ES2246210T3 - Inhibicion citoplasmatica de la expresion genetica. - Google Patents
Inhibicion citoplasmatica de la expresion genetica.Info
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Abstract
Vector genético viral derivado de un virus de cadena sencilla positivo, que puede replicarse en el citoplasma de una célula vegetal, que comprende: a) un primer promotor subgenómico de virus de plantas en combinación funcional con una primera secuencia de ácido nucleico que codifica para un ARN antisentido o un ARN co-supresor específico para un gen de interés en una planta en la que la transcripción de la primera secuencia de ácido nucleico está regulada por el primer promotor subgenómico del virus de plantas; y b) un segundo promotor subgenómico de virus de plantas unido operativamente a una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteína de la cubierta de virus de plantas en la que la transcripción de la segunda secuencia de ácido nucleico está regulada por el segundo promotor subgenómico de virus de planta.
Description
Inhibición citoplasmática de la expresión
génica.
Esta invención es en el campo de una regulación
génica mediante moléculas de ARN inhibidoras producidas
endógenamente de ARN antisentido, tales como ARN antisentido y ARN
co-supresor.
Uno de los principales objetivos de la ingeniería
genética ha sido controlar la expresión de genes seleccionados en
organismos eucariotas de interés. Aunque ha sido relativamente
sencillo insertar nuevos genes para su expresión en células
eucariotas, la selección de la diana de los genes endógenos para la
expresión reducida ha sido más difícil de lograr. La inactivación
dirigida al sitio de genes en organismos superiores ha requerido
manipulaciones genéticas extremadamente complejas y no es aplicable
a una amplia variedad de organismos. Un método que reduce la
expresión de genes específicos en organismos eucariotas ha sido
mediante el uso de ARN antisentido y mediante la
co-supresión.
El ARN antisentido se ha utilizado para reducir
la expresión de genes preseleccionados tanto en plantas como en
animales. Pueden encontrarse descripciones del uso del ARN
antisentido para reducir la expresión de genes seleccionados en
plantas, entre otro documentos, en la patente de los EE.UU. número
5.107.065, Smith et al. Nature 334: 724-726
(1988), Van der Krol et al., Nature 333:
866-869 (1988), Rothstein et al., Proc.
Natl. Aca. Sci. USA 84:8439-8443 (1987), Bird
et al., Bio/Technology 9:635-639
(1991), Bartley et al. Biol. Chem.
267:5036-5039 (1992), y Gray et al., Plant
Mol. Bio. 19:69-87 (1992).
Otro método para reducir la expresión de genes
específicos en organismos eucariotas es mediante el uso de ARN
co-supresor. El ARN co-supresor, a
diferencia del ARN antisentido, está en la misma orientación que el
ARN transcrito a partir del gen diana, es decir, la orientación
"sentido".
Es posible que las rutas bioquímicas en las
plantas transfectadas con virus híbridos pudieran alterarse mediante
la producción en exceso de una enzima que participe en la etapa
limitante de la velocidad, o inhibiendo la síntesis de una enzima
mediante ARN antisentido. Aunque la expresión de numerosos genes en
plantas transgénicas se ha reprimido por ARN antisentido, el
mecanismo y la localización reales de la inhibición no se conocen.
En el núcleo el ARN antisentido puede interferir directamente con la
transcripción o formar dúplex con el ARN heterogéneo nuclear
(ARNhn). Hay evidencia de que la inhibición de genes endógenos puede
producirse en plantas transgénicas que contienen ARN sentido (A.R.
van der Krol et al., Nature 333:866-869
(1988) y C. Napoli et al., Plant cell
2:279-289 (1990)). Se cree que el mecanismo de esta
regulación por disminución o "co-supresión"
está producida por la producción de ARN antisentido mediante la
lectura a través de la transcripción a partir de promotores distales
situados en las cadenas opuestas del ADN cromosómico (Greison, et
al. Trends in Biotech. 9:122-123 (1991)).
Alternativamente, en el citoplasma, el ARN antisentido puede formar
una molécula de doble cadena con el ARNm complementario y evitar la
traducción del ARNm en proteínas.
Se han utilizado vectores derivados de virus de
plantas que contienen ADN de doble cadena y que comprenden
promotores virales en combinación funcional con una secuencia de
ácido nucleico que codifica para ARN antisentido o
co-supresor para inhibir la expresión de genes de
plantas individuales (Bird et al.,
WO-A-91 09128) o para proporcionar
la inhibición coordinada de múltiples genes (Barron et al.,
WO-A-93 23551). No se ha descrito el
uso de vectores derivados de virus de plantas que se replican en el
citoplasma, que emplean promotores subgenómicos.
Los tobamovirus, cuyos genomas consisten en una
cadena de ARN sentido positivo (mismo sentido que el ARNm) de
aproximadamente 6,4 kb, se replican únicamente en el citoplasma y
puede utilizarse como vectores de ARN episómico para modificar las
rutas bioquímicas de las plantas. Los virus híbridos del mosaico del
tabaco (TMV) / odontoglosum ringspot (mosaico de manchas en anillo
de la especie Odontoglosum) (ORSV) se han utilizado previamente para
expresar enzimas heterólogas en plantas transfectadas (Donson, et
al. Proc. Natl. Aca. Sci. USA 88:7204 (1991) y Kumagai, et
al. Proc. Natl. Aca. Sci USA 90:427-430 (1993),
cadena de ARN sentido negativo (sentido contrario que el ARNm)
(Miller, et al.). Transcritos de ARN infecciosos procedentes
de clones de ADNc viral que codifican para proteínas que participan
en la replicación del ARN, el movimiento y la encapsidación (10). El
ARN subgeómico para la síntesis de ARN mensajero está controlado por
promotores internos situados en la cadena de ARN sentido negativo
(se inocularon plantas de N. benthamiana con transcritos
in vitro tal como se describió anteriormente [W.O. Dawson,
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 1832
(1986)]). Las inserciones de genes exógenos en una localización
específica bajo el control de un promotor de ARN subgenómico
adicional ha dado como resultado una expresión sistémica y estable
de neomicina fosfotransferasa y
\alpha-tricosantina (Donson, et al. Proc. Natl.
Aca. Sci. USA 88:7204 (1991) y Kumagai, et al. Proc. Natl.
Aca. Sci USA 90:427-430 (1993)).
Una de las principales rutas bioquímicas que
podrían servir como una diana para la manipulación genética es la
biosíntesis de carotenoides. La primera etapa realizada en la
biosíntesis de carotenoides en plantas superiores es la condensación
de dos moléculas de geranilgeranil pirofosfato a fitoeno, un
hidrocarburo C_{40} incoloro, mediante la enzima fitoeno sintasa.
En la fruta en maduración de Lycopersicon esculentum, la
fitoeno sintasa es una proteína monomérica situada en el
cloroplasto, con una masa molecular relativa aproximada de 42 kDa.
Esta enzima se sintetiza inicialmente como una preproteína de 47 kDa
y se procesa mediante la eliminación de un péptido de transporte
durante importación al cloroplasto (Bartley, et al. J. Biol.
Chem. 267: 5036-5039 (1992)). Plantas de tomate
transgénicas que contienen ARN antisentido para ARNm de fitoeno
sintasa producen fruta amarilla y flores claras. Aunque los
carotenos específicos de la fruta se reduzcan en un 97%, los niveles
de carotenoides en las hojas de las plantas transgénicas no resultan
afectados, (Bird, et al., Bio/Technology
9:635-639 (1991)). Se ha propuesto que se produce un
conjunto adicional de genes biosintéticos en plantas que regulan la
expresión de los carotenoides de las hojas.
La etapa posterior en la ruta biosintética es la
modificación del fitoeno incoloro en fitoflueno y
\zeta-caroteno por la fitoeno desaturasa. Entre
las plantas superiores, se ha descrito el aislamiento de genes que
codifican para esta enzima en el tomate, (Pecker, et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89, 4962 (1992), y Arabidopsis
thaliana (Scolnick y Bartley, Plant Physiol 103:147
(1993)). La fitoeno desaturasa se inhibe por noflurazona, un
herbicida de blanqueo, de una forma reversible y no competitiva
(Sandman, et al., Target Sites of Herbicide Actions,
G. Sandman, P. Boger Es. (RC press, Boca Rotan (1989)). La
aplicación de este compuesto produce una disminución espectacular en
los carotenoides y las clorofilas de las hojas y una acumulación
posterior de fitoeno. La reducción de los carotenoides
fotoprotectores derivados de fitoeno puede producir una rápida
destrucción de la clorofila mediante fotooxidación.
La necesidad de nuevos métodos para reducir la
expresión de genes específicos en eucariotas está claramente
establecida. La invención descrita en el presente documento
proporciona nuevos métodos para reducir la expresión de genes
seleccionados, construcciones genéticas para poner en práctica los
métodos y células transformadas por estas construcciones genéticas,
y los organismos superiores que comprenden las células
transformadas.
Un aspecto de la invención es proporcionar
construcciones genéticas novedosas para la expresión de ARN
inhibidor en el citoplasma de las células vegetales. Las
construcciones genéticas de la invención pueden replicarse en el
citoplasma de una célula vegetal y comprenden una región promotora
en combinación funcional con polinucleótido que codifica para un ARN
inhibidor, es decir, que codifica para un ARN antisentido o un ARN
co-supresor. Las construcciones genéticas de la
invención pueden diseñarse de manera que se repliquen en el
citoplasma de las células vegetales.
En una célula vegetal, la construcción genética
se deriva preferiblemente de un virus ARN de plantas, más
preferiblemente un virus ARN de cadena sencilla positivo. El virus
ARN de plantas derivado de construcciones genéticas puede comprender
un promotor subgenómico de virus de plantas, incluyendo los
promotores subgenómicos de los tobamovirus, en combinación funcional
con la región que codifica para el ARN inhibidor.
Otro aspecto de la invención es proporcionar
células que comprenden las construcciones genéticas de la invención
y proporcionar plantas que comprenden una pluralidad de tales
células.
Otro aspecto de la invención es proporcionar
métodos para reducir la expresión de un gen de interés en células
vegetales, es decir, métodos para producir células vegetales que
muestren niveles reducidos de expresión de un gen de interés. Los
métodos de la invención comprenden la etapa de transformar una
célula con una construcción genética de la invención en la que la
región que codifica para el ARN inhibidor es específica para el gen
de interés. Otro aspecto de la invención es proporcionar células
vegetales que producen niveles elevados del carotenoide fitoeno. Los
niveles elevados de fitoeno se logran inhibiendo la expresión en la
enzima fitoeno desaturasa utilizando los vectores de la
invención.
Figura 1. Vector TTO1/PSY+ de expresión de
fitoeno. Este plásmido contiene los ORF (marcos de lectura abiertos)
de 126, 183 y 30 kDa de TMV-U1, el gen de la
proteína de la cubierta de ToMV (ToMVcp), el promotor de SP6, el gen
de la fitoeno sintasa del tomate y parte del plásmido pBR322. El
codón de terminación TAA en el ORF de 30 kDa está subrayado. El
promotor subgenómico de TMV-U1 localizado dentro de
la cadena negativa del ORF de 30 kDa controla la expresión de la
fitoeno sintasa. El posible punto de inicio de la transcripción
(tsp) del ARN subgenómico está indicado con un periodo (.). (SEQ ID
Nº: 12 y 13).
La figura 2. Comparación de la secuencia
nucleotídica de la fitoeno desaturasa de las hojas de N.
benthamiana (PDS1-Nb) y la fitoeno
desaturasa del tomate (PDS-Le). Los
nucleótidos están alineados para maximizar la similitud de la
secuencia, (SEQ ID Nº: 14 y 15).
El término "ARN inhibidor", tal como se
utiliza en el presente documento, se refiere a una molécula de ARN
que interfiere con la expresión de un gen diana. Un "ARN
inhibidor" es específico para uno o más genes diana. Un ARN
inhibidor puede ser un ARN antisentido con respecto a una molécula
de ARN transcrita a partir del gen diana. Alternativamente, el ARN
inhibidor del gen diana puede ser un ARN co-supresor
con respecto a una molécula de ARN transcrita a partir del gen
diana.
El término "ARN antisentido", tal como se
utiliza en el presente documento, se refiere a una molécula de ARN
que puede formar un dúplex con una segunda molécula de ARN. Por
tanto, se dice que una molécula de ARN dada es una molécula de ARN
antisentido con respecto a una segunda molécula de ARN
complementaria o parcialmente complementaria, es decir, la molécula
diana. Una molécula de ARN antisentido puede ser complementaria a
una región traducida o no traducida de una molécula de ARN diana. No
es necesario que el ARN antisentido sea perfectamente complementario
al ARN diana. El ARN antisentido puede ser o no de la misma longitud
que la molécula diana; la molécula de ARN antisentido puede ser más
larga o más corta que la molécula diana.
El término "ARN co-supresor"
se refiere a una molécula de ARN que logra la supresión de la
expresión de un gen diana en el que el ARN es parcialmente homólogo
a una molécula de ARN transcrita a partir el gen diana. Una molécula
de ARN co-supresor es la molécula de ARN que realiza
la co-supresión tal como se describe en la patente
de los EE.UU. número 5.231.020, Krol et al., Biotechniques
6:958-976 (1988), Mol et al., FEBS Lett.
268:427-430 (1990), y Grierson, et al. Trends in
Biotech. 9: 122-123 (1991) y publicaciones
similares. Un ARN "co-supresor" está en la
orientación sentido con respecto al gen diana, es decir, la
orientación opuesta de la orientación antisentido.
El término "polinucleótido que codifica para el
ARN inhibidor" tal como se utiliza en el presente documento, se
refiere a un polinucleótido, por ejemplo, ADN, ARN y similares, que
puede transcribirse, cuando está en combinación funcional con un
promotor, de manera que de produzca una molécula de ARN inhibidor,
por ejemplo, un ARN antisentido o un ARN
co-supresor. Los polinucleótidos que codifican para
el ARN antisentido y los polinucleótidos que codifican para el ARN
co-supresor son ambos realizaciones de los
polinucleótidos que codifican para el ARN inhibidor. Cuando el ARN
inhibidor es un ARN antisentido, el ARN inhibidor transcrito a
partir de la región del polinucleótido que codifica para el ARN
inhibidor de las construcciones genéticas de la invención es, de
manera preferible, perfectamente complementario con la totalidad de
la longitud de la molécula o moléculas de ARN para las que es
específico el ARN antisentido, es decir, la diana. El polinucleótido
que codifica para el ARN antisentido en los vectores objeto puede
codificar para un ARN antisentido que forma un dúplex con una región
no traducida de un transcrito de ARN, tal como una región de intrón
o una región no traducida en 5', una región no traducida en 3' y
similares. De manera similar, un polinucleótido que codifica para un
ARN co-supresor en los vectores objeto puede
codificar para un ARN que es homólogo a partes traducidas o no
traducidas de un ARN diana. Los polinucleótidos que codifican para
un ARN antisentido pueden producirse convenientemente utilizando la
cadena no codificante, o una parte de la misma, de una secuencia de
ADN que codifica para una proteína de interés.
El término "expresión reducida", tal como se
utiliza en el presente documento, es un término relativo que se
refiere al nivel de expresión de un gen dado en una célula producida
o modificada por los métodos reivindicados, en comparación con una
célula no modificada comparable, es decir, una célula que carece del
vector objeto, bajo un conjunto similar de condiciones ambientales.
Por tanto, una célula modificada por los métodos objeto, es decir,
una célula que tiene "expresión reducida" del gen de interés,
puede expresar niveles superiores de ese gen bajo un primer conjunto
de condiciones ambientales, que una célula no modificada comparable
bajo un segundo conjunto de condiciones ambientales, si el segundo
conjunto de condiciones es sumamente favorable para la expresión
génica.
La invención descrita en el presente documento se
aprovecha del descubrimiento de que el ARN puede reducir la
expresión de un gen diana mediante las interacciones del ARN
inhibidor con el ARNm diana que tienen lugar en el citoplasma de una
célula eucariota, en lugar de en el núcleo. Antes de la invención,
no se sabía si el ARN inhibidor reducía la expresión génica mediante
una interacción que tenía lugar en el citoplasma o una interacción
que tenía lugar en el núcleo. Por tanto, antes de la invención, era
necesario producir ARN inhibidor en el núcleo asegurarse de que se
lograría la inhibición. Además, no se sabía si podrían facilitarse
concentraciones adecuadas de ARN inhibidor en el citoplasma. La
expresión citoplasmática del ARN inhibidor (específico para los
genes diana) tiene numerosas ventajas con respecto a la expresión
nuclear, incluyendo estas ventajas la capacidad de utilizar vectores
de alto nivel de expresión que no son adecuados para la expresión
nuclear. El uso de tales vectores es particularmente ventajoso en
las plantas, porque pueden utilizarse vectores que pueden infectar
sistémicamente a las plantas para producir el ARN inhibidor. La
invención descrita en el presente documento tiene muchos aspectos.
Estos aspectos incluyen construcciones genéticas novedosas para la
expresión del ARN inhibidor del gen diana en el citoplasma de
células vegetales, células transfectadas con esas construcciones
genéticas, organismos multicelulares que comprenden las células
transfectadas y métodos para reducir la expresión de los genes
seleccionados en una célula mediante la transformación de una célula
con una construcción genética de la invención.
Hay numerosas formas de producir las
construcciones genéticas de la invención. Las técnicas para
manipular polinucleótidos, por ejemplo, digestión con endonucleasas
de restricción y ligación, son bien conocidas para la persona
experta habitual en la técnica. Estas técnicas convencionales de
manipulación de polinucleótidos pueden utilizarse para producir y
utilizar la construcción genética de la invención. Aunque pueden
emplearse algunas técnicas habituales de optimización para producir
las construcciones genéticas objeto, no se requiere experimentación
significativa para producir las construcciones genéticas ni para
poner en práctica los métodos reivindicados.
Las construcciones genéticas de la invención
comprenden una región promotora en combinación funcional con un
polinucleótido que codifica para el ARN inhibidor. La región
promotora se selecciona de manera que pueda dirigir la transcripción
de una secuencia de polinucleótido en una célula huésped de interés.
Así, por ejemplo, en una célula vegetal, el promotor se selecciona
de manera que pueda dirigir la transcripción en células vegetales.
Los promotores que pueden funcionar en una célula eucariota dada son
bien conocidos por la persona experta habitual en la técnica.
Ejemplos de promotores que pueden dirigir la transcripción en una
célula de interés pueden encontrarse, entre otros lugares en,
Goeddel et al., Gene Expression Technology Methods in Enzymology,
Volumen 185, Academic Press, San Diego, (1991), Ausubel et
al, Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience (1994), y
publicaciones similares. Cuando la célula para la transformación es
una célula vegetal, se utilizan preferiblemente promotores
subgenómicos de virus ARN como regiones promotoras. El promotor
subgenómico de los virus ARN se describe, entre otros lugares, en
Dawson y Lehto, Advances in Virus Research,
38:307-342, solicitud publicada PCT WO93/03161.
Las construcciones genéticas de la invención
pueden replicarse o conservarse, al menos transitoriamente, en el
citoplasma de las células vegetales de interés es decir, un vector
base. Por tanto, las construcciones genéticas de la invención
comprenden necesariamente una región de polinucleótido derivada de
un vector que puede replicarse o conservarse de manera estable en
las células vegetales de interés. Se conocen muchos vectores que
pueden replicarse (o mantenerse de manera estable) en diferentes
tipos de células eucariotas.
Los vectores para su uso en plantas incluyen
vectores derivados del virus del mosaico de la coliflor, el virus
del mosaico del tabaco, el virus del mosaico del tomate, y
similares. Puede encontrarse información que describe vectores de
células vegetales y su uso en células vegetales, entre otros
lugares, en la solicitud PCT WO93/03161, y en Donson, et al.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:7204-7208
(1991).
El promotor que dirige la transcripción de la
región que codifica para el ARN inhibidor de las construcciones
genéticas objeto puede seleccionarse para que tenga un nivel de
actividad de transcripción suficiente para lograr el grado de
expresión deseado del ARN inhibidor del gen diana de interés. El
promotor puede ser natural o heterólogo para la célula por
modificación genética. El promotor también puede ser natural o
heterólogo para el vector base, es decir, la parte del vector
distinta del promotor y la región que codifica para el ARN
inhibidor. El promotor puede ser inducible o constitutivo.
Preferiblemente, se utilizan promotores fuertes para dirigir la
transcripción del polinucleótido que codifica para el ARN inhibidor
cuando el ARN diana se expresa mucho.
La invención también proporciona métodos para
reducir la expresión de un gen o genes de interés en una célula
eucariota. Como consecuencia de proporcionar los métodos objeto para
reducir la expresión génica en una célula vegetal, la invención
objeto también proporciona métodos para producir una célula vegetal
que tiene expresión reducida de un gen de interés y células
vegetales que tienen expresión reducida de un gen de interés,
producidas por los métodos de la invención. La reducción de la
expresión génica se logra introduciendo uno o más de los vectores de
la invención en una célula vegetal. El vector utilizado para
transformar la célula de interés comprende un polinucleótido que
codifica para el ARN inhibidor que codifica para un ARN inhibidor
específico para el gen para el que se busca reducir su expresión. El
método para reducir la expresión del gen de interés comprende la
etapa de introducir el vector genético objeto en una célula huésped
que puede expresar el gen de interés bajo determinadas condiciones
ambientales. El vector puede introducirse en una célula de interés
mediante cualquiera de una variedad de métodos de transformación
bien conocidos. Tales métodos incluyen: infección, transfección,
electroporación, transformación mediante bombardeo con miproyectiles
(ballistic projectile transformation), conjugación, y similares. El
aspecto inventivo de los métodos objeto no depende de los medios
particulares mediante los cuales se introduce el vector que codifica
para el ARN inhibidor en la célula de interés. Los métodos
particulares de introducir el vector en una célula de interés
dependen, en parte, de la célula particular que se va a modificar y
del tipo preciso de vector seleccionado.
Para las células vegetales, los vectores se
derivan preferiblemente de virus ARN de plantas. Vectores de virus
ARN de plantas preferidos son los virus ARN de cadena sencilla
positivo. Los vectores de virus ARN de plantas pueden manipularse
convenientemente e introducirse en las células en forma de ADN en
lugar de trabajar directamente con vectores ARN. Se prefieren
particularmente los vectores virales derivados de tobamovirus.
Descripciones de vectores de virus de plantas adecuados que pueden
modificarse de manera que contengan una región que codifique para un
ARN inhibidor en combinación funcional con un promotor, y cómo
obtener y utilizar tales vectores, puede encontrarse, entre otros
lugares, en la publicación PCT WO 93/03161, Kumagai et al, Proc.
Natl. Aca. Sci. USA 90:427-430 (1993).
La invención también proporciona polinucleótidos
que codifican para la fitoeno sintasa y la fitoeno desaturasa, así
como diversos vectores para la expresión del ARN inhibidor del gen
diana específico para los genes de la fitoeno sintasa o los genes de
la fitoeno desaturasa. La primera etapa realizada en la biosíntesis
de carotenoides en plantas superiores es la condensación de dos
moléculas de geranilgeranil pirofosfato a fitoeno, un hidrocarburo
C_{40} incoloro, mediante la enzima fitoeno sintasa. La siguiente
etapa en la ruta biosintética es la modificación del fitoeno
incoloro a fitoflueno y \zeta-caroteno mediante la
fitoeno desaturasa.
La invención proporciona polinucleótidos que
codifican para la enzima fitoeno desaturasa de la especie
Nicotiana y para numerosos derivados de la misma.
Específicamente, la invención proporciona, en forma purificada,
polinucleótidos que codifican para la fitoeno desaturasa de
Nicotiana benthantiana. Adicionalmente, la invención
proporciona polinucleótidos que codifican para la fitoeno sintasa y
fitoeno desaturasa del tomate (Lycopersicon esculentum). Los
polinucleótidos que codifican para la fitoeno sintasa y la fitoeno
desaturasa descritos en el presente documento pueden utilizarse para
producir ARN inhibidores específicos para los genes de la fitoeno
sintasa y la fitoeno desaturasa a partir de una variedad de especies
de plantas. Los ARN inhibidores de la fitoeno sintasa y la fitoeno
desaturasa se producen preferiblemente mediante la transcripción de
los polinucleótidos que codifican para el ARN inhibidor de la
fitoeno sintasa o la fitoeno desaturasa en combinación funcional con
una región promotora.
La secuencia de aminoácidos de las diversas
enzimas de fitoeno desaturasa y fitoeno sintasa descritas en el
presente documento y las secuencias de polinucleótidos que se
producen naturalmente que codifican para estas enzimas, permiten que
una persona experta habitual en la técnica de la biología molecular
diseñe y construya una variedad de moléculas relacionadas que tienen
propiedades útiles similares a las de estas enzimas y los
polinucleótidos obtenidos directamente a partir de la clonación de
los ADNc que codifican para estas enzimas. En el caso de los
polinucleótidos, la degeneración del código genético permite a la
persona experta en la técnica producir numerosos polinucleótidos
diferentes que codifican para el mismo polipéptido, es decir,
isocodificación de polinucleótidos. Puede seleccionarse la secuencia
precisa del polinucleótido producido de manera que se optimice la
expresión en un tipo particular de célula huésped, teniendo en
cuenta los factores que afectan a la expresión, tales como la
frecuencia del codón, las posibles estructuras secundarias del ARNm,
la metilación, y similares. La invención también proporciona una
variedad de polipéptidos que tienen la misma actividad enzimática
que la fitoeno desaturasa y la fitoeno sintasa, pero que difieren en
uno o más residuos de aminoácidos, de manera que se producen
polipéptidos variantes de la fitoeno desaturasa y la fitoeno
sintasa. Los polipéptidos variantes pueden producirse y designarse
en una amplia variedad de formas. Los variantes de la fitoeno
desaturasa y la fitoeno sintasa pueden producirse y designarse
mediante la introducción de mutaciones (al azar o intencionados) en
una secuencia polinucléotídica que codifica para la enzima,
transformando el polinucleótido que codifica para la enzima mutada
(unida operativamente a un promotor adecuado) en una célula huésped,
y posteriormente sometiendo a la célula huésped a ensayo para
determinar la expresión de la actividad enzimática deseada. La
identidad de las mutaciones en los polinucleótidos que codifican
para Srf I introducidas aleatoriamente, puede determinarse
secuenciando el polinucleótido que codifica para la enzima.
La invención también proporciona la expresión de
ADN recombinante de la fitoeno desaturasa y la fitoeno sintasa (así
como las variantes de los mismos). La expresión recombinante de
estas enzimas puede lograrse mediante la tecnología habitual en la
expresión del ADN recombinante. Tecnología adecuada en la expresión
del ADN recombinante puede encontrarse, entre otros lugares, en
Goeddel, et al., Gene Expression Technology: Methods in
Enzymology Volumen 185 Academic Press, San Diego (1991). La
enzima puede expresarse en una amplia variedad de células huésped,
incluyendo células huésped tanto eucariotas como procariotas. Otra
ventaja de proporcionar las enzimas objeto mediante metodología de
ADN recombinante es la producción de cantidades crecientes de enzima
a partir de cantidades reducidas de material celular.
Otra ventaja de la producción recombinante de las
enzimas es la capacidad de producir la enzima sin ciertos
contaminantes. La fitoeno sintasa y fitoeno desaturasa (y variantes
de las mismas) producidas mediante las técnicas de ADN recombinante
pueden purificarse mediante procedimientos similares a los
procedimientos descritos en el presente documento para la
purificación de la enzima no recombinante. Puede encontrarse una
guía para idear y modificar procedimientos de purificación de
enzimas, entre otros lugares, en Deutscher Guide to Protein
Purification Methods in Enzymology - Volumen 182) Academic
Press, San Diego (1990), Scopes Protein Purification: Principles
and Practice 3rd edition Springer-Verlag, NY
(1993), y similares.
La invención puede entenderse mejor haciendo
referencia a los ejemplos siguientes. Los siguientes ejemplos se
facilitan con el fin de ilustrar la invención y no deben
interpretarse como una limitación de la invención.
Se aisló un fragmento de 861 pb
(5524-6384) del virus del mosaico del tomate (cepa F
de necrosis en la fruta; ToMV-F) que contenía el
posible promotor subgenómico de la proteína de la cubierta, el gen
de la proteína de la cubierta y se aisló el extremo 3' mediante PCR
utilizando cebadores de ToMV 5' CTCGCAAAGTTTCGAACCAAATCCTC 3' (SEQ
ID Nº: 1) (en el sentido de 5') y
5'CGGGGTACCTGGGCCCCAACCGGGGGTTCCGGGGG 3' (SEQ ID Nº: 2) (en el
sentido de 3') y se subclonó en el sitio HincII de
pBluescript KS-. Se construyó un virus híbrido que consistía en
TMV-U1 y ToMV-F intercambiando un
fragmento de 874 pb XhoI-KpnI de ToMV en pBGC152
(Kumagai, et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA,
90:427-430 (1993)), creando el plásmido TTO1. El
fragmento insertado se verificó mediante secuenciación de
didesoxinucleótidos. Se insertó un único sitio AvrII en el
sentido de 3' del sitio XhoI en TTO1 mediante mutagénesis por
PCR, creando el plásmido TTO1A, utilizando los siguientes
oligonucleótidos:
5'TCCTCGAGCCTAGGCTCGCAAAGTTTCGAACCAAATCCTCA 3'
(SEQ ID Nº:3) (en el sentido de 5')
5'CGGGGTACCTGGGCCCCAACCGGGGGTTCCGGGGG 3' (SEQ ID
Nº:2) (en el sentido de 3')
Se aislaron ADNc parciales a partir de ARN del
fruto del tomate en maduración mediante la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) utilizando los siguientes oligonucleótidos:
PSY, 5' TATGTATGGTGCAGAAGAACAGAT 3' (SEQ ID Nº: 4) (en el
sentido de 5'); 5' AGTCGACTCTTCCTCTTCTGGCATC 3' (SEQ ID Nº: 5) (en
el sentido de 3'); PDS, 5' TGCTCGAGTGTGTTCTTCAGTTTTCTGTCA 3'
(SEQ ID Nº: 6) (en el sentido de 5'); 5'
AACTCGAGCGCTTTGATTTCTCCGAAGCTT 3' (SEQ ID Nº: 7) (en el sentido de
3'). Se seleccionaron aproximadamente 3 X 10^{4} colonia de una
biblioteca de ADNc de Lycopersicon esculentum mediante
hibridación de la colonia utilizando un producto obtenido por PCR de
la fitoeno sintasa del tomate marcado con 32P. La hibridación se
llevó a cabo a 42ºC durante 48 h en formamida al 50%, SSC (cloruro
de sodio - citrato de sodio) 5X, tampón fosfato 0,02 M, solución de
Denhart y ADN del timo de ternero esquilado 0,1 mg/ml. Los filtros
se lavaron a 65ºC en SSC 0,1X, SDS al 0,1% antes de la
autorradiografía. Los productos de PCR y los clones de ADNc de la
fitoeno sintasa se verificaron mediante secuenciación de
didesoxinucleótidos.
Se subclonó un fragmento de 1,2 Kb de PstI -
BamHI que contenían el ADNc de la fitoeno sintasa y uno de 0,7 Kb de
ADNc parcial de la fitoeno desaturasa en pBluescript KS+
(Stratagene, La Jolla, Calif.). La secuenciación nucleotídica de
KS+/PDS Nº 38 y KS+/ 5'3'PSY se llevó a cabo mediante terminación de
cadena o método didesoxi utilizando moldes de cadena sencilla. Se
llevó a cabo el análisis de la secuencia de nucleótidos y
comparaciones de secuencias de aminoácidos utilizando los programas
PCGENE y DNA Inspector IIE.
Se subclonó un fragmento de 1253 pares de bases
de XhoI que contenía el ADNc de la fitoeno sintasa del tomate
en TTO1. El vector TTO1/PSY+ (figura 1) contiene el ADNc de la
fitoeno sintasa (orientación positiva) bajo el control del promotor
subgenómico de la proteína de la cubierta TMV-U1;
mientras que el vector TTO1/PSY- contiene el ADNc de la fitoeno
sintasa en la orientación antisentido.
Se subclonó un fragmento de XhoI que
contiene el ADNc parcial de la fitoeno desaturasa del tomate en
TTO1. El vector TTO1A/PDS+ contiene el ADNc de la fitoeno desaturasa
(orientación positiva) bajo el control del promotor subgenómico de
la proteína de la cubierta TMV-U1; mientras que el
vector TTO1/PDS- contiene el ADNc de la fitoeno desaturasa en la
orientación antisentido.
Se aisló un ADNc parcial que codifica para la
fitoeno desaturasa del ARN de la hoja de N.
benthamiana mediante RT-PCR utilizando los
siguientes oligonucleótidos: PDS, 5' GGCACTCAACTTTATAAACC 3'
(SEQ ID Nº: 8) (en el sentido de 5'), 5' CTTCAGTTTTCTGTCAAACC 3'
(SEQ ID Nº: 9) (en el sentido de 3') y se verificó mediante
secuenciación de didesoxinucleótidos.
Se prepararon ARN infecciosos de TTO1/PSY+
(figura 1), TTO1/PSY-, TTO1A/PDS+, TTO1/PDS- mediante transcripción
in vitro utilizando ARN polimerasa dependiente de ADN de SP6
y se utilizaron para inocular mecánicamente en N. benthamiana
(Dawson, et al., Adv. Virus Res. 38:307 (1990)). Los virus
híbridos se propagaron por todas las hojas superiores no inoculadas,
tal como se verificó mediante microscopía electrónica de
transmisión, ensayo de infectividad de las lesiones locales y
amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los
síntomas virales consistieron en distorsión de las hojas sistémicas,
atrofia de la planta y clorosis leve. Las plantas transfectadas con
TTO1/PSY+ mostraron un aumento de al menos dos veces en la actividad
de la fitoeno sintasa con respecto a las plantas transfectadas con
controles de vectores virales. Las hojas de las plantas infectadas
sistémicamente con TTO1/PSY+ desarrollaron un fenotipo naranja
brillante y acumularon altos niveles de fitoeno (tabla 1). Las hojas
y los sépalos de las plantas TTO1/PDS- desarrollaron un fenotipo de
decoloración blanca similar al observado con el herbicida
noflurazona. La estructura de los cloroplastos de las plantas
transfectadas con TTO1/PSY+ y TTO1/PDS-, cuando se analizó mediante
microscopía electrónica de transmisión, pareció ser normal. Las
hojas de las plantas infectadas sistémicamente por TTO1A/PDS+
desarrollaron un fenotipo de decoloración blanca aproximadamente una
semana después que las hojas de las plantas TT01/PDS- antisentido y
también acumularon altos niveles de fitoeno.
La electroforesis en gel de agarosa del ADNc de
PCR aislado de ARN del virión y el análisis de Nothern blot del ARN
de virión indican que los vectores se mantienen en un estado
extracromosómico y no han experimentado ninguna reorganización
intramolecular detectable.
Cuantificación de fitoeno en las hojas de N. benthamiana transfectada con transcritos virales | ||
Planta | Fitoeno \mug/g FW | Veces de aumento |
N. benthamiana - - - - - | 4,6 | 1 |
N. benthamiana: TTO1/PDS- | 234,8 | 51,0 |
N. benthamiana: Norflurazona | 339,8 | 73,9 |
N. benthamiana: TTO1/PSY+ | 52,4 | 11,4 |
N. benthamiana: TT01/PSY- | 1,0 | 0,2 |
Se extrajo fitoeno en metanol y se identificó
mediante el tiempo de retención de su pico y los espectros de
absorción en una columna Spherisob ODS-1, 5 \mum,
25 cm, utilizando acetonitrilo / metanol /
2-propanol (85:10:5) como un disolvente de
desarrollo a una velocidad de flujo de 1 ml/min. El fitoeno aislado
del tejido infectado sistémicamente tenía un tiempo de retención
idéntico al fitoeno de las plantas tratadas con norflurazona. El
pico de fitoeno de N. benthamiana transfectada con TTO1/PSY+
tenía máximos de absorbancia óptica característicos en 276, 285 y
298 nm. Una semana después de la inoculación, las plantas
transfectadas con fitoeno sintasa codificada viral mostraron un
aumento de cien veces en el fitoeno, en comparación con los niveles
en las plantas no infectadas, medido por separación de carotenoides
mediante HPLC. Los carotenoides se extrajeron en metanol y se
identificaron mediante el tiempo de retención de su pico y los
espectros de absorción en una columna Spherisob
ODS-1, 5 \mum, 25 cm, utilizando acetonitrilo /
metanol / 2-propanol (85:10:5) como un disolvente de
desarrollo. La expresión del ARN sentido (TTO1A/PDS+) y antisentido
(TTO1/PDS-) para una fitoeno desaturasa parcial en las plantas
transfectadas inhibió la síntesis de carotenoides coloreados e hizo
que las hojas infectadas sistémicamente desarrollaran un fenotipo
blanco. El análisis de HPLC de estas plantas reveló que también
acumulaban fitoeno en niveles elevados. La decoloración blanquecina
de las hojas se reprodujo en las plantas control tratadas con el
herbicida norflurazona, un inhibidor no competitivo de la fitoeno
desaturasa.
Se aisló un clon de ADNc parcial que codifica
para la fitoeno desaturasa de N. benthamiana a partir de
tejido de hoja joven. La comparación de la secuencia nucleotídica de
369 pb en las regiones correspondientes entre la fitoeno desaturasa
del tomate y de N. benthamiana indica que son
similares entre sí en un 92% (figura 2). Puesto que los genes de las
dos plantas tienen zonas de alta homología, puede producirse la
inhibición citoplásmica del gen de la planta endógeno mediante ARN
antisentido derivado de virus mediante la formación de moléculas de
ARN híbridas de doble cadena. La regulación por disminución de la
fitoeno desaturasa en plantas transfectadas con TTO1A/PDS+ puede
producirse mediante la interferencia directa durante la traducción
del ARNm en proteínas o mediante dúplex formados entre el ARNm y ARN
de cadena negativa derivada de virus, aunque no es necesario conocer
mecanismo preciso de acción para llevar a cabo la invención.
Se aisló un fragmento de 861 pb
(5524-6384) del virus del mosaico del tomate (cepa F
de necrosis en la fruta; ToMV-F) que contenía el
posible promotor subgenómico de la proteína de la cubierta, el gen
de la proteína de la cubierta y se aisló el extremo 3' mediante PCR
utilizando cebadores de ToMV 5' CTCGCAAAGTTTCGAACCAAATCCTC 3' (SEQ
ID Nº: 1) (en el sentido de 5') y
5'CGGGGTACCTGGGCCCCAACCGGGGGTTCCGGGGG 3' (SEQ ID Nº: 2) (en el
sentido de 3') y se subclonó en el sitio HincII de
pBluescript KS-. Se construyó un virus híbrido que consistía en
TMV-U1 y ToMV-F intercambiando un
fragmento de 874 pb XhoI-KpnI de ToMV en pBGC152 (I.
Pecker, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89, 4962
(1992)), creando el plásmido TTO1. El fragmento insertado se
verificó mediante secuenciación de didesoxinucleótidos. Se insertó
un único sitio AvrII en el sentido de 3' del sitio
XhoI en TTO1 mediante mutagénesis por PCR, creando el
plásmido TTO1A, utilizando los siguientes oligonucleótidos:
5'TCCTCGAGCCTAGGCTCGCAAAGTTTCGAACCAAATCCTCA 3'
(SEQ ID Nº:3) (en el sentido de 5')
5'CGGGGTACCTGGGCCCCAACCGGGGGTTCCGGGGG 3' (SEQ ID
Nº:2) (en el sentido 3')
Utilizando mutagénesis por PCR se amplificó un
fragmento XhoI, que codificaba para la fitoeno sintasa del
tomate a partir de un clon de ADNc de Lycopersicon esculentum
aislado de una biblioteca de ADNc de fruta en maduración, y se situó
bajo el control del promotor subgenómico de la proteína de la
cubierta TMV-U1 subclonando en
TTO1.
TTO1.
Se prepararon ARN infecciosos de TTO1A/PDS+,
TTO1/PDS- mediante transcripción in vitro utilizando ARN
polimerasa dependiente de ADN de SP6 y se utilizaron para inocular
mecánicamente N. benthamiana. Los virus híbridos se
propagaron por todas las hojas superiores no inoculadas, tal como se
verificó mediante microscopía electrónica de transmisión, ensayo de
infectividad de las lesiones locales y amplificación por reacción en
cadena de la polimerasa (PCR). Los síntomas virales consistieron en
distorsión de las hojas sistémicas, atrofia de la planta y clorosis
leve. Las hojas y los sépalos de las plantas TTO1/PDS- desarrollaron
un fenotipo de decoloración blanca similar al observado con el
herbicida noflurazona. La estructura de los cloroplastos de las
plantas transfectadas con TTO1/PSY+ y TTO1/PDS-, cuando se analizó
mediante microscopía electrónica de transmisión, pareció ser normal.
Las hojas de las plantas infectadas sistémicamente por TTO1A/PDS+
desarrollaron un fenotipo de decoloración blanca aproximadamente una
semana después que las hojas de las plantas TT01/PDS- antisentido y
también acumularon altos niveles de fitoeno.
Se prepararon ARN infecciosos de TTO1/PDY-
mediante transcripción in vitro utilizando ARN polimerasa
dependiente de ADN de SP6 y se utilizaron para inocular
mecánicamente N. benthamiana. Los virus híbridos se
propagaron por todas las hojas superiores no inoculadas, tal como se
verificó mediante microscopía electrónica de transmisión, ensayo de
infectividad de las lesiones locales y amplificación por reacción en
cadena de la polimerasa (PCR). Los síntomas virales consistieron en
distorsión de las hojas sistémicas, atrofia de la planta y clorosis
leve. Las plantas transfectadas con TTO1/PSY+ mostraron un aumento
de al menos dos veces en la actividad de la fitoeno sintasa con
respecto a las plantas transfectadas con controles de vectores
virales (datos no mostrados). Las hojas de las plantas infectadas
sistémicamente con TTO1/PSY+ desarrollaron un fenotipo naranja
brillante y acumularon altos niveles de fitoeno (tabla 1). Las hojas
de las plantas TTO1/PDS- desarrollaron un ligero fenotipo de
decoloración blanca. La estructura de los cloroplastos de TTO1/PSY-,
cuando se analizó mediante microscopía electrónica de transmisión,
pareció ser normal. Las hojas de las plantas infectadas
sistémicamente por TTO1A/PSY- no acumularon
fitoeno.
fitoeno.
Se aisló un clon de ADNc parcial que codifica
para la fitoeno desaturasa de N. benthamiana a partir de
tejido de hoja joven. La comparación de la secuencia nucleotídica de
380 pb en las regiones correspondientes entre la fitoeno desaturasa
del tomate y de N. benthamiana indica que son
similares entre sí en un 92% (figura 2). Puesto que los genes de las
dos plantas tienen zonas de alta homología, puede producirse la
inhibición citoplásmica del gen de la planta endógeno mediante ARN
antisentido derivado de virus mediante la formación de moléculas de
ARN híbridas de doble cadena. La regulación por disminución de la
fitoeno desaturasa en plantas transfectadas con TTO1A/PDS+ puede
producirse mediante la interferencia directa durante la traducción
del ARNm en proteínas o mediante dúplex formados entre el ARNm y ARN
de cadena negativa derivada de virus.
Se llevaron a cabo experimentos de PCR de la
transcriptasa inversa que miden la presencia o ausencia de
transcritos de ARNm de PDS detectables en células de N.
benthamiana que contienen TT01/PDS- (que producen ARN
antisentido de PDS). El ARN se aisló de las plantas transfectadas
por el método de Gailiano et al. Los cebadores utilizados
para detectar TT01/L. esculeutum fueron 5'
TAATCGATGATGATTCGGAGGCTAC 3' (SEQ ID Nº: 10 (en el sentido de 5') 5'
GGCACTCAACTTTATAAACC 3' (SEQ ID Nº: 8) (en el sentido de 3'). El
cebador utilizado para detectar los transcritos de N.
benthamiana fueron 5' GGCACTCAACTTTATAAACC 3' (SEQ ID Nº: 8) (en
el sentido de 5') y 5' CTCCTTTAATTGTACTGCCA 3' (SEQ ID Nº: 11) (en
el sentido de 3'). Los experimentos de PCR no pudieron detectar ARNm
de PDS endógeno en las plantas transfectadas por el vector, mientras
que pudo detectarse el transcrito antisentido esperado de 452 pb. El
ARNm de PDS de 219 pb sólo pudo detectarse en las plantas N.
benthamiana control, no infectadas.
Claims (15)
1. Vector genético viral derivado de un virus de
cadena sencilla positivo, que puede replicarse en el citoplasma de
una célula vegetal, que comprende:
- a)
- un primer promotor subgenómico de virus de plantas en combinación funcional con una primera secuencia de ácido nucleico que codifica para un ARN antisentido o un ARN co-supresor específico para un gen de interés en una planta en la que la transcripción de la primera secuencia de ácido nucleico está regulada por el primer promotor subgenómico del virus de plantas; y
- b)
- un segundo promotor subgenómico de virus de plantas unido operativamente a una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteína de la cubierta de virus de plantas en la que la transcripción de la segunda secuencia de ácido nucleico está regulada por el segundo promotor subgenómico de virus de planta.
2. Vector según la reivindicación 1, en el que
dicho vector se deriva de un virus de plantas ARN de cadena sencilla
positiva.
3. Vector según la reivindicación 1, en el que
dichos promotores subgenómicos primero y segundo son heterólogos
entre sí.
4. Vector según la reivindicación 1, en el que
dicho gen de interés es fitoeno desaturasa.
5. Vector según la reivindicación 1, en el que
dicho gen de interés es la fitoeno sintasa.
6. Método para producir una célula vegetal que
tiene expresión reducida de un gen de interés, comprendiendo el
método las etapas de transfectar una célula vegetal con el vector
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la
secuencia de ácido nucleico que codifica para un ARN antisentido o
un ARN co-supresor es específico para el gen de
interés.
7. Método según la reivindicación 6, en el que
dicho vector se deriva de un virus de plantas ARN de cadena sencilla
positiva.
8. Método según la reivindicación 7, en el que
dichos promotores subgenómicos primero y segundo son heterólogos
para la célula vegetal.
9. Método para producir una célula vegetal que
tiene expresión reducida de un gen de interés, comprendiendo el
método las etapas de transfectar una célula con un vector genético
según la reivindicación 4 ó 5.
10. Método según la reivindicación 9, en el que
la célula vegetal es una célula de Nicotiana.
11. Célula vegetal que comprende un vector según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
12. Célula vegetal según la reivindicación 11, en
la que el vector se deriva de un virus de plantas ARN de cadena
sencilla.
13. Célula vegetal según la reivindicación 11,
que comprende el vector según la reivindicación 4 ó 5.
14. Célula vegetal según la reivindicación 13, en
la que dicha célula vegetal es una célula de Nicotiana.
15. Planta que comprende una pluralidad de
células según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14.
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