ES2246210T3

ES2246210T3 - Inhibicion citoplasmatica de la expresion genetica.

Info

Publication number: ES2246210T3
Application number: ES00127988T
Authority: ES
Inventors: Jonathan Donson; Guy Della-Cioppa; Monto Kumagai
Original assignee: Large Scale Biology Corp
Current assignee: Large Scale Biology Corp
Priority date: 1994-06-16
Filing date: 1995-05-26
Publication date: 2006-02-16
Anticipated expiration: 2015-05-26
Also published as: ZA954451B; US20020155605A1; EP0804600A1; EP1087017B1; US20010006797A1; WO1995034668A3; MX9606476A; DE69527654D1; JPH10501968A; US20050204422A1; ATE221574T1; AU2653495A; CA2193094C; ATE303446T1; CA2193094A1; AU710588B2; EP1087017A3; US6376752B1; US5922602A; EP0804600B1

Abstract

Vector genético viral derivado de un virus de cadena sencilla positivo, que puede replicarse en el citoplasma de una célula vegetal, que comprende: a) un primer promotor subgenómico de virus de plantas en combinación funcional con una primera secuencia de ácido nucleico que codifica para un ARN antisentido o un ARN co-supresor específico para un gen de interés en una planta en la que la transcripción de la primera secuencia de ácido nucleico está regulada por el primer promotor subgenómico del virus de plantas; y b) un segundo promotor subgenómico de virus de plantas unido operativamente a una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteína de la cubierta de virus de plantas en la que la transcripción de la segunda secuencia de ácido nucleico está regulada por el segundo promotor subgenómico de virus de planta.

Description

Inhibición citoplasmática de la expresión génica.

Campo de la invención

Esta invención es en el campo de una regulación génica mediante moléculas de ARN inhibidoras producidas endógenamente de ARN antisentido, tales como ARN antisentido y ARN co-supresor.

Antecedentes

Uno de los principales objetivos de la ingeniería genética ha sido controlar la expresión de genes seleccionados en organismos eucariotas de interés. Aunque ha sido relativamente sencillo insertar nuevos genes para su expresión en células eucariotas, la selección de la diana de los genes endógenos para la expresión reducida ha sido más difícil de lograr. La inactivación dirigida al sitio de genes en organismos superiores ha requerido manipulaciones genéticas extremadamente complejas y no es aplicable a una amplia variedad de organismos. Un método que reduce la expresión de genes específicos en organismos eucariotas ha sido mediante el uso de ARN antisentido y mediante la co-supresión.

El ARN antisentido se ha utilizado para reducir la expresión de genes preseleccionados tanto en plantas como en animales. Pueden encontrarse descripciones del uso del ARN antisentido para reducir la expresión de genes seleccionados en plantas, entre otro documentos, en la patente de los EE.UU. número 5.107.065, Smith et al. Nature 334: 724-726 (1988), Van der Krol et al., Nature 333: 866-869 (1988), Rothstein et al., Proc. Natl. Aca. Sci. USA 84:8439-8443 (1987), Bird et al., Bio/Technology 9:635-639 (1991), Bartley et al. Biol. Chem. 267:5036-5039 (1992), y Gray et al., Plant Mol. Bio. 19:69-87 (1992).

Otro método para reducir la expresión de genes específicos en organismos eucariotas es mediante el uso de ARN co-supresor. El ARN co-supresor, a diferencia del ARN antisentido, está en la misma orientación que el ARN transcrito a partir del gen diana, es decir, la orientación "sentido".

Es posible que las rutas bioquímicas en las plantas transfectadas con virus híbridos pudieran alterarse mediante la producción en exceso de una enzima que participe en la etapa limitante de la velocidad, o inhibiendo la síntesis de una enzima mediante ARN antisentido. Aunque la expresión de numerosos genes en plantas transgénicas se ha reprimido por ARN antisentido, el mecanismo y la localización reales de la inhibición no se conocen. En el núcleo el ARN antisentido puede interferir directamente con la transcripción o formar dúplex con el ARN heterogéneo nuclear (ARNhn). Hay evidencia de que la inhibición de genes endógenos puede producirse en plantas transgénicas que contienen ARN sentido (A.R. van der Krol et al., Nature 333:866-869 (1988) y C. Napoli et al., Plant cell 2:279-289 (1990)). Se cree que el mecanismo de esta regulación por disminución o "co-supresión" está producida por la producción de ARN antisentido mediante la lectura a través de la transcripción a partir de promotores distales situados en las cadenas opuestas del ADN cromosómico (Greison, et al. Trends in Biotech. 9:122-123 (1991)). Alternativamente, en el citoplasma, el ARN antisentido puede formar una molécula de doble cadena con el ARNm complementario y evitar la traducción del ARNm en proteínas.

Se han utilizado vectores derivados de virus de plantas que contienen ADN de doble cadena y que comprenden promotores virales en combinación funcional con una secuencia de ácido nucleico que codifica para ARN antisentido o co-supresor para inhibir la expresión de genes de plantas individuales (Bird et al., WO-A-91 09128) o para proporcionar la inhibición coordinada de múltiples genes (Barron et al., WO-A-93 23551). No se ha descrito el uso de vectores derivados de virus de plantas que se replican en el citoplasma, que emplean promotores subgenómicos.

Los tobamovirus, cuyos genomas consisten en una cadena de ARN sentido positivo (mismo sentido que el ARNm) de aproximadamente 6,4 kb, se replican únicamente en el citoplasma y puede utilizarse como vectores de ARN episómico para modificar las rutas bioquímicas de las plantas. Los virus híbridos del mosaico del tabaco (TMV) / odontoglosum ringspot (mosaico de manchas en anillo de la especie Odontoglosum) (ORSV) se han utilizado previamente para expresar enzimas heterólogas en plantas transfectadas (Donson, et al. Proc. Natl. Aca. Sci. USA 88:7204 (1991) y Kumagai, et al. Proc. Natl. Aca. Sci USA 90:427-430 (1993), cadena de ARN sentido negativo (sentido contrario que el ARNm) (Miller, et al.). Transcritos de ARN infecciosos procedentes de clones de ADNc viral que codifican para proteínas que participan en la replicación del ARN, el movimiento y la encapsidación (10). El ARN subgeómico para la síntesis de ARN mensajero está controlado por promotores internos situados en la cadena de ARN sentido negativo (se inocularon plantas de N. benthamiana con transcritos in vitro tal como se describió anteriormente [W.O. Dawson, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 1832 (1986)]). Las inserciones de genes exógenos en una localización específica bajo el control de un promotor de ARN subgenómico adicional ha dado como resultado una expresión sistémica y estable de neomicina fosfotransferasa y \alpha-tricosantina (Donson, et al. Proc. Natl. Aca. Sci. USA 88:7204 (1991) y Kumagai, et al. Proc. Natl. Aca. Sci USA 90:427-430 (1993)).

Una de las principales rutas bioquímicas que podrían servir como una diana para la manipulación genética es la biosíntesis de carotenoides. La primera etapa realizada en la biosíntesis de carotenoides en plantas superiores es la condensación de dos moléculas de geranilgeranil pirofosfato a fitoeno, un hidrocarburo C_{40} incoloro, mediante la enzima fitoeno sintasa. En la fruta en maduración de Lycopersicon esculentum, la fitoeno sintasa es una proteína monomérica situada en el cloroplasto, con una masa molecular relativa aproximada de 42 kDa. Esta enzima se sintetiza inicialmente como una preproteína de 47 kDa y se procesa mediante la eliminación de un péptido de transporte durante importación al cloroplasto (Bartley, et al. J. Biol. Chem. 267: 5036-5039 (1992)). Plantas de tomate transgénicas que contienen ARN antisentido para ARNm de fitoeno sintasa producen fruta amarilla y flores claras. Aunque los carotenos específicos de la fruta se reduzcan en un 97%, los niveles de carotenoides en las hojas de las plantas transgénicas no resultan afectados, (Bird, et al., Bio/Technology 9:635-639 (1991)). Se ha propuesto que se produce un conjunto adicional de genes biosintéticos en plantas que regulan la expresión de los carotenoides de las hojas.

La etapa posterior en la ruta biosintética es la modificación del fitoeno incoloro en fitoflueno y \zeta-caroteno por la fitoeno desaturasa. Entre las plantas superiores, se ha descrito el aislamiento de genes que codifican para esta enzima en el tomate, (Pecker, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89, 4962 (1992), y Arabidopsis thaliana (Scolnick y Bartley, Plant Physiol 103:147 (1993)). La fitoeno desaturasa se inhibe por noflurazona, un herbicida de blanqueo, de una forma reversible y no competitiva (Sandman, et al., Target Sites of Herbicide Actions, G. Sandman, P. Boger Es. (RC press, Boca Rotan (1989)). La aplicación de este compuesto produce una disminución espectacular en los carotenoides y las clorofilas de las hojas y una acumulación posterior de fitoeno. La reducción de los carotenoides fotoprotectores derivados de fitoeno puede producir una rápida destrucción de la clorofila mediante fotooxidación.

La necesidad de nuevos métodos para reducir la expresión de genes específicos en eucariotas está claramente establecida. La invención descrita en el presente documento proporciona nuevos métodos para reducir la expresión de genes seleccionados, construcciones genéticas para poner en práctica los métodos y células transformadas por estas construcciones genéticas, y los organismos superiores que comprenden las células transformadas.

Sumario de la invención

Un aspecto de la invención es proporcionar construcciones genéticas novedosas para la expresión de ARN inhibidor en el citoplasma de las células vegetales. Las construcciones genéticas de la invención pueden replicarse en el citoplasma de una célula vegetal y comprenden una región promotora en combinación funcional con polinucleótido que codifica para un ARN inhibidor, es decir, que codifica para un ARN antisentido o un ARN co-supresor. Las construcciones genéticas de la invención pueden diseñarse de manera que se repliquen en el citoplasma de las células vegetales.

En una célula vegetal, la construcción genética se deriva preferiblemente de un virus ARN de plantas, más preferiblemente un virus ARN de cadena sencilla positivo. El virus ARN de plantas derivado de construcciones genéticas puede comprender un promotor subgenómico de virus de plantas, incluyendo los promotores subgenómicos de los tobamovirus, en combinación funcional con la región que codifica para el ARN inhibidor.

Otro aspecto de la invención es proporcionar células que comprenden las construcciones genéticas de la invención y proporcionar plantas que comprenden una pluralidad de tales células.

Otro aspecto de la invención es proporcionar métodos para reducir la expresión de un gen de interés en células vegetales, es decir, métodos para producir células vegetales que muestren niveles reducidos de expresión de un gen de interés. Los métodos de la invención comprenden la etapa de transformar una célula con una construcción genética de la invención en la que la región que codifica para el ARN inhibidor es específica para el gen de interés. Otro aspecto de la invención es proporcionar células vegetales que producen niveles elevados del carotenoide fitoeno. Los niveles elevados de fitoeno se logran inhibiendo la expresión en la enzima fitoeno desaturasa utilizando los vectores de la invención.

Breve descripción de las figuras

Figura 1. Vector TTO1/PSY+ de expresión de fitoeno. Este plásmido contiene los ORF (marcos de lectura abiertos) de 126, 183 y 30 kDa de TMV-U1, el gen de la proteína de la cubierta de ToMV (ToMVcp), el promotor de SP6, el gen de la fitoeno sintasa del tomate y parte del plásmido pBR322. El codón de terminación TAA en el ORF de 30 kDa está subrayado. El promotor subgenómico de TMV-U1 localizado dentro de la cadena negativa del ORF de 30 kDa controla la expresión de la fitoeno sintasa. El posible punto de inicio de la transcripción (tsp) del ARN subgenómico está indicado con un periodo (.). (SEQ ID Nº: 12 y 13).

La figura 2. Comparación de la secuencia nucleotídica de la fitoeno desaturasa de las hojas de N. benthamiana (PDS1-Nb) y la fitoeno desaturasa del tomate (PDS-Le). Los nucleótidos están alineados para maximizar la similitud de la secuencia, (SEQ ID Nº: 14 y 15).

Descripción de las realizaciones específicas Definiciones

El término "ARN inhibidor", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una molécula de ARN que interfiere con la expresión de un gen diana. Un "ARN inhibidor" es específico para uno o más genes diana. Un ARN inhibidor puede ser un ARN antisentido con respecto a una molécula de ARN transcrita a partir del gen diana. Alternativamente, el ARN inhibidor del gen diana puede ser un ARN co-supresor con respecto a una molécula de ARN transcrita a partir del gen diana.

El término "ARN antisentido", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una molécula de ARN que puede formar un dúplex con una segunda molécula de ARN. Por tanto, se dice que una molécula de ARN dada es una molécula de ARN antisentido con respecto a una segunda molécula de ARN complementaria o parcialmente complementaria, es decir, la molécula diana. Una molécula de ARN antisentido puede ser complementaria a una región traducida o no traducida de una molécula de ARN diana. No es necesario que el ARN antisentido sea perfectamente complementario al ARN diana. El ARN antisentido puede ser o no de la misma longitud que la molécula diana; la molécula de ARN antisentido puede ser más larga o más corta que la molécula diana.

El término "ARN co-supresor" se refiere a una molécula de ARN que logra la supresión de la expresión de un gen diana en el que el ARN es parcialmente homólogo a una molécula de ARN transcrita a partir el gen diana. Una molécula de ARN co-supresor es la molécula de ARN que realiza la co-supresión tal como se describe en la patente de los EE.UU. número 5.231.020, Krol et al., Biotechniques 6:958-976 (1988), Mol et al., FEBS Lett. 268:427-430 (1990), y Grierson, et al. Trends in Biotech. 9: 122-123 (1991) y publicaciones similares. Un ARN "co-supresor" está en la orientación sentido con respecto al gen diana, es decir, la orientación opuesta de la orientación antisentido.

El término "polinucleótido que codifica para el ARN inhibidor" tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un polinucleótido, por ejemplo, ADN, ARN y similares, que puede transcribirse, cuando está en combinación funcional con un promotor, de manera que de produzca una molécula de ARN inhibidor, por ejemplo, un ARN antisentido o un ARN co-supresor. Los polinucleótidos que codifican para el ARN antisentido y los polinucleótidos que codifican para el ARN co-supresor son ambos realizaciones de los polinucleótidos que codifican para el ARN inhibidor. Cuando el ARN inhibidor es un ARN antisentido, el ARN inhibidor transcrito a partir de la región del polinucleótido que codifica para el ARN inhibidor de las construcciones genéticas de la invención es, de manera preferible, perfectamente complementario con la totalidad de la longitud de la molécula o moléculas de ARN para las que es específico el ARN antisentido, es decir, la diana. El polinucleótido que codifica para el ARN antisentido en los vectores objeto puede codificar para un ARN antisentido que forma un dúplex con una región no traducida de un transcrito de ARN, tal como una región de intrón o una región no traducida en 5', una región no traducida en 3' y similares. De manera similar, un polinucleótido que codifica para un ARN co-supresor en los vectores objeto puede codificar para un ARN que es homólogo a partes traducidas o no traducidas de un ARN diana. Los polinucleótidos que codifican para un ARN antisentido pueden producirse convenientemente utilizando la cadena no codificante, o una parte de la misma, de una secuencia de ADN que codifica para una proteína de interés.

El término "expresión reducida", tal como se utiliza en el presente documento, es un término relativo que se refiere al nivel de expresión de un gen dado en una célula producida o modificada por los métodos reivindicados, en comparación con una célula no modificada comparable, es decir, una célula que carece del vector objeto, bajo un conjunto similar de condiciones ambientales. Por tanto, una célula modificada por los métodos objeto, es decir, una célula que tiene "expresión reducida" del gen de interés, puede expresar niveles superiores de ese gen bajo un primer conjunto de condiciones ambientales, que una célula no modificada comparable bajo un segundo conjunto de condiciones ambientales, si el segundo conjunto de condiciones es sumamente favorable para la expresión génica.

La invención

La invención descrita en el presente documento se aprovecha del descubrimiento de que el ARN puede reducir la expresión de un gen diana mediante las interacciones del ARN inhibidor con el ARNm diana que tienen lugar en el citoplasma de una célula eucariota, en lugar de en el núcleo. Antes de la invención, no se sabía si el ARN inhibidor reducía la expresión génica mediante una interacción que tenía lugar en el citoplasma o una interacción que tenía lugar en el núcleo. Por tanto, antes de la invención, era necesario producir ARN inhibidor en el núcleo asegurarse de que se lograría la inhibición. Además, no se sabía si podrían facilitarse concentraciones adecuadas de ARN inhibidor en el citoplasma. La expresión citoplasmática del ARN inhibidor (específico para los genes diana) tiene numerosas ventajas con respecto a la expresión nuclear, incluyendo estas ventajas la capacidad de utilizar vectores de alto nivel de expresión que no son adecuados para la expresión nuclear. El uso de tales vectores es particularmente ventajoso en las plantas, porque pueden utilizarse vectores que pueden infectar sistémicamente a las plantas para producir el ARN inhibidor. La invención descrita en el presente documento tiene muchos aspectos. Estos aspectos incluyen construcciones genéticas novedosas para la expresión del ARN inhibidor del gen diana en el citoplasma de células vegetales, células transfectadas con esas construcciones genéticas, organismos multicelulares que comprenden las células transfectadas y métodos para reducir la expresión de los genes seleccionados en una célula mediante la transformación de una célula con una construcción genética de la invención.

Hay numerosas formas de producir las construcciones genéticas de la invención. Las técnicas para manipular polinucleótidos, por ejemplo, digestión con endonucleasas de restricción y ligación, son bien conocidas para la persona experta habitual en la técnica. Estas técnicas convencionales de manipulación de polinucleótidos pueden utilizarse para producir y utilizar la construcción genética de la invención. Aunque pueden emplearse algunas técnicas habituales de optimización para producir las construcciones genéticas objeto, no se requiere experimentación significativa para producir las construcciones genéticas ni para poner en práctica los métodos reivindicados.

Las construcciones genéticas de la invención comprenden una región promotora en combinación funcional con un polinucleótido que codifica para el ARN inhibidor. La región promotora se selecciona de manera que pueda dirigir la transcripción de una secuencia de polinucleótido en una célula huésped de interés. Así, por ejemplo, en una célula vegetal, el promotor se selecciona de manera que pueda dirigir la transcripción en células vegetales. Los promotores que pueden funcionar en una célula eucariota dada son bien conocidos por la persona experta habitual en la técnica. Ejemplos de promotores que pueden dirigir la transcripción en una célula de interés pueden encontrarse, entre otros lugares en, Goeddel et al., Gene Expression Technology Methods in Enzymology, Volumen 185, Academic Press, San Diego, (1991), Ausubel et al, Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience (1994), y publicaciones similares. Cuando la célula para la transformación es una célula vegetal, se utilizan preferiblemente promotores subgenómicos de virus ARN como regiones promotoras. El promotor subgenómico de los virus ARN se describe, entre otros lugares, en Dawson y Lehto, Advances in Virus Research, 38:307-342, solicitud publicada PCT WO93/03161.

Las construcciones genéticas de la invención pueden replicarse o conservarse, al menos transitoriamente, en el citoplasma de las células vegetales de interés es decir, un vector base. Por tanto, las construcciones genéticas de la invención comprenden necesariamente una región de polinucleótido derivada de un vector que puede replicarse o conservarse de manera estable en las células vegetales de interés. Se conocen muchos vectores que pueden replicarse (o mantenerse de manera estable) en diferentes tipos de células eucariotas.

Los vectores para su uso en plantas incluyen vectores derivados del virus del mosaico de la coliflor, el virus del mosaico del tabaco, el virus del mosaico del tomate, y similares. Puede encontrarse información que describe vectores de células vegetales y su uso en células vegetales, entre otros lugares, en la solicitud PCT WO93/03161, y en Donson, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:7204-7208 (1991).

El promotor que dirige la transcripción de la región que codifica para el ARN inhibidor de las construcciones genéticas objeto puede seleccionarse para que tenga un nivel de actividad de transcripción suficiente para lograr el grado de expresión deseado del ARN inhibidor del gen diana de interés. El promotor puede ser natural o heterólogo para la célula por modificación genética. El promotor también puede ser natural o heterólogo para el vector base, es decir, la parte del vector distinta del promotor y la región que codifica para el ARN inhibidor. El promotor puede ser inducible o constitutivo. Preferiblemente, se utilizan promotores fuertes para dirigir la transcripción del polinucleótido que codifica para el ARN inhibidor cuando el ARN diana se expresa mucho.

La invención también proporciona métodos para reducir la expresión de un gen o genes de interés en una célula eucariota. Como consecuencia de proporcionar los métodos objeto para reducir la expresión génica en una célula vegetal, la invención objeto también proporciona métodos para producir una célula vegetal que tiene expresión reducida de un gen de interés y células vegetales que tienen expresión reducida de un gen de interés, producidas por los métodos de la invención. La reducción de la expresión génica se logra introduciendo uno o más de los vectores de la invención en una célula vegetal. El vector utilizado para transformar la célula de interés comprende un polinucleótido que codifica para el ARN inhibidor que codifica para un ARN inhibidor específico para el gen para el que se busca reducir su expresión. El método para reducir la expresión del gen de interés comprende la etapa de introducir el vector genético objeto en una célula huésped que puede expresar el gen de interés bajo determinadas condiciones ambientales. El vector puede introducirse en una célula de interés mediante cualquiera de una variedad de métodos de transformación bien conocidos. Tales métodos incluyen: infección, transfección, electroporación, transformación mediante bombardeo con miproyectiles (ballistic projectile transformation), conjugación, y similares. El aspecto inventivo de los métodos objeto no depende de los medios particulares mediante los cuales se introduce el vector que codifica para el ARN inhibidor en la célula de interés. Los métodos particulares de introducir el vector en una célula de interés dependen, en parte, de la célula particular que se va a modificar y del tipo preciso de vector seleccionado.

Para las células vegetales, los vectores se derivan preferiblemente de virus ARN de plantas. Vectores de virus ARN de plantas preferidos son los virus ARN de cadena sencilla positivo. Los vectores de virus ARN de plantas pueden manipularse convenientemente e introducirse en las células en forma de ADN en lugar de trabajar directamente con vectores ARN. Se prefieren particularmente los vectores virales derivados de tobamovirus. Descripciones de vectores de virus de plantas adecuados que pueden modificarse de manera que contengan una región que codifique para un ARN inhibidor en combinación funcional con un promotor, y cómo obtener y utilizar tales vectores, puede encontrarse, entre otros lugares, en la publicación PCT WO 93/03161, Kumagai et al, Proc. Natl. Aca. Sci. USA 90:427-430 (1993).

La invención también proporciona polinucleótidos que codifican para la fitoeno sintasa y la fitoeno desaturasa, así como diversos vectores para la expresión del ARN inhibidor del gen diana específico para los genes de la fitoeno sintasa o los genes de la fitoeno desaturasa. La primera etapa realizada en la biosíntesis de carotenoides en plantas superiores es la condensación de dos moléculas de geranilgeranil pirofosfato a fitoeno, un hidrocarburo C_{40} incoloro, mediante la enzima fitoeno sintasa. La siguiente etapa en la ruta biosintética es la modificación del fitoeno incoloro a fitoflueno y \zeta-caroteno mediante la fitoeno desaturasa.

La invención proporciona polinucleótidos que codifican para la enzima fitoeno desaturasa de la especie Nicotiana y para numerosos derivados de la misma. Específicamente, la invención proporciona, en forma purificada, polinucleótidos que codifican para la fitoeno desaturasa de Nicotiana benthantiana. Adicionalmente, la invención proporciona polinucleótidos que codifican para la fitoeno sintasa y fitoeno desaturasa del tomate (Lycopersicon esculentum). Los polinucleótidos que codifican para la fitoeno sintasa y la fitoeno desaturasa descritos en el presente documento pueden utilizarse para producir ARN inhibidores específicos para los genes de la fitoeno sintasa y la fitoeno desaturasa a partir de una variedad de especies de plantas. Los ARN inhibidores de la fitoeno sintasa y la fitoeno desaturasa se producen preferiblemente mediante la transcripción de los polinucleótidos que codifican para el ARN inhibidor de la fitoeno sintasa o la fitoeno desaturasa en combinación funcional con una región promotora.

La secuencia de aminoácidos de las diversas enzimas de fitoeno desaturasa y fitoeno sintasa descritas en el presente documento y las secuencias de polinucleótidos que se producen naturalmente que codifican para estas enzimas, permiten que una persona experta habitual en la técnica de la biología molecular diseñe y construya una variedad de moléculas relacionadas que tienen propiedades útiles similares a las de estas enzimas y los polinucleótidos obtenidos directamente a partir de la clonación de los ADNc que codifican para estas enzimas. En el caso de los polinucleótidos, la degeneración del código genético permite a la persona experta en la técnica producir numerosos polinucleótidos diferentes que codifican para el mismo polipéptido, es decir, isocodificación de polinucleótidos. Puede seleccionarse la secuencia precisa del polinucleótido producido de manera que se optimice la expresión en un tipo particular de célula huésped, teniendo en cuenta los factores que afectan a la expresión, tales como la frecuencia del codón, las posibles estructuras secundarias del ARNm, la metilación, y similares. La invención también proporciona una variedad de polipéptidos que tienen la misma actividad enzimática que la fitoeno desaturasa y la fitoeno sintasa, pero que difieren en uno o más residuos de aminoácidos, de manera que se producen polipéptidos variantes de la fitoeno desaturasa y la fitoeno sintasa. Los polipéptidos variantes pueden producirse y designarse en una amplia variedad de formas. Los variantes de la fitoeno desaturasa y la fitoeno sintasa pueden producirse y designarse mediante la introducción de mutaciones (al azar o intencionados) en una secuencia polinucléotídica que codifica para la enzima, transformando el polinucleótido que codifica para la enzima mutada (unida operativamente a un promotor adecuado) en una célula huésped, y posteriormente sometiendo a la célula huésped a ensayo para determinar la expresión de la actividad enzimática deseada. La identidad de las mutaciones en los polinucleótidos que codifican para Srf I introducidas aleatoriamente, puede determinarse secuenciando el polinucleótido que codifica para la enzima.

La invención también proporciona la expresión de ADN recombinante de la fitoeno desaturasa y la fitoeno sintasa (así como las variantes de los mismos). La expresión recombinante de estas enzimas puede lograrse mediante la tecnología habitual en la expresión del ADN recombinante. Tecnología adecuada en la expresión del ADN recombinante puede encontrarse, entre otros lugares, en Goeddel, et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology Volumen 185 Academic Press, San Diego (1991). La enzima puede expresarse en una amplia variedad de células huésped, incluyendo células huésped tanto eucariotas como procariotas. Otra ventaja de proporcionar las enzimas objeto mediante metodología de ADN recombinante es la producción de cantidades crecientes de enzima a partir de cantidades reducidas de material celular.

Otra ventaja de la producción recombinante de las enzimas es la capacidad de producir la enzima sin ciertos contaminantes. La fitoeno sintasa y fitoeno desaturasa (y variantes de las mismas) producidas mediante las técnicas de ADN recombinante pueden purificarse mediante procedimientos similares a los procedimientos descritos en el presente documento para la purificación de la enzima no recombinante. Puede encontrarse una guía para idear y modificar procedimientos de purificación de enzimas, entre otros lugares, en Deutscher Guide to Protein Purification Methods in Enzymology - Volumen 182) Academic Press, San Diego (1990), Scopes Protein Purification: Principles and Practice 3rd edition Springer-Verlag, NY (1993), y similares.

La invención puede entenderse mejor haciendo referencia a los ejemplos siguientes. Los siguientes ejemplos se facilitan con el fin de ilustrar la invención y no deben interpretarse como una limitación de la invención.

Ejemplos Ejemplo 1 Aislamiento del ADNc del virus del mosaico del tomate

Se aisló un fragmento de 861 pb (5524-6384) del virus del mosaico del tomate (cepa F de necrosis en la fruta; ToMV-F) que contenía el posible promotor subgenómico de la proteína de la cubierta, el gen de la proteína de la cubierta y se aisló el extremo 3' mediante PCR utilizando cebadores de ToMV 5' CTCGCAAAGTTTCGAACCAAATCCTC 3' (SEQ ID Nº: 1) (en el sentido de 5') y 5'CGGGGTACCTGGGCCCCAACCGGGGGTTCCGGGGG 3' (SEQ ID Nº: 2) (en el sentido de 3') y se subclonó en el sitio HincII de pBluescript KS-. Se construyó un virus híbrido que consistía en TMV-U1 y ToMV-F intercambiando un fragmento de 874 pb XhoI-KpnI de ToMV en pBGC152 (Kumagai, et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA, 90:427-430 (1993)), creando el plásmido TTO1. El fragmento insertado se verificó mediante secuenciación de didesoxinucleótidos. Se insertó un único sitio AvrII en el sentido de 3' del sitio XhoI en TTO1 mediante mutagénesis por PCR, creando el plásmido TTO1A, utilizando los siguientes oligonucleótidos:

5'TCCTCGAGCCTAGGCTCGCAAAGTTTCGAACCAAATCCTCA 3' (SEQ ID Nº:3) (en el sentido de 5')

5'CGGGGTACCTGGGCCCCAACCGGGGGTTCCGGGGG 3' (SEQ ID Nº:2) (en el sentido de 3')

Ejemplo 2 Aislamiento de un ADNc que codifica para la fitoeno sintasa del tomate y un ADNc parcial que codifica para la fitoeno desaturasa del tomate

Se aislaron ADNc parciales a partir de ARN del fruto del tomate en maduración mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando los siguientes oligonucleótidos: PSY, 5' TATGTATGGTGCAGAAGAACAGAT 3' (SEQ ID Nº: 4) (en el sentido de 5'); 5' AGTCGACTCTTCCTCTTCTGGCATC 3' (SEQ ID Nº: 5) (en el sentido de 3'); PDS, 5' TGCTCGAGTGTGTTCTTCAGTTTTCTGTCA 3' (SEQ ID Nº: 6) (en el sentido de 5'); 5' AACTCGAGCGCTTTGATTTCTCCGAAGCTT 3' (SEQ ID Nº: 7) (en el sentido de 3'). Se seleccionaron aproximadamente 3 X 10^{4} colonia de una biblioteca de ADNc de Lycopersicon esculentum mediante hibridación de la colonia utilizando un producto obtenido por PCR de la fitoeno sintasa del tomate marcado con 32P. La hibridación se llevó a cabo a 42ºC durante 48 h en formamida al 50%, SSC (cloruro de sodio - citrato de sodio) 5X, tampón fosfato 0,02 M, solución de Denhart y ADN del timo de ternero esquilado 0,1 mg/ml. Los filtros se lavaron a 65ºC en SSC 0,1X, SDS al 0,1% antes de la autorradiografía. Los productos de PCR y los clones de ADNc de la fitoeno sintasa se verificaron mediante secuenciación de didesoxinucleótidos.

Ejemplo 3 Secuenciación de ADN y análisis por ordenador.

Se subclonó un fragmento de 1,2 Kb de PstI - BamHI que contenían el ADNc de la fitoeno sintasa y uno de 0,7 Kb de ADNc parcial de la fitoeno desaturasa en pBluescript KS+ (Stratagene, La Jolla, Calif.). La secuenciación nucleotídica de KS+/PDS Nº 38 y KS+/ 5'3'PSY se llevó a cabo mediante terminación de cadena o método didesoxi utilizando moldes de cadena sencilla. Se llevó a cabo el análisis de la secuencia de nucleótidos y comparaciones de secuencias de aminoácidos utilizando los programas PCGENE y DNA Inspector IIE.

Ejemplo 4 Construcción del vector de expresión de la fitoeno sintasa del tomate

Se subclonó un fragmento de 1253 pares de bases de XhoI que contenía el ADNc de la fitoeno sintasa del tomate en TTO1. El vector TTO1/PSY+ (figura 1) contiene el ADNc de la fitoeno sintasa (orientación positiva) bajo el control del promotor subgenómico de la proteína de la cubierta TMV-U1; mientras que el vector TTO1/PSY- contiene el ADNc de la fitoeno sintasa en la orientación antisentido.

Ejemplo 5 Construcción de un vector viral que contiene un ADNc parcial de la fitoeno desaturasa del tomate

Se subclonó un fragmento de XhoI que contiene el ADNc parcial de la fitoeno desaturasa del tomate en TTO1. El vector TTO1A/PDS+ contiene el ADNc de la fitoeno desaturasa (orientación positiva) bajo el control del promotor subgenómico de la proteína de la cubierta TMV-U1; mientras que el vector TTO1/PDS- contiene el ADNc de la fitoeno desaturasa en la orientación antisentido.

Se aisló un ADNc parcial que codifica para la fitoeno desaturasa del ARN de la hoja de N. benthamiana mediante RT-PCR utilizando los siguientes oligonucleótidos: PDS, 5' GGCACTCAACTTTATAAACC 3' (SEQ ID Nº: 8) (en el sentido de 5'), 5' CTTCAGTTTTCTGTCAAACC 3' (SEQ ID Nº: 9) (en el sentido de 3') y se verificó mediante secuenciación de didesoxinucleótidos.

Ejemplo 6 Transfección y análisis de N. benthamiana [TTO1/PSY+, TTO1/PSY-, TTO1/PDS700 +, TTO1/PDS700 -]

Se prepararon ARN infecciosos de TTO1/PSY+ (figura 1), TTO1/PSY-, TTO1A/PDS+, TTO1/PDS- mediante transcripción in vitro utilizando ARN polimerasa dependiente de ADN de SP6 y se utilizaron para inocular mecánicamente en N. benthamiana (Dawson, et al., Adv. Virus Res. 38:307 (1990)). Los virus híbridos se propagaron por todas las hojas superiores no inoculadas, tal como se verificó mediante microscopía electrónica de transmisión, ensayo de infectividad de las lesiones locales y amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los síntomas virales consistieron en distorsión de las hojas sistémicas, atrofia de la planta y clorosis leve. Las plantas transfectadas con TTO1/PSY+ mostraron un aumento de al menos dos veces en la actividad de la fitoeno sintasa con respecto a las plantas transfectadas con controles de vectores virales. Las hojas de las plantas infectadas sistémicamente con TTO1/PSY+ desarrollaron un fenotipo naranja brillante y acumularon altos niveles de fitoeno (tabla 1). Las hojas y los sépalos de las plantas TTO1/PDS- desarrollaron un fenotipo de decoloración blanca similar al observado con el herbicida noflurazona. La estructura de los cloroplastos de las plantas transfectadas con TTO1/PSY+ y TTO1/PDS-, cuando se analizó mediante microscopía electrónica de transmisión, pareció ser normal. Las hojas de las plantas infectadas sistémicamente por TTO1A/PDS+ desarrollaron un fenotipo de decoloración blanca aproximadamente una semana después que las hojas de las plantas TT01/PDS- antisentido y también acumularon altos niveles de fitoeno.

La electroforesis en gel de agarosa del ADNc de PCR aislado de ARN del virión y el análisis de Nothern blot del ARN de virión indican que los vectores se mantienen en un estado extracromosómico y no han experimentado ninguna reorganización intramolecular detectable.

TABLA 1

Cuantificación de fitoeno en las hojas de N. benthamiana transfectada con transcritos virales
Planta	Fitoeno \mug/g FW	Veces de aumento
N. benthamiana - - - - -	4,6	1
N. benthamiana: TTO1/PDS-	234,8	51,0
N. benthamiana: Norflurazona	339,8	73,9
N. benthamiana: TTO1/PSY+	52,4	11,4
N. benthamiana: TT01/PSY-	1,0	0,2

Ejemplo 7 Purificación y análisis de fitoeno a partir de plantas transfectadas

Se extrajo fitoeno en metanol y se identificó mediante el tiempo de retención de su pico y los espectros de absorción en una columna Spherisob ODS-1, 5 \mum, 25 cm, utilizando acetonitrilo / metanol / 2-propanol (85:10:5) como un disolvente de desarrollo a una velocidad de flujo de 1 ml/min. El fitoeno aislado del tejido infectado sistémicamente tenía un tiempo de retención idéntico al fitoeno de las plantas tratadas con norflurazona. El pico de fitoeno de N. benthamiana transfectada con TTO1/PSY+ tenía máximos de absorbancia óptica característicos en 276, 285 y 298 nm. Una semana después de la inoculación, las plantas transfectadas con fitoeno sintasa codificada viral mostraron un aumento de cien veces en el fitoeno, en comparación con los niveles en las plantas no infectadas, medido por separación de carotenoides mediante HPLC. Los carotenoides se extrajeron en metanol y se identificaron mediante el tiempo de retención de su pico y los espectros de absorción en una columna Spherisob ODS-1, 5 \mum, 25 cm, utilizando acetonitrilo / metanol / 2-propanol (85:10:5) como un disolvente de desarrollo. La expresión del ARN sentido (TTO1A/PDS+) y antisentido (TTO1/PDS-) para una fitoeno desaturasa parcial en las plantas transfectadas inhibió la síntesis de carotenoides coloreados e hizo que las hojas infectadas sistémicamente desarrollaran un fenotipo blanco. El análisis de HPLC de estas plantas reveló que también acumulaban fitoeno en niveles elevados. La decoloración blanquecina de las hojas se reprodujo en las plantas control tratadas con el herbicida norflurazona, un inhibidor no competitivo de la fitoeno desaturasa.

Ejemplo 8 Aislamiento de un ADNc parcial que codifica para la fitoeno desaturasa de N. benthamiana.

Se aisló un clon de ADNc parcial que codifica para la fitoeno desaturasa de N. benthamiana a partir de tejido de hoja joven. La comparación de la secuencia nucleotídica de 369 pb en las regiones correspondientes entre la fitoeno desaturasa del tomate y de N. benthamiana indica que son similares entre sí en un 92% (figura 2). Puesto que los genes de las dos plantas tienen zonas de alta homología, puede producirse la inhibición citoplásmica del gen de la planta endógeno mediante ARN antisentido derivado de virus mediante la formación de moléculas de ARN híbridas de doble cadena. La regulación por disminución de la fitoeno desaturasa en plantas transfectadas con TTO1A/PDS+ puede producirse mediante la interferencia directa durante la traducción del ARNm en proteínas o mediante dúplex formados entre el ARNm y ARN de cadena negativa derivada de virus, aunque no es necesario conocer mecanismo preciso de acción para llevar a cabo la invención.

Ejemplo 9 Construcción de los vectores de expresión TTO1 y TTO1A

Se aisló un fragmento de 861 pb (5524-6384) del virus del mosaico del tomate (cepa F de necrosis en la fruta; ToMV-F) que contenía el posible promotor subgenómico de la proteína de la cubierta, el gen de la proteína de la cubierta y se aisló el extremo 3' mediante PCR utilizando cebadores de ToMV 5' CTCGCAAAGTTTCGAACCAAATCCTC 3' (SEQ ID Nº: 1) (en el sentido de 5') y 5'CGGGGTACCTGGGCCCCAACCGGGGGTTCCGGGGG 3' (SEQ ID Nº: 2) (en el sentido de 3') y se subclonó en el sitio HincII de pBluescript KS-. Se construyó un virus híbrido que consistía en TMV-U1 y ToMV-F intercambiando un fragmento de 874 pb XhoI-KpnI de ToMV en pBGC152 (I. Pecker, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89, 4962 (1992)), creando el plásmido TTO1. El fragmento insertado se verificó mediante secuenciación de didesoxinucleótidos. Se insertó un único sitio AvrII en el sentido de 3' del sitio XhoI en TTO1 mediante mutagénesis por PCR, creando el plásmido TTO1A, utilizando los siguientes oligonucleótidos:

5'CGGGGTACCTGGGCCCCAACCGGGGGTTCCGGGGG 3' (SEQ ID Nº:2) (en el sentido 3')

Ejemplo 10 Construcción de TTO1/PDS-, TTO1A/PDS+

Utilizando mutagénesis por PCR se amplificó un fragmento XhoI, que codificaba para la fitoeno sintasa del tomate a partir de un clon de ADNc de Lycopersicon esculentum aislado de una biblioteca de ADNc de fruta en maduración, y se situó bajo el control del promotor subgenómico de la proteína de la cubierta TMV-U1 subclonando en
TTO1.

Ejemplo 11 Inhibición de la expresión de un gen de planta endógeno específico (fitoeno desaturasa) utilizando un vector viral de ARN: Transfección y análisis de N. benthamiana [TTO1/PDS-, TTO1A/PDS+]

Se prepararon ARN infecciosos de TTO1A/PDS+, TTO1/PDS- mediante transcripción in vitro utilizando ARN polimerasa dependiente de ADN de SP6 y se utilizaron para inocular mecánicamente N. benthamiana. Los virus híbridos se propagaron por todas las hojas superiores no inoculadas, tal como se verificó mediante microscopía electrónica de transmisión, ensayo de infectividad de las lesiones locales y amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los síntomas virales consistieron en distorsión de las hojas sistémicas, atrofia de la planta y clorosis leve. Las hojas y los sépalos de las plantas TTO1/PDS- desarrollaron un fenotipo de decoloración blanca similar al observado con el herbicida noflurazona. La estructura de los cloroplastos de las plantas transfectadas con TTO1/PSY+ y TTO1/PDS-, cuando se analizó mediante microscopía electrónica de transmisión, pareció ser normal. Las hojas de las plantas infectadas sistémicamente por TTO1A/PDS+ desarrollaron un fenotipo de decoloración blanca aproximadamente una semana después que las hojas de las plantas TT01/PDS- antisentido y también acumularon altos niveles de fitoeno.

Ejemplo 12 Inhibición de la expresión de un gen de planta endógeno específico (fitoeno desaturasa) utilizando un vector viral de ARN: Transfección y análisis de N. benthamiana [TTO1/PYS-]

Se prepararon ARN infecciosos de TTO1/PDY- mediante transcripción in vitro utilizando ARN polimerasa dependiente de ADN de SP6 y se utilizaron para inocular mecánicamente N. benthamiana. Los virus híbridos se propagaron por todas las hojas superiores no inoculadas, tal como se verificó mediante microscopía electrónica de transmisión, ensayo de infectividad de las lesiones locales y amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los síntomas virales consistieron en distorsión de las hojas sistémicas, atrofia de la planta y clorosis leve. Las plantas transfectadas con TTO1/PSY+ mostraron un aumento de al menos dos veces en la actividad de la fitoeno sintasa con respecto a las plantas transfectadas con controles de vectores virales (datos no mostrados). Las hojas de las plantas infectadas sistémicamente con TTO1/PSY+ desarrollaron un fenotipo naranja brillante y acumularon altos niveles de fitoeno (tabla 1). Las hojas de las plantas TTO1/PDS- desarrollaron un ligero fenotipo de decoloración blanca. La estructura de los cloroplastos de TTO1/PSY-, cuando se analizó mediante microscopía electrónica de transmisión, pareció ser normal. Las hojas de las plantas infectadas sistémicamente por TTO1A/PSY- no acumularon
fitoeno.

Ejemplo 13 Aislamiento de un ADNc parcial que codifica para la fitoeno desaturasa de N. benthamiana

Se aisló un clon de ADNc parcial que codifica para la fitoeno desaturasa de N. benthamiana a partir de tejido de hoja joven. La comparación de la secuencia nucleotídica de 380 pb en las regiones correspondientes entre la fitoeno desaturasa del tomate y de N. benthamiana indica que son similares entre sí en un 92% (figura 2). Puesto que los genes de las dos plantas tienen zonas de alta homología, puede producirse la inhibición citoplásmica del gen de la planta endógeno mediante ARN antisentido derivado de virus mediante la formación de moléculas de ARN híbridas de doble cadena. La regulación por disminución de la fitoeno desaturasa en plantas transfectadas con TTO1A/PDS+ puede producirse mediante la interferencia directa durante la traducción del ARNm en proteínas o mediante dúplex formados entre el ARNm y ARN de cadena negativa derivada de virus.

Ejemplo 15 Análisis de ARNm de PDS en células de Nicotiana que producen PDS del tomate derivada de ARN antisentido específico

Se llevaron a cabo experimentos de PCR de la transcriptasa inversa que miden la presencia o ausencia de transcritos de ARNm de PDS detectables en células de N. benthamiana que contienen TT01/PDS- (que producen ARN antisentido de PDS). El ARN se aisló de las plantas transfectadas por el método de Gailiano et al. Los cebadores utilizados para detectar TT01/L. esculeutum fueron 5' TAATCGATGATGATTCGGAGGCTAC 3' (SEQ ID Nº: 10 (en el sentido de 5') 5' GGCACTCAACTTTATAAACC 3' (SEQ ID Nº: 8) (en el sentido de 3'). El cebador utilizado para detectar los transcritos de N. benthamiana fueron 5' GGCACTCAACTTTATAAACC 3' (SEQ ID Nº: 8) (en el sentido de 5') y 5' CTCCTTTAATTGTACTGCCA 3' (SEQ ID Nº: 11) (en el sentido de 3'). Los experimentos de PCR no pudieron detectar ARNm de PDS endógeno en las plantas transfectadas por el vector, mientras que pudo detectarse el transcrito antisentido esperado de 452 pb. El ARNm de PDS de 219 pb sólo pudo detectarse en las plantas N. benthamiana control, no infectadas.

Claims

1. Vector genético viral derivado de un virus de cadena sencilla positivo, que puede replicarse en el citoplasma de una célula vegetal, que comprende:

a): un primer promotor subgenómico de virus de plantas en combinación funcional con una primera secuencia de ácido nucleico que codifica para un ARN antisentido o un ARN co-supresor específico para un gen de interés en una planta en la que la transcripción de la primera secuencia de ácido nucleico está regulada por el primer promotor subgenómico del virus de plantas; y

b): un segundo promotor subgenómico de virus de plantas unido operativamente a una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteína de la cubierta de virus de plantas en la que la transcripción de la segunda secuencia de ácido nucleico está regulada por el segundo promotor subgenómico de virus de planta.

2. Vector según la reivindicación 1, en el que dicho vector se deriva de un virus de plantas ARN de cadena sencilla positiva.

3. Vector según la reivindicación 1, en el que dichos promotores subgenómicos primero y segundo son heterólogos entre sí.

4. Vector según la reivindicación 1, en el que dicho gen de interés es fitoeno desaturasa.

5. Vector según la reivindicación 1, en el que dicho gen de interés es la fitoeno sintasa.

6. Método para producir una célula vegetal que tiene expresión reducida de un gen de interés, comprendiendo el método las etapas de transfectar una célula vegetal con el vector según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la secuencia de ácido nucleico que codifica para un ARN antisentido o un ARN co-supresor es específico para el gen de interés.

7. Método según la reivindicación 6, en el que dicho vector se deriva de un virus de plantas ARN de cadena sencilla positiva.

8. Método según la reivindicación 7, en el que dichos promotores subgenómicos primero y segundo son heterólogos para la célula vegetal.

9. Método para producir una célula vegetal que tiene expresión reducida de un gen de interés, comprendiendo el método las etapas de transfectar una célula con un vector genético según la reivindicación 4 ó 5.

10. Método según la reivindicación 9, en el que la célula vegetal es una célula de Nicotiana.

11. Célula vegetal que comprende un vector según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

12. Célula vegetal según la reivindicación 11, en la que el vector se deriva de un virus de plantas ARN de cadena sencilla.

13. Célula vegetal según la reivindicación 11, que comprende el vector según la reivindicación 4 ó 5.

14. Célula vegetal según la reivindicación 13, en la que dicha célula vegetal es una célula de Nicotiana.

15. Planta que comprende una pluralidad de células según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14.