JP2019515682A - メープルリーフ型キュウリ植物 - Google Patents
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Abstract
本発明は、メープルリーフ型の複葉を有する変異キュウリ植物ＣＣ８１２２１、またはそれから誘導されるメープルリーフ型の葉の単一劣性核遺伝子を有するキュウリ植物を提供する。また、メープルリーフ型キュウリ植物の育種、分子同定、および応用方法を提供する。【選択図】 図１
Description
本発明は、植物の葉形、及びその育種方法の分野に関するもので、具体的には、メープルリーフ型キュウリ植物、及びその育種方法と同定方法に関するものである。
キュウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ Ｌ．）は大葉の蔓植物であり、光合成面積、即ち葉面積の大きさ、分布、及びその光合成効率は、キュウリ栽培、特に高緯度地域の季節はずれの施設栽培において、収量、果実品質、病害抵抗性等に対して直接的な影響がある。葉は植物の光合成作用の物質基礎であるとともに、生態系におけるガス、水、及びエネルギー交換にとっての重要な基盤でもある。また、葉面積係数とも呼ばれている葉面積指数（ｌｅａｆ ａｒｅａ ｉｎｄｅｘ、ＬＡＩ）は、作物集団の規模を反映する動的指標であり、一定の範囲内では、葉面積指数の向上に伴い、作物の収量が増加する。一方、葉面積指数が一定の限界まで増加すると、圃場は覆い尽され、光が不十分になり、光合成効率が低下し、収量は逆に減少してしまう。
生態学において、葉面積指数は生態系における重要な構造パラメータであり、植物の葉面の数、林冠構造の変化、植物群落の生存力およびその環境効果を反映するためのもので、植物の林冠の表面物質およびエネルギー交換の描写のために構造化された定量的情報を提供し、生態系における炭素蓄積、植生の生産力、土壌と植物と大気の相互作用のエネルギーバランス、及び植生のリモートセンシングなどの面において重要な役割を果たしている。一定の範囲内では、葉面積が増加すると、葉面積指数が向上し、光合成生産性が向上し、収量が増加するが、葉面積が大きすぎると、林冠構造が不合理になり、中期と後期の葉が互いに光を遮断してしまう場合があり、光合成生産性が低下し、無効な呼吸と水の消費量が増加し、ソースシンクの調整が利かず、最終的に収量が減少してしまう（Ｊｉａｎｇ Ｘｉａｎｍｉｎｇ，１９８２；Ｗａｎｇ Ｃｈｅｎｇｙｕ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｚｈａｎｇ Ｙｏｎｇｐｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。キュウリ果実の光沢や色などの商品性も、光条件による影響を大きく受ける。果実の光条件が良いと、果実の光沢は高くなり、その色も鮮やかになる。
野生キュウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ Ｖａｒ．ｈａｒｄｗｉｃｋｉｉ）の葉は小さく、人工栽培された栽培キュウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ Ｖａｒ．ｓａｔｉｖｕｓ）の葉面積は２〜３倍拡大する。葉の大きさおよび形状は、葉面積指数を構成する重要な要素であり、適切な葉面積値は、キュウリ植物の理想的な植物型を決定し、集団光エネルギーおよび栄養利用率の高いキュウリ品種を栽培するために重要な意味を持つ。
キュウリの葉面積は、複数の遺伝子によって制御される量的形質である（Ｗｕ Ｐｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｉｎｅｓｅ ｖｅｇｅｔａｂｌｅｓ．２００９，（２４）：４３−４６；Ｓｈｉ Ｔｉｎｇｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．２０１４，（４）：４１５−４２１）。量的形質は環境条件の影響を受けやすく、伝統的な育種法により、葉の大きさを変えることだけでキュウリの集団構造を解決する方法は、非常に困難であり、今のところ、著しい進展はなかった。
一般的なキュウリの葉の形状には主に６つの種類があり、それぞれが掌状五角形、ハート型五角形、類円形、長い五角形、長い三角形、およびハート型三角形である（Ｌｉ Ｘｉｘｉａｇｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｏｐ ｖａｒｉｅｔｙ ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，１９９９（３）：２７−２９）。
現在、既に発見されたキュウリの葉の形状を制御する遺伝子には、主に、披針形の葉（ｂｌａ）（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，１９８７ａ）、ハート型の葉−１（ｃｏｒ−１）（Ｇｏｒｎｉｔｓｋａｙａ，１９６７）、ハート型の葉−２（ｃｏｒ−２）（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，１９８７ｃ）、皺葉（ｃｒ）（Ｏｄｌａｎｄ ａｎｄ Ｇｒｏｆｆ，１９６３ａ）、複葉（ｄｖｌ）（ｄｅｎ Ｎｉｊｓ ａｎｄ Ｍａｃｋｉｅｗｉｃｚ，１９８０）、イチョウ葉（ｇｉ）（Ｊｏｈｎ ａｎｄ Ｗｉｌｓｏｎ，１９５２）、小葉（ｌｌ）（Ｇｏｏｄｅ ｅｔ ａｌ．，１９８０；Ｗｅｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７）、傘状葉（ｕｌ）（ｄｅｎ Ｎｉｊｓ ａｎｄ ｄｅ Ｐｏｎｔｉ，１９８３）の８つが存在する（Ｃｕｃｕｒｂｉｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ，Ｇｅｎｅ Ｌｉｓｔ ２０１５ ｆｏｒ Ｃｕｃｕｍｂｅｒで開示されたキュウリ遺伝子リスト及び性状の描写）。
そのうち、複葉１（ｄｖｌ−１ ）変異体は、ポーランドキュウリ品種をエチレンイミンで変異誘発して得られるものである。その本葉は完全または部分的に分裂し、２〜５枚の小葉となり、小葉の数は植物の生長状態に依存する。最適な生長条件下で、変異体のいくつかの葉は正常な形態を示すが、大部分の植物は最初の本葉によって同定することができる。雄花と雌花の花冠のいずれにも切り口があり、５〜７枚の分離した花弁を示す。複葉２（ｄｖｌ−２ ）変異体はキュウリ品種Ｂｏｒｓｚｃｚａｇｏｗｓｋｉをアジリジンで変異誘発して得られるものである。２番目の本葉の後、葉が複葉状になり、花冠が離弁する。
現在、メープルリーフ型キュウリ植物およびそれに関する報告がない。
本発明の目的は、従来の掌状五角形、ハート型五角形、類円形、長い五角形、長い三角形、ハート型三角形といった６つの一般的な葉型のキュウリに基づいて、メープルリーフ型キュウリ植物及びその育種方法と分子同定方法を提供することである。
本発明者らは、親植物としてＴＡ５１１（中国唐山秋瓜類）、ＨＡ４４２（白緑色で、棘の少ない中国華南型キュウリ類）及びＳＧ３２１（平滑で、棘のないヨーロッパ鮮食キュウリ類）の３種類のキュウリ近交系を利用し、通常の複合交雑を行った。後代の分離集団では、白緑色で、棘のない鮮食キュウリの性状の組換え植物が現れ、さらに、３世代にわたり同系交配と連続的な選抜を経て、２０１２年春に北京海淀区の実験温室に植えた。同系交配の後代の植物集団において、本発明者らは、自然変異したメープルリーフ型の葉を有する変異体植物、すなわち、メープルリーフ型の葉を有するキュウリ植物を見出した。その特性は主に、複葉の特徴が一枚目の本葉の段階から現れ始め、明らかなメープルリーフ型の葉の特徴が２枚目の本葉から現れ始める面に反映されている。メープルリーフ型の複葉を有するキュウリ植物の葉は、掌状五角形の複葉であり、初期の段階で開きたての若葉の形は、五角形のメープルリーフに似ていて、成熟した葉の中央部分は長い三角形の卵形であり、端部分より長くなっている。発明者らは、当該キュウリ近交系を、ＣＣ８１２２１と命名した。
遺伝子解析を経て、キュウリのメープルリーフ型の複葉の性状は、単一劣性核遺伝子制御の遺伝法則に合致していた。即ち、本発明のメープルリーフ型の葉の複葉の性状は、単一劣性核遺伝子によって制御される。本発明者らは、メープルリーフ型の葉を制御する複葉遺伝子を、ｄｖｌ−３と命名した。
ｄｖｌ、ｄｖｌ−２と異なるメープルリーフ型の複葉の遺伝子ｄｖｌ−３を有する本発明のキュウリ植物は、葉の形状以外、花弁、草丈、葉脉およびその他の栄養生長、生殖生長などにおいて、通常の植物と何の変わりもない。
本発明は、１）受託番号がＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１１２８５のククミス属植物ＣＣ８１２２１である、メープルリーフ型の葉の単一劣性核遺伝子を有するキュウリ変異体植物、または、
２）ＣＣ８１２２１から誘導されるメープルリーフ型の葉の単一劣性核遺伝子を有するキュウリ植物であって、
前記メープルリーフ型の葉の単一劣性核遺伝子が、キュウリゲノムの第２染色体の１６３８３７００−１６３８５７１９塩基に位置する遺伝子であり、通常の葉型のキュウリの当該遺伝子に比べて、その８５９番目の塩基ＡがＴに変異することを特徴とするメープルリーフ型キュウリ植物を提供する。
２）ＣＣ８１２２１から誘導されるメープルリーフ型の葉の単一劣性核遺伝子を有するキュウリ植物であって、
前記メープルリーフ型の葉の単一劣性核遺伝子が、キュウリゲノムの第２染色体の１６３８３７００−１６３８５７１９塩基に位置する遺伝子であり、通常の葉型のキュウリの当該遺伝子に比べて、その８５９番目の塩基ＡがＴに変異することを特徴とするメープルリーフ型キュウリ植物を提供する。
その中、前記メープルリーフ型は、葉が掌状五角形の複葉であることを意味し、その中、中央部が長い三角形の卵形であり、端部よりも明らかに長くなっている；当該端部は三角状の卵形であり、端部は比較的に短く、浅く裂けていて、葉の基部はハート型または略ハート型である。遺伝的背景が異なる場合、葉の裂け方には異なる程度の変化が現れ、浅裂もしくは深裂であっても、その中央部がかなり長くなっても、中央部の幅が変化しても、その葉基に小さな突起が現われても、もしくはその葉縁がジグザグ状や波状などであってもよく、メープルリーフ型の葉の基本特性に基づいて生じる、これらのような修飾又は量の変化はいずれも本発明の範囲内に属するものである。詳細は図１を参照し、左上は普通の葉であり、残りは遺伝的背景が異なる場合のメープルリーフ型の葉である。
そのうち、前記誘導は、従来の育種、バイオテクノロジー育種、栄養繁殖またはそれらの組み合わせによって、新しいメープルリーフ型キュウリ植物を得ることを意味する。
そのうち、前記従来の育種は、同系交配、交配、戻し交配などの一般的な育種方法、およびそれらの組み合わせを含む。
そのうち、前記バイオテクノロジー育種は、トランスジェニック育種、半数体・二倍体育種、分子マーカー育種などの既知のバイオテクノロジー育種法、およびそれらの組み合わせを含む。
また、本発明は、前記メープルリーフ型キュウリ植物の観光ガーデニングにおける応用を提供する。
また、本発明は、前記メープルリーフ型キュウリ植物の品種鑑定におけるメープルリーフ型の用途を提供する。
また、本発明は、前記メープルリーフ型キュウリ植物の一部を提供する。前記一部は、植物細胞、種子、葯、花粉、胚珠、葉、胚芽、根、根冠、花、果実、茎、枝、穂木、プロトプラストまたはカルスを含むが、これらに限定されない。
また、本発明は、キュウリゲノムの第２条染色体の１６３８３７００−１６３８５７１９塩基に位置する遺伝子であり、通常の葉型のキュウリの当該遺伝子に比べて、その８５９番目の塩基ＡがＴに変異することを特徴とするメープルリーフ型の葉の単一劣性核遺伝子を提供する。当該遺伝子をｄｖｌ−３と命名した。
また、本発明は、メープルリーフ型の葉の単一劣性核遺伝子を含むベクター及び前記ベクターの宿主を提供する。
さらに、本発明は、ＣＣ８１２２１、またはそれから誘導されるメープルリーフ型の葉の単一劣性核遺伝子を有するキュウリ植物を、メープルリーフ型の遺伝源として、メープルリーフ型の葉を有するキュウリ品種を育種することを特徴とするメープルリーフ型キュウリ植物品種の育種方法を提供する。
前記育種は、同系交配・分離、交配、戻し交配、循環選抜、半数体、組織培養、変異誘発又は分子マーカー支援選抜などの当業者にとっての周知の技術またはそれらの組み合わせによって行われる。
前記育種において、交配技術を採用して近交系を育種する際の、具体的なステップは下記のとおりである。メープルリーフ型キュウリ植物とキュウリ品種Ａとを交配させ、後代のメープルリーフ型遺伝子を有する植物を連続的に選抜して同系交配させ、他の農業形質がホモ接合になり、分離しなくなるまでに系統育種を行い、メープルリーフ型の葉を有する株を選抜することで、メープルリーフ型キュウリ植物の近交系が得られる。前記の他の農業形質は、複葉以外の農業形質、例えば、草丈、葉の色などの通常の農業形質である。
前記育種において、戻し交配技術を採用して近交系を育種する際の、具体的なステップは下記のとおりである。メープルリーフ型キュウリ植物とキュウリ品種Ｂとを交配させ、キュウリ品種Ｂを反復親として、メープルリーフ型遺伝子を有する植物と連続的に戻し交配させ、葉形以外の他の性状が分離しなくなる時に、一世代を同系交配させ、その他の農業形質がキュウリ品種Ｂと似ていて、且つ葉がメープルリーフ型である株を選抜することで、メープルリーフ型キュウリ植物の近交系が得られる。前記メープルリーフ型遺伝子を有する植物の選抜方法は下記のとおりである。
Ｉ．分子マーカー法により、メープルリーフ型の葉の単一劣性核遺伝子を有する植物を選抜し、及び／又は
ＩＩ．同系交配の後代から分離したメープルリーフ型の表現型を有する植物を選抜する。
ＩＩ．同系交配の後代から分離したメープルリーフ型の表現型を有する植物を選抜する。
メープルリーフ型キュウリ植物の近交系を育種する方法は、メープルリーフ型品種の同系交配・分離育種、半数体・二倍体育種、組織培養、突然変異育種などを利用することにより行っても良い。
メープルリーフ型キュウリ植物の交配種の製造方法は下記の通りである。メープルリーフ型キュウリ植物における二種類の近交系を選択して交配させ、メープルリーフ型キュウリ植物の交配種を得る。
また、本発明は、メープルリーフ型の葉の単一劣性核遺伝子を有するキュウリ植物またその一部の分子同定法を提供し、その具体的なステップは下記のとおりである。特異的なプライマー対で同定待ちの植物をＰＣＲ増幅させ配列決定を行い、配列決定の結果がＴＴホモ接合のピーク、またはＡＴヘテロ接合のピークを有するものが、メープルリーフ型葉の単一劣性核遺伝子を有するキュウリ植物であり；前記特異的なプライマー対の配列が下記のとおりである。
配列番号１で示される上流プライマー：ＧＴＣＣＡＧＧＴＴＣＴＣＡＡＴＣＧＡＧＣＴ；
配列番号２で示される下流プライマー：ＧＣＣＡＣＧＡＴＡＴＴＧＡＧＡＧＧＴＴＣＴ。
配列番号２で示される下流プライマー：ＧＣＣＡＣＧＡＴＡＴＴＧＡＧＡＧＧＴＴＣＴ。
前記ＰＣＲ増幅の反応系は下記の通りである。
１０μＭ上流プライマー １μｌ
１０μＭ下流プライマー １μｌ
ＤＮＡ ２μｌ
Ｐｒｅｍｉｘｔｕｒｅ（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｌｉｕ
ｈｅｔｏｎｇ Ｅｃｏｎｏｍｙ Ａｎｄ Ｔｒａ
ｄｅ Ｃｏ．，Ｌｔｄ、名称Ｐｒｅｍｉｘ Ｔａ
ｑ、製品ＲＲ９０１Ａ） １２．５μｌ
滅菌水 残量
１０μＭ下流プライマー １μｌ
ＤＮＡ ２μｌ
Ｐｒｅｍｉｘｔｕｒｅ（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｌｉｕ
ｈｅｔｏｎｇ Ｅｃｏｎｏｍｙ Ａｎｄ Ｔｒａ
ｄｅ Ｃｏ．，Ｌｔｄ、名称Ｐｒｅｍｉｘ Ｔａ
ｑ、製品ＲＲ９０１Ａ） １２．５μｌ
滅菌水 残量
総反応系は２５μｌである。
前記ＰＣＲ増幅の反応条件は下記の通りである。
９４℃でプレ変性を２ｍｉｎ；９４℃で変性を３０ｓｅｃ、５６℃でアニーリングを４５ｓｅｃ、７２℃で伸長を２．０ｍｉｎ、３０サイクル；７２℃で伸長を１５ｍｉｎ、４℃で終了する。
また、本発明は、
配列番号１で示される上流プライマー：ＧＴＣＣＡＧＧＴＴＣＴＣＡＡＴＣＧＡＧＣＴ、
配列番号２で示される下流プライマー：ＧＣＣＡＣＧＡＴＡＴＴＧＡＧＡＧＧＴＴＣＴ
であることを特徴とするメープルリーフ型の葉の単一劣性核遺伝子を有するキュウリ植物またはその一部を同定するためのプライマー対を提供する。
配列番号１で示される上流プライマー：ＧＴＣＣＡＧＧＴＴＣＴＣＡＡＴＣＧＡＧＣＴ、
配列番号２で示される下流プライマー：ＧＣＣＡＣＧＡＴＡＴＴＧＡＧＡＧＧＴＴＣＴ
であることを特徴とするメープルリーフ型の葉の単一劣性核遺伝子を有するキュウリ植物またはその一部を同定するためのプライマー対を提供する。
本発明は下記の利点を有する。
（１）本発明が提供するメープルリーフ型の葉を有するキュウリ植物は、キュウリの品種資源を豊かにし、キュウリの生態育種に良好な遺伝資源を提供する。
（２）本発明におけるメープルリーフ型の葉では、キャノピーの気孔率が高く、下葉に対する遮蔽が少なく、それに伴い、集団栽植密度、葉面積指数、光合成效率がいずれも大幅に向上するため、キュウリの生産に遍在し、調和し難い栽植密度と集団光合成效率、栄養生長と生殖生長などの矛盾が解決される。
（３）本発明のメープルリーフ型の葉を有する植物の集団は、強力な換気および光透過性を有し、病気の発生を低減させ、それに伴って殺虫剤の使用が減少し、人々の健康および環境保護に有益でありながら、生産コストを削減する。
（４）本発明のメープルリーフ型の葉は、単一劣性核遺伝子によって制御される質的形質として、キュウリ種子の純度同定および品種の真正性同定に迅速かつ有効なマーカーを提供する。
（５）本発明のメープルリーフ型の葉を有するキュウリ植物は、新規且つユニークであり、観光農業にとって有意義な製品を提供する；
（６）本発明は、当該遺伝子をクローニングし、さらに関連のウリ類に対して植物育種を行うための良好な材料基礎を提供する。
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明の範囲はこれらに制限されるものではない。
実施例１ メープルリーフ型キュウリ植物変異体ＣＣ８１２２１の遺伝的解析試験
（一）試験材料
発明者は、２０１２年春に北京市海淀区上庄の実験温室に植えた、農家品種唐山秋瓜、白葉三とヨーロッパ鮮食類キュウリ品種によりマルチハイブリダイズされた後代の近交系において、メープルリーフ型の変異体を発見し、ＣＣ８１２２１と命名し、その写真を図２、図３に示す。
（一）試験材料
発明者は、２０１２年春に北京市海淀区上庄の実験温室に植えた、農家品種唐山秋瓜、白葉三とヨーロッパ鮮食類キュウリ品種によりマルチハイブリダイズされた後代の近交系において、メープルリーフ型の変異体を発見し、ＣＣ８１２２１と命名し、その写真を図２、図３に示す。
前記ククミス属植物（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ Ｌ．）ＣＣ８１２２１は、２０１５年１０月１６日付けでＣｈｉｎａ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ（寄託先：Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，３ｔｈ，ＮＯ．１ Ｃｏｕｒｔｙａｒｄ，Ｂｅｉｃｈｅｎ Ｗｅｓｔ Ｒｏａｄ，Ｃｈａｏｙａｎｇ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ，Ｂｅｉｊｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ）に寄託され、受託番号がＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１１２８５である。
Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｂｅｉｎｏｎｇ Ｓａｎｙｉ Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｅｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒによって提供される複数種の通常の葉型のキュウリを対照品種とし、具体的には、下記のものがある。
（１）華北型（強刺類，掌状五角形の葉）：Ｍ１１１。
（２）華南型（刺の少ない種類，掌状五角形の葉）の２つの近交系、それぞれ
（ａ）短くて太い唐山秋瓜類近交系ＴＡ５１１、
（ｂ）中程度の短さの乾燥地キュウリ（ｄｒｙｌａｎｄ ｃｕｃｕｍｂｅｒ）類近交系ＨＡ４１１である。
（３）ヨーロッパ鮮食類（棘のない種類、ハート型五角形）の２つの近交系、それぞれ
（ａ）緑キュウリ類近交系ＳＬ３１１、
（ｂ）白キュウリ類近交系ＳＬ３２２である。
（２）華南型（刺の少ない種類，掌状五角形の葉）の２つの近交系、それぞれ
（ａ）短くて太い唐山秋瓜類近交系ＴＡ５１１、
（ｂ）中程度の短さの乾燥地キュウリ（ｄｒｙｌａｎｄ ｃｕｃｕｍｂｅｒ）類近交系ＨＡ４１１である。
（３）ヨーロッパ鮮食類（棘のない種類、ハート型五角形）の２つの近交系、それぞれ
（ａ）緑キュウリ類近交系ＳＬ３１１、
（ｂ）白キュウリ類近交系ＳＬ３２２である。
（二）試験デザイン
５０ウェルのプレートに苗を移植し、Ｆ１世代、ＢＣ１世代ごとに５０粒を播種し、Ｆ２世代を１００粒播種した。
５０ウェルのプレートに苗を移植し、Ｆ１世代、ＢＣ１世代ごとに５０粒を播種し、Ｆ２世代を１００粒播種した。
組合わせ方は次のとおりである。
（１）メープルリーフ型：同系交配
（２）メープルリーフ型×通常の葉→Ｆ１→Ｆ２
Ｆ１×メープルリーフ型
（３）通常の葉×メープルリーフ型→Ｆ１→Ｆ２
Ｆ１×メープルリーフ型
（１）メープルリーフ型：同系交配
（２）メープルリーフ型×通常の葉→Ｆ１→Ｆ２
Ｆ１×メープルリーフ型
（３）通常の葉×メープルリーフ型→Ｆ１→Ｆ２
Ｆ１×メープルリーフ型
（三）試験方法
（１）２０１２年５月に、北京市海淀区上庄の実験温室で、番号ＣＣ８１２２１のメープルリーフ型の葉の材料を親の１つとし、通常の葉の異なるタイプのキュウリ近交系をそれぞれもう１つの親として、正交雑交配種と逆交雑交配種（メープルリーフ型を雌親として、通常の葉の近交系と交配することが正交雑であり、メープルリーフ型を雄親として、通常の葉の近交系と交配することが逆交雑である）をそれぞれ収穫し、Ｆ１世代を得た。
（１）２０１２年５月に、北京市海淀区上庄の実験温室で、番号ＣＣ８１２２１のメープルリーフ型の葉の材料を親の１つとし、通常の葉の異なるタイプのキュウリ近交系をそれぞれもう１つの親として、正交雑交配種と逆交雑交配種（メープルリーフ型を雌親として、通常の葉の近交系と交配することが正交雑であり、メープルリーフ型を雄親として、通常の葉の近交系と交配することが逆交雑である）をそれぞれ収穫し、Ｆ１世代を得た。
（２）各種類の交雑の組み合わせのＦ１世代を植え、Ｆ１世代の植物の葉形を観察した。交雑の組み合わせごとにＦ１世代の植物の半分を選択して同系交配させ、Ｆ２世代をそれぞれ収穫した。Ｆ１世代の植物の残りの半分をＣＣ８１２２１と検定交雑を行い、ＢＣ１世代の種子を収穫した。
（３）Ｆ２世代とＢＣ１世代をそれぞれ植え、苗期から観察し、葉形の分離データをまとめた。
その結果（表１および表２を参照）、メープルリーフ型と通常の葉型の植物を交雑して得られたＦ１世代の植物の葉形はすべて通常の葉形であり、Ｆ２世代における通常の葉とメープルリーフ型葉形との分離比（表１を参照）はすべて、通常の葉：メープルリーフ＝３：１であった。検定交雑を行って得たＢＣ１世代における通常の葉とメープルリーフ型葉形の比は１：１であった。上記の比は、メープルリーフ型の葉形の性状が一対の劣性遺伝子の遺伝法則に合致し、メープルリーフ型の葉形の性状が単一劣性遺伝子によって制御され、質的形質に属し、その性状が遺伝的に安定であり、環境条件の影響を受けないことを示している。苗期の葉形の性状分離の写真を図２に示す。
表１および表２のデータをＸｃ ２によって検証し、その結果、Ｘｃ ２＜Ｘ２ 0.05.1＝３．８４，Ｐ＞０．０５。
実施例２ 交配方法によるメープルリーフ型の葉を有するキュウリ植物品種の培養
メープルリーフ型の葉を有するキュウリ植物ＣＣ８１２２１又はそれから誘導されるメープルリーフ型の葉を有するキュウリ近交系、Ｆ１交配種又はヘテロ接合体を、メープルリーフ型のドナーとすることで、メープルリーフ型の葉を有するキュウリ植物を育種した。よって、本発明の方法により育種されるいずれのメープルリーフ型の葉を有するキュウリ植物、及び番号がＣＣ８１２２１であるメープルリーフ型キュウリ植物またはそれらから誘導されるメープルリーフ型キュウリ植物は、全て本発明の範囲に属する。
メープルリーフ型の葉を有するキュウリ植物ＣＣ８１２２１又はそれから誘導されるメープルリーフ型の葉を有するキュウリ近交系、Ｆ１交配種又はヘテロ接合体を、メープルリーフ型のドナーとすることで、メープルリーフ型の葉を有するキュウリ植物を育種した。よって、本発明の方法により育種されるいずれのメープルリーフ型の葉を有するキュウリ植物、及び番号がＣＣ８１２２１であるメープルリーフ型キュウリ植物またはそれらから誘導されるメープルリーフ型キュウリ植物は、全て本発明の範囲に属する。
（１）２０１２年５月２５日、北京市海淀区の実験シェッドで実験を行い、実験シェッドを防虫ネットで閉鎖して隔離した。メープルリーフ型の葉を有するキュウリ材料であるＣＣ８１２２１を親の１つとし、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｂｅｉｎｏｎｇ Ｓａｎｙｉ Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｅｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒによって提供される３つの異なる種類の通常の葉の近交系をもう１つの親として、それぞれを人工受粉によって交配させ、それぞれ収穫してＦ１世代の種子を得た。前記の通常の葉の近交系は、強刺類キュウリ近交系Ｍ１１４１（掌状五角形の葉）、華南型キュウリ近交系ＨＡ１１５１（掌状五角形の葉）と平滑で棘のない鮮食類近交系ＳＧ１１３１（ハート形五角形の葉）である。
（２）２０１２年９月１５日、実験シェッド内でＦ１世代をそれぞれ植え、同系交配させ、それぞれ収穫してＦ２世代の種子を得た。
（３）２０１３年１月１５日、実験シェッド内でＦ２世代をそれぞれ植え、表現型の分離の状況により、農業形質が優れるメープルリーフ型の葉を有する株、又は農業形質が優れる正常の葉を有する株をそれぞれ選抜して同系交配させ、株ごとに収穫し、Ｆ３世代の種子を得た。
（４）２０１３年５月２５日、実験シェッド内でＦ３世代をそれぞれ植え、メープルリーフ型の葉を有する株を同系交配させて得られたＦ３世代集団から、目標とする農業形質だけによって選抜して同系交配させた。メープルリーフ型のマーカー性状を分離できない株を排除し、メープルリーフ型の葉を有する株から分離した集団に対して、ステップ（３）を繰り返した。株ごとに収穫し、Ｆ４世代の種子を得た。
（５）２０１３年９月２５日、実験シェッド内でＦ４世代の種子をそれぞれ植え続け、ステップ（４）を繰り返し、株ごとに収穫し、Ｆ５世代の種子を得た。
（６）２０１４年１月１５日、実験シェッド内でＦ５世代の種子をそれぞれ植え続け、ステップ（４）を繰り返し、株ごとに収穫し、Ｆ６世代の種子を得た。
（７）２０１４年５月から２０１４年９月まで、Ｆ６世代とＦ７世代をそれぞれ植え、ステップ（４）を繰り返し、ホモ接合が安定なメープルリーフ型の複葉を有するキュウリの近交系をそれぞれ得た。
強刺類メープルリーフ型近交系ＣＣ８１４１３の写真を図４、図５に示し；華南型メープルリーフ型近交系ＣＣ８１４２３の写真を図６、図７に示し、ヨーロッパ型の平滑で棘のない種類のメープルリーフ型近交系ＣＣ８１４３３の写真を図８、図９に示した。
実施例３ 戻し交配方法によるメープルリーフ型の葉を有するキュウリ品種の育種試験
戻し交配法を本発明に用い、その主な目的は、原品種の葉形を変更または置き換えるとともに、基本的に原品種の他の全ての望ましい遺伝学的組成、および望ましい生理学的組成と形態学的組成を保留することである。
戻し交配法を本発明に用い、その主な目的は、原品種の葉形を変更または置き換えるとともに、基本的に原品種の他の全ての望ましい遺伝学的組成、および望ましい生理学的組成と形態学的組成を保留することである。
メープルリーフ型の葉は、単一劣性核遺伝子によって制御され特性であり、このような場合、戻し交配のステップに後代に対するテストを導入しなければならない。即ち、どの戻し交配の植物がメープルリーフ型の葉をコードする劣性遺伝子を有するかを決定するために、各戻し交配世代と対応する同系交配の後代に対して表現型の試験を行わなければならない。
ＳＳＲ，ＲＦＬＰ，ＳＮＰ又はＡＦＬＰマーカーなどの分子マーカーを使用することで、前記戻し交配プロセスを簡潔にし、且つそれを速めることができる。
（１）２０１２年５月２５日に、北京市海淀区の試験シェッドで、メープルリーフ型キュウリ植物ＣＣ８１２２１を非反復親とし、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｂｅｉｎｏｎｇ Ｓａｎｙｉ Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｅｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒによって提供される強刺類キュウリ近交系Ｍ１１４２（掌状五角形の葉）を反復親として交配させ、Ｆ１世代の種子を収穫した。
（２）２０１２年９月１５日、実験シェッド内でＦ１世代及びステップ（１）に記載の反復親をそれぞれ植え、反復親と戻し交配させ、ＢＣ１Ｆ１世代の種子を収穫した。
（３）２０１３年１月１５日、実験シェッドでＢＣ１Ｆ１世代と反復親を植え、農業形質が優れる個体の植物を選抜して同系交配させ、選抜した個体の植物を雄親として、反復親と戻し交配させ、対応の番号を振り、個体の植物ごとにＢＣ１Ｆ２世代の種子とＢＣ２Ｆ１世代の種子をそれぞれ収穫した。
（４）２０１３年５月２５日、実験シェッド内でＢＣ１Ｆ２世代の種子とＢＣ２Ｆ１世代の種子をそれぞれ植え、メープルリーフ型の株を分離できたＢＣ１Ｆ２世代を選択して対応の番号を振り、株を選抜し、同系交配を行い続けた。選抜した個体の植物を雄親として、反復親と戻し交配させ、対応の番号を振り、個体の植物ごとに収穫し、ＢＣ２Ｆ２世代の種子とＢＣ３Ｆ１世代の種子をそれぞれ得た。
（５）２０１３年９月２５日から２０１５年１月まで、実験シェッド内でステップ（４）を２〜８世代にわたって繰り返し、ＢＣｎＦ１（アルファベットのｎで世代数を表す）世代で、葉形以外の他の性状が分離しなくなった際に、同系交配を一回行い、メープルリーフ型の葉を有するキュウリ近交系ＭＣＣ８１４１１（圃場の写真を図１０に示し、葉と通常のキュウリの葉の比較写真を図１１に示し、左側が通常のキュウリの葉であり、右側はＭＣＣ８１４１１の葉である。）を得た。
実施例４ 雄・雌親が全てメープルリーフ型の近交系であるメープルリーフ型キュウリ植物の交配種試験
本発明以外の交配種と比べて、本発明の方法により培養した交配種は、二つのメープルリーフ型の葉を有するキュウリを親として利用して交配することを特徴とする。本試験の目的は、メープルリーフ型の葉を有するキュウリ植物のハイブリッド種子の商業生産を実現することである。具体的には、以下のことを含む。
本発明以外の交配種と比べて、本発明の方法により培養した交配種は、二つのメープルリーフ型の葉を有するキュウリを親として利用して交配することを特徴とする。本試験の目的は、メープルリーフ型の葉を有するキュウリ植物のハイブリッド種子の商業生産を実現することである。具体的には、以下のことを含む。
（１）２０１２年９月から２０１５年１月まで、北京市海淀区の実験温室で、メープルリーフ型の葉を有するキュウリ植物ＣＣ８１２２１を非反復親として利用し、Ｄ２−４−１（金童（品種登録番号：ＣＮＡ２０１００６９９．０）の雌親）とＤ２−４−３１（金童（品種登録番号：ＣＮＡ２０１００６９９．０）の雄親）をそれぞれメープルリーフ型受容体として利用し、実施例３に記載の戻し交配法により、メープルリーフ型の葉を有するキュウリ近交系Ｄ２−４−１−ＣＣ３（メープルリーフ型金童キュウリの雌親）とＤ２−４−３１−ＣＣ１（メープルリーフ型金童キュウリの雄親）をそれぞれ育種した。
（２）２０１５年２月５日に播種・育苗を行い、３月５日に６６７メートルあたり４０００株の基準で定植し、雄親と雌親の割合は１：４であった。人工受粉によって交配を行い、７月１日にメープルリーフ型の金童キュウリのハイブリッド種子を収穫した。
（３）２０１５年７月１５日に金童とメープルリーフ型金童をそれぞれ５００粒播種し、８月１日に定植を行った。
（４）表現型による交配純度テスト：元の金童と、葉形及びキュウリの形状、キュウリの色、雌性、早熟性、病害抵抗性、収量などを比較した。１０月１５日に試験が完了し、その結果、１００％がメープルリーフ型の葉を有する金童キュウリであり、その写真を図１２、図１３に示す。
実施例５ メープルリーフ型の葉の遺伝子のＳＮＰ分子マーカー支援選抜試験
（一）試験材料：
雄親：Ｍ１１１（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｂｅｉｎｏｎｇ Ｓａｎｙｉ Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｅｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒにより提供されるもの）：通常の葉（優性ホモ接合）。
雌親：ＣＣ８１２２１（受託番号：ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１１２８５）、メープルリーフ型（劣性ホモ接合）。
Ｆ１：通常の葉（ヘテロ接合）。
（一）試験材料：
雄親：Ｍ１１１（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｂｅｉｎｏｎｇ Ｓａｎｙｉ Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｅｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒにより提供されるもの）：通常の葉（優性ホモ接合）。
雌親：ＣＣ８１２２１（受託番号：ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１１２８５）、メープルリーフ型（劣性ホモ接合）。
Ｆ１：通常の葉（ヘテロ接合）。
（二）試験方法：
１、葉のＤＮＡの抽出
Ａｉｄｌａｂ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏ．，Ｌｔｄの植物Ｒａｐｉｄ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔで葉のＤＮＡを抽出し、キットの取扱説明書を参照して試験を実施した。
１、葉のＤＮＡの抽出
Ａｉｄｌａｂ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏ．，Ｌｔｄの植物Ｒａｐｉｄ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔで葉のＤＮＡを抽出し、キットの取扱説明書を参照して試験を実施した。
２、遺伝子断片のクローニング
ＳＮＰサイト変異に使用されるプライマー配列は下記の通りである：
配列番号１で示される上流プライマー:ＧＴＣＣＡＧＧＴＴＣＴＣＡＡＴＣＧＡＧＣＴ、
配列番号２で示される下流プライマー:ＧＣＣＡＣＧＡＴＡＴＴＧＡＧＡＧＧＴＴＣＴ。
ＳＮＰサイト変異に使用されるプライマー配列は下記の通りである：
配列番号１で示される上流プライマー:ＧＴＣＣＡＧＧＴＴＣＴＣＡＡＴＣＧＡＧＣＴ、
配列番号２で示される下流プライマー:ＧＣＣＡＣＧＡＴＡＴＴＧＡＧＡＧＧＴＴＣＴ。
前記ＰＣＲ増幅の反応系は下記の通りである。
１０μＭ上流プライマー １μｌ
１０μＭ下流プライマー １μｌ
ＤＮＡ ２μｌ
Ｐｒｅｍｉｘｔｕｒｅ（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｌｉ
ｕｈｅｔｏｎｇ Ｅｃｏｎｏｍｙ Ａｎｄ Ｔｒ
ａｄｅ Ｃｏ．，Ｌｔｄ、名称Ｐｒｅｍｉｘ Ｔ
ａｑ、製品ＲＲ９０１Ａ） １２．５μｌ
滅菌水 残量
１０μＭ下流プライマー １μｌ
ＤＮＡ ２μｌ
Ｐｒｅｍｉｘｔｕｒｅ（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｌｉ
ｕｈｅｔｏｎｇ Ｅｃｏｎｏｍｙ Ａｎｄ Ｔｒ
ａｄｅ Ｃｏ．，Ｌｔｄ、名称Ｐｒｅｍｉｘ Ｔ
ａｑ、製品ＲＲ９０１Ａ） １２．５μｌ
滅菌水 残量
総反応系は２５μｌである。
前記ＰＣＲ増幅の反応条件は次の通りである。
９４℃でプレ変性を２ｍｉｎ；９４℃で変性を３０ｓｅｃ、５６℃でアニーリングを４５ｓｅｃ、７２℃で伸長を２．０ｍｉｎ、３０サイクル；７２℃伸長を１５ｍｉｎ、４℃で終了する。
３、ＰＣＲ産物の配列決定
増幅された産物を配列決定に供し、その結果は図１４（雄親）、図１５（雌親）、図１６（Ｆ１）に示すとおりであり、当該ＳＮＰ分子マーカーがメープルリーフ型の葉の単一劣性核遺伝子を有するキュウリ植物を標識できることが示されている。
増幅された産物を配列決定に供し、その結果は図１４（雄親）、図１５（雌親）、図１６（Ｆ１）に示すとおりであり、当該ＳＮＰ分子マーカーがメープルリーフ型の葉の単一劣性核遺伝子を有するキュウリ植物を標識できることが示されている。
以上、本発明を一般的な説明および具体的な実施形態により詳しく説明したが、本発明に基づいて修正または改良を行い得ることは、当業者にとって明らかである。従って、本発明の趣旨から逸脱しない限りなされたこれらの修正又は改良は、いずれも本発明の保護範囲に属すものである。
本発明では、交雑育種の過程で発見されたメープルリーフ型の複葉を有する変異体キュウリ植物ＣＣ８１２２１、またはそれから誘導されるメープルリーフ型の葉の単一劣性核遺伝子を有するキュウリ植物である、メープルリーフ型キュウリ植物が開示されている。本発明は、交雑育種の過程で発見されたメープルリーフ型の複葉を有するキュウリ葉変異体植物を提供する。本発明はこれらの植物の誘導物および植物の一部を提供する。また、本発明はこれらの植物の使用方法を提供する。本発明の重要な意味は、このようなメープルリーフ型の葉を有する遺伝的特徴が単一劣性核遺伝子によって制御される質的形質であること、および当該特性の形態学的特徴と分子マーカーを開示したことにある。本発明によれば、キュウリの新品種を育種する過程において、葉面積のような複数の遺伝子によって制御される量的形質と比べて、伝統的な育種方法でメイプルリーフ型の葉を有するキュウリ植物の特性をより簡単に各種類の品種に導入でき、これにより、キュウリの生産に遍在しながらも調和し難い集団の各種の生育上の矛盾、例えば、栽培密度と集団の光合成効率、栄養成長と生殖成長等の矛盾を効果的に解決できる。集団の換気と光透過性を向上させることで、商品性と病害抵抗性、収量等の目的も達成できる。また、本発明は美しく、観賞価値の高いキュウリの品種の新たな性状を提供する。
Claims (9)
- １）受託番号がＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１１２８５のククミス属植物ＣＣ８１２２１である、メープルリーフ型の葉の単一劣性核遺伝子を有するキュウリ変異体植物、または、
２）ＣＣ８１２２１から誘導されるメープルリーフ型の葉の単一劣性核遺伝子を有するキュウリ植物であって、
前記メープルリーフ型の葉の単一劣性核遺伝子が、キュウリゲノムの第２染色体の１６３８３７００−１６３８５７１９塩基に位置する遺伝子であり、通常の葉型のキュウリの当該遺伝子に比べて、その８５９番目の塩基ＡがＴに変異する
ことを特徴とするメープルリーフ型キュウリ植物。 - 植物細胞、種子、葯、花粉、胚珠、葉、胚芽、根、根冠、花、果実、茎、枝、穂木、プロトプラストまたはカルスであることを特徴とする請求項１に記載のメープルリーフ型キュウリ植物の一部。
- 観光ガーデニングにおける請求項１に記載のメープルリーフ型キュウリ植物の応用。
- メープルリーフ型キュウリ植物の品種鑑定における請求項１に記載のメープルリーフ型の用途。
- キュウリゲノムの第２条染色体の１６３８３７００−１６３８５７１９塩基に位置する遺伝子であり、通常の葉型のキュウリの当該遺伝子に比べて、その８５９番目の塩基ＡがＴに変異することを特徴とするメープルリーフ型の葉の単一劣性核遺伝子。
- 請求項５に記載のメープルリーフ型の葉の単一劣性核遺伝子を含むベクター及び前記ベクターの宿主。
- ＣＣ８１２２１、またはそれから誘導されるメープルリーフ型の葉の単一劣性核遺伝子を有するキュウリ植物をメープルリーフ型の遺伝源として、メープルリーフ型の葉を有するキュウリ品種を育種することを特徴とするメープルリーフ型キュウリ植物品種の育種方法。
- 特異的なプライマー対で同定待ちの植物をＰＣＲ増幅させ配列決定を行い、配列決定の結果がＴＴホモ接合のピーク、またはＡＴヘテロ接合のピークを有するものが、メープルリーフ型の葉の単一劣性核遺伝子を有するキュウリ植物であり、
前記特異的なプライマー対の配列が配列番号１で示される上流プライマー:ＧＴＣＣＡＧＧＴＴＣＴＣＡＡＴＣＧＡＧＣＴ、配列番号２で示される下流プライマー: ＧＣＣＡＣＧＡＴＡＴＴＧＡＧＡＧＧＴＴＣＴである
ことを特徴とするメープルリーフ型の葉の単一劣性核遺伝子を有するキュウリ植物又はその一部の分子同定方法。 - 配列番号１で示される上流プライマー:ＧＴＣＣＡＧＧＴＴＣＴＣＡＡＴＣＧＡＧＣＴ、
配列番号２で示される下流プライマー:ＧＣＣＡＣＧＡＴＡＴＴＧＡＧＡＧＧＴＴＣＴ
であることを特徴とするメープルリーフ型の葉の単一劣性核遺伝子を有するキュウリ植物またはその一部を同定するためのプライマー対。
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