CN102212553A - 超声波辅助农杆菌介导植物萌发种子基因转化方法 - Google Patents

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Abstract

一种超声波辅助农杆菌介导植物萌发种子基因转化方法，其目的是直接以植物萌发种子作为农杆菌侵染受体，不需进行组织培养和植株再生过程。本发明以植物萌发种子为受体，以携带外源基因片段的农杆菌Ti质粒为基因载体，在种子萌发过程中对受体植物萌发种子生长点部位进行划伤和超声波处理后与农杆菌共培养；将外源基因转移到受体基因组中，并通过对种子或幼苗的直接筛选，对植株叶片DNA进行PCR扩增和Southern杂交，进一步确定转化株。

Description

超声波辅助农杆菌介导植物萌发种子基因转化方法
技术领域
本发明涉及一种植物基因转化方法，特别是一种利用超声波处理划伤和农杆菌介导直接转化植物萌发种子，不需要组织培养过程的新方法。
技术背景
在专利号为ZL 01104185.4的中国专利中公开了一种利用农杆菌直接转化玉米萌发种胚的转基因方法，该发明是一种利用农杆菌介导植物萌发种子进行基因转化的方法，即以植物萌发种子为受体材料，以携带外源基因片段的农杆菌Ti质粒为基因供体，在植物种子萌发过程中与农杆菌共培养，使其将供体的外源基因片段转移到受体基因组中。该法以植物萌发种子为受体，避开了繁冗、操作要求高的植物组织培养过程，同时，利用种子作为受体，获得的转化植株和种子的周期性大大缩短，并且种子取材方便，不受季节限制。但该方法的主要缺点是转化率较低，仅有0.6％左右，并且容易形成嵌合体。
在中国发明专利ZL 91103622.9和ZL 97111924.4中，许宁等公开了用超声波处理植物组织块进行基因转化的方法。他们使用的植物组织块为叶片、愈伤组织或幼胚，处理后仍需经过组织培养过程才能获得完整的转化植株和种子。孙毅等提出了一种超声波处理花粉诱导基因转移的方法(中国专利ZL9912115.2)。该方法是将植物新鲜花粉放入含有外源DNA缓冲液的容器中，用超声波处理溶液，在脉冲超声波的作用下，将外源基因导入植物花粉中。以上这些发明都说明，采用超声波处理可以使植物处于感受态，并有利于外源DNA的进入。在这些发明中，所使用的都是质粒DNA，它们是靠渗透作用进入植物细胞的。
发明内容
本发明目的是克服上述已有技术的不足，提供一种直接以植物萌发种子作为农杆菌侵染受体，不需进行组织培养和植株再生过程的超声波辅助农杆菌介导植物萌发种子基因转化方法。
本发明的具体技术方案是：以划伤萌发幼胚后进行超声波处理的萌发种子为受体，以携带外源基因片段的农杆菌Ti质粒为基因载体，在植物种子萌发过程中与农杆菌共培养，使外源基因转移到受体基因组中，并通过对种子或幼苗的直接筛选，对植株叶片DNA进行PCR扩增和Southern杂交，进一步确定转化株。为利于农杆菌Ti质粒进入到受体细胞中，对受体植物萌发种子生长点部位进行划伤和超声波处理后与农杆菌共培养，将植物萌发种子生长点部位划伤后立即进行超声波处理，使其顶端分生组织细胞处于感受态。所用超声波的功率100-900W，频率10秒/次，处理次数为1-10次。
胚是植物的雏形，胚部的顶端分生组织细胞具有旺盛分裂的能力，用刀片划伤萌发种子胚生长点时，划得太深会使生长点部位受伤过重，其细胞分裂能力下降甚至死亡；而划伤太浅则生长点部位未受伤，其细胞很难被农杆菌侵染，因此划伤应适度。划伤深度随作物种与品种不同而略有差异，一般为1-3mm，在玉米自交系昌7-2上划伤深度约为2mm。(再具体一点)。同时，在对萌发种子生长点部位进行人为划伤的基础上，进行超声波处理可以使生长点细胞处于感受状态，进一步提高转化率并减少嵌合体的形成。
根据前人的研究结果，那些易被农杆菌转化的双子叶植物通常可在感染处分泌出一种酚类物质——乙酰丁香酮，该物质可激活农杆菌Ti质粒上的Vir基因，从而促进农杆菌侵染和对受体的转化。因此当受体为农杆菌宿主植物叶芽时，可直接被农杆菌侵染和转化；当受体为非农杆菌宿主或单子叶植物叶芽时，可在农杆菌悬浮液中加入一定量的乙酰丁香酮作为农杆菌侵染诱导物。在本发明中，对划胚和超声波处理后的植物萌发种子经农杆菌侵染和共培养；植物萌发种子与农杆菌的共培养是在浓度为106-108cfu/ml的农杆菌液中进行，并在菌液中加入终浓度为10-200umol/L乙酰丁香酮。
在萌发种子与农杆菌共培养后，可以直接播种于苗床中，将共培养后(无论是否经过初筛)的萌发种子播种于苗床中继续进行筛选。或置于含筛选剂的水溶液中进行初步筛选。
筛选方法可以是根据外源基因载体所携带的选择标记基因使用相应的筛选剂，或者采用分子检测方法，如PCR扩增或Southern杂交。对检测阳性的植株进行自交或杂交获得转基因T0代种子，将获得的T0代转基因种子播种，获得T1代转基因植株，并在此后继续进行自交和分子检测，直至获得稳定纯合的转基因自交系或品种。获得的自交系或品种可以用作配制杂交种的亲本或用作杂交育种的亲本。
本发明通过对萌发种子生长点部分进行划伤和超声波处理后作为农杆菌侵染受体。在将农杆菌与处理后的萌发种子共培养一段时间后，然后对种子进行直接筛选，不需进行组织培养和植株再生。通过超声波处理也可以使萌发中的幼胚分生组织细胞处于感受状态，从而有利于农杆菌感染，比其他的植物基因转化方法更为简便、快速、经济。
在传统的农杆菌介导的基因转化中，可以通过在培养基中加入筛选标记来淘汰未转化细胞，本发明受此启发在种子与农杆菌共培养48小时后，将其置于含有一定浓度筛选剂的溶液中筛选，然后进行播种。实验证实：采用农杆菌介导植物萌发种子基因转化后，外源基因已整合到受体植物基因组中。利用植物萌发种子作为农杆菌介导外源基因转化的受体系统，避开了传统农杆菌共培养法所要求的严格繁冗的组织培养过程，缩短了实验周期，且在种子萌发过程中就进行筛选，可以有效地淘汰未转化苗数，减少后期检测的工作量，并节省土地。本发明不需要昂贵的仪器及复杂的操作技术，且利用植物萌发种子作为受体，取材方便，不受季节限制；本方法操作简单，一次可处理大量种子。采用本发明已成功对玉米、高粱、小麦的萌发种子进行了遗传转化。
附图说明
图1为质粒Cry1Ac的物理图谱；
图2为将萌发种子沿胚芽生长方向纵向划伤后的划伤部位图。
图中：1、种皮或果皮，2、胚乳，3、胚芽鞘，4、胚芽，5、子叶，6、胚根，7、胚根鞘。
具体实施方式
实施例1.基本转化方法：
1)以携带有质粒Cry1Ac的农杆菌LBA4404为外源基因供体。质粒Cry1Ac携带有苏云金芽孢杆菌毒蛋白AC基因和植物筛选标记基因bar，它赋予植物对除草剂basta(有效成分为Phosphiothricin或PPT)的抗性。此基因构建由中国农科院作物科学研究所王国英研究员提供。质粒Cry1Ac的物理图谱如图1所示。
2)以玉米(Zea mays L.)自交系昌7-2和郑58、高粱恢复系晋粱5号、小麦品种晋作239等为受体材料。
3)转化操作过程：首先将供试种子在自来水中漂洗后，置于75％乙醇中30秒，然后在超净工作台中用无菌蒸馏水漂洗3次后放于玻璃容器无菌水中(水的高度以略微超过种子为宜)，用高压灭菌后的纸或封口膜盖好，置于室温下(20-26℃)摇床上(100-200转/分钟)24-48小时。在种子胚芽部分突起(俗称“露白”)后，用解剖刀将萌发种子沿胚芽生长方向纵向划伤(划伤部位见图2)后立即进行超声波处理。超声波处理强度为300、600和900W。
在含有50mg/L卡那霉素(Km)和20mg/L利福平(rif)的LB平板挑取含以上基因的农杆菌单菌落，接种于10mL含有50mg/L Km和20mg/L rif的LB培养基中，28℃，180r/min过夜培养至对数中期(OD600约为0.4-0.6)并加入终浓度为100μmol/L乙酰丁香酮。将以上经划伤和超声波处理的萌发种子，在每350mL划伤种子培养液中加入10-50mL含106-108cfu/mL的农杆菌液，在120-150r/min下振荡培养10-12小时后，倾去多余菌液，再加入等量蒸馏水，并置于摇床上，继续进行振荡共培养。本实验中还设有一个在此时向培养液中加入0.01％筛选剂basta的处理。光照为12小时，保持温度28℃。再经过2天的共培养后，将发芽的种子播种于沙土中进行筛选培养，并在一周左右用0.1％的除草剂basta作为筛选剂喷施到幼苗叶片上。经过1-3周的选择，取生长健壮、发育良好的basta抗性植株移入大田。对移入大田的幼苗进行正常生长管理，在开花时套袋自交，并在籽粒成熟时收获。
实施例2.转基因植株的分子检测：
转基因植株的分子检测根据《分子克隆手册》进行：
1)本实验中，植物总DNA的提取采用CTAB(十六烷基三乙基溴化铵)法，用琼脂糖凝胶电泳检查DNA提取结果和进行DNA定量。根据Cry1Ac和bar基因的核苷酸序列，分别取5’端和3’端20bp的核苷酸对设计引物，进行PCR扩增。引物序列及其扩增片段大小如下：
Cry1Ac基因
上游引物：5’-CTGACCGTGACCGTGCTG-3’
下游引物：5’-TGGTGCCGTAGGCGAACT-3’.
扩增片段大小：500bp
Bar基因
上游引物：5’-GTCTGCACCATCGTCAACC-3’
下游引物：5’-ACTCGGCCGTCCAGTCGTA-3’.
扩增片段大小：201bp
引物由上海生工生物工程公司合成。PCR扩增用大连宝生物公司的TaKaRaTaqTM试剂盒和PTC-200型PCR仪完成。将经过转化处理和抗性筛选得到的植株取叶片，提取总DNA和PCR扩增。扩增程序根据引物序列予以调整。
2)Southern杂交：为进一步证实PCR扩增结果的可靠性，随机取PCR扩增阳性植株叶片提取总DNA并进行Southern杂交，以质粒DNA为阳性对照，未转化株叶片DNA为阴性对照。结果表明，外源基因确已整合到玉米基因组中。
实施例3.玉米遗传转化：
为了探讨多种因素对转化率的影响，设计了包含有划伤萌发种子、超声波处理和是否在共培养48小时后向培养液中加入筛选剂3个因素的实验。其中超声波处理还包括了3个强度水平(300W、600W和900W)，对玉米自交系昌7-2进行了遗传转化，每一处理有4次重复，每一重复用萌发种子500粒。所有处理共筛选出basta抗性植株1333株。将经basta筛选的植株移入大田后，约80％以上的幼苗能正常成苗。开花时大部分植株表现正常，只有少部分植株出现花期不遇、不能正常散粉等变异。根据实施例2的方法对basta抗性株取叶片和提取总DNA进行分子检测，以确定转化率，总计获得129株转化株。
筛选和分子检测结果见表1。
表1玉米种子基因转化处理后抗basta筛选和PCR检测结果
Figure BSA00000475225200051
*对实验数据采用SPSS11.5软件进行统计分析，方差分析采用one way ANOVA，不同字母表示在0.05水平差异显著。
根据PCR扩增和Southern杂交检测结果证明，利用本发明方法对玉米自交系进行遗传转化，确实可以将外源基因导入受体植物。在各种处理中以用600W和900W处理划伤萌发种子，并在农杆菌液中加入乙酰丁香酮的处理为佳，已全部处理种子为基数，平均可获得1％左右的转化率，是不加超声波处理的2.5倍(5/2)。如果以basta筛选存活株数为基数，总的转化率为9.7％(129/1333)。如果不划伤萌发种子，仅施加强度为300-900W超声波处理(处理7-处理9)，以basta筛选存活株数为基数，转化率仅为0-0.12％；仅划伤萌发胚而不进行超声波处理的转化率为7.41％，(CK1)但与仅采用超神波处理之间的差异未达到显著水平；而划伤种子后再进行超声波处理(处理1-处理6、及处理10)，可使转化率剧增至15.99-28.09％。是否在共培养两天后向共培养液中添加筛选剂对获得的转化体数没有明显影响，但可以减少假阳性株数，略微降低其后取样和DNA检测分析的工作量。虽然在不同超声波强度处理之间的转化体数和转化率之间没有统计学意义上的显著差异，但较高强度超声波处理(600和900W)获得的转化体数较低强度(300W)下为高。我们采用此方法已经获得抗basta的转基因T1代玉米种子，说明导入的外源基因可以遗传。
实施例4.小麦遗传转化：
用相似的方法在小麦(晋作239)上也进行了遗传转化，该实验每个处理2000粒种子，对照处理1000粒种子。转化处理后用0.1％的basta对出苗株进行了两次筛选，获得181株抗该除草剂的植株。对这些抗除草剂植株进行分子检测，获得了一批转基因植株(见表2)。
表2.小麦种子基因转化处理后抗basta筛选和PCR检测结果
Figure BSA00000475225200061
*转化率＝(转化体数/处理种子数)X 100％
从表2中可以看出，尽管转化率很低(0.12％)，但除一个处理(500W)外，胚划伤并加有超声波的处理都获得了转化体。由于没有设重复，且获得的转化体数较少，我们没有对该数据进行统计分析。小麦转化率低及效果不稳定的原因可能与其种子和胚都较小，在划伤处理时不易找准生长点细胞有关。当以basta抗性株为基数时，转化率为9.4％(17/181)。
实施例5.高粱转化结果：
对高粱恢复系晋粱5号进行转化处理，由于没有设重复，未对数据做统计分析。但仅就现有结果看，除一个处理(处理3-2)外，其余从300W到900W的超声波处理，均能获得一定量的转化体，尽管以出苗数作为基数的转化率上，高强度处理获得的转化率略高一些，但由于数目较少，尚无法得出具有统计学意义的结论。添加乙酰丁香酮与否对高粱的转化率似乎没有大的影响，这是否与高粱自身含有较高的酚类物质有关尚待进一步研究。所有施加超声波的处理获得的转化率均高于不进行处理的对照，这说明，对划伤的萌发胚进行超声波处理可以较大幅度提高转化率(平均由3.6％增至8.3％)。采用此方法已经获得的抗basta的转基因T1代高粱种子，说明导入的外源基因可以遗传。对高粱种子基因转化处理后抗basta筛选和PCR检测结果见表3。
表3.高粱种子基因转化处理后抗basta筛选和PCR检测结果
Figure BSA00000475225200071
*转化率＝(转化体数/basta筛选存活株数)×100％。
还需要说明的是，本实验中超声波处理使用的是宁波新芝JY92-IID细胞粉碎仪进行，该仪器最大功率为900W。在对萌发种子不造成严重损伤的的前提下，这一功率还可提高，而且处理时间也可进一步延长。

Claims (8)

1.一种超声波辅助农杆菌介导植物萌发种子基因转化方法，其特征是以植物萌发种子为受体，以携带外源基因片段的农杆菌Ti质粒为基因载体，在种子萌发过程中与农杆菌共培养，将外源基因转移到受体基因组中，并通过对种子或幼苗的直接筛选，对植株叶片DNA进行PCR扩增和Southern杂交，进一步确定转化株。
2.根据权利要求1所述的超声波辅助农杆菌介导植物萌发种子基因转化方法，其特征是对受体植物萌发种子生长点部位进行划伤和超声波处理后与农杆菌共培养；划伤深度随作物种与品种不同而略有差异，一般的划伤深度约为2-3mm；所用超声波的功率100-900W，频率10秒/次，处理次数为1-10次。
3.根据权利要求1所述的超声波辅助农杆菌介导植物萌发种子基因转化方法，其特征是对划胚和超声波处理后的植物萌发种子经农杆菌侵染和共培养；植物萌发种子与农杆菌的共培养是在浓度为106-108cfu/ml的农杆菌液中进行，并在菌液中加入终浓度为10-200umol/L乙酰丁香酮。
4.根据权利要求3所述的超声波辅助农杆菌介导植物萌发种子基因转化方法，其特征是在萌发种子与农杆菌共培养后，直接播种于苗床中，或置于含筛选剂的水溶液中进行初步筛选。
5.根据权利要求4所述的超声波辅助农杆菌介导植物萌发种子基因转化方法，其特征是将共培养后的萌发种子播种于苗床中继续进行筛选，筛选方法是根据外源基因载体所携带的选择标记基因使用相应的筛选剂，或者采用分子检测方法，如PCR扩增或Southern杂交。
6.根据权利要求5所述的超声波辅助农杆菌介导植物萌发种子基因转化方法，其特征是对检测阳性的植株进行自交或杂交获得转基因T0代种子。
7.根据权利要求6所述的超声波辅助农杆菌介导植物萌发种子基因转化方法，其特征是将获得的T0代转基因种子播种，获得T1代转基因植株，并继续进行自交和分子检测，直至获得稳定纯合的转基因自交系或品种。
8.根据权利要求7所述的超声波辅助农杆菌介导植物萌发种子基因转化方法，其特征是获得的自交系或品种用作配制杂交种的亲本或用作杂交育种的亲本。
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