CN113234750A - 快速获得以菘蓝转基因根为外植体的转基因植株的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种快速获得以菘蓝转基因根为外植体的转基因植株的方法，包括：对菘蓝种子进行催芽后分配到土盆中；活化携带有目的基因的发根农杆菌；使用一次性注射器吸取发根农杆菌菌液创伤侵染幼茎；注射苗培养直至伤口周围萌蘖出不定根并开始分化出根毛；筛选阳性外植体；消毒后将阳性外植体接入诱导再生培养基，经历诱导愈伤、愈伤增殖、愈伤分化出芽和根；挑选分化状态良好的幼芽接入生根培养基生成完整再生植株；筛选阳性转基因苗；将阳性转基因苗经过炼苗移栽到土盆中。本发明对发根农杆菌诱导生根技术进行了优化，提高了发根效率。并通过转基因根通过组织培养获得稳定菘蓝转基因植株，相对传统方式缩短了实验周期。

Description

快速获得以菘蓝转基因根为外植体的转基因植株的方法
技术领域
本发明涉及植物生物技术中的植物基因工程技术领域，是一种发根农杆菌直接诱导幼苗在茎上生成转基因根，并以其为外植体快速获得转基因植株的方法。
背景技术
菘蓝(2n＝14)是中国重要的药用植物，叶和根分别被称为大青叶(IsatidisFolium)和板蓝根(Isatidis Radix)。从菘蓝中分离出的主要活性化合物萜类化合物，木脂素、吲哚生物碱，已被证实具有抗病毒、抗菌、抗炎和抗白血病的功能，在医药行业具有重要功能，例如复方板蓝根颗粒等。
现阶段菘蓝的有性繁殖(种子苗)已经不能够满足良种选育和优良性状保持的需求，完善的无性繁殖体系是进一步提升菘蓝经济价值的重要基础技术。同样通过菘蓝良种苗的离体组织快速获得性状相同的菘蓝植株也是建立菘蓝转基因体系的基础。在近几十年的发展中，模式植物已逐渐具备完善的转化及转基因技术体系，但以菘蓝为例具有重要经济价值和发展潜力的非模式植物，则因为缺乏便捷、高效、稳定的转化和转基因技术体系限制了对菘蓝功能基因筛选和快速扩繁的进度，因此使菘蓝药用化合物代谢机制的研究变得缓慢，相对的优良品系的选育工作仍旧只能依从传统的方法。
植物细胞的全能性对损伤和组织缺失表现出的修复和再生能力，主要是为了适应恶劣的生长环境。体细胞感知到诱导因子后，可以发生脱分化、增殖，获得新的命运，最后修复伤口或直接在伤口部位发育出新的器官。植物激素是一个重要的诱导因子，植物细胞获得新的细胞命运完成脱分化及再生的过程需要内源或外源植物激素的刺激。
而发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)与根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciiens)同属一种病原土壤杆菌，对自然界的植物组织表现出广谱侵染性。发根农杆菌与根癌农杆菌的不同在于，其从植物伤口侵入后不能诱发冠瘿瘤，而是诱发产生许多不定根。这是因为发根农杆菌携带根诱导(Ri)质粒，该质粒携带一组编码生长激素调控和细胞分裂素生物合成酶的基因。
根生真菌仍然保留着根诱导(Ri)质粒，该质粒携带一组编码植物激素生长素控制和细胞分裂素生物合成酶的基因，并合成木质素。一旦Ri T-DNA被整合到到宿主基因组DNA中，新的激素平衡就会解除对受侵染细胞的控制，在伤口部位诱导生成毛状根。诱导增殖的根，即毛状根的形成，在感染点出现。同样，通过对Ri质粒进行修饰，也可以将外源的目的基因整合到宿主植物的基因组中，进而获得目的基因稳定表达的转基因不定根。相较于传统的转化过程，通过发根农杆菌改变被侵染细胞内源激素的平衡，诱导细胞命运发生改变，直接在正常生长的植株生成转基因组织极大地提高了转化的效率和成功率。再将获得的阳性不定根转移到培养基中，施加合适的外源植物激素刺激外植体再次发生脱分化及再分化快速地获得了完整的转基因菘蓝植株。
发明内容
为促进对菘蓝次生代谢的研究，利用转基因再生苗加快菘蓝及其他药用植物功能基因的筛选和表征，本发明提供了完善菘蓝转化体系快速获得转基因不定根和转基因不定根诱导再生体系短周期内获得阳性苗的技术体系。
为达到以上目的，本发明采取的技术方案是：
一种快速获得以菘蓝转基因根为外植体的转基因植株的方法，包括以下步骤：
(1)对菘蓝种子进行催芽，萌发长至整株幼苗的长度为2-3cm后分配到土盆中；
(2)活化携带有目的基因的发根农杆菌；
(3)当菘蓝幼苗茎粗至0.2-0.6cm时，使用1cm规格的一次性注射器吸取步骤(2)的发根农杆菌菌液创伤侵染幼茎。
(4)注射苗放置在高湿(50％-90％)的环境培养7-8天，直至伤口周围萌蘖出不定根并开始分化出根毛(毛状根数量大于10)。
(5)使用激光共聚焦显微镜检测外源目的基因表型的表达状况，筛选阳性外植体；
(6)消毒后将阳性外植体接入诱导再生培养基，经历诱导愈伤、愈伤增殖、愈伤分化出芽和根；
(7)愈伤组织分化出根后芽的生长速度下降，挑选分化状态良好的幼芽接入生根培养基生成完整再生植株。
(8)通过PCR和Western Blot验证再生植株外源目的基因和蛋白表达量以筛选阳性转基因苗。
(9)将阳性转基因苗经过炼苗移栽到土盆中。
本发明的实例中，以mCherry基因作为目的基因，将携带目的基因的表达载体35S：mCherry-pROK2转化到发根农杆菌中。
步骤(1)和(2)无时间上的顺序；
所述步骤(1)中，使用40℃温水浸泡菘蓝种子后，放置在37℃环境下始终保持湿润的滤纸上完成催芽。
步骤(2)中，发根农杆菌的种类包括K599；
步骤(2)中，发根农杆菌以携带35S：mCherry-pROK2质粒的方式携带目的基因mCherry；
步骤(2)中，带有目的基因的发根农杆菌在-80℃冰箱中保存，使用时使用YRK固体培养基进行活化；
所述YRK固体培养基为：在每升YEP培养基中添加50-100mg卡那霉素(Kanamycin)、50-100mg利福平(Rifampicin)和10g琼脂(Agar)；
步骤(2)具体为：使用牙签蘸取菌液在YRK固体培养基划线后密封，放置在28℃下培养12-16h，长出的单菌落为活化菌落，挑取单菌落转移至5ml YRK液体培养基后在28℃、150r摇床培养。
所述YRK液体培养基为：在每升YEP培养基中添加50-100mg卡那霉素(Kanamycin)和50-100mg利福平(Rifampicin)；
步骤(3)所述发根农杆菌菌液OD值为0.6-0.9；
步骤(3)注射点距菘蓝幼苗茎基1-3cm。
步骤(4)中，注射苗培养的环境条件为：光照强度1000-4000Lux，温度23-25℃，光照时间为每天的8时到24时，并且需要保持育苗盆环境湿度为50-75％。
步骤(5)中，外植体阳性表达的鉴定方法诱导不定根分化的根毛，通过激光共聚焦检测目的基因mCherry的表达。
步骤(5)中，通过激光共聚焦检测目的基因的表达，mCherry的最大吸收和发射峰分别位于587nm和610nm。
步骤(6)中，阳性外植体接入诱导再生培养基的过程在超净台中完成，所使用的全部器皿工具均需要消毒处理。
步骤(6)中，对阳性外植体消毒的方法为，酒精浸泡30s，灭菌水冲洗1次，7％次氯酸钠浸泡2min，灭菌水冲洗5次。
步骤(6)中，诱导再生培养基为：每升基础培养基+1mg萘乙酸(NAA)+2mg 6-苄氨基嘌呤(6-BA)+500mg水解乳蛋白(LH)+700mg脯氨酸(Pro)+30g蔗糖+8g琼脂(Agar)，调至PH为5.8。
步骤(7)中，生根培养基为：每升基础培养基+0.1mg吲哚丁酸(IBA)+0.005mg萘乙酸(NAA)+30g蔗糖+8g琼脂(Agar)，调至PH为5.8。
所述基础培养基的配方为：每升基础培养基中含有硝酸钾23.75g、硝酸铵20.625g、硫酸镁4.625g、磷酸二氢钾2.125g、氯化钙44g、乙二胺四乙酸二钠3.73g、硫酸亚铁2.78g、硼酸6.2g、硫酸锰16.9g、硫酸锌8.6g、钼酸钠0.25g、硫酸铜25mg、氯化钴25mg、碘化钾0.83g、甘氨酸800mg、盐酸硫胺素40mg、盐酸吡哆素200mg和肌醇20g。
步骤(8)中，阳性转基因苗的鉴定方案为：取所述再生植株的叶片，通过CTAB法提取叶片总RNA，通过反转录试剂盒得到总DNA。以所得总DNA为模板通过PCR检测外源目的基因mCherry是否表达。
步骤(9)中，炼苗为：培养间无菌环境打开组培瓶培养三到五天后，洗净培养基移入土盆中。
步骤(9)中，炼苗培养条件如下：各组分的体积比为，营养土：蛭石：珍珠岩＝3：1：1，光照强度1000-4000Lux，温度23-25℃，光照时间为每天的8时到24时。
本发明的有益效果：
本发明通过注射侵染的方式直接在活体植物上获得转基因外植体，省略了离体植物组织出愈伤及再分化的过程，转入目的基因的正常表达可以用于对菘蓝功能基因的初筛。通过不定根诱导再生体系将转基因外植体接入诱导培养基中诱导生成完整的阳性苗，有效缩短的了转基因植物的构建周期。
本发明对板蓝根发根农杆菌诱导生根技术进行了优化，提高了发根效率。并通过获得的转基因根通过组织培养获得稳定板蓝根转基因植株。通过转基因根获得转基因全株，相对传统方式缩短了实验周期。
附图说明
本发明有如下附图：
图1为获得菘蓝阳性外植体及获得转基因再生植株的模式图。
图2为菘蓝诱导培养基诱导转基因根得到再生土培苗过程中的各时期特征示意图。
图3中，a图、b图分别为正常根的明场图像和荧光图像；c图、d图分别为转基因根的明场图像和荧光图像。
图4为菘蓝再生植株mCherry蛋白表达Western Blot图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明作进一步详细说明。
如图1-4所示，一种快速获得以菘蓝转基因根为外植体的转基因植株的方法，包括以下步骤：
(1)对菘蓝种子进行催芽，萌发长至2-3cm大小分配到土盆中；
(2)活化携带有目的基因荧光标签的发根农杆菌；
(3)当菘蓝幼苗茎粗至0.2-0.6cm时，使用1cm注射器吸发根农杆菌取菌液创伤侵染幼茎。
注射点距菘蓝幼苗茎基1-3cm。
(4)注射苗放置在湿度为50％-90％的环境下培养7-8天，直至伤口周围萌蘖出不定根并开始分化出根毛(毛状根数量大于10)。
(5)使用激光共聚焦显微镜检测外源目的基因表型的表达状况，筛选阳性外植体；
(6)消毒后将阳性外植体接入诱导再生培养基，经历诱导愈伤、愈伤增殖、愈伤分化出芽和根；
(7)愈伤组织开始分化出根组织分化芽生长速度下降，挑选分化状态良好的幼芽接入生根培养基生成完整植株。
(8)通过PCR和Western Blot验证再生植株外源目的基因和蛋白表达量以筛选阳性转基因苗。
(9)外源基因阳性表达的再生菘蓝幼苗经过炼苗后移栽到土盆中。
本发明的实例中，以mCherry作为目的基因，将携带目的基因的表达载体35S：mCherry-pROK2转化到发根农杆菌中。
步骤(1)和(2)无时间上的顺序；
步骤(1)中，使用40℃温水浸泡菘蓝种子后，放置在37℃环境下始终保持湿润的滤纸上完成催芽，并无限定时间，根据幼苗的状态决定是否分盆。
本发明通过携带目的基因的发根农杆菌侵染菘蓝伤口周围的细胞，将携带目的基因的质粒整合到被侵染细胞的细胞核中，提供了在活体菘蓝幼苗直接获得转基因外植体的一种方法，对于具体的目的基因及适宜的表达载体没有特殊限定。在本发明的实例中，以mCherry基因为目的基因，发根农杆菌携带35S:mCherry-pROK2质粒对菘蓝伤口细胞进行转化诱导出不定根。
本发明中，所述发根农杆菌的种类包括但不限于K599。
本发明使用的菌液保存在-80℃冰箱中，使用前需要对菌液进行活化。
本发明中，所述带有目的基因的发根农杆菌菌液OD值为0.6-0.9，更优选为0.9。如本发明的具体实例所示，OD值为0.9的菌液诱导生成转基因根的效率更高。
本发明中，所述注射点距菘蓝幼苗茎基1-3cm，发根农杆菌侵染会影响菘蓝幼苗的生长，诱导不定根随生长分化出毛状根深入土壤中。本发明的实例所示，不同的注射位置对诱导不定根生长速率有一定影响，注射点下的幼茎生长量降低，注射点距菘蓝幼苗茎基1cm时毛状根分化效率更高。
本发明中是用注射器处理菘蓝幼苗时使用注射器以45°角度将菌液注入菘蓝幼苗茎中，并可以在伤口残留菌株，可以提高转化诱导的效率。
本发明中，注射苗培养的环境条件为：光照强度1000-4000Lux，温度23-25℃，照射时间8-24h，并且需要保持育苗盆环境湿度为50-75％。
下面实例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但不能将其理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1转基因菘蓝幼苗获得
(1)菘蓝幼苗的培养：
当年产菘蓝种子从安国药材市场购买获得，在40℃温水中浸泡4h后放置在育苗盆中进行催芽，5-7天后菘蓝种子破壳萌发后移栽到土盆中。在温室中培育5-7天，幼苗长度达到2-3cm可进行下一步操作。
(2)活化携带35S：mCherry-pROK2重组质粒的发根农杆菌工程菌。
将携带35S：mCherry-pROK2重组质粒的发根农杆菌工程菌从-80冰箱中取出，蘸取少量菌液在YRK固体培养基画线，在28℃菌培养箱中放置16h。挑取单菌落到5mlYEP液体培养基中，在28℃、150r摇床培养。
(3)菘蓝幼苗的注射伤口侵染
使用1ml规格的一次性注射器吸取0.5ml菌液，镊子稳定好菘蓝幼苗后，注射器针头以45°角度将菌液注入菘蓝幼苗幼茎。注射点距菘蓝幼苗茎基1-2cm，针头没入幼茎缓慢推动注射器推动杆使菌液与伤口周围细胞密切接触。
(4)诱导不定根及检测
注射侵染的植株7d左右在伤口处会萌发出不定根并分化出毛状根扎入土壤中，不同环境湿度下毛状根的生长和分化效率不同，收集毛状根在激光共聚焦显微镜下观测mCherry基因表达，筛选阳性外植体。
(5)菘蓝转基因根再生植株
取阳性外植体，在超净台中经消毒处理后接入诱导再生培养基中，大概14天左右发生愈伤组织并逐渐扩增。将部分扩增的愈伤组织转移到新的诱导再生培养基中，愈伤组织会首先分化出芽再分化出根，出根后芽的生长速度下降。将分化芽转移到生根培养基中诱导发根并发育成完整再生植株。如图2所示，a图为诱导转基因根示意图，b图为外植体出愈伤示意图，c图为愈伤扩增示意图，d图为愈伤增值示意图，e图为分化出芽示意图，f图为分化出根示意图，g图为幼芽分瓶示意图，h图为幼芽生根示意图，i图为成苗示意图。
(6)菘蓝再生植株的检测:在RNA和蛋白水平对目的基因的表达状况进行检测。取适量的再生植株叶子，利用CTAB法提取总RNA，经反转录酶获得cDNA，涉及引物：
mCherry-F：ATGGTGAGCAAGGGCGAGG
mCherry-R：CTTGTACAGCTCGTCCATGCC
进行PCR检测，检测到再生植株叶片中存在mCherry基因。(如图3所示，为鉴定再生植株转基因根mCherry荧光标签表达状况)。
取适量再生植株叶片，提取粗蛋白，通过12％(w/v)SDA-PAGE分离蛋白质，并电泳转移至PVDF膜。封闭液封闭处理2h后将第一抗体(抗mcherry)、TBST溶液、封闭液混合与膜孵育过夜。TBST冲洗干净后，第二抗体、TBST溶液、封闭液混合与膜孵育2h，TBST冲洗干净后加入发光液，可视化免疫反应条带，检测到mCherry蛋白条带(如图4所示)。
可以看出，本发明所述方法可以高效、稳定地获得转基因植物。
实施例2
表1不同浓度的发根农杆菌对不定根诱导的影响
Figure BDA0003039353550000121
选择长势相近的菘蓝种子苗，使用四份不同OD值的发根农杆菌对其进行伤口侵染诱导转化不定根。按照实例1的方法对其进行注射，观察10天后的诱导不定根效率。
如表1所示，不同浓度的菌液表现出不同诱导效率，其中OD值＝0.9时效率最高。
实施例3
表2不同注射位置对转化诱导不定根根毛分化效率的影响
Figure BDA0003039353550000122
选择苗龄相同株高近似的菘蓝幼苗，使用OD＝0.9的菌液在不同注射点对菘蓝幼苗进行注射伤口侵染，注射位置分别为茎基部以上1cm、2cm、3cm，注射具体操作同实例一。处理十天后观察毛状根分化状况。
如表2所示，毛状根分化效率与注射位置存在关联，其中茎基上1cm的注射点更有利于诱导转基因根的毛状根分化。
实施例4不同湿度环境对诱导不定根诱导的影响
选择长势相近的菘蓝种子苗，经OD＝0.9的菌液处理后，放置在不同湿度的环境中，湿度环境分别为50％、75％、90％。按照实例1的方法对其进行注射，观察10天后的诱导不定根效率。
表3不同湿度环境对诱导不定根诱导的影响
Figure BDA0003039353550000131
如表3所示，湿度环境对诱导不定根极为重要，湿度高于75％的环境湿度有利于不定根的诱导。
以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，有关技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的实质和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型，因此所有等同的技术方案也属于本发明的保护范围。
本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。

Claims (10)

1.一种快速获得以菘蓝转基因根为外植体的转基因植株的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)对菘蓝种子进行催芽，萌发长至整株幼苗的长度为2-3cm后分配到土盆中；
(2)活化携带有目的基因的发根农杆菌；步骤(1)和步骤(2)无时间上的顺序；
(3)当菘蓝幼苗茎粗至0.2-0.6cm时，使用一次性注射器吸取步骤(2)的发根农杆菌菌液创伤侵染幼茎；
(4)注射苗放置在湿度为50％-90％的环境下培养7-8天，直至伤口周围萌蘖出不定根并开始分化出根毛；
(5)使用激光共聚焦显微镜检测外源目的基因表型的表达状况，筛选阳性外植体；
(6)消毒后将阳性外植体接入诱导再生培养基，经历诱导愈伤、愈伤增殖、愈伤分化出芽和根；
(7)愈伤组织分化出根后，芽的生长速度下降，挑选分化状态良好的幼芽接入生根培养基生成完整再生植株；
(8)通过PCR和Western Blot验证再生植株外源目的基因和蛋白表达量以筛选阳性转基因苗；
(9)将阳性转基因苗经过炼苗移栽到土盆中。
2.如权利要求1所述的快速获得以菘蓝转基因根为外植体的转基因植株的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，使用40℃温水浸泡菘蓝种子后，放置在37℃环境下始终保持湿润的滤纸上完成催芽。
3.如权利要求1所述的快速获得以菘蓝转基因根为外植体的转基因植株的方法，其特征在于：步骤(2)中，以mCherry基因作为目的基因，将携带目的基因的表达载体35S：mCherry-pROK2转化到发根农杆菌中；发根农杆菌的种类包括K599；
步骤(2)中，带有目的基因的发根农杆菌在-80℃冰箱中保存，使用时，使用YRK固体培养基进行活化；所述YRK固体培养基为：在每升YEP培养基中添加50-100mg卡那霉素、50-100mg利福平和10g琼脂；
步骤(2)具体为：使用牙签蘸取菌液在YRK固体培养基划线后密封，放置在28℃下培养12-16h，长出的单菌落为活化菌落，挑取单菌落转移至5ml YRK液体培养基后在28℃、150r摇床培养；所述YRK液体培养基为：在每升YEP培养基中添加50-100mg卡那霉素和50-100mg利福平。
4.如权利要求1所述的快速获得以菘蓝转基因根为外植体的转基因植株的方法，其特征在于：步骤(3)所述发根农杆菌菌液OD值为0.6-0.9；注射点距菘蓝幼苗茎基1-3cm。
5.如权利要求4所述的快速获得以菘蓝转基因根为外植体的转基因植株的方法，其特征在于，所述发根农杆菌菌液OD值为0.9；注射点距菘蓝幼苗茎基1cm，注射器以45°角度将菌液注入菘蓝幼苗茎中，并在伤口残留菌株，以提高转化诱导的效率。
6.如权利要求1所述的快速获得以菘蓝转基因根为外植体的转基因植株的方法，其特征在于，步骤(4)中，注射苗培养的环境条件为：光照强度1000-4000Lux，温度23-25℃，光照时间为每天的8时到24时，并且需要保持育苗盆环境湿度为75％；步骤(5)中，通过激光共聚焦检测目的基因mCherry的表达，mCherry的最大吸收和发射峰分别位于587nm和610nm。
7.如权利要求1所述的快速获得以菘蓝转基因根为外植体的转基因植株的方法，其特征在于，步骤(6)中，阳性外植体接入诱导再生培养基的过程在超净台中完成，所使用的全部器皿工具均进行消毒处理；对阳性外植体消毒的方法为：酒精浸泡30s，灭菌水冲洗1次，7％次氯酸钠浸泡2min，灭菌水冲洗5次；诱导再生培养基为：每升基础培养基+1mg萘乙酸+2mg 6-苄氨基嘌呤+500mg水解乳蛋白+700mg脯氨酸+30g蔗糖+8g琼脂，调至PH为5.8。
8.如权利要求1所述的快速获得以菘蓝转基因根为外植体的转基因植株的方法，其特征在于，步骤(7)中，生根培养基为：每升基础培养基+0.1mg吲哚丁酸+0.005mg萘乙酸+30g蔗糖+8g琼脂，调至PH为5.8。
9.如权利要求7或8所述的快速获得以菘蓝转基因根为外植体的转基因植株的方法，其特征在于，所述基础培养基的配方为：每升基础培养基中含有硝酸钾23.75g、硝酸铵20.625g、硫酸镁4.625g、磷酸二氢钾2.125g、氯化钙44g、乙二胺四乙酸二钠3.73g、硫酸亚铁2.78g、硼酸6.2g、硫酸锰16.9g、硫酸锌8.6g、钼酸钠0.25g、硫酸铜25mg、氯化钴25mg、碘化钾0.83g、甘氨酸800mg、盐酸硫胺素40mg、盐酸吡哆素200mg和肌醇20g。
10.如权利要求1所述的快速获得以菘蓝转基因根为外植体的转基因植株的方法，其特征在于，步骤(8)中，阳性转基因苗的鉴定方案为：取所述再生植株的叶片，通过CTAB法提取叶片总RNA，通过反转录试剂盒得到总DNA；以所得总DNA为模板通过PCR检测外源目的基因mCherry是否表达；
步骤(9)中，炼苗为：培养间无菌环境打开组培瓶培养三到五天后，洗净培养基移入土盆中；炼苗培养条件如下：各组分的体积比为，营养土：蛭石：珍珠岩＝3：1：1，光照强度1000-4000Lux，温度23-25℃，光照时间为每天的8时到24时。
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