CN104853595B - 细胞质雄性不育洋桔梗及其制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有细胞质雄性不育性的新型洋桔梗及其育种方法。更详细地，本发明涉及具有细胞质雄性不育性的新型洋桔梗及其育种方法，其特征在于因雄蕊或花粉形成不充分、从而实质上欠缺授粉功能。

Description

细胞质雄性不育洋桔梗及其制造方法
技术领域
本发明涉及具有细胞质雄性不育性的新型洋桔梗及其育种方法。更详细地，本发明涉及具有细胞质雄性不育性的新型洋桔梗及其育种方法，其特征在于因雄蕊或花粉形成不充分、从而实质上欠缺授粉功能。
背景技术
洋桔梗(Eustoma)是北美洲南部到中美洲北部天然生长的龙胆科洋桔梗(Eustoma)属的自花授粉型种子繁殖植物，其存在有以下两种：(1)Eustoma grandiflorum(英文名Prairie gentian，旧学名E.russellianum(Hook)G.Don ex Sweet，Lisianth(i)usrussellianus Hook.)、和(2)Eustoma exaltatum(英文名Seaside gentian，Catchflygentian，旧学名E.selenifolium Salisb.)。作为其别名，土耳其桔梗或丽钵花(Lisianthus)为人们所熟知。1835年天然生长的品种被引入苏格兰，并被命名为Lisianthus russellianus Hook.。日本则是在1930年代引入的，这之后主要作为切花用、盆栽用而进行了很多品种改良。品种改良中，主要使用Eustoma grandiflorum。
洋桔梗已作为观赏价值及市场价值高的花卉植物而为人们所知，尤其是在切花用品种中，制造出了具有多种多样的性质的品种，被认为是切花的主要品类之一(参见非专利文献1)。
一般而言，在主要园艺作物中，利用杂种第一代交配(F1)植物，其利用了杂种优势，具有比双方亲本更优秀的性质。
在切花需求高的洋桔梗的栽培品种中，杂种第一代交配品种也是主流，因为其具有抗病性和高品质性。
此外，为了使得生产中的播种操作更为高效，需要育种者供给高纯度的种子。
杂种第一代交配品种的制种通过下述方式来进行：首先以手工方式对种子亲本去雄，之后将花粉亲本的花粉向经去雄的种子亲本的柱头授粉。
通常，能对种子亲本去雄的时期局限为临开花前期，并且易受天气影响，因此去雄中存在难以预测可进行去雄的时期这样的操作性问题。此外，该操作是通过手工进行的，因此，有时因未彻底去雄而残存的花粉而导致违人所愿地产生自花授粉种子，因自花授粉种子的混入导致的种子品质的低下成为问题。
鉴于上述理由，期望开发在洋桔梗中不需要通过人工进行的种子亲本去雄的、利用雄性不育性的制种方法。
通过发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)导入rolC基因进行转化获得的矮型土耳其桔梗是已知的(非专利文献2)，但是有报道称其出现了花的小型化，花粉生育性丧失，顶芽优势也同时消失(rol综合征)。
公开了应用非专利文献2的技术、从通过不定芽再生而被维持的雄性不育土耳其桔梗制造F1品种的方法(专利文献1)。但是，遵循该方法制造的F1品种伴有不期望的性质，因此，该方法存在无法在对切花品种(要求具有商品性的植株形态、植株高度)的育种中利用的问题。
作为雄性不育性之一的细胞质雄性不育性是细胞质遗传性的，在细胞质雄性不育品系与雄性可育品系交配的情况下，后代植物具有雄性不育性，因此能够供给纯度高的种子。并且，对细胞质雄性不育品系而言，通过将其与细胞核基因组相同、细胞质正常的保持品系交配，能够容易地实现品系的保持和增殖。因此，利用细胞质雄性不育性的杂种第一代交配品种的制种方法实用性极高，被利用于多种主要的园艺作物中。但是，对洋桔梗而言，虽然期望开发利用雄性不育性的制种方法，但尚未有成功制造出细胞质雄性不育桔梗的报道。因此，在洋桔梗F1品种的种子生产中，因为不存在使用了实用的雄性不育品系的制种体系，故而只能进行必须要进行去雄操作的制种。
另一方面，人们希望花的保持性好(通过使花瓣的老化延迟而延长花的观赏期)。作为花瓣老化的原因，可举出授粉、或雌蕊的柱头或花柱受到损伤导致乙烯生成等原因(非专利文献3)。
洋桔梗中，作为花的保持性良好的品种，具有变形雌蕊(通过使柱头部分闭合、阻碍授粉从而延迟花的老化)的洋桔梗是已知的(专利文献2)。
为了使得花的保持性好，过去必须要育成雄蕊花丝较短的品系、或利用改变了植物器官的构造从而得以以物理方式实现柱头上不授粉(如前文所述的变形雌蕊那样)的品系。
进一步地，作为市场价值高的花卉植物的条件之一，需要防止花粉的飞散。但是，现在的洋桔梗品种中，所有品种均为雄蕊具有花粉的品种，因此都存在花粉飞散导致花瓣或衣服污损等问题。
虽然有可能能通过利用雄性不育性从而在不改变有用性质的情况下解决花的保持性等问题，但是迄今尚未制造出具有这样的实用的雄性不育性的洋桔梗。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开平9-107829号公报
专利文献2：日本专利4133011号公报
非专利文献
非专利文献1：農業技術体系花卉編(农业技术体系花卉编)第8卷追录第6号387-395 2004年社团法人农山渔村文化协会发行
非专利文献2：組織培養(组织培养)Vol.19No.2p50-55 1993年New Science Co.,Ltd.
非专利文献3：実践花き園芸技術トルコギキョウ栽培管理と開花調節(实践花卉园艺技术土耳其桔梗栽培管理与开花调节)2003年株式会社诚文堂新光社发行
非专利文献4：E.S.Mousavi,M.Behbahani,E.Hadavi,S.M.Miri(2012)CALLUSINDUCTION AND PLANT REGENERATION IN LISIANTHUS(EUSTOMAGRANDIFLORIUM),ANNIVERSARY EDITION TRAKIA JOURNAL OF SCIENCES Vol.10,No 1,pp 22-25
非专利文献5：J.Duminil,M.-H.PEMONGE and R.J.PETIT(2002)MolecularEcology Notes vol.2p428-430“A set of 35consensus primer pairs amplifyinggenes and introns of plant mitochondrial DNA”
发明内容
鉴于上文所述的以往的洋桔梗品种中F1种子生产时烦杂的去雄操作等问题点、种子品质低下的问题点、以及进一步的花的保持性和花粉飞散的问题，本发明提供具有细胞质雄性不育性的新型洋桔梗及其制造方法。
本申请的发明人为了解决上述问题进行了深入研究，制造出了具有细胞质雄性不育性的新型洋桔梗个体、育成了具有该细胞质雄性不育性的洋桔梗品种，完成了使用该细胞质雄性不育性洋桔梗获得杂种第一代交配品种的育种方法。
即，本发明涉及具有细胞质雄性不育性的新型洋桔梗及其育种方法，进一步优选涉及下述具有细胞质雄性不育性的新型洋桔梗及其育种方法，所述新型洋桔梗特征在于因雄蕊或花粉形成不充分、从而实质上欠缺授粉功能。
即，本发明提供以下的(1)～(34)。
(1)具有细胞质雄性不育性的洋桔梗属植物或其后代。
(2)(1)所述的洋桔梗属植物或其后代，其特征在于，具有序列号1或序列号2记载的碱基序列。
(3)(1)或(2)所述的洋桔梗属植物或其后代，其特征在于，所述洋桔梗属植物或其后代是从下述杂交后代产生的细胞质雄性不育植物，所述杂交后代是以具有序列号1或序列号2记载的碱基序列的洋桔梗属植物作为种子亲本、以任意的洋桔梗属植物作为花粉亲本而得的杂交后代。
(4)(1)～(3)中任一项所述的洋桔梗属植物或其后代，其特征在于，所述洋桔梗属植物或其后代是从下述杂交后代产生的细胞质雄性不育植物，所述杂交后代是以具有序列号1或序列号2记载的碱基序列的洋桔梗属植物作为种子亲本、以E.grandiflorum作为花粉亲本而得的杂交后代。
(5)(1)～(4)中任一项所述的洋桔梗属植物或其后代的植物体的一部分。
(6)(1)～(4)中任一项所述的洋桔梗属植物或其后代的种子。
(7)一种愈伤组织，其包含(1)～(4)中任一项所述的洋桔梗属植物或其后代的细胞。
(8)通过从(7)所述的愈伤组织进行诱导、利用组织培养的无性繁殖而得到的洋桔梗属植物或其后代。
(9)(8)所述的洋桔梗属植物或其后代的植物体的一部分。
(10)洋桔梗属植物的制造方法，所述洋桔梗属植物是从(7)所述的愈伤组织进行诱导、利用组织培养的无性繁殖而得到的。
(11)一种细胞质，其是被包含在(1)～(4)及(8)中任一项所述的洋桔梗属植物或其后代、(5)及(9)所述的植物体的一部分、(6)所述的种子、或(7)所述的愈伤组织中的细胞质。
(12)一种线粒体，其是被包含在(1)～(4)及(8)中任一项所述的洋桔梗属植物或其后代、(5)及(9)所述的植物体的一部分、(6)所述的种子、或(7)所述的愈伤组织中的线粒体。
(13)保藏编号为FERM BP-11506的、具有细胞质雄性不育性的洋桔梗属植物或其后代。
(14)(13)所述的洋桔梗属植物或其后代的植物体的一部分。
(15)(13)所述的洋桔梗属植物或其后代的种子。
(16)一种细胞质，其是被包含在(13)所述的洋桔梗属植物或其后代、(14)所述的植物体的一部分、或(15)所述的种子中的细胞质。
(17)一种线粒体，其是被包含在(13)所述的洋桔梗属植物或其后代、(14)所述的植物体的一部分、或(15)所述的种子中的线粒体。
(18)保藏编号为FERM BP-11507的、具有细胞质雄性不育性的洋桔梗属植物的愈伤组织。
(19)通过从(18)所述的愈伤组织进行诱导、利用组织培养的无性繁殖而得到的洋桔梗属植物或其后代。
(20)(19)所述的洋桔梗属植物或其后代的植物体的一部分。
(21)洋桔梗属植物的制造方法，所述洋桔梗属植物是通过从(18)所述的愈伤组织进行诱导、利用组织培养的无性繁殖而得到的。
(22)一种细胞质，其是被包含在(18)所述的愈伤组织、(19)所述的洋桔梗属植物或其后代、或(20)所述的植物体的一部分中的细胞质。
(23)一种线粒体，其是被包含在(18)所述的愈伤组织、(19)所述的洋桔梗属植物或其后代、或(20)所述的植物体的一部分中的线粒体。
(24)杂种第一代种子的制造方法，所述方法包括：将(1)～(4)及(8)中任一项所述的洋桔梗属植物或其后代作为种子亲本、将能够与该植物交配的洋桔梗属植物作为花粉亲本进行交配，从交配后的种子亲本制种杂种第一代种子。
(25)杂种第一代种子的制造方法，所述方法包括：将(13)所述的洋桔梗属植物或其后代作为种子亲本、将能够与该植物交配的洋桔梗属植物作为花粉亲本进行交配，从交配后的种子亲本制种杂种第一代种子。
(26)杂种第一代种子的制造方法，所述方法包括：将从(18)所述的愈伤组织再生的洋桔梗属植物或其后代作为种子亲本、将能够与该植物交配的洋桔梗属植物作为花粉亲本进行交配，从交配后的种子亲本制种杂种第一代种子。
(27)通过(24)～(26)中任一项所述的方法制造的杂种第一代种子。
(28)从(27)所述的杂种第一代种子生长发育出的杂种第一代植物。
(29)洋桔梗属植物的制造方法，其特征在于，通过将在细胞质中具有序列号1或序列号2记载的碱基序列的洋桔梗属植物与具有有用性质的洋桔梗属植物连续回交，从而使制造的洋桔梗属植物具有所述有用性质、并且呈现为细胞质雄性不育性。
(30)洋桔梗属植物的制造方法，其特征在于，通过将保藏编号为FERM BP-11506的具有细胞质雄性不育性的洋桔梗属植物或其后代与具有有用性质的洋桔梗属植物连续回交，从而使制造的洋桔梗属植物具有所述有用性质、并且呈现为细胞质雄性不育性。
(31)洋桔梗属植物的制造方法，其特征在于，通过将从下述愈伤组织进行诱导、利用组织培养的无性繁殖而得到的洋桔梗属植物或其后代与具有有用性质的洋桔梗属植物连续回交，从而使制造的洋桔梗属植物具有所述有用性质、并且呈现为细胞质雄性不育性，所述愈伤组织为保藏编号为FERM BP-11507的、具有细胞质雄性不育性的洋桔梗属植物的愈伤组织。
(32)(29)～(31)中任一项所述的制造方法，其中，具有有用性质的洋桔梗属植物来自E.grandiflorum。
(33)通过(29)～(32)中任一项所述的方法制造的洋桔梗属植物或其后代。
(34)(33)所述的洋桔梗属植物或其后代的植物体的一部分。
通过利用本发明提供的具有细胞质雄性不育性的新型洋桔梗，能够育成制种性、花的保持性和/或鉴赏性优异的洋桔梗及其F1品种，能够进行对其高品质种子的制种。
附图说明
[图1]图1是本发明的细胞质雄性不育洋桔梗和雄性可育的洋桔梗的照片。(A)是雄性可育品系，(B)和(C)是雄蕊发育不完全的细胞质雄性不育品系，(D)是完全不存在雄蕊的细胞质雄性不育品系。
[图2]图2显示以细胞质雄性不育洋桔梗品系(SSE-CMS细胞质：泳道1)、坂田种苗株式会社持有的洋桔梗属野生种(泳道2-8)、及坂田种苗株式会社育成的洋桔梗属栽培种(泳道9-15)的总DNA作为模板实施PCR并进行电泳的结果。M是分子量标志物。(A)标志物1：SSE-CMS洋桔梗品系特异性的标志物；(B)标志物2：SSE-CMS洋桔梗品系特异性的标志物；(C)nad5/4-5：所有洋桔梗属植物共有的标志物。
[图3]图3显示标志物1和标志物2的碱基序列。
具体实施方式
以下，针对本发明进行详细说明。
1、细胞质雄性不育洋桔梗
本发明的具有雄性不育性的洋桔梗的育种方法特征在于，从洋桔梗属植物的杂种选出具有细胞质雄性不育性的洋桔梗。
本发明涉及的“洋桔梗属植物”或“洋桔梗”是龙胆科洋桔梗(Eustoma)属的植物，是在日本以土耳其桔梗的名称为人熟知的园艺作物。
花(以洋桔梗为代表)通常具有萼片和花瓣，在其内侧有雄蕊和雌蕊。典型的雄蕊包含花丝与含有花粉的花药。本发明所涉及的“雄性不育”表示下述状态：因为雄蕊的发育不完全，所以不能充分产生花粉。例如(但非限定性地)，雄蕊完全不存在的状态、雄蕊的发育不完全的状态的洋桔梗呈现为雄性不育性(参见图1)。此外，“细胞质雄性不育”指通过来源于细胞质的细胞器的基因以母系遗传方式遗传的雄性不育性质。
本发明中，“具有细胞质雄性不育性的洋桔梗属植物的后代”表示：通过以具有细胞质雄性不育性的洋桔梗属植物作为雌性亲本(种子亲本)、以能够与该植物交配的洋桔梗属植物作为雄性亲本(花粉亲本)进行交配而得的、通过母系遗传而继承雄性不育性的下一代及更后代的世代的洋桔梗属植物。此外，本发明中，“植物体的一部分”表示包含该植物体的一个以上细胞或来自一个以上细胞的细胞质的“植物体的一部分”，具体而言，表示花、叶、茎、根等器官或组织、或来自这些器官或组织的细胞(包括从细胞制造的原生质体)或细胞质、或上述细胞或细胞质的集合体。
本申请的说明书中，“保藏编号为FERM BP-11506的洋桔梗属植物”的范围中，也包括具有细胞质雄性不育性的性质的、与该植物实质上等同的植物。即，只要维持有细胞质雄性不育性，例如保藏编号为FERM BP-11506的洋桔梗属植物的突变体或基因重组体等也包括在该范围内。
本申请的说明书中，“保藏编号为FERM BP-11507的洋桔梗属植物的愈伤组织”的范围中，也包括：从该愈伤组织再生的植物具有细胞质雄性不育性的性质的、与该愈伤组织实质上等同的愈伤组织。即，只要再生的植物维持有细胞质雄性不育性，例如，来自保藏编号为FERM BP-11507的洋桔梗属植物的愈伤组织的突变体或基因重组体，以及来自维持有细胞质雄性不育性的、保藏编号为FERMBP-11506的洋桔梗属植物的突变体或基因重组体等的愈伤组织也包括在该范围内。
本发明涉及的细胞质雄性不育洋桔梗具有下述特征。
(1)制造杂种第一代交配品种时不需要进行种子亲本的去雄，省时省力，能够经济地进行制种。
(2)与雄性可育品系交配的情况下，后代具有雄性不育性，因此能够供给纯度高的种子。
(3)通过将该品系与细胞核基因组相同、细胞质正常的保持品系进行交配，能够容易地实现品系的保持与增殖。
(4)因为不发生自花授粉，能够抑制授粉导致的花的老化，因此花的保持性好。
(5)因为没有花粉，因此不会因花粉飞散导致花瓣或衣服污损。
2、细胞质雄性不育洋桔梗的制造方法
本发明所涉及的细胞质雄性不育洋桔梗的制造方法中，将洋桔梗属植物的野生种作为雌性亲本、将Eustoma grandiflorum作为雄性亲本进行交配，从它们的杂交后代中选出呈现雄性不育性的个体，进行育种。作为呈现雄性不育性的个体，选出雄蕊完全不存在、或者雄蕊的发育不完全的状态的个体。进而，为了确认雄性不育性是细胞质遗传的性质，将其与雄性可育品系的洋桔梗回交，确认后代植物呈现雄性不育性。
3、杂种第一代种子的制造方法
通过将具有优良性质的洋桔梗属植物与本发明的方法制造的细胞质雄性不育洋桔梗连续回交，作为后代能够得到具有细胞质雄性不育性的优良品系。该具有细胞质雄性不育性的优良品系可作为用于获得杂种第一代种子(F1种子)的种子亲本使用。
4、花的保持性试验
对本发明所涉及的细胞质雄性不育洋桔梗的花的保持性的评价可按照下文所述来实施。需要说明的是，本申请的说明书中，“花的保持性”表示“开花了的花的维持”，因此，“花充满生机”表示“从开始开花到开花结束的开花期相对较长”。通过将通常的雄性可育洋桔梗与细胞质雄性不育洋桔梗在相同环境条件下栽培多株并进行对比评价来判断洋桔梗的开花期是否相对较长。
作为花的保持性试验的一个例子，对评价切花后的花的保持性的方法进行说明。该方法中，首先，将在相同条件下栽培的洋桔梗中的通常的雄性可育个体和雄性不育个体分别准备适当的数量作为试验材料。针对各洋桔梗，在开花日(观察到花瓣打开的日期)当日大致相同时间点，以保留有花柄的状态采花、将花柄部分调整为一定的长度(例如4～6cm左右)。接着，使得经调整的试验材料成为茎的断面浸到水中的状态，静置于恒温(优选18～22℃)、恒湿(优选55～65％)且以12小时明暗周期交替的恒温室内，观察花的外观变化。
“开始开花”被定义为花瓣打开的时间点，并且，从花瓣的外观(花瓣的皱缩、枯萎)来判断·确定“开花结束”，由此测定花的开花期(从开始开花到开花结束的时期)。针对通常的雄性可育个体和雄性不育个体，分别求出测得的开花期的平均值并进行比较，由此可对本发明的雄性不育洋桔梗的花的保持性进行评价。
5、制造基于分子标志物的标识因子
通过在根据本发明制造的细胞质雄性不育洋桔梗品系与以往已知的洋桔梗属植物之间比较线粒体基因组序列、并鉴定细胞质雄性不育洋桔梗品系特异性的区域，从而能够制造成为标识因子的分子标志物。分子标志物的检测可通过PCR法等本领域技术人员公知的方法来进行。通过使用分子标志物，可证实根据本发明的细胞质雄性不育洋桔梗品系不仅在形态特征上、还在分子生物学特征上均与以往已知的洋桔梗属植物明确不同。
作为用于识别本发明的细胞质雄性不育洋桔梗品系的分子标志物，可使用序列号1及序列号2所示的碱基序列。此外，对于具有在序列号1或序列号2记载的碱基序列中缺失、取代或添加一个或数个碱基而得的碱基序列的洋桔梗品系而言，只要该碱基序列能与序列号1或序列号2的碱基序列同样地被扩增和检测，则也可被视为是与本发明的细胞质雄性不育洋桔梗品系实质上相同的品系。例如，作为用于识别细胞质雄性不育洋桔梗品系的分子标志物，可使用与序列号1或序列号2记载的碱基序列具有80％、优选90％、更优选95％以上的同源性的碱基序列。
6、细胞质雄性不育洋桔梗品系的愈伤组织诱导、增殖及再分化
通过本发明制造的细胞质雄性不育洋桔梗品系可通过组织培养法而无性繁殖。例如，可通过非专利文献4中公开的诱导愈伤组织、并使其再分化的方法来使其无性繁殖。
具体而言，通过对温室育成的细胞质雄性不育洋桔梗品系的叶片进行表面杀菌、将其置于愈伤组织诱导培养基中进行培养，来进行愈伤组织诱导。这之后，通过将形成的愈伤组织转移到再分化培养基，诱导根芽。接着，将形成的根芽转移至生根培养基，诱导生根并使得植物体再生。关于用于愈伤组织诱导、增殖和再分化的培养条件，本领域技术人员可遵循已知的技术合适地设定。
本申请说明书中明确引用的所有专利和参考文献的内容全部作为参考并入本说明书中。并且，作为本申请享有的优先权主张的基础申请的日本专利申请2012-213296号(2012年9月27日申请)的说明书及附图记载的内容全部作为参考并入本说明书中。
实施例
通过下述实施例来具体说明本发明，但本发明不受这些实施例的任何限定。
实施例1具有雄性不育性的新型洋桔梗个体的制造
本发明的具有雄性不育性的洋桔梗是从美国引入的种名非特定的野生洋桔梗属植物和Eustoma grandiflorum杂交得到的杂种选出、并在坂田种苗株式会社的三乡试验场制造的。
本发明中的洋桔梗个体的育成过程
在此之前，坂田种苗株式会社持有的种名非特定的野生洋桔梗属植物的十余个品系与同为坂田种苗株式会社持有的来源不同的亲本品系(E.grandiflorum)之间总计60组左右的杂种被制造出来，并获得了F1种子。将这些F1种子播种，确认了表型之后，从F1种群中选出合适的2、3个个体，将它们大量交配(mass crossing)，由此得到后代种子(下文中称为“F2代”)。
将该F2代种子播种，栽培50至100株个体左右，对F2种群中含有的表型性质进行了确认。结果，虽然从几乎所有的F2种群观察到了花径大小、花色花型、早晚性的分离，但来自以坂田种苗株式会社持有的种名非特定的野生洋桔梗属植物中的E-1作为雌性亲本、以亲本品系中的G-1(E.grandiflorum)作为雄性亲本交配得到的F1种子(下文中记为A组)的F2种群中，出乎意料之外地出现了数个呈现出在此前的洋桔梗属植物中未知的雄性不育性质的个体。从中选出1个个体，得到将4个品系G-2、G-3、G-4、G-5(坂田种苗株式会社持有的亲本品系)作为花粉亲本与其交配产生的后代种子(F2BC1代、分别记为B、C、D、E组)。需要说明的是，关于各代的标注，为了避免混乱，以E.grandiflorum回交至CMS品系的次数为准，记为BC1、BC2……。
将这些后代种子(F2BC1代)播种，对各品系12个个体的性质进行了确认，发现在所有的品系及个体中，均呈现出完全不存在雄蕊、或雄蕊的发育不完全的状态的雄性不育性质。选出来自C组的F2BC1代的4个个体(下文中记为ms-1)、来自D组的F2BC1代的2个个体(下文中记为ms-2)、来自E组的F2BC1代的3个个体(下文中记为ms-3)和4个个体(下文中记为ms-4)，针对ms-1以亲本品系G-3和亲本品系G-6作为花粉亲本，针对ms-2以亲本品系G-4和亲本品系G-7作为花粉亲本，针对ms-3以亲本品系G-5和亲本品系G-8作为花粉亲本，针对ms-4以亲本品系G-5和亲本品系G-9作为花粉亲本进行交配，分别得到后代种子(F2BC2代)。
将后代种子(F2BC2代)播种，对后代的表型性质加以确认，在将G-3和G-6与ms-1交配得到的品系的后代种群的一部分中观察到了雄蕊发育不完全的状态的雄性不育个体，除此以外的组合均呈现完全无雄蕊的雄性不育性质。将这些雄性不育个体与大约100个品系的亲本品系交配，得到后代种子(F2BC3代)。
将后代种子(F2BC3代)播种，对后代的表型性质进行了检查，得以确认了雄性不育性质。由此证实了已成功制造出显示稳定的母性遗传的细胞质雄性不育品系，将该细胞质命名为SSE-CMS细胞质。需要说明的是，呈现稳定的细胞质雄性不育的上述F2BC1种子已于2012年7月20日在独立行政法人制品评价技术基盘机构专利生物保藏中心(茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)进行了国际保藏(保藏者提供的供识别标注为08P-81S，保藏编号FERMBP-11506)。
实施例2对雄性不育性的重现性的确认
为了确认雄性不育性质的稳定出现，将前述洋桔梗属植物E-1作为雌性亲本、将亲本品系G-10(E.grandiflorum)作为雄性亲本进行交配，对F1种子(下文中记为F组)进行了制种。对前述的A组和F组进行播种，各自选出6个个体，进行大量交配，由此，来自A组的个体以56个荚0.22g、来自F组的个体以59个荚0.47g的收量得到了F2代种子。将各F2代种子播种，对雄性不育个体的出现频率进行了检查，发现：在来自A组的F2代中，92个个体中有19个个体呈现雄性不育性质，在来自F组的F2代中，88个个体中有14个个体呈现雄性不育性质。
以上的结果显示了雄性不育性质稳定地出现。
实施例3具有雄性不育性的洋桔梗品种的花的保持性试验
对雄性不育品系和可育品系实施了花的保持性试验。
(1)试验材料
关于作为试验材料使用的洋桔梗，使用了2个种类：通常的雄性可育洋桔梗的F1个体和细胞质雄性不育洋桔梗的F1个体。对于上述2个种类的洋桔梗，从洋桔梗栽培苗圃场以保留花柄的状态采集被认为是当日开花的洋桔梗的花，将花柄部分的长度调整为4cm。对雄性可育洋桔梗预计其将输送花粉，将花粉强制授粉至柱头。此外，对于细胞质雄性不育洋桔梗，对强制授粉了雄性可育品系的花粉的个体以及未授粉的个体分别进行试验。
(2)试验方法
花的保持性试验如下进行：将试验材料插入进装满自来水的试管中，以温度20℃、湿度60％(±5％)、普通荧光灯(I型白色快速40W)12小时周期交替开关的恒温室内进行花的保持性试验。需要说明的是，试验中没有特别观察到水的污染，因此没有换水。
(3)评价·判定
“开始开花”被定义为花瓣打开的时间点，而“开花结束”则由进行育种的技术人员从花瓣外观观察到花的皱缩、枯萎来判断、确定。
(4)试验结果
在向细胞质雄性不育的洋桔梗强制授粉可育品系的花粉的情况下，与雄性可育的洋桔梗相比，花的保持性差异不大。因此，证明了该试验是在所用的品系的遗传背景对花的保持性没有影响的条件下进行的。此外发现，细胞质雄性不育的洋桔梗不产生花粉，因此在花的保持性方面，较之雄性可育品系而言，平均来说优秀7天。
[表1]
花的保持性试验
实施例4制造用于识别SSE-CMS洋桔梗品系的标志物
根据本发明制造的SSE-CMS洋桔梗品系展现出以往的栽培品种、野生品种中不存在的表型特性。另一方面，为了从分子生物学侧面证明其为与以往已知的洋桔梗属植物不同的品系，制造了用于识别SSE-CMS洋桔梗品系的分子标志物。
使用非专利文献5记载的线粒体的简并引物，以SSE-CMS洋桔梗品系以及现有的洋桔梗品系为模板，实施了PCR分析，从而发现了扩增出的DNA片段大小不同的标志物。从上述展示出多态性的标志物中，选择nad4L/orf25和nad7/4-5这两种，对扩增片段的碱基序列进行了分析，从而鉴定出了SSE-CMS洋桔梗品系特异性的区域。为了将这些区域作为标识因子，设计了如表2所示的引物，并实施了PCR分析(热变性于94℃进行1分钟，退火于65℃进行1分钟，延伸反应于72℃进行1分钟，上述循环重复30次)，成功制造了能实现仅从SSE-CMS洋桔梗品系扩增DNA片段的两种分子标志物“标志物1”和“标志物2”。标志物1是使用引物orf25-F和orf25-R、从而得以扩增序列号1记载的323bp的DNA片段的标志物(图3)。标志物2是使用引物nad7-F和nad7-R、从而得以扩增序列号2记载的492bp的DNA片段的标志物(图3)。
使用通过上述手段制作的标志物，以坂田种苗株式会社育成的现有的洋桔梗品系(E.grandiflorum)190品系以及坂田种苗株式会社持有的洋桔梗属野生品种34品系为模板，实施了PCR试验，结果发现除SSE-CMS洋桔梗品系以外不存在具有上述两种碱基序列的品系。该试验结果的一部分示于图2。图2(A)～(C)中，在下述条件下进行了实验。
(A)标志物1：SSE-CMS洋桔梗品系特异性的标志物
使用orf25-F和orf25-R引物进行了PCR(热变性于94℃进行1分钟，退火于65℃进行1分钟，延伸反应于72℃进行1分钟，30个循环)，扩增出了序列号1所示的碱基序列(323bp)。
(B)标志物2：SSE-CMS洋桔梗品系特异性的标志物
使用nad7-F和nad7-R引物进行了PCR(热变性于94℃进行1分钟，退火于65℃进行1分钟，延伸反应于72℃进行1分钟，30个循环)，扩增出了序列号2所示的碱基序列(492bp)。
(C)nad5/4-5：所有洋桔梗属植物共有的标志物
使用nad5/4和nad5/5引物进行了PCR(热变性于94℃进行1分钟，退火于65℃进行1分钟，延伸反应于72℃进行1分钟，30个循环)，从所有品系扩增出了约1.5kb的DNA片段。
即，确认了根据本发明制造的SSE-CMS洋桔梗品系是与以往已知的洋桔梗属植物不同的品系。
[表2]
本发明使用的引物及其碱基序列
实施例5SSE-CMS洋桔梗品系的愈伤组织诱导、增殖及再分化
为了通过组织培养法使得根据本发明制造的SSE-CMS洋桔梗品系无性繁殖，采集温室育成的SSE-CMS洋桔梗品系的叶片。使用1％的次氯酸钠溶液对叶片进行10分钟的表面杀菌，用灭菌水进行了漂洗。将经灭菌的叶片置于添加有1.5mg/l NAA的MS培养基上，诱导出愈伤组织。将愈伤组织转移到添加有0.5mg/l GA3、1.5mg/lBA的B5培养基，诱导出根芽。将形成的根芽转移至不含植物激素的B5培养基中，使其生根，再生出植物体，确认了其为雄性不育的植物体。
通过上述方法制造的愈伤组织已于2012年7月26日在独立行政法人制品评价技术基盘机构专利生物保藏中心(茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)进行了国际保藏(保藏者提供的供识别标注为12S-134C，保藏编号FERM BP-11507)。
产业上的可利用性
通过利用本发明提供的具有细胞质雄性不育性的新型洋桔梗，能够育成制种性、花的保持性、鉴赏性优异的洋桔梗及其F1品种，能够进行对其高品质种子的制种。

Claims (9)

1.洋桔梗属植物的制造方法，所述洋桔梗属植物是从下述愈伤组织进行诱导、利用组织培养的无性繁殖而得到的，所述愈伤组织包含具有序列号1或2所述的碱基序列、具有细胞质雄性不育性的洋桔梗属植物或其后代的细胞。
2.洋桔梗属植物的制造方法，所述洋桔梗属植物是通过从保藏编号为FERM BP-11507的、具有细胞质雄性不育性的洋桔梗属植物的愈伤组织进行诱导、利用组织培养的无性繁殖而得到的。
3.杂种第一代种子的制造方法，所述方法包括：将具有序列号1或2所述的碱基序列、具有细胞质雄性不育性的洋桔梗属植物或其后代作为种子亲本、将能够与该植物交配的洋桔梗属植物作为花粉亲本进行交配，从交配后的种子亲本制种杂种第一代种子。
4.杂种第一代种子的制造方法，所述方法包括：将保藏编号为FERM BP-11506的、具有细胞质雄性不育性的洋桔梗属植物或其后代作为种子亲本、将能够与该植物交配的洋桔梗属植物作为花粉亲本进行交配，从交配后的种子亲本制种杂种第一代种子。
5.杂种第一代种子的制造方法，所述方法包括：将从保藏编号为FERM BP-11507的、具有细胞质雄性不育性的洋桔梗属植物的愈伤组织再生的洋桔梗属植物或其后代作为种子亲本、将能够与该植物交配的洋桔梗属植物作为花粉亲本进行交配，从交配后的种子亲本制种杂种第一代种子。
6.洋桔梗属植物的制造方法，其特征在于，通过将在细胞质中具有序列号1或序列号2记载的碱基序列的洋桔梗属植物与具有有用性质的洋桔梗属植物连续回交，从而使制造的洋桔梗属植物具有所述有用性质、并且呈现为细胞质雄性不育性。
7.洋桔梗属植物的制造方法，其特征在于，通过将保藏编号为FERM BP-11506的具有细胞质雄性不育性的洋桔梗属植物或其后代与具有有用性质的洋桔梗属植物连续回交，从而使制造的洋桔梗属植物具有所述有用性质、并且呈现为细胞质雄性不育性。
8.洋桔梗属植物的制造方法，其特征在于，通过将从下述愈伤组织进行诱导、利用组织培养的无性繁殖而得到的洋桔梗属植物或其后代与具有有用性质的洋桔梗属植物连续回交，从而使制造的洋桔梗属植物具有所述有用性质、并且呈现为细胞质雄性不育性，所述愈伤组织为保藏编号为FERM BP-11507的、具有细胞质雄性不育性的洋桔梗属植物的愈伤组织。
9.权利要求6～8中任一项所述的制造方法，其中，具有有用性质的洋桔梗属植物来自E.grandiflorum。
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