Fragaria vesca et Fragaria ananassa) et dans divers tissus de la plante-mère. Les messagers s'accumulent dans le fruit, dés le stade tournant chez la fraise sauvage alors qu'ils s'accumulent dés le développement du fruit chez la fraise commerciale. D'une manière générale, les messagers s'accumulent abondamment et de manière croissante pendant les phases de maturation (Fig. 1). Une très faible accumulation de messagers est détectée dans d'autres tissus tels que la feuille jeune et les fleurs (Fig. 2). Aucune expression n'est détectée dans d'autres organes tels que la racine, la tige et les graines de la fraise (les achènes).
c ) Répression du gène par l'auxine.
Une analyse de l'expression du gène a été effectuée en fonction du taux d'auxine présente naturellement dans les achènes de fraise. L'expression du gène cgs a été analysée sur des fraises exemptes d' achènes (fraises désachénées ayant donc un taux très faible d'auxine) et sur des fraises ayant subi une adjonction d'auxine exogène (fort taux d'auxine) comparées à des fraises témoin. Suivant le niveau d'expression du gène cgs (Fig. 3) il a pu être mis en évidence que l'auxine réprime de manière significative l'expression et peut donc agir comme un répresseur au niveau du promoteur.
d) Présence du gène chez la fraise et d'autres espèces (technique de Southern-Blot ) . Un seul gène chez la fraise sauvage a été mis en évidence (Fig. 4) corrélant des résultats similaires chez Arabidopsis thafiana (Kim et Leustek, 1996, Plant Mol. Biol., vol. 32, pages 1117-24). Un seul allèle a pu être détecté chez d'autres espèces fruitières, notamment des rosacées (abricotier, pêcher, fraisier commercial).
e) Corrélation spatio-temporelle entre l'accumulation des messagers et de la protéine (technique de estern-Blot ) . L'accumulation de la protéine correspondante a été réalisée à partir d'anticorps dirigés contre la CGS d 'Arabidopsis thafiana . L'accumulation de la protéine et de ses dérivés s'effectue de manière concomitante avec celle des messagers suggérant la bonne traduction des messagers (Fig. 5). 2 ) Transformation génétique du fraisier avec le promoteur FP2.
a) Fusion du promoteur et du gène gus. La transformation génétique s'effectue par le biais d ' Agrobacterium tumefaciens et de vecteurs binaires contenant la construction chimérique du promoteur fusionné avec le gène gus . Ce gène gus a la propriété de coder pour l'enzyme β-glucuronidase dont l'activité est facilement détectable soit par coloration directe des tissus (technique histochimique ) , soit par enzymologie (technique de dosage fluori étrique) . Le plasmide binaire utilisé pour les transformations est le plasmide pBilOl, dérivé du vecteur pBINl9 (Bevan et ai . , 1983, Nucleic Acids Res . , vol. 11, pages 369-85). Ce vecteur possède (i) une origine de réplication RK2 à faible nombre de copies, (ii) un gène nptll permettant la sélection des bactéries transformées sur kana ycine, (iii) les bornes RB et LB assurant le transfert de l'ADN placé entre ces bornes. Cet ADN de transfert est constitué d'un gène nptll encadré du promoteur et terminateur NOS (NOS-Pr et NOS-Ter) permettant la sélection des plantes transformées, d'un gène gus de 1,87 Kb sans promoteur (gène issu du plasmide pRAJ260) inséré au site Kpnl dans la région de multiclonage, le terminateur NOS de 260 pb clone Sstl-EcoRI dans la région de multiclonage (Bevan, 1984, Nucleic Acids Res., vol. 12, pages 8711-21). Suivant la taille des promoteurs à insérer dans cette cassette et la conservation du cadre de lecture ouvert du gène gus , 3 plasmides pBilOl ont été construits distincts de 1 pb - pBHOl.l, pBil01.2, pBil01.3). Le plasmide pBil01.2 a été utilisé pour réaliser la fusion entre le promoteur FP2 et le gène gus . La séquence promotrice a été amplifiée avec des amorces spécifiques auxquelles ont été ajoutées les séquences des sites de restriction [amorce 5' avec site Xbal souligné: AAATCTAGATCATACGTGACTCTCCAG (SEQ ID No.2 dans la liste de séquences en annexe), amorce 3' avec site Smal souligné : AAACCCGGGAAGCGGAGAATGAGTGAC (SEQ ID No.3 dans la liste de séquences en annexe)]. Cet ADN amplifié de 1133 pb correspond à 942 pb de la région promotrice et à 179 pb du premier exon. Cet ADN digéré par Xbal-Smal est inséré dans la cassette du plasmide pBil01.2 lui-même digéré par Xbal- Smal. Le plasmide ainsi obtenu est appelé pBi-FP2-gus et contient entre les bornes LB et RB:
- le promoteur FP2 de 1133 pb,
- le gène gus et NOS-Ter,
- le gène nptll encadré de NOS-Pr et NOS-Ter.
b) Virulence des Agrobactéries C58GV2260 et AGL1.
Quatre souches d' agrobactéries , AGLl, C58GV2260, C58pMP90 et LBA4404 ont été testées pour leur virulence sur fraisiers. Deux souches, AGLl et C58GV2260, ont donné des rendements d'infection et de transfert d'ADN considérables et ont été sélectionnées pour être transformées par la construction plasmidique décrite précédemment.
AGLl : chromosome C58 (résistance à la Rifampicine) , plasmide Ti de la souche B0542 (résistance à 1 ' ampicilline ) . C58GV2260 : chromosome C58 (résistance à la
Rifampicine), plasmide Ti de la souche B6806 (résistance à 1' ampicilline ) .
Une fois transformées par le vecteur, les souches ont été dénommées C et D respectivement.
c) Transformation de fraisiers avec les souches C et D.
Un protocole efficace de transformation génétique par Agrobacterium tumefaciens a été mis au point sur le fraisier sauvage. Des explants foliaires d'environ 0.5 cm2 sont découpés à partir de feuilles âgées d'environ 6 à 8 semaines sur des plants de fraisiers cultivés in vitro. Ils sont transférés sur un milieu de régénération (milieu Murashige et Skoog, 3% de sucrose, 0.1% vitamine de Gamborg (B5), 18 μM de Benzyle Amino Purine, 2.5 μM d'Acide Indol-3 butyrique). Vingt quatre heures après, les explants sont mis au contact des solutions d'Agrobactéries (C ou D) . La concentration des Agrobactéries est évaluée à 1.103 cellules/ml. La co-culture est réalisée à 28°C pendant 1 heure avec agitation à 100 rpm. Les explants sont ensuite égouttés sur du papier filtre stérile et disposés sur le milieu de régénération en présence de 100 μM d'acétosyringone. Quarante huit heures après, les explants sont transférés sur le milieu de régénération avec 500 mg/1 de timentin. Les explants présentant des boursouflements et des formations calleuses sont repiqués toutes les 3 semaines sur du milieu de régénération neuf avec 500 mg/1 de timentin. Les premières pousses apparaissent 2 mois après transformation et sont repiquées individuellement sur du milieu d'élongation (milieu Murashige et Skoog, 3% de sucrose, 0,1% vitamine de Gamborg (B5), 2,5 μM de Benzyle Amino Purine, 1,25 μM d'Acide Indol-3 butyrique) en présence de 500 mg/1 de timentin et 25 mg/1 de kanamycine. Six semaines plus tard, les pousses suffisamment développées sont disposées sur un milieu d'enracinement (milieu MS/2, 3% de sucrose, 0,1% vitamine de Gamborg (B5)) en présence de 100 mg/1 de timentin et 25 mg/1 de kanamycine. Les plantes transformées produisent des racines environ 2 à 4 semaines après repiquage. Les plantules présentant des racines longues d'environ 2 cm sont acclimatées dans des pots avec du terreau dans des chambres de culture à 22°C avec une photopériode de 18 heures de lumière et 6 heures d'obscurité avant leur transfert dans des serres.
d) Analyse préliminaire des transformants. Une étude des plants transformés (plants d'environ 10-15 cm à ce jour) a été effectuée à différents niveaux : - une amplification par PCR du gène gus permettant d'évaluer la présence de ce gène et par voie de conséquence du promoteur FP2 en amont, un dosage histochimique de l'activité GUS permettant d'évaluer la spécificité et l'efficacité du promoteur FP2 (comparé au promoteur constitutif 35S).
L'analyse par PCR a montré la présence du gène gus chez quelques plantes dont l'analyse histochimique effectuée sur les organes actuellement disponibles (racine, tige et feuille) n'a révélé aucune activité GUS (Fig. 6). Cette révélation histochimique a été effectuée en parallèle sur des plants transformés possédant le promoteur constitutif 35S dont les organes présentent une coloration bleue intense révélant la fonctionnalité constitutive du promoteur 35S en comparaison avec le promoteur (FP2) considéré comme fruit-fort.
Dés que les plants de fraisiers fructifieront, l'activité GUS sera dosée (par enzymologie) sur différents stades de développement des fruits et notamment sur des fruits aux stades tournant et mature dans lesquels le promoteur FP2 devrait être fonctionnel .
De plus, la fonctionnalité in vivo du promoteur (FP2) est en cours d'analyse chez la tomate et sera prochainement analysée chez le raisin après transformation de ces plants avec le vecteur décrit précédemment.

Claims

REVENDICATIONS
1) Un promoteur qui dirige fortement l'expression des séquences d'ADN placées sous son contrôle dans les fruits, caractérisé en ce qu'il comprend ou est constitué par la séquence SEQ ID No.l de la liste de séquences en annexe, un fragment ou un dérivé de celle-ci constituant un promoteur modulé par une hormone et/ou 1' anaérobiose.
2) Un promoteur selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est constitué par la molécule d'acide nucléique comprise entre les nucléotides aux positions 7 et 948 de la séquence SEQ ID No.l de la liste de séquences en annexe.
3) Un promoteur selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un site de réponse à une hormone et/ou au moins un site de réponse à 1' anaérobiose.
4 ) Un promoteur selon la revendication 3 , caractérisé en ce qu'il comprend un site de réponse à l'une des hormones choisies parmi l'auxine et l'acide abscissique.
5) Une molécule d'acide nucléique recombinant comprenant un promoteur selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, lié de manière fonctionnelle à une séquence d'ADN comprenant un ou plusieurs gènes, éventuellement un gène de sélection placé sous le contrôle de son propre promoteur ou du même promoteur que ladite séquence d'acide nucléique, et avantageusement une séquence de terminateur placée en aval de ladite séquence d'ADN.
6) Une molécule d'acide nucléique selon la revendication 5, caractérisée en ce que le ou lesdits gène(s), autre(s) que le gène de sélection, sont avantageusement des gènes, en position sens ou antisens, codant une protéine d'intérêt agronomique. 7) Une cellule végétale dans le génome de laquelle est incorporée de façon stable une molécule d'acide nucléique recombinant comprenant un promoteur selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 lié de manière fonctionnelle à une séquence d'ADN comprenant au moins un gène qui est ainsi exprimé seulement sous le contrôle dudit promoteur .
8) Une plante ayant incorporé de manière stable dans son génome une molécule d'acide nucléique recombinant comprenant le promoteur selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 lié de manière fonctionnelle à une séquence d'ADN comprenant au moins un gène qui est ainsi fortement exprimé dans les fruits de la plante au cours de leur développement et plus particulièrement au cours de la phase de maturation.
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