ES2247629T3 - Potenciacion de la expresion de un gen. - Google Patents

Potenciacion de la expresion de un gen.

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Abstract

UN METODO PARA FAVORECER LA EXPRESION DE UN GEN SELECCIONADO DE UN ORGANISMO AL TIEMPO QUE SE EVITA O REDUCE LA COSUPRESION QUE LLEVA CONSIGO LA SINTESIS DE UN ADN ALTERADO EN LA SECUENCIA DE NUCLEOTIDOS Y QUE ES CAPAZ DE EXPRESAR UNA PROTEINA, PREFERENTEMENTE IDENTICA A LA DE UNA PROTEINA YA EXPRESADA POR UN ADN YA PRESENTE EN EL ORGANISMO. CON ESTE METODO SE ASEGURA QUE LA SIMILITUD DE LA SECUENCIA ENTRE LOS DOS GENES ES LO SUFICIENTEMENTE REDUCIDA COMO PARA ELIMINAR EL FENOMENO DE COSUPRESION, PERMITIENDO LA SOBREEXPRESION DE UNA PROTEINA ESPECIFICA. EL METODO ES PARTICULARMENTE ADECUADO EN PLANTAS.

Description

Potenciación de la expresión de un gen.
Esta invención se refiere a un método y un material para potenciar o mejorar la expresión de un gen en organismos, en particular en vegetales. Una aplicación concreta, pero no exclusiva, de la invención es la potenciación de la biosíntesis de carotenoides en plantas tales como el tomate (Lycopersicon spp.).
Para aumentar la producción de una proteína por un organismo, es una práctica conocida insertar en el genoma del organismo diana una o más copias adicionales del gen que codifica la proteína mediante transformación genética. Tales copias serían normalmente idénticas a un gen que ya está presente en la planta o, alternativamente, pueden ser copias idénticas de un gen extraño. En teoría, al expresarse, las copias múltiples de genes deberían hacer que el organismo produjese la proteína elegida en cantidades superiores a la normal, lo que se denomina "sobreexpresión". Sin embargo, hay experimentos que indican que puede resultar una expresión baja o la no expresión de ciertos genes cuando están presentes copias múltiples del gen (Napoli et al., 1990 y Dorlhac de Borne et al., 1994). Este fenómeno se denomina co-supresión. Ocurre con la mayor frecuencia cuando se introducen genes recombinantes en una planta que ya contiene un gen de secuencia de nucleótidos similar. Se ha observado también en genes de plantas endógenos y elementos transponibles. Los efectos de la co-supresión no son siempre inmediatos y pueden estar influidos por factores de desarrollo y ambientales en los transformantes primarios o en generaciones subsiguientes.
La regla general es transformar plantas con una secuencia de DNA cuyo uso de codón se aproxima a la frecuencia de codón usada por la planta. El análisis experimental ha indicado que la introducción de una segunda copia de un gen idéntico en secuencia a un gen que está ya en el genoma de la planta puede tener por resultado (en algunos casos) la expresión del transgén, siendo inactivados el gen endógeno o ambos genes (co-supresión). Los mecanismos de cómo ocurre exactamente la co-supresión no están claros, si bien hay varias teorías que incorporan los dos bloques pre- y post-transcripcionales del gen.
Como regla general, la secuencia de nucleótidos de un gen insertado se "optimiza" en dos aspectos. El uso de codón del gen insertado se modifica para que se aproxime al uso de codón preferido de la especie en la que se ha de insertar el gen. Los genes insertados pueden optimizarse también en relación con el uso de los nucleótidos con la intención de aproximar la relación de purina a pirimidina a la que se encuentra comúnmente en la especie diana. Cuando se transfieren genes de origen bacteriano a plantas, por ejemplo, es bien sabido que el uso de nucleótidos ha de ser alterado para evitar regiones altamente adeniladas, comunes en los genes bacterianos, que pueden ser erróneamente leídas por la maquinaria de expresión eucariótica como una señal de poliadenilación que especifica la terminación de la traducción, lo que da lugar al truncamiento del polipéptido. Todo ello es práctica común y es completamente lógico que una secuencia insertada deba imitar el uso de codón y de nucleótidos del organismo diana para tener una expresión óptima.
Un objeto de la presente invención es proporcionar medios por los que puede ser evitada o mitigada la co-supresión.
De acuerdo con la presente invención, se proporciona un método que mitiga la co-supresión y de estar forma potencia la expresión de una proteína elegida, por un organismo que tiene un gen que produce dicha proteína, que comprende insertar en el genoma de dicho organismo un DNA cuya región de codificación que define la proteína a producir tiene una secuencia de nucleótidos que es tal que el RNA producido en la transcripción es diferente pero la proteína producida en la traducción es la misma que la expresada por el gen ya presente en el genoma.
También se describe una construcción génica que comprende por orden un promotor que es operable en un organismo diana, una región de codificación que codifica una proteína y una señal de terminación, caracterizada porque la secuencia de nucleótidos de dicha construcción es tal que el RNA producido en la transcripción es diferente pero la proteína producida en la traducción es la misma que la expresada por el gen ya presente en el genoma.
La secuencia insertada puede tener un promotor constitutivo o un promotor preferencial de tejido o de desarrollo.
Se prefiere que el promotor usado en la construcción insertada sea diferente del usado por el gen ya presente en el genoma diana. Sin embrago, la evidencia de los autores de la presente invención sugiere que puede ser suficiente que sea diferente la región entre los codones de iniciación de la transcripción y de la traducción, algunas veces denominada "región interpuesta 5'". En otras palabras, el fenómeno de la co-supresión está asociado probablemente con la etapa de transcripción de la expresión en vez de la etapa de traducción; ocurre en los niveles de DNA o RNA o ambos.
La invención proporciona además plantas transgénicas que tienen potenciada la capacidad de expresar un gen elegido y de sembrar y propagar material derivado de dicha planta.
Esta invención puede aplicarse de un modo general a la expresión de genes, pero se ilustrará en una realización específica de la presente invención por un método para potenciar la expresión del gen de la fitoeno sintetasa que es necesario para la biosíntesis de carotenoides en las plantas, consiguiéndose dicha sobreexpresión mediante el uso de un transgén modificado que tiene una secuencia de nucleótidos diferente de la secuencia endógena.
Preferentemente dicho gen de la fitoeno sintetasa modificado tiene la secuencia SEC ID No 1.
La invención proporciona además una secuencia de dirección de cloroplasto modificada, que comprende los nucleótidos 1 a 417 de la SEC ID No 1.
En términos simples, la presente invención requiere que la expresión de la proteína sea potenciada insertando una construcción génica que está alterada, con respecto al gen ya presente en el genoma, maximizando la disimilitud del uso de nucleótidos al tiempo que se mantiene la identidad de la proteína codificada. En otras palabras, el concepto es expresar la misma proteína a partir de genes que tienen secuencias de nucleótidos diferentes dentro de su región codificadora y, preferentemente, también la región del promotor. Es deseable aproximar el uso de nucleótidos (la relación de purina a pirimidina) del gen insertado al del gen ya presente en el genoma. Los autores de la presente invención creen también que es deseable evitar el uso de codones en el gen insertado que son no comunes en el organismo diana y aproximar el uso de codón global al uso de codón publicado para el genoma diana.
El grado en el que puede modificarse una secuencia depende de la frecuencia de los codones degenerados. En algunos casos puede hacerse una proporción elevada de cambios, en particular el tercer nucleótido de un triplete, dando por resultado una baja homología de la secuencia del DNA (y en consecuencia del RNA) entre el gen insertado y el gen ya presente, mientras que en otros casos, a causa de la presencia de codones únicos, el número de cambios de que se dispone puede ser bajo. El número de cambios que son disponibles puede determinarse fácilmente mediante un estudio de la secuencia del gen que está ya presente en su degeneración.
Para obtener el gen para la inserción de acuerdo con la presente invención puede ser necesario sintetizarlo. Los parámetros generales dentro de los cuales puede elegirse la secuencia de nucleótidos del gen sintético comparado con el gen ya presente, son:
1.
Minimizar la similitud de la secuencia de nucleótidos entre el gen sintético y el gen ya presente en el genoma de la planta.
2.
Mantener la identidad de la proteína codificada por la región codificadora.
3.
Mantener aproximadamente el uso de codón óptimo indicado para el genoma diana.
4.
Mantener aproximadamente la misma relación de bases purina a pirimidina.
5.
Cambiar el promotor o, al menos, la región interpuesta 5'.
Los autores de la presente invención han trabajado con el gen de la fitoeno sintetasa del tomate. La secuencia de DNA del fitoeno endógeno es conocida (número de entrada EBML Y00521) y se descubrió que este gen contenía dos errores de secuenciación hacia el extremo 3'. Estos errores se corrigieron de la forma siguiente: (1) cancelar la citosina en la posición 1365 y (2) insertar una citosina en 1421. La secuencia de la fitoeno sintetasa corregida (Bartley et al., 1992) se da en el presente texto como SEC ID No 2. Comenzando por esa secuencia natural, los autores de la presente invención seleccionaron modificaciones de acuerdo con los parámetros citados antes y sintetizaron el gen modificado al que denominaron MTOM5, y que tiene la SEC ID No 1. La figura 1 que se acompaña muestra una alineación del gen natural y del sintetizado, con los nucleótidos retenidos indicados por puntos y las alteraciones por rayas. El gen modificado MTOM5 tiene un 63% de homología en cuanto al DNA, 100% en cuanto a la proteína, y la proporción de adenina más timidina (es decir, las purinas) es 54% en el gen modificado, frente a un 58% para la secuencia natural.
En los listados de secuencia proporcionados con el presente texto, la SEC ID No 1 es la secuencia de DNA del gen sintético (TOM5 modificado) denominado MTOM5 en la Figura 1, la SEC ID No 2 es el gen de la fitoeno sintetasa (Psy) genómico natural denominado GTOM5 en la Figura 1, y la SEC ID No 3 es el producto de la traducción tanto de GTOM5 como de MTOM5.
En el tomate (Lycopersicon esculentum), se ha demostrado que el carotenoide, o sea el licopeno, es el principal responsable de la coloración roja del fruto desarrollado (Bird et al., 1991). La producción de una enzima fitoeno sintetasa, denominada en el presente texto PsyI, es un catalizador importante en la producción de fitoeno, un precursor del licopeno.
La PsyI cataliza la conversión de geranil geranil difosfato en fitoeno, la primera etapa dedicada en la biosíntesis de carotenoides.
La regulación y expresión del gen PsyI activo son necesarias para la producción de licopeno y por tanto para la coloración roja del fruto durante la maduración. Esto puede ilustrarse por el fenotipo de pulpa amarilla de los frutos de tomate observado en un mutante de origen natural en el que el gen de la PsyI es inactivo. Además, plantas transgénicas que contienen un transgén de PsyI antisentido, que específicamente regula por disminución la expresión de PsyI, han producido también el fenotipo de la pulpa amarilla del fruto maduro.
Cuando se produjeron plantas transgénicas que expresan otra copia del gen de PsyI (denominada TOM5) puesto bajo el control de un promotor constitutivo (que es el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor), aproximadamente el 30% de los transformantes primarios produjeron frutos maduros amarillos indicadores del fenómeno de la co-supresión. Aunque algunos de los transformantes primarios produjeron un mayor contenido de carotenoide, las generaciones posteriores no mostraron este fenotipo, proporcionando así la evidencia de que la co-supresión no es siempre inmediata y puede ocurrir en generaciones futuras.
La secuencia de PsyI es conocida y a partir de ella se determinó la secuencia de aminoácidos.
Con referencia a los datos publicados de secuencia genética Genbank (Ken-nosuke Wada et al., 1992), se produjo un DNA sintético alterando la secuencia de nucleótidos para obtener una que tuviese todavía una frecuencia razonable de uso de codón en el tomate, y que retuviese la secuencia de aminoácidos de la PsyI. Se usó un simple intercambio entre codones en los casos en los que solamente hay dos opciones de codón, si bien en otros casos los codones fueron cambiados dentro del sesgo del uso de codón del tomate. El análisis de la secuencia de nucleótidos indicó que el DNA sintético tiene una similitud de nucleótidos con la PsyI (TOM5, Bartley et al., 1992) de un 63% y una similitud de secuencia de aminoácidos del 100%.
El gen sintético fue después clonado en vectores de transformación de plantas bajo el control del promotor 35S. Estos fueron después transfectados en plantas de tomate mediante transformación en Agrobacterium, y tanto el gen endógeno como el sintético parecen expresar la proteína. El análisis de los transformantes primarios ilustra que no hay ninguna evidencia, tal como la producción de fruto amarillo, que indique co-supresión entre los dos genes.
La presente invención se describirá ahora a título de ilustración en los ejemplos que siguen.
Ejemplo 1
Se modificó la región de codificación del cDNA que codifica la fitoeno sintetasa del tomate, TOM5 (número de entrada EMBL Y00521), ya que la secuencia original contenía dos errores hacia el extremo 3' de la secuencia. La secuencia publicada por Bartley et al. 1992 (J. Biol. Chem. 267: 5036-5039) para homólogos del cDNA de TOM5 difiere por tanto de TOM5 (número de entrada EMBL Y00521). Para los fines de la producción del gen sintético la secuencia usada es una versión corregida del cDNA de TOM5 que es idéntica a PsyI (Bartley et al., 1992).
Diseño de la secuencia
1.
Se consideraron sitios de segmentación con endonucleasa de restricción potenciales dadas las restricciones de la secuencia de aminoácidos. Se introdujeron sitios útiles alrededor del sitio de segmentación de la secuencia diana prevista, para facilitar la subsiguiente manipulación de la secuencia guía.
2.
Se usó un simple canje entre codones en los casos en los que hay solamente dos opciones de codón (p. ej. lisina). En otros casos los codones fueron cambiados dentro del sesgo del uso de codón del tomato, como señalan Ken-nosuke Wada er al. (uso de codón tabulado a partir de los datos de secuencia genética GenBak, 1992, Nucleic Acids Research 20: S2111-2118). Se dio prioridad para reducir la homología y evitar codones no comunes en vez de producir una diseminación representativa del uso de codón.
3.
Se introdujo un sitio BamHI en cualquier extremo de la secuencia para facilitar la clonación en la inicial. En el extremo 5' se pusieron 4A secuencia arriba del ATG de acuerdo con la secuencia de consenso del sitio de inicio de "dicot" (Cavener y Ray 1991, Eukaryotic start and stop translation sites. NAR 19: 3183-3192).
4.
El gen sintético ha sido clonado en el vector pGEM4Z de forma que pueda ser traducido usando SP6.
5.
Se realizaron análisis del sitio de restricción, stemloop y uso de codón, siendo satisfactorios todos los resultados.
6.
La secuencia de TOM5 modificada se denominó CGS48 ó MTOM5.
Análisis de la secuencia
CGS48 contenido de AT = 54%
TOM5 contenido de AT = 58%
La homología de nucleótidos entre TOM5 y CGS48 es del 63%.
La homología de secuencia de aminoácidos es del 100%.
En resumen, la secuencia de TOM5 (Nº de entrada Y00521) se extrajo de la base de datos GenBank y se modificó para incorporar las siguientes correcciones: C borrado en 1365, C insertado en 1421. CGS48 se basa en la CDS de Y00521 modificada y la secuencia original, aun conservando la homología del producto de la traducción e intentando mantener el uso de codón óptimo del tomate.
Ensamblaje de CGS48
La CGS48 se dividió en tres partes:
CGS48A: BamHI/KpnI
CGS48B: KpnI/SacI
CGS48C: SacI/BamHI
Las tres se diseñaron para ser clonadas en fragmentos de EcoRI/HindIII. Las secuencias fueron divididas en fragmentos de oligonucleótidos después de análisis con ordenador para dar complementariedad única en las regiones solapantes usadas para el ensamblaje del gen.
Los oligonucleótidos fueron sintetizados en un sintetizador de DNA Applied Biosystems 380B usando una química estándar de cianoetil fosforamidita. Los oligonucleótidos se purificaron en gel y se ensamblaron en fragmentos de longitud completa usando los propios procedimientos de los autores de la presente invención.
Los fragmentos ensamblados se clonaron en pUC18 mediante sus salientes de EcoRI/HindIII.
Los clones se secuenciaron bidireccionalmente usando cebadores de secuenciación "directa" e "inversa" junto con los cebadores "de construcción" ("build") apropiados para las cadenas superior e inferior, usando el método de terminación de cadena mediada por didesoxi para DNA de plásmido.
Los materiales de inserción procedentes de clones corregidos CGS48A, B y C fueron aislados mediante digestión con BamHI/Kpni, Kpni/SacI, SacI/BamHI respectivamente. Los extremos KpnI y SacI de los fragmentos BamHI/Kpni y SacI/BamHI fueron tratados con fosfatasa. Los tres fragmentos fueron co-ligados en un corte BamHI y pGEM4Z tratado con fosfatasa. Los clones con el tamaño correcto orientados con el extremo 5' del material de inserción adyacente al sitio SmaI fueron identificados mediante amplificación con PCR de colonias aisladas y digestión de DNA de plásmido purificado con una selección de enzimas de restricción.
Se hizo un preparado de DNA de plásmido purificado con CsCl a partir de uno de estos clones. Este clon (CGS48) fue secuenciado bidireccionalmente usando cebadores de secuenciación "directa" e "inversa" junto con los cebadores "de construcción" apropiados para las cadenas superior e inferior, usando el método de terminación de cadenas mediada con didesoxi para DNA de plásmido.
Ejemplo 2 Construcción del vector MTOM 5 con el promotor CaMV 35S
El fragmento de DNA de MTOM5 (CDS48) descrito en el Ejemplo 1 fue clonado en el vector pJR1Ri (Figura 2) para dar el clon pRD13 (Figura 3). El clon CGS48 fue digerido con SmaI y XbaI y después clonado en pJR1Ri que fue cortado con SmaI y XbaI para producir el clon pRD13.
Ejemplo 3 Generación y análisis de plantas transformadas con el vector pRD13
El vector pRD13 fue transferido a Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (un microorganismo ampliamente disponible en tecnología de plantas) y usado para transformar plantas de tomate. La transformación de segmentos de tallo de tomate siguió protocolos estándar (p. ej. Bird et al., Plant Molecular Biology 11, 651-662, 1988). Las plantas transformadas fueron identificadas por su capacidad para crecer en un medio que contiene el antibiótico canamicina. Se regeneraron cuarenta y nueve plantas individuales y se desarrollaron hasta la madurez. Ninguna de estas plantas produjo frutos que cambiasen el color a amarillo en vez de rojo al madurar. La presencia de la construcción pRD13 en todas las plantas se confirmó por análisis de reacción en cadena de polimerasa. El análisis de transferencia de DNA en todas las plantas indicó que el número de copias del material de inserción estaba entre uno y siete. El análisis de transferencia Northern en el fruto de una planta indicó que el gen MTOM5 se había expresado. Seis plantas transformantes fueron autofecundadas para producir progenie. Ninguna de las plantas de la progenie produjeron frutos que cambiasen de color al amarillo en vez de al rojo durante la maduración.
Los resultados se resumen en la Tabla 1 que sigue. La incidencia de frutos amarillos o amarillos/rojos mixtos (por ejemplo a rayas) es indicadora de la supresión de la síntesis de fitoeno. Así, con la construcción GTOM5 normal, el 28% de las plantas transgénicas mostraron el fenotipo co-suprimido. Todas las plantas que llevan la construcción MTOM5 modificada de esta invención tenían fruto rojo, lo que demuestra que en ninguna de ellas había tenido lugar la co-supresión de la síntesis de fitoeno.
TABLA 1
Construcción
nos. 35S-GTOM5 nos. 35S-MTOM5
Número total de plantas fructíferas 39 49
Número de plantas que producen fruto amarillo 8 0
Número total de plantas que producen frutos mixtos amarillos 3 0
y rojos o cambios temporales
Número de plantas que producen fruto rojo 28 49
% de plantas que muestran co-supresión de PsyI 28% 0% 
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 1 Alineación de la secuencia de TOM5 modificado, con el MTOM5 sintético
1
2
3
4
5
.= la misma base
-= base diferente
Secuencia de DNA: 63% de homología
Secuencia de proteína: 100% de homología
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE: ZENECA LIMITED., ...
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TITULO DE LA INVENCIÓN: POTENCIACIÓN DE LA EXPRESIÓN GÉNICA.
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NUMERO DE SECUENCIAS: 3
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DIRECCIÓN PARA LA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESTINATARIO: IP DEPT., ZENECA AGROCHEMICALS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: JEALOTTS HILL RESEARCH STATION
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: BRACKNELL
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO: BERKSHIRE
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: GB
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CP: RG42 6ET
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: disco blando
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: PC compatible IBM
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
PROGRAMA: PatentIn Release nº 1.0, ver. 1.25
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
DATOS SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NUMERO DE SOLICITUD: WO NO CONOCIDO
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
INFORMACIÓN DE ABOGADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: HUSKISSON, FRANK M.
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
REFERENCIA/NUMERO EXPEDIENTE: PPD 50156/WO
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TELÉFONO: 01344 414822
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1239 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
AISLADO INDIVIDUAL: DNA SINTÉTICO
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No: 1:
6
7 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1239 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: LYOPERSICON ESCULENTUM (TOMATE)
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLON: GTOM5 - GEN DE LA FITOENO SINTASA.
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
8
9 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 402 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: LYOPERSICON ESCULENTUM (TOMATE)
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
GENOTECA: PRODUCTO DE TRADUCCIÓN DE GTOM5 Y MTOM5
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
10
11
12

Claims (9)

1. Un método para mitigar la co-supresión, y potenciar así la expresión de una proteína seleccionada, por un organismo que tiene ya un gen que produce dicha proteína, que comprende insertar en el genoma de dicho organismo un DNA cuya región codificadora que define la proteína a producir tiene una secuencia de nucleótidos que es tal que el RNA producido al tener lugar la transcripción es diferente, pero la proteína producida en la traducción es la misma que la expresada por el gen ya presente en el genoma.
2. Un método según la reivindicación 1ª, en el que el organismo es una planta.
3. Un método según la reivindicación 2ª, en el que la planta es una planta de tomate.
4. Un método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el gen elegido es el gen que codifica la fitoeno sintetasa.
5. Un método según la reivindicación 4ª, en el que la región de codificación de dicho gen insertado tiene la secuencia SEC ID No: 1.
6. Un organismo no mamífero que comprende una construcción génica que comprende por orden un promotor que es operable en el organismo, una región de codificación que codifica una proteína y una señal de terminación, caracterizada porque la secuencia de nucleótidos de dicha construcción es tal que el RNA producido en la transcripción es diferente pero la proteína producida en la traducción es la misma que la expresada por un gen ya presente en el genoma de dicho organismo.
7. Un método para potenciar la expresión de carotenoides en una planta, que comprende la sobreexpresión en la planta de una construcción génica que comprende por orden un promotor que es operable en un organismo diana, una región de codificación que codifica una proteína y una señal de terminación, caracterizada porque la secuencia de nucleótidos de dicha construcción es tal que el RNA producido en la transcripción es diferente pero la proteína producida en la traducción es la misma que la expresada por el gen ya presente en el genoma, especificando dicha región de codificación una enzima necesaria para la biosíntesis de carotenoides.
8. Un método según la reivindicación 7ª, en el que el gen modificado especifica fitoeno sintetasa.
9. Una secuencia de dirección de cloroplasto modificada, que comprende los nucleótidos 1 a 417 de la SEC ID 
\hbox{No: 1.}
ES97924102T 1996-06-07 1997-05-23 Potenciacion de la expresion de un gen. Expired - Lifetime ES2247629T3 (es)

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Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6229066B1 (en) 1997-07-30 2001-05-08 The Curators Of The University Of Missouri Cytokinin oxidase
AU3749199A (en) * 1998-04-24 1999-11-16 E.I. Du Pont De Nemours And Company Carotenoid biosynthesis enzymes
US6635806B1 (en) 1998-05-14 2003-10-21 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for expression of transgenes in plants
AU5346099A (en) 1998-08-10 2000-03-06 Monsanto Company Methods for controlling gibberellin levels
FR2796395B1 (fr) * 1999-07-16 2004-05-28 Aventis Cropscience Sa Nouveau gene sgs3 de plante et son utilisation
FR2804128A1 (fr) * 2000-01-26 2001-07-27 Rhobio Nouveau gene sgs2 de plante et son utilisation
US7122720B2 (en) 2001-04-24 2006-10-17 Cornell Research Foundation, Inc. Synthetic nucleic acid molecule for imparting multiple traits
CN1681923B (zh) 2002-07-18 2010-06-02 孟山都技术有限公司 利用人工的多核苷酸及其组合物来减少转基因沉默的方法
US7663021B2 (en) * 2002-12-06 2010-02-16 Del Monte Fresh Produce Company Transgenic pineapple plants with modified carotenoid levels and methods of their production
ES2376868T3 (es) * 2002-12-06 2012-03-20 Del Monte Fresh Produce Company Plantas de piña transgénicas que presentan concentraciones modificadas de carotenoides y procedimiento de fabricación
US7741541B2 (en) * 2003-07-07 2010-06-22 University Of Delhi South Campus Method for obtaining improved fertility restorer lines for transgenic male sterile crop plants and a DNA construct for use in said method
AU2006236392B2 (en) * 2005-04-15 2011-07-21 Del Monte Fresh Produce Company Plant promoters, terminators, genes, vectors and related transformed plants
US7592504B2 (en) * 2005-06-17 2009-09-22 Boyce Thompson Istitute For Plant Research, Inc. Methods for determining specificity of RNA silencing and for genetic analysis of the silenced gene or protein
US8334430B2 (en) 2005-10-13 2012-12-18 Monsanto Technology Llc Methods for producing hybrid seed
ES2332690B1 (es) * 2008-07-24 2011-01-28 Fundacion Para El Desarrollo De La Investigacion En Genomica Y Proteomica Promotor constitutivo de solanum lycopersicum.
MX354471B (es) 2011-07-01 2018-03-07 Monsanto Technology Llc Métodos y composiciones para la regulación selectiva de la expresión de proteínas.
AU2016290214B2 (en) * 2015-07-06 2022-07-14 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. Tomato plants having fruit with yellow and red segments

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5922602A (en) * 1988-02-26 1999-07-13 Biosource Technologies, Inc. Cytoplasmic inhibition of gene expression
EP0428572A1 (en) * 1988-07-29 1991-05-29 Washington University School Of Medicine Producing commercially valuable polypeptides with genetically transformed endosperm tissue
WO1990002184A1 (en) * 1988-08-19 1990-03-08 The Upjohn Company Potyvirus coat protein genes and plants transformed therewith
GB8928179D0 (en) * 1989-12-13 1990-02-14 Ici Plc Dna,constructs,cells and plants derived therefrom
US5618988A (en) * 1990-03-02 1997-04-08 Amoco Corporation Enhanced carotenoid accumulation in storage organs of genetically engineered plants
US5723747A (en) * 1991-02-22 1998-03-03 Calgene, Inc. Wax esters in transformed plants
WO1994009143A1 (en) * 1992-10-15 1994-04-28 Mogen International N.V. Genetic moderation or restoration of plant phenotypes
GB9314261D0 (en) * 1993-07-09 1993-08-18 Zeneca Ltd Dwarf plants
EP0771353A1 (en) * 1994-07-18 1997-05-07 Zeneca Limited Dna, constructs, cells and plants derived therefrom
US5795737A (en) * 1994-09-19 1998-08-18 The General Hospital Corporation High level expression of proteins

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EP0906435A1 (en) 1999-04-07
GB9611981D0 (en) 1996-08-07

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