ES2247629T3 - Potenciacion de la expresion de un gen. - Google Patents
Potenciacion de la expresion de un gen.Info
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-
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Abstract
UN METODO PARA FAVORECER LA EXPRESION DE UN GEN SELECCIONADO DE UN ORGANISMO AL TIEMPO QUE SE EVITA O REDUCE LA COSUPRESION QUE LLEVA CONSIGO LA SINTESIS DE UN ADN ALTERADO EN LA SECUENCIA DE NUCLEOTIDOS Y QUE ES CAPAZ DE EXPRESAR UNA PROTEINA, PREFERENTEMENTE IDENTICA A LA DE UNA PROTEINA YA EXPRESADA POR UN ADN YA PRESENTE EN EL ORGANISMO. CON ESTE METODO SE ASEGURA QUE LA SIMILITUD DE LA SECUENCIA ENTRE LOS DOS GENES ES LO SUFICIENTEMENTE REDUCIDA COMO PARA ELIMINAR EL FENOMENO DE COSUPRESION, PERMITIENDO LA SOBREEXPRESION DE UNA PROTEINA ESPECIFICA. EL METODO ES PARTICULARMENTE ADECUADO EN PLANTAS.
Description
Potenciación de la expresión de un gen.
Esta invención se refiere a un método y un
material para potenciar o mejorar la expresión de un gen en
organismos, en particular en vegetales. Una aplicación concreta,
pero no exclusiva, de la invención es la potenciación de la
biosíntesis de carotenoides en plantas tales como el tomate
(Lycopersicon spp.).
Para aumentar la producción de una proteína por
un organismo, es una práctica conocida insertar en el genoma del
organismo diana una o más copias adicionales del gen que codifica la
proteína mediante transformación genética. Tales copias serían
normalmente idénticas a un gen que ya está presente en la planta o,
alternativamente, pueden ser copias idénticas de un gen extraño. En
teoría, al expresarse, las copias múltiples de genes deberían hacer
que el organismo produjese la proteína elegida en cantidades
superiores a la normal, lo que se denomina "sobreexpresión".
Sin embargo, hay experimentos que indican que puede resultar una
expresión baja o la no expresión de ciertos genes cuando están
presentes copias múltiples del gen (Napoli et al., 1990 y
Dorlhac de Borne et al., 1994). Este fenómeno se denomina
co-supresión. Ocurre con la mayor frecuencia cuando
se introducen genes recombinantes en una planta que ya contiene un
gen de secuencia de nucleótidos similar. Se ha observado también en
genes de plantas endógenos y elementos transponibles. Los efectos de
la co-supresión no son siempre inmediatos y pueden
estar influidos por factores de desarrollo y ambientales en los
transformantes primarios o en generaciones subsiguientes.
La regla general es transformar plantas con una
secuencia de DNA cuyo uso de codón se aproxima a la frecuencia de
codón usada por la planta. El análisis experimental ha indicado que
la introducción de una segunda copia de un gen idéntico en secuencia
a un gen que está ya en el genoma de la planta puede tener por
resultado (en algunos casos) la expresión del transgén, siendo
inactivados el gen endógeno o ambos genes
(co-supresión). Los mecanismos de cómo ocurre
exactamente la co-supresión no están claros, si bien
hay varias teorías que incorporan los dos bloques pre- y
post-transcripcionales del gen.
Como regla general, la secuencia de nucleótidos
de un gen insertado se "optimiza" en dos aspectos. El uso de
codón del gen insertado se modifica para que se aproxime al uso de
codón preferido de la especie en la que se ha de insertar el gen.
Los genes insertados pueden optimizarse también en relación con el
uso de los nucleótidos con la intención de aproximar la relación de
purina a pirimidina a la que se encuentra comúnmente en la especie
diana. Cuando se transfieren genes de origen bacteriano a plantas,
por ejemplo, es bien sabido que el uso de nucleótidos ha de ser
alterado para evitar regiones altamente adeniladas, comunes en los
genes bacterianos, que pueden ser erróneamente leídas por la
maquinaria de expresión eucariótica como una señal de
poliadenilación que especifica la terminación de la traducción, lo
que da lugar al truncamiento del polipéptido. Todo ello es práctica
común y es completamente lógico que una secuencia insertada deba
imitar el uso de codón y de nucleótidos del organismo diana para
tener una expresión óptima.
Un objeto de la presente invención es
proporcionar medios por los que puede ser evitada o mitigada la
co-supresión.
De acuerdo con la presente invención, se
proporciona un método que mitiga la co-supresión y
de estar forma potencia la expresión de una proteína elegida, por un
organismo que tiene un gen que produce dicha proteína, que comprende
insertar en el genoma de dicho organismo un DNA cuya región de
codificación que define la proteína a producir tiene una secuencia
de nucleótidos que es tal que el RNA producido en la transcripción
es diferente pero la proteína producida en la traducción es la misma
que la expresada por el gen ya presente en el genoma.
También se describe una construcción génica que
comprende por orden un promotor que es operable en un organismo
diana, una región de codificación que codifica una proteína y una
señal de terminación, caracterizada porque la secuencia de
nucleótidos de dicha construcción es tal que el RNA producido en la
transcripción es diferente pero la proteína producida en la
traducción es la misma que la expresada por el gen ya presente en el
genoma.
La secuencia insertada puede tener un promotor
constitutivo o un promotor preferencial de tejido o de
desarrollo.
Se prefiere que el promotor usado en la
construcción insertada sea diferente del usado por el gen ya
presente en el genoma diana. Sin embrago, la evidencia de los
autores de la presente invención sugiere que puede ser suficiente
que sea diferente la región entre los codones de iniciación de la
transcripción y de la traducción, algunas veces denominada "región
interpuesta 5'". En otras palabras, el fenómeno de la
co-supresión está asociado probablemente con la
etapa de transcripción de la expresión en vez de la etapa de
traducción; ocurre en los niveles de DNA o RNA o ambos.
La invención proporciona además plantas
transgénicas que tienen potenciada la capacidad de expresar un gen
elegido y de sembrar y propagar material derivado de dicha
planta.
Esta invención puede aplicarse de un modo general
a la expresión de genes, pero se ilustrará en una realización
específica de la presente invención por un método para potenciar la
expresión del gen de la fitoeno sintetasa que es necesario para la
biosíntesis de carotenoides en las plantas, consiguiéndose dicha
sobreexpresión mediante el uso de un transgén modificado que tiene
una secuencia de nucleótidos diferente de la secuencia endógena.
Preferentemente dicho gen de la fitoeno sintetasa
modificado tiene la secuencia SEC ID No 1.
La invención proporciona además una secuencia de
dirección de cloroplasto modificada, que comprende los nucleótidos 1
a 417 de la SEC ID No 1.
En términos simples, la presente invención
requiere que la expresión de la proteína sea potenciada insertando
una construcción génica que está alterada, con respecto al gen ya
presente en el genoma, maximizando la disimilitud del uso de
nucleótidos al tiempo que se mantiene la identidad de la proteína
codificada. En otras palabras, el concepto es expresar la misma
proteína a partir de genes que tienen secuencias de nucleótidos
diferentes dentro de su región codificadora y, preferentemente,
también la región del promotor. Es deseable aproximar el uso de
nucleótidos (la relación de purina a pirimidina) del gen insertado
al del gen ya presente en el genoma. Los autores de la presente
invención creen también que es deseable evitar el uso de codones en
el gen insertado que son no comunes en el organismo diana y
aproximar el uso de codón global al uso de codón publicado para el
genoma diana.
El grado en el que puede modificarse una
secuencia depende de la frecuencia de los codones degenerados. En
algunos casos puede hacerse una proporción elevada de cambios, en
particular el tercer nucleótido de un triplete, dando por resultado
una baja homología de la secuencia del DNA (y en consecuencia del
RNA) entre el gen insertado y el gen ya presente, mientras que en
otros casos, a causa de la presencia de codones únicos, el número de
cambios de que se dispone puede ser bajo. El número de cambios que
son disponibles puede determinarse fácilmente mediante un estudio de
la secuencia del gen que está ya presente en su degeneración.
Para obtener el gen para la inserción de acuerdo
con la presente invención puede ser necesario sintetizarlo. Los
parámetros generales dentro de los cuales puede elegirse la
secuencia de nucleótidos del gen sintético comparado con el gen ya
presente, son:
- 1.
- Minimizar la similitud de la secuencia de nucleótidos entre el gen sintético y el gen ya presente en el genoma de la planta.
- 2.
- Mantener la identidad de la proteína codificada por la región codificadora.
- 3.
- Mantener aproximadamente el uso de codón óptimo indicado para el genoma diana.
- 4.
- Mantener aproximadamente la misma relación de bases purina a pirimidina.
- 5.
- Cambiar el promotor o, al menos, la región interpuesta 5'.
Los autores de la presente invención han
trabajado con el gen de la fitoeno sintetasa del tomate. La
secuencia de DNA del fitoeno endógeno es conocida (número de entrada
EBML Y00521) y se descubrió que este gen contenía dos errores de
secuenciación hacia el extremo 3'. Estos errores se corrigieron de
la forma siguiente: (1) cancelar la citosina en la posición 1365 y
(2) insertar una citosina en 1421. La secuencia de la fitoeno
sintetasa corregida (Bartley et al., 1992) se da en el
presente texto como SEC ID No 2. Comenzando por esa secuencia
natural, los autores de la presente invención seleccionaron
modificaciones de acuerdo con los parámetros citados antes y
sintetizaron el gen modificado al que denominaron MTOM5, y que tiene
la SEC ID No 1. La figura 1 que se acompaña muestra una alineación
del gen natural y del sintetizado, con los nucleótidos retenidos
indicados por puntos y las alteraciones por rayas. El gen modificado
MTOM5 tiene un 63% de homología en cuanto al DNA, 100% en cuanto a
la proteína, y la proporción de adenina más timidina (es decir, las
purinas) es 54% en el gen modificado, frente a un 58% para la
secuencia natural.
En los listados de secuencia proporcionados con
el presente texto, la SEC ID No 1 es la secuencia de DNA del gen
sintético (TOM5 modificado) denominado MTOM5 en la Figura 1, la SEC
ID No 2 es el gen de la fitoeno sintetasa (Psy) genómico natural
denominado GTOM5 en la Figura 1, y la SEC ID No 3 es el producto de
la traducción tanto de GTOM5 como de MTOM5.
En el tomate (Lycopersicon esculentum), se
ha demostrado que el carotenoide, o sea el licopeno, es el principal
responsable de la coloración roja del fruto desarrollado (Bird et
al., 1991). La producción de una enzima fitoeno sintetasa,
denominada en el presente texto PsyI, es un catalizador importante
en la producción de fitoeno, un precursor del licopeno.
La PsyI cataliza la conversión de geranil geranil
difosfato en fitoeno, la primera etapa dedicada en la biosíntesis de
carotenoides.
La regulación y expresión del gen PsyI activo son
necesarias para la producción de licopeno y por tanto para la
coloración roja del fruto durante la maduración. Esto puede
ilustrarse por el fenotipo de pulpa amarilla de los frutos de tomate
observado en un mutante de origen natural en el que el gen de la
PsyI es inactivo. Además, plantas transgénicas que contienen un
transgén de PsyI antisentido, que específicamente regula por
disminución la expresión de PsyI, han producido también el fenotipo
de la pulpa amarilla del fruto maduro.
Cuando se produjeron plantas transgénicas que
expresan otra copia del gen de PsyI (denominada TOM5) puesto bajo el
control de un promotor constitutivo (que es el promotor 35S del
virus del mosaico de la coliflor), aproximadamente el 30% de los
transformantes primarios produjeron frutos maduros amarillos
indicadores del fenómeno de la co-supresión. Aunque
algunos de los transformantes primarios produjeron un mayor
contenido de carotenoide, las generaciones posteriores no mostraron
este fenotipo, proporcionando así la evidencia de que la
co-supresión no es siempre inmediata y puede ocurrir
en generaciones futuras.
La secuencia de PsyI es conocida y a partir de
ella se determinó la secuencia de aminoácidos.
Con referencia a los datos publicados de
secuencia genética Genbank (Ken-nosuke Wada et
al., 1992), se produjo un DNA sintético alterando la secuencia
de nucleótidos para obtener una que tuviese todavía una frecuencia
razonable de uso de codón en el tomate, y que retuviese la secuencia
de aminoácidos de la PsyI. Se usó un simple intercambio entre
codones en los casos en los que solamente hay dos opciones de codón,
si bien en otros casos los codones fueron cambiados dentro del sesgo
del uso de codón del tomate. El análisis de la secuencia de
nucleótidos indicó que el DNA sintético tiene una similitud de
nucleótidos con la PsyI (TOM5, Bartley et al., 1992) de un
63% y una similitud de secuencia de aminoácidos del 100%.
El gen sintético fue después clonado en vectores
de transformación de plantas bajo el control del promotor 35S. Estos
fueron después transfectados en plantas de tomate mediante
transformación en Agrobacterium, y tanto el gen endógeno como
el sintético parecen expresar la proteína. El análisis de los
transformantes primarios ilustra que no hay ninguna evidencia, tal
como la producción de fruto amarillo, que indique
co-supresión entre los dos genes.
La presente invención se describirá ahora a
título de ilustración en los ejemplos que siguen.
Se modificó la región de codificación del cDNA
que codifica la fitoeno sintetasa del tomate, TOM5 (número de
entrada EMBL Y00521), ya que la secuencia original contenía dos
errores hacia el extremo 3' de la secuencia. La secuencia publicada
por Bartley et al. 1992 (J. Biol. Chem. 267:
5036-5039) para homólogos del cDNA de TOM5 difiere
por tanto de TOM5 (número de entrada EMBL Y00521). Para los fines de
la producción del gen sintético la secuencia usada es una versión
corregida del cDNA de TOM5 que es idéntica a PsyI (Bartley et
al., 1992).
- 1.
- Se consideraron sitios de segmentación con endonucleasa de restricción potenciales dadas las restricciones de la secuencia de aminoácidos. Se introdujeron sitios útiles alrededor del sitio de segmentación de la secuencia diana prevista, para facilitar la subsiguiente manipulación de la secuencia guía.
- 2.
- Se usó un simple canje entre codones en los casos en los que hay solamente dos opciones de codón (p. ej. lisina). En otros casos los codones fueron cambiados dentro del sesgo del uso de codón del tomato, como señalan Ken-nosuke Wada er al. (uso de codón tabulado a partir de los datos de secuencia genética GenBak, 1992, Nucleic Acids Research 20: S2111-2118). Se dio prioridad para reducir la homología y evitar codones no comunes en vez de producir una diseminación representativa del uso de codón.
- 3.
- Se introdujo un sitio BamHI en cualquier extremo de la secuencia para facilitar la clonación en la inicial. En el extremo 5' se pusieron 4A secuencia arriba del ATG de acuerdo con la secuencia de consenso del sitio de inicio de "dicot" (Cavener y Ray 1991, Eukaryotic start and stop translation sites. NAR 19: 3183-3192).
- 4.
- El gen sintético ha sido clonado en el vector pGEM4Z de forma que pueda ser traducido usando SP6.
- 5.
- Se realizaron análisis del sitio de restricción, stemloop y uso de codón, siendo satisfactorios todos los resultados.
- 6.
- La secuencia de TOM5 modificada se denominó CGS48 ó MTOM5.
CGS48 | contenido de AT = 54% |
TOM5 | contenido de AT = 58% |
La homología de nucleótidos entre TOM5 y CGS48 es
del 63%.
La homología de secuencia de aminoácidos es del
100%.
En resumen, la secuencia de TOM5 (Nº de entrada
Y00521) se extrajo de la base de datos GenBank y se modificó para
incorporar las siguientes correcciones: C borrado en 1365, C
insertado en 1421. CGS48 se basa en la CDS de Y00521 modificada y la
secuencia original, aun conservando la homología del producto de la
traducción e intentando mantener el uso de codón óptimo del
tomate.
La CGS48 se dividió en tres partes:
CGS48A: | BamHI/KpnI |
CGS48B: | KpnI/SacI |
CGS48C: | SacI/BamHI |
Las tres se diseñaron para ser clonadas en
fragmentos de EcoRI/HindIII. Las secuencias fueron divididas en
fragmentos de oligonucleótidos después de análisis con ordenador
para dar complementariedad única en las regiones solapantes usadas
para el ensamblaje del gen.
Los oligonucleótidos fueron sintetizados en un
sintetizador de DNA Applied Biosystems 380B usando una química
estándar de cianoetil fosforamidita. Los oligonucleótidos se
purificaron en gel y se ensamblaron en fragmentos de longitud
completa usando los propios procedimientos de los autores de la
presente invención.
Los fragmentos ensamblados se clonaron en pUC18
mediante sus salientes de EcoRI/HindIII.
Los clones se secuenciaron bidireccionalmente
usando cebadores de secuenciación "directa" e "inversa"
junto con los cebadores "de construcción" ("build")
apropiados para las cadenas superior e inferior, usando el método de
terminación de cadena mediada por didesoxi para DNA de plásmido.
Los materiales de inserción procedentes de clones
corregidos CGS48A, B y C fueron aislados mediante digestión con
BamHI/Kpni, Kpni/SacI, SacI/BamHI respectivamente. Los extremos KpnI
y SacI de los fragmentos BamHI/Kpni y SacI/BamHI fueron tratados con
fosfatasa. Los tres fragmentos fueron co-ligados en
un corte BamHI y pGEM4Z tratado con fosfatasa. Los clones con el
tamaño correcto orientados con el extremo 5' del material de
inserción adyacente al sitio SmaI fueron identificados mediante
amplificación con PCR de colonias aisladas y digestión de DNA de
plásmido purificado con una selección de enzimas de restricción.
Se hizo un preparado de DNA de plásmido
purificado con CsCl a partir de uno de estos clones. Este clon
(CGS48) fue secuenciado bidireccionalmente usando cebadores de
secuenciación "directa" e "inversa" junto con los
cebadores "de construcción" apropiados para las cadenas
superior e inferior, usando el método de terminación de cadenas
mediada con didesoxi para DNA de plásmido.
El fragmento de DNA de MTOM5 (CDS48) descrito en
el Ejemplo 1 fue clonado en el vector pJR1Ri (Figura 2) para dar el
clon pRD13 (Figura 3). El clon CGS48 fue digerido con SmaI y XbaI y
después clonado en pJR1Ri que fue cortado con SmaI y XbaI para
producir el clon pRD13.
El vector pRD13 fue transferido a
Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (un microorganismo
ampliamente disponible en tecnología de plantas) y usado para
transformar plantas de tomate. La transformación de segmentos de
tallo de tomate siguió protocolos estándar (p. ej. Bird et
al., Plant Molecular Biology 11, 651-662, 1988).
Las plantas transformadas fueron identificadas por su capacidad para
crecer en un medio que contiene el antibiótico canamicina. Se
regeneraron cuarenta y nueve plantas individuales y se desarrollaron
hasta la madurez. Ninguna de estas plantas produjo frutos que
cambiasen el color a amarillo en vez de rojo al madurar. La
presencia de la construcción pRD13 en todas las plantas se confirmó
por análisis de reacción en cadena de polimerasa. El análisis de
transferencia de DNA en todas las plantas indicó que el número de
copias del material de inserción estaba entre uno y siete. El
análisis de transferencia Northern en el fruto de una planta indicó
que el gen MTOM5 se había expresado. Seis plantas transformantes
fueron autofecundadas para producir progenie. Ninguna de las plantas
de la progenie produjeron frutos que cambiasen de color al amarillo
en vez de al rojo durante la maduración.
Los resultados se resumen en la Tabla 1 que
sigue. La incidencia de frutos amarillos o amarillos/rojos mixtos
(por ejemplo a rayas) es indicadora de la supresión de la síntesis
de fitoeno. Así, con la construcción GTOM5 normal, el 28% de las
plantas transgénicas mostraron el fenotipo
co-suprimido. Todas las plantas que llevan la
construcción MTOM5 modificada de esta invención tenían fruto rojo,
lo que demuestra que en ninguna de ellas había tenido lugar la
co-supresión de la síntesis de fitoeno.
Construcción | ||
nos. 35S-GTOM5 | nos. 35S-MTOM5 | |
Número total de plantas fructíferas | 39 | 49 |
Número de plantas que producen fruto amarillo | 8 | 0 |
Número total de plantas que producen frutos mixtos amarillos | 3 | 0 |
y rojos o cambios temporales | ||
Número de plantas que producen fruto rojo | 28 | 49 |
% de plantas que muestran co-supresión de PsyI | 28% | 0% |
\vskip1.000000\baselineskip
.= la misma base
-= base diferente
Secuencia de DNA: 63% de homología
Secuencia de proteína: 100% de homología
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: ZENECA LIMITED., ...
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TITULO DE LA INVENCIÓN: POTENCIACIÓN DE LA EXPRESIÓN GÉNICA.
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NUMERO DE SECUENCIAS: 3
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN PARA LA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: IP DEPT., ZENECA AGROCHEMICALS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: JEALOTTS HILL RESEARCH STATION
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: BRACKNELL
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: BERKSHIRE
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: GB
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CP: RG42 6ET
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: disco blando
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC compatible IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA: PatentIn Release nº 1.0, ver. 1.25
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NUMERO DE SOLICITUD: WO NO CONOCIDO
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DE ABOGADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: HUSKISSON, FRANK M.
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- REFERENCIA/NUMERO EXPEDIENTE: PPD 50156/WO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: 01344 414822
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1239 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL: DNA SINTÉTICO
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1239 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: LYOPERSICON ESCULENTUM (TOMATE)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: GTOM5 - GEN DE LA FITOENO SINTASA.
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 402 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: LYOPERSICON ESCULENTUM (TOMATE)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- GENOTECA: PRODUCTO DE TRADUCCIÓN DE GTOM5 Y MTOM5
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (9)
1. Un método para mitigar la
co-supresión, y potenciar así la expresión de una
proteína seleccionada, por un organismo que tiene ya un gen que
produce dicha proteína, que comprende insertar en el genoma de dicho
organismo un DNA cuya región codificadora que define la proteína a
producir tiene una secuencia de nucleótidos que es tal que el RNA
producido al tener lugar la transcripción es diferente, pero la
proteína producida en la traducción es la misma que la expresada por
el gen ya presente en el genoma.
2. Un método según la reivindicación 1ª, en el
que el organismo es una planta.
3. Un método según la reivindicación 2ª, en el
que la planta es una planta de tomate.
4. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que el gen elegido es el gen que
codifica la fitoeno sintetasa.
5. Un método según la reivindicación 4ª, en el
que la región de codificación de dicho gen insertado tiene la
secuencia SEC ID No: 1.
6. Un organismo no mamífero que comprende una
construcción génica que comprende por orden un promotor que es
operable en el organismo, una región de codificación que codifica
una proteína y una señal de terminación, caracterizada porque
la secuencia de nucleótidos de dicha construcción es tal que el RNA
producido en la transcripción es diferente pero la proteína
producida en la traducción es la misma que la expresada por un gen
ya presente en el genoma de dicho organismo.
7. Un método para potenciar la expresión de
carotenoides en una planta, que comprende la sobreexpresión en la
planta de una construcción génica que comprende por orden un
promotor que es operable en un organismo diana, una región de
codificación que codifica una proteína y una señal de terminación,
caracterizada porque la secuencia de nucleótidos de dicha
construcción es tal que el RNA producido en la transcripción es
diferente pero la proteína producida en la traducción es la misma
que la expresada por el gen ya presente en el genoma, especificando
dicha región de codificación una enzima necesaria para la
biosíntesis de carotenoides.
8. Un método según la reivindicación 7ª, en el
que el gen modificado especifica fitoeno sintetasa.
9. Una secuencia de dirección de cloroplasto
modificada, que comprende los nucleótidos 1 a 417 de la SEC ID
\hbox{No: 1.}
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