CN104388443B - 草莓生长素合成限速酶FaYUC11基因及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及农业生物技术，公开了一种草莓生长素合成限速酶基因FaYUC11及用于调节果实大小的应用，提供了这个基因的核酸序列以及蛋白序列。FaYUC11用于调节果实大小的方法包括：构建FaYUC11基因的病毒诱导沉默载体；将沉默载体转入农杆菌，并用微注射方法感染草莓幼绿果，建立病毒诱导FaYUC11基因沉默的转基因草莓株系。该基因沉默可以导致果实瘦果(种子)中游离生长素含量下降，果实纵横径增长率降低，同时，影响了果实硬度和可溶性固形物含量。此基因在草莓果实大小调控方面具有很好的应用前景，对于功能性SNP分子标记的开发和优质大果草莓的选育具有重要意义。

Description

草莓生长素合成限速酶FaYUC11基因及应用

技术领域

本发明涉及植物生物技术领域，具体涉及八倍体草莓生长素限速酶FaYUC11基因及应用，以及用上述基因调控草莓果实大小的方法。

背景技术

草莓(Fragaria×ananassa)属蔷薇科草莓属植物，是重要的鲜食水果作物之一，也是蔷薇科植物重要的功能基因研究的模式物种，其果实发育相关的遗传和分子生物学研究越来越受到关注。其中，植物激素的调控对于果实发育和品质形成至为关键。

草莓果实属“假果”，由花托发育而来，植物学意义的果实是点缀其表面的种子，后者又称为瘦果。早在上个世纪中期，Nitsch就研究发现草莓花托的生长发育受激素的调控，主要是瘦果中合成的生长素起着重要作用(Nitsch1955)。授粉后若去掉草莓花托上的全部瘦果，花托就会停止生长；而去掉花托上的部分种子，则仅含有瘦果的那部分花托发育，最后会长成畸形的果实。但是，如果去掉花托上所有的种子，再用人工合成生长素NAA涂在花托上，最后能生长发育成正常的果实。

生长素是植物中最早发现的一类激素，至今已有近80年(Thimann and Koepfli等1935)。目前知道生长素几乎参与了植物生命的每一个方面的调控，包括多种组织器官的发育和形态建成以及对环境的响应。吲哚乙酸IAA是植物中的主要生长素，其合成途径可能因物种、器官类型、发育阶段或环境条件而有差异。近来研究表明，依赖于色氨酸的吲哚丙酮酸途径(IPyA pathway of IAA biosynthesis)是多种植物中的主要生长素合成途径。草莓中的研究也表明，IPyA途径生长素合成对草莓生长发育至关重要(Liu等2014)。

仅包括两步反应的IPyA途径又称为TAA/YUC途径：色氨酸氨基转移酶TAA/TAR催化下由色氨酸产生吲哚丙酮酸(indole-3-pyruvic acid,IPyA),之后YUC家族黄素单加氧酶将IPyA转变为IAA(Mashiguchi等2011；Abu-Zaitoon等2012；Stepanova等2011)。赵云德等2001最早报道了从拟南芥中鉴定出YUC，为色氨酸依赖生长素合成限速步骤的关键酶。近年来，在包括拟南芥、水稻、玉米、矮牵牛、番茄和草莓等多种植物中发现来自TAA/YUC途径的生长素对植物生长发育很重要。这些研究支持一个论点，YUC在植物中广泛存在、高度保守，经由YUC催化合成生长素可能是植物中生长素的主要来源。

病毒诱导基因沉默(virus-induced gene silencing，VIGS)是一种操作简单、快速便捷的基因功能鉴定方法。将带有目的基因片段的病毒载体侵染植物，植物细胞会自发识别入侵病毒的威胁，然后利用自身的防卫机制来抵御并且摧毁病毒和病毒载体上的目的基因，从而引起目的基因在转录后水平发生降解甚至是消除(Lange等2013；Purkayastha和Dasgupta2009)。多种植物中都有VIGS基因沉默体系用于研究相应基因功能的成功报道，特别是有针对性的研究植物繁殖器官中的特异基因，从而理解植物果实的发育与品质形成机理。广为运用的VIGS沉默载体是双链RNA病毒-烟草脆裂病毒(TRV)(Liu等2002)，草莓中已成功应用(Jia等2011)。

果树作物的传统杂交育种周期漫长。分子标记辅助选择技术可显著缩短育种周期，提高育种效率。当前，分子标记辅助育种对于加速果树传统杂交育种选育进程的重要性越来越突显。新型分子标记中的功能性分子标记(functional markers,FMs),以与表型相关的功能基因基序中的功能性单核苷酸多态性位点(SNP)为基础而开发出，其优势在于来自控制表型的序列模体，与目标基因紧密连锁，可以在多种不同遗传背景下直接应用，能更有效准确地筛选和追踪已知基因。积极鉴定农艺性状相关基因功能，可为功能标记的开发和分子育种工作提供重要材料和手段。

我国的草莓生产在总面积和总产量上称得上“草莓大国”，但与“世界草莓强国”美国、西班牙等相比仍存在一定差距，自育优质大果草莓品种占世界草莓良种的比例很低，且平均单产显著较低。揭示草莓果实大小调控分子机制，对于果实大小、重量等相关功能标记开发和辅助选育适合我国栽培环境和消费习惯的大果草莓新种质，具有重要意义。

参考文献：

Nitsch JP(1955)Free auxins and free tryptophane in thestrawberry.Plant Physiol 30:33-39

Thimann KV,Koepfli JB(1935)Identity of the growth-promoting and root-forming substances of plants.Nature 135:101–102

Liu H,Xie WF,Zhang L,Valpuesta V,Ye ZW,Gao QH,Duan K(2014)Auxinbiosynthesis by the YUCCA6 flavin monooxygenase gene in woodland strawberry(Fragaria vesca).J Integr Plant Biol 56:350-363

Stepanova AN,Yun J,Robles LM,Novak O,He W,Guo H,Ljung K,Alonso JM(2011)The Arabidopsis YUCCA1 flavin monooxygenase functions in the indole-3-pyruvic acid branch of auxin biosynthesis.Plant Cell 23:3961-3973

Mashiguchi K,Tanaka K,Sakai T,Sugawara S,Kawaide H,Natsume M,HanadaA,Yaeno T,Shirasu K,Yao H,McSteen P,Zhao Y,Hayashi K,Kamiya Y,Kasahara H(2011)The main auxin biosynthesis pathway in Arabidopsis.Proc Natl Acad Sci US A108:18512-18517

Abu-Zaitoon YM,Bennett K,Normanly J,Nonhebel HM(2012)A large increasein IAA during development of rice grains correlates with the expression oftryptophan aminotransferase OsTAR1 and a grain-specific YUCCA.Physiol Plant146:487-499

Lange M,Yellina AL,Orashakova S,Becker A.Virus-induced gene silencing(VIGS)in plants:an overview of target species and the virus-derived vectorsystems.Methods Mol Biol (2013)975:1-14.

Purkayastha A,Dasgupta I.Virus-induced gene silencing:a versatiletool for discovery of gene functions in plants.Plant Physiol Biochem.(2009)47(11-12):967-976.

Liu Y,Schiff M,Dinesh-Kumar SP.Virus-induced gene silencing intomato.Plant J.(2002)31:777-786

Jia HF,Chai YM,Li CL,Lu D,Luo JJ,Qin L,Shen YY.Abscisic acid plays animportant role in the regulation of strawberry fruit ripening.Plant Physiol.(2011)157:188-199

发明内容：

本发明的目的在于提供一种调节草莓果实膨大的生长素合成限速酶FaYUC11基因及其应用。

技术方案为，一种草莓生长素合成限速酶FaYUC11基因，含有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。优选的，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

这种基因来源于八倍体草莓，编码生长素的吲哚丙酮酸合成途径(IPyA pathwayof IAA biosynthesis)中的限速酶-YUCCA类黄素单加氧酶(FMO)，含有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。优选的，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

上述的基因可用于调控草莓果实中的吲哚乙酸(IAA)含量和果实大小，该基因的沉默不但可以导致草莓果实中游离IAA含量下降，还使草莓果实膨大受到抑制。

本发明利用RT-PCR(反转录PCR)和病毒诱导基因沉默VIGS(Virus-induced genesilencing)技术从八倍体草莓中克隆并鉴定了一种新的草莓果实大小调控基因FaYUC11，该基因编码生长素的吲哚丙酮酸合成途径(IPyA pathway of IAA biosynthesis)中的限速酶-YUCCA类黄素单加氧酶(FMO)。该基因的沉默不但可以导致草莓果实中游离IAA含量下降，还使草莓果实膨大受到抑制。本发明提供这个基因的核酸序列以及蛋白序列，同时还涉及该基因在草莓果实大小调控中的用途。

根据前述的应用，将草莓生长素合成限速酶FaYUC11基因的非保守区域构建到pTRV2载体的2×35S启动子的下游，形成内含子(Intron)隔开的双向发夹结构，通过微注射法转化草莓，并鉴定转基因草莓。FaYUC11基因沉默后，草莓果实膨大被抑制并且草莓果实中游离IAA含量下降。

使草莓生长素合成限速酶FaYUC11基因沉默的方法，是构建沉默表达载体，并与农杆菌混合后侵染草莓。具体步骤为：根据草莓生长素合成限速酶FaYUC11基因的CDS序列设计PCR扩增引物对，如SEQ ID No.3和No.4所示。

其全长正向引物OF为：5’-AAAATGGAGAACAATGTGTTTGGGA-3’；

反向引物OR：5’-GGACTAGACCTCTCTTGCAGCAT-3’。

以八倍体“久香”草莓瘦果cDNA为模版，利用上述引物，通过PCR扩增获得FaYUC11基因全序列；将PCR产物克隆至pUCm-T载体上，经测序正确。

根据草莓YUC全家族序列比对结果，选择FaYUC11基因特异区域，设计扩增出253bp的基因特异引物对，如SEQ ID No.5和No.6所示。

正向引物RiF:5’-TTCTGCTCTCTGCCGATGAT-3’；

反向引物RiR：5’-CTCCAGTCGCAATTACCAAG-3’。

以前面所获得全长基因的T质粒为模版，利用RiF和RiR引物对，通过PCR扩增获得FaYUC11基因的253bp片段，利用体外重组方法分两步克隆进pBSK-in载体(Duan等2008)的Intron两端，形成了带有2个FaYUC11基因片段的重组质粒pBSK-in-dYUC11，其中2个YUC11基因片段方向相反，且中间为一个内含子Intron隔开。具体为：该基因片段首先克隆到pUCm-T载体上，再将含有该FaYUC11基因片段的pUCm-T质粒经PstI和BamHI双酶切，通过体外重组将基因片段转移进入用相同组合酶切的pUCm-T质粒上；再次用PstI和SalI酶切含有FaYUC11基因片段的pUCm-T质粒，将切下的基因片段通过体外重组转移进入用NsiI和SalI线性化的已含有一个FaYUC11基因片段的pBSK-in载体。

进一步用KpnI酶和SacI酶双酶切pBSK-in-dYUC11重组质粒，将FaYUC11基因片段的双向发夹结构克隆至烟草脆裂病毒pTRV2(Liu等2002)的2×35S启动子后病毒CP蛋白的下游，获得pTRV2-dYUC11重组载体即沉默载体。混合含有烟草脆裂病毒的RNA1和RNA2的农杆菌，采用农杆菌微注射法处理草莓小绿果，经过连续拍照观察，结合TRV病毒RNA1/2特异引物和FaYUC11的RT-PCR检测筛选，最终获得病毒诱导FaYUC11沉默的草莓果实。

本发明首次利用病毒诱导基因沉默方法，构建FaYUC11的烟草脆裂病毒沉默载体，并利用微注射方法转化到草莓，改变果实生长发育，从而影响草莓产量和品质。对于详细阐明草莓果实膨大的激素调控机理具有重要的理论价值，并且可以通过对该基因及其等位基因的单核苷酸多态性研究为基础，开发出果实大小相关的功能性分子标记，在草莓分子育种和大果优质草莓选育中也具有重要意义。

附图说明

图1为本发明实施例1中所构建目标基因的病毒诱导沉默载体(pTRV2-dYUC11载体)图谱。

图2为本发明实施例3中病毒阳性株系的RT-PCR鉴定结果。采用TRV2特异引物对进行PCR扩增后电泳检测，其中泳道1为八倍体草莓“久香”的果实，泳道2为CK1不含目标基因片段的TRV农杆菌注射的久香果实，泳道3为RiYUC11目标基因沉默载体农杆菌注射的久香果实。

图3为本发明实施例3中FaYUC11基因沉默的qRT-PCR鉴定结果，为草莓生长素合成基因FaYUC11在对照(CK1)久香草莓及2个病毒诱导基因沉默株系中的表达。纵坐标为real-time PCR(实时荧光定量PCR)检测该基因在对照CK1或病毒诱导基因沉默株系中的相对表达量(相对于未注射病毒沉默载体的野生型)。

图4为本发明实施例4中病毒诱导基因沉默后果实表型分析，为对照(CK1，不含目标基因插入的病毒空载体转化)和2个病毒诱导基因沉默株系(RiYUC11-2和RiYUC11-3)果实处理34天后的形态。与对照相比，病毒诱导基因沉默果实膨大明显受抑制，而对照果实膨大正常。

图5为本发明实施例4中病毒诱导基因沉默株系与对照草莓瘦果中自由IAA的含量差异。纵坐标显示通过GC-MS方法所测定的草莓瘦果中的IAA含量。

图6为本发明实施例4中病毒诱导沉默株系和对照的果实纵、横径增长比例的差异。纵坐标显示微注射前后纵、横径变化相比于注射前的比值。

具体实施方式

以下实施例仅用于说明本发明而不用于限定本发明的应用范围。

实施例1FaYUC11基因的分离和病毒诱导基因沉默载体构建

根据二倍体森林草莓YUC全家族基因序列信息(Liu等2014)，在八倍体栽培草莓果实(分花托和瘦果)中解析全家族基因基因的动态表达模式。结果发现FaYUC11是该家族唯一在瘦果中高表达成员，且其动态表达模式和瘦果中生长素积累动态模式一致。

根据森林草莓同源基因的序列设计PCR扩增引物，正向引物OF：

5’-AAAATGGAGAACAATGTGTTTGGGA-3’；反向引物OR：

5’-GGACTAGACCTCTCTTGCAGCAT-3’，分别如SEQ ID No.3和4所示。

以野生型久香草莓果实cDNA为模版，采用全式金高保真酶(来自北京TransGene公司)用上述扩增引物进行PCR扩增，获得FaYUC11全序列，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其所编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

按照TranStart聚合酶扩增体系和反应程序进行PCR反应。将PCR产物连接克隆到pUCm-T载体上，经测序鉴定得到与目的基因完全相同的序列，如SEQ ID No.1。

之后，再根据久香草莓YUC全家族成员的序列比对结果，选取靠5’端的基因特异区域，设计了干涉引物对，正向引物：5’-TTCTGCTCTCTGCCGATGAT-3’和反向引物：5’-CTCCAGTCGCAATTACCAAG-3’，分别如SEQ ID No.5和6所示。

以所获得全长基因质粒为模版，利用上述所设计干涉引物对，PCR扩增获得了253bp的基因片段。该基因片段首先克隆到pUCm-T载体上，然后再经过两次体外重组转移到pBSK-in载体的intron序列两端，最后经KpnI和SacI双酶切点整合进病毒RNA2质粒pTRV2中，得到pTRV2-dYUC11病毒诱导基因沉默载体。载体图谱见图1。

其中，中间载体pBSK-in-dYUC11的构建过程为：首先将含有FaYUC11基因片段(253bp)的pUCm-T质粒经PstI和BamHI双酶切，通过体外重组将基因片段转移进入用相同组合酶切的pUCm-T质粒(上海生工生物工程有限公司)上。之后，再次用PstI和SalI酶切含有FaYUC11基因片段的pUCm-T质粒，将切下的基因片段通过体外重组转移进入用NsiI和SalI线性化的已含有一个目标基因片段的pBSK-in载体，就得到了含有2个FaYUC11基因片段的重组质粒pBSK-in-dYUC11，其中2个YUC11基因片段方向相反，且中间被一个内含子(Intron)隔开。

实施例2病毒诱导基因沉默草莓的获得

进一步用KpnI酶和SacI酶双酶切pBSK-in-dYUC11重组质粒，将FaYUC11基因片段的双向发夹结构克隆至烟草脆裂病毒pTRV2(Liu等2002)的2×35S启动子后病毒CP蛋白的下游，获得pTRV2-dYUC11重组载体。混合含有烟草脆裂病毒的RNA1和RNA2的农杆菌。

将含有目标基因病毒诱导沉默表达载体以及空pTRV1和pTRV2载体的GV3101农杆菌接种于含50μg/mL Kan、10μg/mL Rif和50μg/mL Gen的5mL YEP培养基中28℃培养过夜，次日按照1：50的比例接种于诱导培养基(YEP，含有10mM/L MES、20μM/L AS、50μg/mL Kan、10μg/mLRif和50μg/mL Gen)中，28℃摇菌至对数期(OD值0.6-0.8)，5000r/min离心10min收集菌体，再用侵染缓冲液(含有10mM/L MES、100μM/L AS、10mM/L MgCl₂)重悬菌体，并调节菌液浓度至OD值为1.2-1.5间，28℃放置3h后用于接种草莓果实(以智能人工温室中的“久香”草莓小绿果为材料)。然后将含有pTRV1的GV3101菌液与含有pTRV2-dYUC11的GV3101菌液按1:1体积混匀，使用微注射方法将混合的菌液，从果实顶部注入，控制环境温度在25-28℃，保证病毒有效侵染。

实施例3病毒诱导基因沉默草莓的鉴定

为了检测烟草脆裂病毒是否成功侵染草莓，分别提取野生型和注射病毒原始载体以及重组的FaYUC11的病毒诱导沉默载体的草莓果实总RNA，利用随机引物进行反转录合成cDNA。

按照Jia等2011文献提供烟草脆裂病毒RNA2的特异引物进行RT-PCR反应，来鉴定病毒侵染的草莓果实。对PCR产物进行电泳检测，结果发现，病毒原始载体和FaYUC11的重组病毒载体侵染的草莓果实能扩增出病毒特异条带(如图2)，而野生型草莓中无此目的条带。初步确定，烟草脆裂病毒已通过微注射方法侵染了草莓果实。

进一步地，在所选构建病毒沉默载体的片段下游，设计FaYUC11新的特异引物对。正向引物：5’-GGAAAGGTGAAAAGGGCGT-3’；反向引物：

5’-GACCTCTCTTGCAGCATTAC-3’。

通过RT-PCR在转录水平鉴定病毒诱导基因沉默的效果。取两个用重组病毒诱导的FaYUC11基因沉默株系进行验证，分别用RiYUC11-2和RiYUC11-3表示。

结果表明，相比于注射含原始病毒质粒农杆菌的果实，部分微注射含FaYUC11重组的病毒诱导沉默质粒农杆菌的果实中发生了FaYUC11的不同程度转录产物积累水平下降，如图3。

实施例4病毒诱导基因沉默草莓表型分析

将原始病毒侵染草莓果实和野生型同发育时期的草莓果实相比较，发现含原始TRV病毒的农杆菌注射后果实顶部有轻微凹陷，此外果实膨大和基本形态未受到明显影响。进一步的表型分析发现，注射重组病毒载体农杆菌的草莓果实膨大受到抑制，部分果实经过一个月的生长几乎没有变大，仍然处于小绿果阶段，另外有部分果实膨大所受的抑制要轻微些，如图4。

通过GC-MS方法测定草莓果实种子(瘦果)中的IAA，可以明显看出病毒诱导FaYUC11沉默的草莓果实不仅膨大受到抑制，生长素含量也明显下降，如图5。进一步通过果实纵横径测定，与微注射含病毒农杆菌之前的果实大小数据相比较，可以明显看出重组FaYUC11的病毒诱导沉默载体注射的草莓果实比原始病毒载体注射果实的纵横径增长比例小，如图6。

结果证明，该基因沉默可以导致果实瘦果(种子)中游离生长素含量下降，果实纵横径增长率降低，同时，影响了果实硬度和可溶性固形物含量。此基因在草莓果实大小调控方面具有很好的应用前景，对于功能性SNP分子标记的开发和优质大果草莓的选育具有重要意义。

虽然，以上已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所作的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (2)

1.一种草莓生长素合成限速酶FaYUC11基因在调控草莓果实大小方面的应用，其特征在于，所述草莓生长素合成限速酶FaYUC11基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.一种草莓生长素合成限速酶FaYUC11基因用于调控草莓果实中吲哚乙酸的含量，其特征在于，所述草莓生长素合成限速酶FaYUC11基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。