KR20180124928A - 단풍잎형 오이 식물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 단풍잎형 갈래잎을 갖는 돌연변이체 오이 식물 CC81221 또는 이로부터 유도된 단풍잎형 엽신 단일 열성 핵유전자를 갖는 오이 식물을 제공하며, 또한, 단풍잎형 오이 식물의 육종, 분자동정 및 응용 방법을 제공한다.

Description

단풍잎형 오이 식물
본 발명은 식물 잎 모양 및 이의 육종방법 분야에 관한 것으로서, 구체적으로 단풍잎형 오이 식물, 및 이의 육종방법과 동정방법에 관한 것이다.
오이(Cucumis satius L.)는 큰 엽신의 덩굴식물로서, 광합성 면적인 엽면적의 크기, 분포 및 그 광합성 효능은 오이의 재배, 특히 고위도 지역의 역계절 시설 재배에서 생산량, 열매 품질, 내병성 등에 대해 직접적인 영향을 준다. 엽신은 식물 광합성 작용의 물질적 기초이며, 이와 동시에 엽신은 생태계에서 기체, 물 및 에너지 교환의 중요한 플랫폼이다. 엽면적지수(leaf area index, LAI)는 엽면적계수라고도 불리우며, 작물 집단 크기를 반영하는 동적 지표로서, 일정한 범위내에서 작물의 생산량은 엽면적지수의 증대에 따라 증가한다. 엽면적지수가 일정한 한도에 도달한 후, 밭은 가리워지게 되며, 일광 조사가 부족하여 광합성 효율이 저하되어 생산량이 오히려 감소된다.
생태학에서 엽면적지수는 식물 엽면의 수량, 캐노피(canopy) 구조의 변화, 식물 군락의 생명 활력 및 이의 환경효과를 반영하기 위한 생태계의 중요한 구조 매개변수이며, 식물 캐노피 표면 물질과 에너지 교환의 묘사를 위하여 구조화된 정량적 정보를 제공하며, 생태계의 탄소 누적, 식생 생산성(vegetation productivity)과 토양, 식물, 대기간의 상호작용의 에너지 균형, 식생 원격탐사 등 면에서 중요한 작용을 한다. 일정한 범위내에서, 엽면적이 증대됨에 따라, 엽면적지수가 증가하고, 광합성 생산율이 높아지며, 생산량도 증가하지만; 엽면적이 지나치게 큰 경우, 캐노피 구조의 불합리성을 초래할 수 있고, 중기 및 후기 집단의 엽신들은 서로 빛을 가려 광합성 생산율이 낮아지고, 무효 호흡과 물 소모량이 증가되며, 싱크-소오스가 조화롭지 못하여 최종적으로 생산량을 저하시킨다(Xianming JIANG, 1982; Chengyu WANG 등, 2012; Yongping ZHANG 등, 2013). 오이 열매의 광택도, 빛깔 등 상품성도 일광 조사 조건의 영향을 비교적 크게 받는다. 열매가 빛을 받는 조건이 우수하면 광택을 나타내고 빛깔이 신선하다.
야생오이(Cucumis sativus Var.hardwickii)의 엽신은 비교적 작고, 인위적인 순화과정을 거친 후의 재배오이(Cucumis sativus Var.sativus)의 엽면적은 2~3 배 확대되었다. 엽신의 크기와 모양은 엽면적지수를 구성하는 중요한 요소이며, 적합한 엽면적지수는 오이 식물체의 이상적인 초형을 확정하고, 집단의 광 에너지와 영양분의 이용률이 높은 오이 품종을 육성하는데 중요한 의의가 있다.
오이의 엽면적은 다수 유전자에 의해 제어되는 양적형질이다(Peng WU 등. 중국야채. 2009. (24):43~46; Tingting SHI 등. 농업생물기술학보. 2014, 22(4):415~421). 양적형질은 환경 조건의 영향을 쉽게 받으며, 전통적인 육종방법에 의해 단순히 엽신의 크기를 변화하여 오이 집단 구조를 해결하는 방법은 매우 어려운 것이며, 현재까지 모두 뚜렷한 진보를 얻지 못한 실정이다.
일반적인 오이 엽신 모양은 주로 손바닥 모양의 오각형, 하트 모양의 오각형, 원에 가까운 모양, 긴 오각형, 긴 삼각형, 하트 모양의 삼각형과 같은 6 가지 유형이 있다(Xixiang LI 등. 작물 품종 자원. 1999.(3):27~29).
현재까지 발견된 오이 엽신 모양을 제어하는 유전자는 주로 뭉툭한 잎끝(bla)(Robinson, 1987a), 하트 모양의 잎-1(cor-1)(Gornitskaya， 1967), 하트 모양의 잎-2(cor-2)(Robinson, 1987c), 주름진 잎(cr)(Odland and Groff, 1963a), 갈래잎(dvl)(den Nijs and Mackiewicz, 1980), 은행잎(gi)(John and Wilson, 1952), 작은 잎(ll)(Goode et al., 1980; Wehner et al., 1987), 우산 모양의 잎(ul)(den Nijs and de Ponti, 1983)과 같은 8 가지가 있다(Cucurbit Genetics Cooperative, Gene List 2015 for Cucumber에서 발표한 오이 유전자 목록 및 형질의 묘사에 근거).
그중, 갈래잎 1(dvl-1) 돌연변이체는 에틸렌이민으로 폴란드 오이 품종을 돌연변이시켜 얻은 것이다. 이의 본엽의 전부 또는 일부가 갈라져 엽신은 2~5 편의 작은 엽신으로 되고, 작은 엽신의 수량은 식물체의 성장세에 의해 결정된다. 최적의 성장 조건에서 돌연변이체의 일부 엽신은 정상적인 형태를 나타내지만, 대다수 식물체는 첫번째 본엽에 의하여 식별될 수 있다. 수꽃과 암꽃의 화관에 모두 절개부가 있고, 5~7 편의 분리된 꽃잎을 나타낸다. 갈래잎 2(dvl-2) 돌연변이체는 아지리딘으로 오이 품종 Borszczagowski 를 돌연변이시켜 얻은 것이며, 두번째 본엽 이후부터 엽신은 갈래잎 모양을 나타내며, 화관은 이판(choripetalous)된다.
현재까지 단풍잎형 오이 식물 및 이에 관련된 보도는 발견되지 않았다.
종래의 손바닥 모양의 오각형, 하트 모양의 오각형, 원에 가까운 모양, 긴 오각형, 긴 삼각형, 하트 모양의 삼각형과 같은 6 가지 일반 잎형 오이의 기초상에서, 본 발명은 단풍잎형 오이 식물 및 이의 육종방법과 분자동정방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은 TA511(중국 탕산 가을 오이류), HA442(가시가 적은 백녹색 중국 화남형 오이류)와 SG321(매끈하고 가시가 없는 유럽 신선한 식용 오이류)과 같은 3 가지 오이 자식계통을 모재로 하고, 통상적인 복합 교잡을 거쳐, 후대 분리집단에서 가시가 없는 백녹색의 신선한 식용 오이 형질의 재조합 식물체가 나타난 후, 다시 3 대의 자식(selfing)과 연속 선택을 거쳐, 2012 년 봄에 베이징시 하이뎬구(Haidian District, Beijing) 실험 온실에서 재배하였다. 본 발명자들은 자식 후대의 재배 집단에서 한포기의 자연돌연변이된 단풍잎형 엽신 돌연변이 식물체, 즉, 단풍잎형 엽신의 오이 식물을 발견하였다. 이의 특성은 주요하게 첫번째 본엽 시기부터 갈래잎의 특징을 나타냈으며, 두번째 본엽부터 명확한 단풍잎형 엽신 특징을 나타내는 것으로 표현되었다. 단풍잎형 갈래잎의 오이 식물 엽신은 손바닥 모양의 오각형 갈래잎이며, 초기 갓 펼쳐진 어린잎의 모양은 오각형 단풍잎과 유사하며; 성숙된 엽신의 중앙 열편은 긴 삼각형 모양의 난형을 나타내며, 중앙 열편은 측면의 열편보다 길다. 발명자들은 해당 오이 자식계통을 CC81221 로 명명하였다.
유전 분석을 통해, 오이 단풍잎형 갈래잎의 형질은 단일 열성 핵유전자에 의해 제어되는 유전 법칙에 부합된다. 즉, 본 발명에 따른 단풍잎형 엽신의 갈래잎 형질은 단일 열성 핵유전자에 의해 제어된다. 본 발명자들은 단풍잎형 엽신의 갈래잎을 제어하는 유전자를 dvl-3 으로 명명하였다.
dvl, dvl-2 와 달리, 본 발명에 따른 단풍잎형 갈래잎 유전자 dvl-3을 갖는 오이 식물에서 잎 모양을 제외한 꽃잎, 식물체 높이, 잎맥 및 기타 영양생장, 생식생장 등은 모두 일반 식물체와 동일하다.
본 발명은
1) 단풍잎형 엽신 단일 열성 핵유전자를 갖는 오이 돌연변이체 식물로서, 기탁번호가 CGMCC No.11285 인 오이속 식물 CC81221 이며; 또는
2) CC81221 로부터 유도된 단풍잎형 엽신 단일 열성 핵유전자를 갖는 오이 식물이며;
상기 단풍잎형 엽신 단일 열성 핵유전자는 오이 게놈의 2 번 염색체의 16383700-16385719 염기 위치의 유전자이며, 일반 잎형 오이의 해당 유전자와 비교시 859번째 염기 A 가 T 로 돌연변이된, 단풍잎형 오이 식물을 제공한다.
그중, 상기 단풍잎형은 엽신이 손바닥 모양의 오각형 갈래잎을 나타내며, 그중 중앙 열편은 긴 삼각형 모양의 난형을 나타내고, 중앙 열편은 측면의 열편보다 확연하게 길며; 측면의 열편은 삼각형 모양의 난형으로서, 상대적으로 짧고, 얕게 갈라졌으며; 엽신의 기저부는 하트 모양 또는 하트 모양에 가까운 모양을 나타내는 것을 의미한다. 유전적 배경이 상이한 경우, 잎의 갈라지는 정도는 얕거나 깊게 갈라지는 다른 변화를 나타낼 수 있으며, 중앙 열편이 확연히 길게 나타나거나, 또는 열편의 넓이가 변화하거나, 또는 잎의 기저부에 작은 돌기가 나타나거나, 또는 잎의 가장자리가 톱니 모양, 파도 모양 등을 나타낼 수 있으며, 이와 같은 유형의 단풍잎형 엽신의 기본 특성의 기초상에서 발생하는 수식적 또는 양적 변화는 모두 본 발명의 범위내에 속한다. 구체적으로 도 1 을 참조할 수 있으며, 그중 좌측 윗부분은 일반 잎이고, 나머지는 유전적 배경이 상이한 경우의 단풍잎형 엽신이다.
여기서, 상기 유도는 통상적인 육종, 생명공학 육종, 무성생식 또는 이들의 조합으로 얻은 새로운 단풍잎형 오이 식물이다.
여기서, 상기 통상적인 육종은 자식, 교잡, 여교잡 등 흔히 사용하는 육종 방식 및 이들의 조합을 포함한다.
여기서, 상기 생명공학 육종은 유전자변형(transgenic breeding) 육종, 반수체/복배수체 육종, 분자표지 육종 등 알려진 생명공학 육종 방식 및 이들의 조합을 포함한다.
또한, 본 발명은 관광원예에 있어서, 상기 단풍잎형 오이 식물의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 단풍잎형 오이 식물의 품종 동정에 있어서, 단풍잎형의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 단풍잎형 오이 식물의 일부를 제공한다. 상기 일부는 식물 세포, 종자, 꽃밥, 화분, 배주, 잎, 배아, 뿌리, 근단, 꽃, 열매, 줄기, 슈트(shoot), 접순, 원형질체 또는 유상조직 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 오이 게놈 2 번 염색체의 16383700-16385719 염기 위치의 유전자로서, 일반 잎형 오이의 해당 유전자와 비교시 859 번째 염기 A 가 T 로 돌연변이된, 단풍잎형 엽신 단일 열성 핵유전자를 제공한다. 해당 유전자를 dvl-3 으로 명명하였다.
또한, 본 발명은 단풍잎형 엽신 단일 열성 핵유전자를 포함하는 벡터 및 상기 벡터의 숙주를 제공한다.
또한, 본 발명은 CC81221 또는 이로부터 유도된 단풍잎형 엽신 단일 열성 핵유전자를 갖는 오이 식물을 단풍잎형의 유전적 기원으로 하여, 단풍잎형 엽신을 갖는 오이 품종을 육종하는, 단풍잎형 오이 식물 품종의 육종방법을 제공한다.
상기 육종은 자식 분리, 교잡, 여교잡, 순환선발, 반수체, 조직배양, 돌연변이 또는 분자표지 보조 선택 등 당업자들에게 잘 알려진 기술 또는 이들의 조합으로 육종하는 것이다.
상기 육종에서 교잡 기술을 사용하여 자식계통을 육종하는 경우, 그 구체적인 단계는 하기와 같다: 단풍잎형 오이 식물과 오이 품종 A 를 교잡시키고, 단풍잎형 유전자를 갖는 식물체를 후대 연속 선택 및 자식시켜, 기타 농업 형질이 동형접합되어 더 이상 분리되지 않을 때까지 계보 육종을 하여, 단풍잎형 엽신의 식물체 계통을 선택하여 단풍잎형 오이 식물 자식계통을 얻었다. 상기 기타 농업 형질은 갈래잎 외의 농업 형질로서, 예로, 식물체 높이, 엽신의 색 등 통상적인 농업 형질이다.
상기 육종에서 여교잡 기술을 사용하여 자식계통을 육종하는 경우, 그 구체적인 단계는 하기와 같다: 단풍잎형 오이 식물과 오이 품종B를 교잡시키고, 오이 품종 B 를 반복친으로 하여 단풍잎형 유전자를 갖는 식물체와 연속적인 여교잡을 진행하여, 잎 모양 외의 기타 형질이 더 이상 분리되지 않을 때, 1 대 자식하여, 기타 농업 형질이 오이 품종 B 와 유사하나 엽신이 단풍잎형인 식물체를 선택하여, 단풍잎형 오이 식물 자식계통을 얻었다. 상기 단풍잎형 유전자를 갖는 식물체를 선택하는 방법은:
I. 분자표지 방식으로 단풍잎형 엽신 단일 열성 핵유전자를 갖는 식물체를 선택, 및/또는
II. 자식 후대에서 분리한 단풍잎형 표현형의 식물체를 선택하는 것이다.
또한, 단풍잎형 오이 식물 자식계통을 육종하는 방법은 단풍잎형 품종의 자식 분리 육종, 반수체/복배수체 육종, 조직배양, 돌연변이 육종 등에 의해 진행할 수 있다.
단풍잎형 오이 식물 교잡종의 배합 방법은: 단풍잎형 오이 식물에서 2가지 자식계통을 선택하여 교잡시켜 단풍잎형 오이 식물 교잡종을 얻는 것이다.
또한, 본 발명은 특이적 프라이머 쌍으로 동정 대기중인 식물에 대하여 PCR 증폭 및 시퀀싱을 진행하여, 시퀀싱 결과 TT 동형접합 피크 다이어그램(peak diagram) 또는 AT 이형접합 피크 다이어그램를 나타내는 것이 단풍잎형 엽신 단일 열성 핵유전자를 갖는 오이 식물인 것을 구체적인 단계로 하며; 상기 특이적 프라이머 쌍의 서열은:
포워드 프라이머(forward primer): GTCCAGGTTCTCAATCGAGCT, 서열번호 1 로 표시되며;
리버스 프라이머(reverse primer): GCCACGATATTGAGAGGTTCT, 서열번호 2 로 표시되는, 단풍잎형 엽신 단일 열성 핵유전자를 갖는 오이 식물 또는 그 일부의 분자동정방법을 제공한다.
상기 PCR 증폭의 반응계는:
Figure pct00001
총 반응계는 25μl이다.
상기 PCR 증폭의 반응 조건은:
94℃에서 2min 동안 사전 변성; 94℃에서 30sec 동안 변성, 56℃에서 45sec 동안 어닐링, 72℃에서 2.0min 동안 신장, 순환 30회; 72℃에서 15min 동안 신장, 4℃에서 종료.
또한, 본 발명은
포워드 프라이머: GTCCAGGTTCTCAATCGAGCT, 서열번호 1 로 표시되며;
리버스 프라이머: GCCACGATATTGAGAGGTTCT, 서열번호 1 로 표시되는, 단풍잎형 엽신 단일 열성 핵유전자 오이 식물 또는 그 일부를 동정하기 위한 프라이머 쌍을 제공한다.
본 발명은 하기와 같은 우점이 있다:
(1) 본 발명에서 제공하는 단풍잎형 엽신의 오이 식물은 오이 품종의 자원을 다양화시키고, 오이의 생태 육종에 양호한 유전자원을 제공하였다.
(2) 본 발명에 따른 단풍잎형 엽신의 캐노피 공극율이 높아 하부 엽신에 대한 차폐가 적고, 상응하게 집단의 재배 밀도, 엽면적지수와 광합성 효율도 모두 크게 증가되어, 오이 생산에서 보편적으로 존재하나 조절하기 어려운 재배 밀도와 집단의 광합성 효율, 영양생장과 생식생장 등의 모순을 해결하였다.
(3) 본 발명에 따른 단풍잎형 엽신 식물의 집단의 통풍성과 투광성이 강하여, 병해의 발생을 감소하였으며, 상응하게 농약의 사용을 감소하여 인간의 신체건강과 환경 보호에 유익함과 동시에 생산 원가를 감소하였다.
(4) 본 발명에 따른 단풍잎형 엽신은 단일 열성 핵유전자에 의해 제어되는 질적형질로서, 오이 종자의 순도 동정과 품종 진실성 동정에 대하여 신속하고 효과적인 마커를 제공하였다.
(5) 본 발명에 따른 단풍잎형 엽신의 오이 식물은 참신하고 독특하며, 관광농업에 가치있는 제품을 제공하였다.
(6) 본 발명은 해당 유전자의 클론, 나아가 관련 오이류의 초형 육종에 우수한 물질적 기초를 제공하였다.
도 1은 본 발명에 따른 단풍잎형 엽신의 사진이며, 그중 좌측 윗부분은 일반 잎이고, 나머지는 유전적 배경이 상이한 경우의 단풍잎형 엽신이다.
도 2는 실시예 1 에 따른 CC81221 단풍잎형 오이 식물의 밭에서의 사진이다.
도 3은 실시예 1 에 따른 CC81221 단풍잎형 오이 식물의 엽신과 일반 오이 엽신의 비교 사진이며, 그중 좌측은 일반 오이의 엽신이고, 우측은 CC81221 단풍잎형 오이 식물의 엽신이다.
도 4는 실시예 2 에 따른 CC81413 단풍잎형 오이 식물의 밭에서의 사진이다.
도 5는 실시예 2 에 따른 CC81413 단풍잎형 오이 식물의 엽신과 일반 오이 엽신의 비교 사진이며, 그중 좌측은 일반 오이의 엽신이고, 우측은 CC81413 단풍잎형 오이 식물의 엽신이다.
도 6은 실시예 2 에 따른 CC81423 단풍잎형 오이 식물의 밭에서의 사진이다.
도 7은 실시예 2 에 따른 CC81423 단풍잎형 오이 식물의 엽신과 일반 오이 엽신의 비교 사진이며, 그중 좌측은 일반 오이의 엽신이고, 우측은 CC81423 단풍잎형 오이 식물의 엽신이다.
도 8은 실시예 2 에 따른 CC81433 단풍잎형 오이 식물의 밭에서의 사진이다.
도 9는 실시예 2 에 따른 CC81433 단풍잎형 오이 식물의 엽신과 일반 오이 엽신의 비교 사진이며, 그중 좌측은 일반 오이의 엽신이고, 우측은 CC81433 단풍잎형 오이 식물의 엽신이다.
도 10은 실시예 3 에 따른 MCC81411 단풍잎형 오이 식물의 밭에서의 사진이다.
도 11은 실시예 3 에 따른 MCC81411 단풍잎형 오이 식물의 엽신과 일반 오이 엽신의 비교 사진이며, 그중 좌측은 일반 오이의 엽신이고, 우측은 MCC81411 단풍잎형 오이 식물의 엽신이다.
도 12는 실시예 4 에 따른 단풍잎형 Jintong 식물의 밭에서의 사진이다.
도 13은 실시예 4 에 따른 단풍잎형 Jintong 엽신과 일반 오이 엽신의 비교 사진이며, 그중 좌측은 일반 오이의 엽신이고, 우측은 단풍잎형 Jintong의 엽신이다.
도 14는 실시예 5 에 따른 SNP 로 마킹된 부본 시퀀싱 결과의 피크 다이어그램이다.
도 15는 실시예 5 에 따른 SNP 로 마킹된 모본 시퀀싱 결과의 피크 다이어그램이다.
도 16은 실시예 5 에 따른 SNP 로 마킹된 F1 대 시퀀싱 결과의 피크 다이어그램이다.
이하 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것이며, 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.
실시예 1 단풍잎형 오이 식물 돌연변이체 CC81221 의 유전 분석 시험
(I) 시험 재료
발명자들은 2012 년 봄에 베이징시 하이뎬구(Haidian District, Beijing) Shangzhuang 실험온실에서 재배한, 재래종인 탕산 가을 오이, Baiyesan 및 유럽 신선한 식용류 오이 품종을 다중 복합 교잡한 후대 자식계통 재료에서 한포기의 단풍잎형 돌연변이체를 발견하였으며, 이를 CC81221 로 명명하였고, 이의 사진은 도 2, 도 3 과 같다.
상기 오이속 식물 (Cucumis satius L.) CC81221은 2015년 10월 16일자로 중국 미생물 균종 기탁 관리위원회 일반 미생물 센터에 기탁하였으며(기탁주소: Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, 3th, No. 1 Courtyard, Beichen West Road, Chaoyang District, Beijing, China), 기탁번호는: CGMCC No.11285이다.
Beijing Beinong Sanyi Cucumber Ecological Breeding Science and Technology Center 에서 제공한 몇가지 일반 잎형의 오이를 대조 품종으로 하였으며, 구체적으로 하기와 같다:
(1) 화북형(가시가 밀집한 종류, 손바닥 모양의 오각형 잎): M111
(2) 화남형(가시가 적은 종류, 손바닥 모양의 오각형 잎)의 2개 자식계통:
(a) 짧고 굵은 탕산 가을 오이류 자식계통 TA511
(b) 중단길이 드라이랜드 오이(dryland cucumber) 자식계통 HA411
(3) 유럽 신선한 식용류(가시가 없고 하트 모양의 오각형)의 2개 자식계통:
(a) 녹색 오이류 자식계통 SL311
(b) 흰색 오이류 자식계통 SL322
(II) 시험 설계
50 구 육묘상자(Seedling tray)로 육묘하여 이식하며, F1 대, BC1 대는 각각 50 알씩 파종하였으며; F2대는 100알 파종하였다. 배합(combination) 유형은 하기와 같다:
(1) 단풍잎형: 자식
(2) 단풍잎형 × 일반 잎 →F1→F2
F1 × 단풍잎형
(3) 일반 잎 × 단풍잎형 →F1→F2
F1 × 단풍잎형
(III) 시험방법
(1) 2012 년 5 월 베이징시 하이뎬구(Haidian District, Beijing) Shangzhuang 실험 온실에서 번호가 CC81221 인 단풍잎형 엽신 재료를 모재중 하나로 하고, 각각 일반 잎의 상이한 유형의 오이 자식계통을 다른 하나의 모재로 하여 정역교잡 교잡종을 설정하여(단풍잎형을 모본으로 하여 일반 잎 자식계통과 교잡하는 것을 정교잡으로 설정하고, 단풍잎형을 부본으로 하여 일반 잎 자식계통과 교잡하는 것을 여교잡으로 설정함), 각각 수확하여 F1 대를 얻었다.
(2) 각종 교잡 조합의 F1 대를 재배하고, F1 대 식물체의 잎 모양을 관측하였으며; 각 교잡 조합에서 절반의 F1 대 식물체를 선택하여 자식시키고, 각각 수확하여 F2대를 얻었으며; 나머지 절반의 F1 대 식물체와 CC81221 을 검정교잡하여 BC1 대 종자를 수확하였다.
(3) F2 대와 BC1 대를 각각 재배하여, 유묘기에서부터 잎 모양의 분리 데이터를 관측하고 통계하였다.
결과(표 1 과 표 2 를 참조), 단풍잎형과 일반 잎형을 교잡하여 얻은 F1대 식물체의 잎 모양은 전부 일반 잎 유형이고; F2 대에서 일반 잎과 단풍잎형 잎 모양의 분리 비율(표1을 참조)은 모두 일반 잎:단풍잎=3:1이다. 검정교잡 BC1 대에서 일반 잎과 단풍잎형 잎 모양의 비율은 1:1이다. 상술한 비율은 단풍잎형 잎 모양의 형질은 한쌍의 열성 유전자의 유전 법칙에 부합됨을 나타내며, 단풍잎형 잎 모양의 형질은 단일 열성 유전자에 의해 제어되는 것으로서, 질적형질에 속하고, 이의 형질 유전은 안정적이며, 환경조건의 영향을 받지 않는다는 것을 설명한다. 유묘기 잎 모양의 형질 분리 사진은 도2 와 같다.
[표1] F2대 분리 시험 결과
Figure pct00002
[표2] 단풍잎형 엽신 형질 검정교배 시험 결과
Figure pct00003
표 1과 표 2의 데이터를 XC 2 테스트한 결과, XC 2<X2 0.05.1=3.84, P>0.05.
실시예 2 교잡방법에 의한 단풍잎형을 갖는 오이 식물 품종의 육성
단풍잎형 엽신을 갖는 오이 식물 CC81221 또는 이로부터 유도된 단풍잎형 엽신을 갖는 오이 자식계통, F1 교잡종 또는 이형접합체를 단풍잎형의 도너(donor)로 이용하여 단풍잎형 엽신 오이 식물을 육종하였다. 따라서, 본 발명에 따른 방법으로 육종한 그 어떠한 단풍잎형 엽신 오이 식물 및 번호 CC81221 또는 이로부터 유도된 단풍잎형 오이 식물은 모두 본 발명의 범위에 속한다.
(1) 2012 년 5 월 25 일, 베이징 하이뎬구(Haidian District, Beijing)의 실험하우스에서 시험을 진행하였고, 실험하우스는 방충망으로 봉쇄하고 격리하였으며, 단풍잎형 엽신 오이 재료 CC81221 를 모재 중 하나로 하고, 각각 Beijing Beinong Sanyi Cucumber Ecological Breeding Science and Technology Center에서 제공한 3 가지 상이한 유형의 일반 엽신 자식계통: 가시가 밀집한 오이 자식계통 M1141(손바닥 모양의 오각형 잎), 화남형 오이 자식계통 HA1151(손바닥 모양의 오각형 잎)과 매끈하고 가시가 없는 신선한 식용류 자식계통SG1131(하트 모양의 오각형 잎)을 다른 하나의 모재로 하여, 각각 인공수분 방식을 통해 교잡을 진행하였으며, 각각 수확하여 F1 대 종자를 얻었다.
(2) 2012 년 9 월 15 일, 실험하우스에서 F1 대를 각각 재배하였고, 자식시켜 각각 수확하여 F2 대 종자를 얻었다.
(3) 2013 년 1 월 15 일, 실험하우스에서 F2 대를 각각 재배하였고, 표현형의 분리 상황에 따라, 각각 농업 형질이 우수한 단풍잎형 식물체 또는 농업 형질이 우수한 정상 잎의 식물체를 선택하여 자식시키며; 단일 식물체로 수확하여 F3대 종자를 얻었다.
(4) 2013 년 5 월 25 일, 실험하우스에서 F3 대를 각각 재배하였고, 단풍잎형 엽신의 식물체를 자식시켜 얻은 F3 대 집단에서 목표로 하는 농업 형질에 따라서만 식물체를 선택하여 자식시키며; 단풍잎형 표지 형질이 더 이상 분리되지 않는 식물체를 도태하였으며; 단풍잎형 엽신을 갖는 식물체가 분리되는 집단에 대하여, (3)단계를 반복하였으며; 각각 단일 식물체로 수확하여 F4 대 종자를 얻었다.
(5) 2013 년 9 월 25 일, 계속하여 실험하우스에서 F4 대 종자를 각각 재배하였고,
(4)단계를 반복하였으며, 각각 단일 식물체로 수확하여 F5 대 종자를 얻었다.
(6) 2014 년 1 월 15 일, 계속하여 실험하우스에서 F5 대 종자를 각각 재배하였고,
(4)단계를 반복하였으며, 각각 단일 식물체로 수확하여 F6 대 종자를 얻었다.
(7) 2014 년 5 월 내지 2014 년 9 월, F6 대와 F7 대를 각각 재배하였고, (4)단계를 반복하여, 각각 동형접합적 및 안정적인 단풍잎형 갈래잎의 오이 자식계통인:
가시가 밀집한 단풍잎형 자식계통 CC81413(사진은 도4, 도5와 같음); 화남형류의 단풍잎형 자식계통 CC81423(사진은 도 6, 도 7과 같음)과 유럽의 매끈하고 가시가 없는 단풍잎형 자식계통 CC81433(사진은 도8, 도9와 같음) 등을 얻었다.
실시예 3 여교잡 방법을 이용한 단풍잎형 엽신의 오이 품종 육종 시험
여교잡 방법을 본 발명에 적용하는 주요 목적은 초기 품종의 잎 모양을 변화시키거나 대체시키는 동시에, 최초 품종의 기타 모든 이상적인 유전학적, 및 이상적인 생리학적과 형태학적 구성을 기본적으로 보류하기 위한 것이다.
단풍잎형 엽신은 단일 열성 핵유전자에 의해 제어되는 형질이며, 이와 같은 경우 여교잡 형질전환 단계에서 반드시 후대 검정을 도입해야 하는 바, 즉, 어느 여교잡 식물이 단풍잎형 엽신을 코딩하는 열성 유전자를 보유하는지를 확정하기 위하여 각 여교잡 세대와 대응되는 자식 후대에 대하여 표면형 테스트를 진행하여야 한다.
SSR, RFLP, SNP 또는 AFLP 표지 등과 같은 분자표지를 사용하여, 상기 여교잡 과정을 간소화 및 가속화할 수 있다.
(1) 2012 년 5 월 25 일, 베이징 하이뎬구(Haidian District, Beijing)의 실험하우스에서 단풍잎형 오이 식물 CC81221 을 일회친으로 하고; Beijing Beinong Sanyi Cucumber Ecological Breeding Science and Technology Center에서 제공한 가시가 밀집한 오이 자식계통 M1142(손바닥 모양의 오각형 잎)를 반복친으로 하여 교잡을 진행하였으며, 수확하여 F1 대 종자를 얻었다.
(2) 2012 년 9 월 15 일, 실험하우스에서 F1 대 및 상기 (1)단계의 반복친을 각각 재배하였고, 반복친과 여교잡시켰으며, 수확하여 BC1F1 대 종자를 얻었다.
(3) 2013 년 1 월 15 일, 실험하우스에서 BC1F1 대와 반복친을 재배하였고, 농업 형질이 우수한 단일 식물체를 선택하여 자식시켰으며, 선택한 단일 식물체를 부본으로 하여 반복친과 여교잡시키고, 번호에 대응되게 각각 단일 식물체로 수확하여 BC1F2 대 종자와 BC2F1 대 종자를 얻었다.
(4) 2013 년 5 월 25 일, 실험하우스에서 BC1F2 대 종자와 BC2F1 대 종자를 각각 재배하였고, 단풍잎형 식물체를 분리한 BC1F2 대에 대응하는 번호를 선택하여, 계속해서 식물체를 선택하여 자식시키며; 선택한 단일 식물체를 부본으로 하여 반복친과 여교잡시키고, 번호에 대응되게 단일 식물체로 수확하여, 각각 BC2F2 대 종자와 BC3F1 대 종자를 얻었다.
(5) 2013 년 9 월 25 일 내지 2015 년 1 월, 실험하우스에서 (4)단계를 2~8 대 반복하여, BCnF1(자모 n 으로 대수를 표시함)대에서 잎 모양외의 기타 형질이 더 이상 분리되지 않을 때, 1 회 자식시켜, 단풍잎형 엽신의 오이 자식계통 MCC81411(밭에서의 사진은 도10 을 참조, 엽신과 일반 오이 엽신의 비교 사진은 도11 을 참조, 그중 좌측은 일반 오이잎이고, 우측은 MCC81411 엽신임)을 얻었다.
실시예 4 부본 및 모본이 모두 단풍잎형인 자식계통과 단풍잎형 오이 식물을 배합한 교잡종 시험
본 발명에 따른 방법으로 육성한 교잡종은 본 발명 외의 교잡종에 비하여 두개의 단풍잎형 엽신을 갖는 오이 모재를 이용하여 교잡하는 것을 특점으로 한다. 본 시험은 단풍잎형 엽신을 갖는 오이 식물의 교잡종자를 상업화 생산하는 것을 목적으로 한다. 구체적으로 하기 내용을 포함한다:
(1) 2012 년 9 월 내지 2015 년 1 월, 베이징 하이뎬구(Haidian District, Beijing)의 실험하우스에서, 단풍잎형 엽신 오이 식물 CC81221 을 일회친으로 이용하고, D2-4-1(Jintong(품종권 번호: CNA 20100699.0)의 모본)과 D2-4-31(Jintong(품종권 번호: CNA 20100699.0)의 부본)을 각각 단풍잎형의 수용체로 하여, 상기 실시예 3 의 여교잡 형질전환 방법으로 단풍잎형 엽신을 갖는 오이 자식계통 D2-4-1-CC3(단풍잎형 Jintong 오이 모본)과 D2-4-31-CC1(단풍잎형 Jintong 오이 부본)을 각각 육종하였다.
(2) 2015 년 2 월 5 일에 파종하여 육묘하였고, 3 월 5 일에 667 평방미터 당 4000 포기를 기준으로 이식하였으며, 부본과 모본의 비율은 1:4 이다. 교잡은 인공수분 방식을 사용하였으며, 7 월 1 일에 단풍잎형 Jintong 오이 교잡종을 수확하였다.
(3) 2015 년 7 월 15 일에 Jintong과 단풍잎형 Jintong을 각각 500 알씩 파종하고, 8 월 1 일에 이식하였다.
(4) 표현형에 의한 교잡종의 순도 테스트: 원 Jintong 과 잎 모양 및 오이 모양, 오이색, 자성, 조숙성, 내병성, 생산량 등을 비교하였다. 10 월 15 일에 테스트를 완성하였으며, 결과 100%가 단풍잎형 엽신 Jintong 오이이고, 사진은 도 12, 도 13 과 같다.
실시예 5 SNP 분자표지를 이용한 단풍잎형 엽신 유전자에 대한 보조 선택 시험
(I) 시험 재료:
부본: M111(Beijing Beinong Sanyi Cucumber Ecological Breeding Science and Technology Center에서 제공): 일반 잎(우성 동형접합)
모본: CC81221(기탁번호: CGMCC No.11285), 단풍잎형(열성 동형접합).
F1: 일반 잎(이형접합)
(II) 시험방법:
1. 엽신 DNA의 추출
Aidlab 사의 식물 DNA 신속 추출 키트로 이의 DNA 를 추출하였으며, 조작 절차는 키트를 참조하여 진행하였다.
2. 유전자 단편 클론
SNP 점 돌연변이에 사용된 프라이머 서열은 하기와 같다:
포워드 프라이머: GTCCAGGTTCTCAATCGAGCT, 서열번호 1 로 표시되며;
리버스 프라이머: GCCACGATATTGAGAGGTTCT, 서열번호 1 로 표시된다.
상기 PCR 증폭의 반응계는:
Figure pct00004
총 반응계는 25μl이다.
상기 PCR 증폭의 반응 조건은:
94℃에서 2min 동안 사전 변성; 94℃에서 30sec 동안 변성, 56℃에서 45sec 동안 어닐링, 72℃에서 2.0min 동안 신장, 순환 30 회; 72℃에서 15min 동안 신장, 4℃에서 종료.
3. PCR 생성물의 시퀀싱
증폭 생성물에 대해 시퀀싱을 진행한 결과는 도 14(부본), 도 15(모본), 도16(F1)에서 나타낸 바와 같으며, 해당 SNP 분자표지는 단풍잎형 엽신 단일 열성 핵유전자를 갖는 오이 식물을 표지할 수 있음을 나타낸다.
상술한 바와 같이 일반적인 설명 및 구체적인 실시형태를 통해 본 발명을 상세히 설명하였으나, 본 발명의 기초상에서 보정과 개선을 진행할 수 있음은 당업자에게 있어서 자명한 것이다. 따라서, 본 발명의 요지를 벗어나지 않는 기초상에서 진행한 보정 또는 개선은 모두 본 발명의 보호범위에 속한다.
산업상 이용 가능성
본 발명은 교잡 육종 과정에서 발견한 단풍잎형 갈래잎을 갖는 돌연변이체 오이 식물 CC81221 또는 이로부터 유도된 단풍잎형 엽신 단일 열성 핵유전자를 갖는 오이 식물인 단풍잎형 오이 식물에 관한 것이다. 본 발명은 교잡 육종 과정에서 발견한 단풍잎형 갈래잎을 갖는 오이 엽신 돌연변이체 식물을 제공한다. 본 발명은 이들 식물의 유도체 또는 식물체 일부를 제공하며; 또한, 본 발명은 이들 식물의 응용방법을 제공한다. 본 발명은 이와 같은 단풍잎형 엽신을 갖는 유전 특성은 단일 열성 핵유전자에 의해 제어되는 질적형질이며, 해당 특성의 형태 특징과 분자표지를 개시한데 있어서 중요한 의의가 있다. 본 발명을 이용하면 오이의 신규 품종을 육종하는 과정에서, 엽면적과 같은 다수 유전자에 의해 제어되는 양적형질에 비하여 보다 간편하게 전통적인 육종방법으로 단풍잎형 엽신의 오이 식물 특성을 각종 품종에 인입하여, 오이 생산에서 보편적으로 존재하나 조절하기 어려운 재배 밀도와 집단의 광합성 효율, 영양생장과 생식생장 등과 같은 집단의 각종 생육조절 모순을 효과적으로 해결할 수 있다. 또한, 집단의 통풍성과 투광성을 증가하여, 상품성과 내병성, 생산량 등을 향상시키는 목적을 달성할 수 있다. 또한, 본 발명은 정교하고 감상 가치가 높은 오이 품종을 육종할 수 있는 신규 형질을 제공한다.
염기서열
<110> Zhuhu Cai, Wuzi Cui
<120> Maple-leaf-type cucumber plant
<130> KHP183110178.0
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
gtccaggttc tcaatcgagc t 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
gccacgatat tgagaggttc t 21
SEQUENCE LISTING <110> CAI Zhuhu, CUI Wuzi <120> MAPLE-LEAF-TYPE CUCUMBER PLANT <130> KHP183110176.8 <160> 2 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 1 gtccaggttc tcaatcgagc t 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 2 gccacgatat tgagaggttc t 21

Claims (9)

1) 단풍잎형 엽신 단일 열성 핵유전자를 갖는 오이 돌연변이체 식물로서, 기탁번호가 CGMCC No.11285 인 오이속 식물 CC81221 이며; 또는
2) CC81221 로부터 유도된 단풍잎형 엽신 단일 열성 핵유전자를 갖는 오이 식물이며;
상기 단풍잎형 엽신 단일 열성 핵유전자는 오이 게놈의 2 번 염색체의 16383700-16385719 염기 위치의 유전자이며, 일반 잎형 오이의 해당 유전자와 비교시 859 번째 염기 A 가 T 로 돌연변이된 것을 특징으로 하는, 단풍잎형 오이 식물.
제 1 항에 있어서, 식물 세포, 종자, 꽃밥, 화분, 배주, 잎, 배아, 뿌리, 근단, 꽃, 열매, 줄기, 슈트, 접순, 원형질체 또는 유상조직인 것을 특징으로 하는, 단풍잎형 오이식물의 일부.
관광원예에 있어서, 제 1 항의 단풍잎형 오이 식물의 용도.
단풍잎형 오이 식물의 품종 동정에 있어서, 제 1 항의 단풍잎형의 용도.
오이 게놈의 2 번 염색체의 16383700-16385719 염기 위치의 유전자로서, 일반 잎형 오이의 해당 유전자와 비교시 859 번째 염기 A 가 T 로 돌연변이된 것을 특징으로 하는, 단풍잎형 엽신 단일 열성 핵유전자.
제 5 항의 단풍잎형 엽신 단일 열성 핵유전자를 포함하는 벡터 및 상기 벡터의 숙주.
CC81221 또는 이로부터 유도된 단풍잎형 엽신 단일 열성 핵유전자를 갖는 오이 식물을 단풍잎형의 유전적 기원으로 하여, 단풍잎형 엽신을 갖는 오이 품종을 육종하는 것을 특징으로 하는, 단풍잎형 오이 식물 품종의 육종방법.
특이적 프라이머 쌍으로 동정 대기중인 식물에 대하여 PCR 증폭 및 시퀀싱을 진행하여, 시퀀싱 결과 TT 동형접합 피크 다이어그램 또는 AT 이형접합 피크 다이어그램를 나타내는 것이 단풍잎형 엽신 단일 열성 핵유전자를 갖는 오이 식물인 것을 구체적인 단계로 하며; 상기 특이적 프라이머 쌍의 서열은:
포워드 프라이머: GTCCAGGTTCTCAATCGAGCT，서열번호 1 로 표시되며;
리버스 프라이머: GCCACGATATTGAGAGGTTCT，서열번호 2 로 표시되는 것을 특징으로 하는, 단풍잎형 엽신 단일 열성 핵유전자를 갖는 오이 식물 또는 그 일부의 분자동정방법.
포워드 프라이머: GTCCAGGTTCTCAATCGAGCT, 서열번호 1 로 표시되며;
리버스 프라이머: GCCACGATATTGAGAGGTTCT, 서열번호 2 로 표시되는 것을 특징으로 하는, 단풍잎형 엽신 단일 열성 핵유전자 오이 식물 또는 그 일부를 동정하기 위한 프라이머 쌍.
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