CN105188382B - 用于植物害虫控制的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

提供了提高各种作物植物的真菌病抗性和/或线虫抗性的方法和组合物。还提供了提高各种作物植物的真菌病抗性和/或线虫抗性的组合物和方法的组合。白粉病是影响广泛植物的真菌疾病，所述植物包括谷物、禾本科植物、蔬菜、观赏植物、野草、灌木、果树、阔叶树荫以及林木，所述真菌疾病是由白粉菌目中的不同的真菌菌种所引起。

Description

用于植物害虫控制的方法和组合物
相关申请的交叉引用
本国际专利申请要求2013年1月15日提交的美国临时专利申请号61/752,703的权益，该美国临时专利申请以引用的方式整体并入本文。
序列表的并入
通过USPTO的EFS系统随本文提供了作为本国际专利申请一部分的被命名为“40_71_59225_SEQ_LISTING”的文件的序列表并且该序列表以引用的方式整体并入本文，该文件大小是70,527个字节(在MS-中所测量)，含有128个序列，并且创建于2014年1月14日。
背景
白粉病是影响广泛植物的真菌疾病，所述植物包括谷物、禾本科植物、蔬菜、观赏植物、野草、灌木、果树、阔叶树荫以及林木，所述真菌疾病是由白粉菌目(Erysiphales)中的不同的真菌菌种所引起。所述疾病的特征在于白色至浅灰色、滑石粉样生长的斑点或斑块，所述斑点或斑块产生很小的针头大小的球形结果结构(真菌的闭囊壳或越冬体)，这些结构最初是白色的，随后是黄棕色的并且最终是黑色的。引起白粉病的真菌具有寄主特异性并且不能在没有适当的寄主植物的情况下存活。它们产生菌丝体(真菌丝状体)，所述菌丝体仅生长在植物的表面上并且通过将吸器或根样结构伸到植物的表皮细胞中来汲养。所述真菌在植物残体上以闭囊壳或菌丝体的形式越冬。在春天，闭囊壳产生孢子，所述孢子通过雨水、风或昆虫被移到易感的寄主上。
白粉病在温和并且潮湿的气候中特别普遍，其中它们常常在包括温室和田地养殖在内的各种农业环境中造成显著的产量损失和质量下降。这影响关键的谷物(例如大麦和小麦)、园艺作物(例如葡萄藤、豌豆以及番茄)以及经济上重要的观赏植物(例如玫瑰)。获得对白粉病具有抗性的天然来源的途径有限、病原体毒力的快速变化以及合适的抗性基因向优良品种中的耗时的基因渗入已造成广泛使用杀真菌剂来控制所述疾病。这并不惊人地已导致杀真菌剂抗性的进化和传播，这在最具经济重要性的白粉病当中尤其显著。
霜霉病是由来自霜霉科(Peronosporaceae)的卵菌纲(oomycete)微生物所引起，所述微生物是植物的寄生物。霜霉科是专性活体营养性植物病原体并且以胞间菌丝体的形式使用吸器穿透寄主细胞来寄生于它们的寄主植物。霜霉菌通过在独特的白色孢囊柄上形成孢子囊而以无性方式繁殖，所述孢囊柄通常形成于受感染叶片的下表面上。这些构成了“霜霉病”并且最初症状在叶片上表现为淡绿色至黄色斑点。孢子囊被风分散到其他叶片的表面。根据菌属，孢子囊可以通过形成游动孢子或通过芽管而萌发。在后一种情况中，孢子囊表现得像真菌的分生孢子并且常常被这样称呼。有性繁殖是经由卵孢子。
大部分霜霉是草本双子叶植物的病原体。一些霜霉菌菌属具有相对有限的寄主范围，例如菊科植物(Asteraceae)上的圆梗霉属(Basidiophora)、类霜霉属(Paraperonospora)、原盘梗霉属(Protobremia)以及盘梗霉属(Bremia)；几乎仅仅处于十字花科植物(Brassicaceae)上的普罗氏霜霉属(Perofascia)和透明霜霉属(Hyaloperonospora)；禾本科植物(Poaceae)上的维氏霜霉属(Viennotia)、食禾霜霉属(Graminivora)、普卡氏霜霉属(Poakatesthia)、指梗霉属(Sclerospora)以及霜指霉属(Peronosclerospora)；毛茛科植物上的普拉氏霜霉属(Plasmoverna)。然而，最大的菌属，即霜霉属(Peronospora)和单轴霉属(Plasmopara)具有非常广泛的寄主范围。
在商业性农业中，霜霉病对于十字花科植物、葡萄以及在藤本植物上生长的蔬菜的种植者来说是一个特别的问题。具有经济重要性的霜霉包括感染葡萄藤的葡萄生单轴霉(Plasmopara viticola)、引起烟草上的青霉病的烟草霜霉(Peronospora tabacina)、莴苣盘梗霉(Bremia lactucae)(莴苣上的一种寄生物)、以及向日葵上的霍尔斯单轴霉(Plasmopara halstedii)。
锈菌(柄锈菌目(Pucciniales)，原先的锈菌目(Uredinales))是维管束植物的专性活体营养性寄生物。锈菌影响多种植物；叶片、茎、果实以及种子，并且最常被看到的是有色粉末，所述粉末由微小的锈孢子构成，所述锈孢子落在植被上，产生在下表面上形成的孢子堆或夏孢子堆。在晚春或初夏期间，被称作冬孢子堆的黄橙色或棕色的毛发状或舌状结构在叶片上生长或从木本寄主的树皮中显露。这些冬孢子堆产生冬孢子，所述冬孢子将萌发成气生担孢子，从而传播并且引起进一步的感染。
概述
本实施方案提供了包含多核苷酸分子的组合物和例如通过提供抑制表达的RNA或DNA对植物进行处理以改变或调节所述植物中的基因或基因转录物表达的方法。各个方面提供了包含多核苷酸分子的组合物和用于对植物局部施用这些组合物以调节植物细胞中的内源性PMR5基因的相关方法。本文公开的多核苷酸、组合物以及方法可用于降低PMR5转录物的水平以及提高植物的真菌病和/或线虫抗性。
在一个方面，在组合物中提供了多核苷酸分子，所述多核苷酸分子能够渗透或被吸收到活植物组织中以引发局部的、部分全身性的或全身性的基因抑制作用或调节作用。在某些实施方案中，所述多核苷酸分子最终向植物提供或允许在植物中产生如下的RNA，所述RNA能够在生理条件下在植物细胞中与植物细胞中从靶标内源性基因或靶标转基因所转录的RNA杂交，从而实现对内源性PMR5靶基因的调节。在某些实施方案中，如通过使靶基因沉默或抑制所述靶基因对PMR5靶基因进行调节会引起另一种基因的上调，所述另一种基因本身是通过减少PMR5靶基因的表达而被影响或调节。
在一些实施方案中，根据本文所述的方法向植物或植物部分局部施用包含外源性多核苷酸和转移剂的组合物并不一定引起也不需要所述外源性多核苷酸被整合到植物的染色体中。在一些实施方案中，根据本文所述的方法向植物或植物部分局部施用包含外源性多核苷酸和转移剂的组合物并不一定引起也不需要所述外源性多核苷酸由被整合到植物的染色体中的DNA进行的转录。在某些实施方案中，根据本文所述的方法向植物局部施用包含外源性多核苷酸和转移剂的组合物还并不一定需要所述外源性多核苷酸与粒子以物理方式结合，如在生物射弹介导的向植物、植物部分或植物细胞的内部引入与金粒子或钨粒子缔合的多核苷酸中。在本文所提供的方法的某些实施方案中，本文所提供的某些方法和组合物中所用的外源性多核苷酸可以任选地与可操作地连接的启动子序列缔合。然而，在其他实施方案中，本文所提供的某些方法和组合物中所用的外源性多核苷酸并非与可操作地连接的启动子序列缔合。此外，在某些实施方案中，本文所提供的某些方法和组合物中所用的外源性多核苷酸没有可操作连接至病毒载体。
在某些实施方案中，提供了用于提高植物的真菌病抗性和/或线虫抗性的方法，所述方法包括局部施用包含抑制靶PMR5基因的多核苷酸和转移剂的组合物。在某些实施方案中，提供了用于选择性抑制靶PMR5基因的方法，所述方法是通过在植物生长的一个或多个所选择的种子期、营养生长期或繁殖期向植物表面局部施用多核苷酸组合物来实现的。这些方法可以根据需要或依照要求在植物或植物部分中提供基因抑制作用。在某些实施方案中，提供了用于选择性抑制靶PMR5基因的方法，所述方法是通过在植物生长的一个或多个预定的种子期、营养生长期或繁殖期向植物表面局部施用多核苷酸组合物来实现的。这些方法可以在植物或植物部分中提供PMR5基因抑制作用，所述PMR5基因抑制作用避免了在植物发育的特定的种子期、营养生长期或繁殖期抑制基因表达的任何不希望有的或不必要的影响。
在某些实施方案中，提供了用于选择性提高植物的真菌病抗性和/或线虫抗性的方法，所述方法是通过在一个或多个所选择的种子期、营养生长期或繁殖期向植物表面局部施用多核苷酸组合物来实现的。这些方法可以根据需要或依照要求在植物或植物部分中提供提高的真菌病抗性和/或线虫病抗性。在某些实施方案中，提供了用于选择性提高植物的真菌病抗性和/或线虫抗性的方法，所述方法是通过在一个或多个预定的种子期、营养生长期或繁殖期向植物表面局部施用多核苷酸组合物来实现的。这些方法可以在植物或植物部分中提供真菌病和/或线虫抗性的提高，所述提高避免了在植物发育的特定的种子期、营养生长期或繁殖期抑制PMR5基因表达的任何不希望有的或不必要的影响。
可以用于抑制PMR5的多核苷酸包括但不限于以下各项中的任一种：i)包含至少18个连续核苷酸的多核苷酸，所述至少18个连续核苷酸与表2(SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11)中的基因或基因转录物或编码表3(SEQ ID NO：41-48或49)中的蛋白质的基因或基因转录物基本上同一或基本上互补；ii)包含至少18个连续核苷酸的多核苷酸，所述至少18个连续核苷酸与表3中的编码PMR5或PMR5样蛋白的基因基本上同一或基本上互补，所述基因包括SEQ ID NO：41-48或49的多核苷酸；或包含至少18个连续核苷酸的多核苷酸，所述至少18个连续核苷酸与SEQ ID NO：12-19、21-37、53-127或128的多核苷酸基本上同一或基本上互补。提供了某些多核苷酸在转移剂存在下的局部施用的方法和组合物可以用于以最佳的方式抑制PMR5基因表达。在某些实施方案中，可以“根据需要”在发现真菌病或线虫出现后施用本文提供的组合物。在某些实施方案中，可以避免对产量或其他特征有任何有害影响的方式施用所述组合物，所述其他特征可能与抑制作物植物的PMR5基因表达有关。所施用的多核苷酸与植物中的PMR5靶标寄主基因互补并且它们的局部施用引起了对PMR5基因活性的抑制。
本文提供了用于控制植物真菌病的组合物和方法。可以使用本文提供的方法和组合物加以控制的植物真菌病包括但不限于植物中的专性活体营养性白粉病、霜霉病以及锈病真菌侵扰。在某些实施方案中，提供了方法和组合物，所述方法和组合物用于减少植物的一种或多种细胞或组织中一种或多种植物PMR5多核苷酸和/或蛋白质分子的表达以使得植物不太易感白粉菌目、霜霉科或柄锈菌目的真菌感染。在某些实施方案中，公开了可以通过本文提供的方法和组合物下调以提高植物对白粉病、霜霉病或锈病感染的抗性的植物PMR5基因的核苷酸和氨基酸序列。
本文还提供了如下的方法和组合物，所述方法和组合物使得植物根部的至少细胞中PMR5靶标多核苷酸和蛋白质分子的表达减少以提高对线虫的抗性。可以通过本文提供的方法和组合物加以控制的线虫包括但不限于根癌线虫(如根结线虫属种(Meloidogynesp.))、孢囊线虫(如黄金线虫属种(Globodera sp.)和异皮线虫属种(Heterodera sp.))、根腐线虫(如短体线虫属种(Pratylenchus sp.))等。在某些实施方案中，通过向植物叶片、苗、根部和/或种子局部提供组合物来减少滋养线虫的植物根部细胞中的PMR5表达，所述组合物包含多核苷酸，所述多核苷酸包含至少18个连续核苷酸，所述至少18个连续核苷酸与PMR5基因或PMR5基因的转录物基本上同一或基本上互补；以及转移剂。
还提供了如下的方法和组合物，其中利用局部诱导的PMR5转录物或蛋白质水平的降低来实现白粉病、霜霉病或锈病控制，同时使在寄主植物中有害的多效性效应减到最低程度。这些方法和组合物提供了经过优化的PMR5基因抑制水平和/或经过优化的PMR5基因抑制时机。
某些实施方案涉及用于产生植物的方法，所述植物表现出真菌病抗性和/或线虫抗性的提高，所述方法包括向植物表面局部施用包含以下各项的组合物：
a.至少一种包含至少18个连续核苷酸的多核苷酸，所述至少18个连续核苷酸与PMR5基因或所述基因的转录物基本上同一或基本上互补；以及
b.转移剂，其中所述植物表现出由于抑制PMR5基因所引起的真菌病抗性和/或线虫抗性的提高。在某些实施方案中，所述多核苷酸分子包含正义ssDNA、正义ssRNA、dsRNA、dsDNA、双链DNA/RNA杂交体、反义ssDNA或反义ssRNA。在某些实施方案中，所述多核苷酸选自由SEQ ID NO：12-19、21-37、53-127或128组成的组，或其中所述多核苷酸包含至少18个连续核苷酸，所述至少18个连续核苷酸与SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11基本上同一或基本上互补。在某些实施方案中：(a)所述植物是大豆植物，所述基因或所述转录物是大豆PMR5基因或转录物，并且所述多核苷酸分子选自由SEQ ID NO：12-19、57-127以及SEQID NO：128组成的组，或所述多核苷酸包含至少18个连续核苷酸，所述至少18个连续核苷酸与SEQ ID NO：8或11基本上同一或基本上互补；(b)所述植物是大麦植物，所述基因或转录物是大麦PMR5基因或转录物，并且所述多核苷酸分子选自由SEQ ID NO：21-37以及SEQ IDNO：38组成的组，或所述多核苷酸包含至少18个连续核苷酸，所述至少18个连续核苷酸与SEQ ID NO：4基本上同一或基本上互补；(c)所述植物是黄瓜植物，所述基因或所述转录物是黄瓜PMR5基因或转录物，并且所述多核苷酸包含至少18个连续核苷酸，所述至少18个连续核苷酸与SEQ ID NO：3或6、53、54、55或56基本上同一或基本上互补；(d)所述植物是莴苣植物，所述基因或所述转录物是莴苣PMR5基因或转录物，并且所述多核苷酸包含至少18个连续核苷酸，所述至少18个连续核苷酸与SEQ ID NO：1基本上同一或基本上互补；(e)所述植物是玉米植物，所述基因或所述转录物是玉米PMR5基因或转录物，并且所述多核苷酸包含至少18个连续核苷酸，所述至少18个连续核苷酸与SEQ ID NO：7基本上同一或基本上互补；(f)所述植物是番茄植物，所述基因或所述转录物是番茄PMR5基因或转录物，并且所述多核苷酸包含至少18个连续核苷酸，所述至少18个连续核苷酸与SEQ ID NO：2或10基本上同一或基本上互补；(g)所述植物是小麦植物，所述基因或所述转录物是小麦PMR5基因或转录物，并且所述多核苷酸包含至少18个连续核苷酸，所述至少18个连续核苷酸与SEQ IDNO：5基本上同一或基本上互补；或(h)所述植物是水稻植物，所述基因或所述转录物是水稻PMR5基因或转录物，并且所述多核苷酸包含至少18个连续核苷酸，所述至少18个连续核苷酸与SEQ ID NO：9基本上同一或基本上互补。在某些实施方案中，所述组合物包含两种或更多种多核苷酸分子的任何组合。在某些实施方案中，所述多核苷酸具有至少18至约24个、约25至约50个、约51至约100个、约101至约300个、约301至约500个、或至少约500个或更多个残基的长度。在某些实施方案中，所述组合物还包含非多核苷酸除草剂分子、多核苷酸除草剂分子、抑制除草剂靶基因的多核苷酸、杀虫剂、杀真菌剂、杀线虫剂、或其组合。在某些实施方案中，所述组合物还包含非多核苷酸除草剂分子并且所述植物对所述除草剂分子具有抗性。在某些实施方案中，所述转移剂包含有机硅制剂。在某些实施方案中，所述多核苷酸没有可操作连接至病毒载体。在某些实施方案中，所述多核苷酸未被整合到植物染色体中。另外的实施方案涉及：根据上述方法中的任一种所制得的植物；表现出真菌病抗性和/或线虫抗性提高的植物的后代；所述植物的种子，其中来自所述植物的种子表现出真菌病抗性和/或线虫抗性的提高；以及所述植物、所述后代植物或所述种子的加工产品，其中所述加工产品表现出真菌病抗性和/或线虫抗性的提高。在某些实施方案中，所述植物或植物部分的加工产品相对于未经过处理的对照植物的加工产品表现出改进的属性，并且所述改进的属性是由提高的真菌病抗性和/或线虫抗性所产生。在与从未经过处理的植物或植物部分获得的加工产品相比较时，加工产品的改进属性可以包括但不限于霉菌毒素含量降低、营养含量提高、储存特征改进、风味改进、稠度提高等。
另一个实施方案涉及一种组合物，所述组合物包含多核苷酸分子，所述多核苷酸分子包含至少18个连续核苷酸，所述至少18个连续核苷酸与PMR5基因或所述基因的转录物基本上同一或基本上互补，其中所述多核苷酸并非与启动子可操作地连接；以及b)转移剂。在某些实施方案中，所述多核苷酸选自由SEQ ID NO：12-19、21-38、53-127和128组成的组，或所述多核苷酸包含至少18个连续核苷酸，所述至少18个连续核苷酸与SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11基本上同一或基本上互补，或者其中所述多核苷酸包含至少18个连续核苷酸，所述至少18个连续核苷酸与SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11基本上同一或基本上互补。在某些实施方案中：(a)所述植物是大豆植物，所述基因或所述转录物是大豆PMR5基因或转录物，并且所述多核苷酸分子选自由SEQ ID NO：12-19、57-127以及SEQ IDNO：128组成的组，或所述多核苷酸包含至少18个连续核苷酸，所述至少18个连续核苷酸与SEQ ID NO：8或11基本上同一或基本上互补；(b)所述植物是大麦植物，所述基因或转录物是大麦PMR5基因或转录物，并且所述多核苷酸分子选自由SEQ ID NO：21-37以及SEQ IDNO：38组成的组，或所述多核苷酸包含至少18个连续核苷酸，所述至少18个连续核苷酸与SEQ ID NO：4基本上同一或基本上互补；(c)所述植物是黄瓜植物，所述基因或所述转录物是黄瓜PMR5基因或转录物，并且所述多核苷酸包含至少18个连续核苷酸，所述至少18个连续核苷酸与SEQ ID NO：3或6、53、54、55或56基本上同一或基本上互补；(d)所述植物是莴苣植物，所述基因或所述转录物是莴苣PMR5基因或转录物，并且所述多核苷酸包含至少18个连续核苷酸，所述至少18个连续核苷酸与SEQ ID NO：1基本上同一或基本上互补；(e)所述植物是玉米植物，所述基因或所述转录物是玉米PMR5基因或转录物，并且所述多核苷酸包含至少18个连续核苷酸，所述至少18个连续核苷酸与SEQ ID NO：7基本上同一或基本上互补；(f)所述植物是番茄植物，所述基因或所述转录物是番茄PMR5基因或转录物，并且所述多核苷酸包含至少18个连续核苷酸，所述至少18个连续核苷酸与SEQ ID NO：2或10基本上同一或基本上互补；(g)所述植物是小麦植物，所述基因或所述转录物是小麦PMR5基因或转录物，并且所述多核苷酸包含至少18个连续核苷酸，所述至少18个连续核苷酸与SEQ IDNO：5基本上同一或基本上互补；或(h)所述植物是水稻植物，所述基因或所述转录物是水稻PMR5基因或转录物，并且所述多核苷酸包含至少18个连续核苷酸，所述至少18个连续核苷酸与SEQ ID NO：9基本上同一或基本上互补。在某些实施方案中，所述多核苷酸具有至少18至约24个、约25至约50个、约51至约100个、约101至约300个、约301至约500个、或至少约500个或更多个残基的长度。在某些实施方案中，所述组合物还包含非多核苷酸除草剂分子、多核苷酸除草剂分子、抑制除草剂靶基因的多核苷酸、杀虫剂、杀真菌剂、杀线虫剂、或其组合。在某些实施方案中，所述转移剂是有机硅制剂。在某些实施方案中，所述多核苷酸并非与生物射弹粒子以物理方式结合。
另一个实施方案涉及一种制备组合物的方法，所述方法包括组合至少以下的步骤：(a)包含至少18个连续核苷酸的多核苷酸分子，所述至少18个连续核苷酸与植物的PMR5基因或转录物基本上同一或基本上互补，其中所述多核苷酸没有可操作连接至启动子或病毒载体；以及(b)转移剂。在某些实施方案中，所述多核苷酸是通过体内生物合成、体外酶促合成或化学合成而获得的。在某些实施方案中，所述方法还包括将多核苷酸和转移剂与以下各项中的至少一种组合：非多核苷酸除草剂分子、多核苷酸除草剂分子、杀虫剂、杀真菌剂和/或杀线虫剂。在某些实施方案中，所述转移剂是有机硅制剂。
另一个实施方案涉及一种鉴定用于提高植物的真菌病抗性和/或线虫抗性的多核苷酸的方法，所述方法包括：(a)选择与植物的PMR5基因或转录物基本上同一或基本上互补的一群多核苷酸；(b)向所述植物中的至少一种的表面局部施用组合物，所述组合物包含来自所述群体的至少一种多核苷酸和转移剂，从而获得经过处理的植物；以及(c)鉴定表现出对所述PMR5基因的抑制作用或表现出真菌病抗性的提高或表现出线虫抗性的提高的经过处理的植物，从而鉴定提高所述植物的真菌病抗性和/或线虫抗性的多核苷酸。在某些实施方案中，与植物的PMR5基因或转录物基本上同一或基本上互补的多核苷酸群体的选择可以通过鉴别经由病毒诱导的基因沉默(VIGS)而抑制PMR5基因的多核苷酸来实现。可以经由VIGS抑制PMR5基因的那些多核苷酸与局部应用于包含那些多核苷酸的至少一种的组合物中植物表面的VIGS载体解离，并且鉴别表现出PMR5基因抑制或表现出真菌病抗性或线虫抗性提高的经处理的植物，由此鉴别提高植物真菌病抗性和/或线虫抗性的多核苷酸。在某些实施方案中，其中所述多核苷酸选自由SEQ ID NO：12-19、21-38、53-127和128组成的组，或其中所述多核苷酸包含至少18个连续核苷酸，所述至少18个连续核苷酸与SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11基本上同一或基本上互补。在某些实施方案中：(a)所述植物是大豆植物，所述基因或所述转录物是大豆PMR5基因或转录物，并且所述多核苷酸分子选自由SEQID NO：12-19、57-127以及SEQ ID NO：128组成的组，或所述多核苷酸包含至少18个连续核苷酸，所述至少18个连续核苷酸与SEQ ID NO：8或11基本上同一或基本上互补；(b)所述植物是大麦植物，所述基因或转录物是大麦PMR5基因或转录物，并且所述多核苷酸分子选自由SEQ ID NO：21-37以及SEQ ID NO：38组成的组，或所述多核苷酸包含至少18个连续核苷酸，所述至少18个连续核苷酸与SEQ ID NO：4基本上同一或基本上互补；(c)所述植物是黄瓜植物，所述基因或所述转录物是黄瓜PMR5基因或转录物，并且所述多核苷酸包含至少18个连续核苷酸，所述至少18个连续核苷酸与SEQ ID NO：3或6、53、54、55或56基本上同一或基本上互补；(d)所述植物是莴苣植物，所述基因或所述转录物是莴苣PMR5基因或转录物，并且所述多核苷酸包含至少18个连续核苷酸，所述至少18个连续核苷酸与SEQ ID NO：1基本上同一或基本上互补；(e)所述植物是玉米植物，所述基因或所述转录物是玉米PMR5基因或转录物，并且所述多核苷酸包含至少18个连续核苷酸，所述至少18个连续核苷酸与SEQID NO：7基本上同一或基本上互补；(f)所述植物是番茄植物，所述基因或所述转录物是番茄PMR5基因或转录物，并且所述多核苷酸包含至少18个连续核苷酸，所述至少18个连续核苷酸与SEQ ID NO：2或10基本上同一或基本上互补；(g)所述植物是小麦植物，所述基因或所述转录物是小麦PMR5基因或转录物，并且所述多核苷酸包含至少18个连续核苷酸，所述至少18个连续核苷酸与SEQ ID NO：5基本上同一或基本上互补；或(h)所述植物是水稻植物，所述基因或所述转录物是水稻PMR5基因或转录物，并且所述多核苷酸包含至少18个连续核苷酸，所述至少18个连续核苷酸与SEQ ID NO：9基本上同一或基本上互补。
另一个实施方案涉及一种植物，所述植物包含外源性多核苷酸，所述外源性多核苷酸包含至少18个连续核苷酸，所述至少18个连续核苷酸与PMR5基因或所述基因的转录物基本上同一或基本上互补，其中所述外源性多核苷酸没有可操作连接至启动子或病毒载体，未被整合到所述植物的染色体DNA中，并且不存在于非转基因植物中；并且其中所述植物表现出由抑制所述PMR5基因所引起的真菌病抗性和/或线虫抗性的提高。在某些实施方案中，植物还包含有机硅化合物或其组分。在某些实施方案中，所述多核苷酸选自由SEQ IDNO：12-19、21-38、53-127和128组成的组，或所述多核苷酸包含至少18个连续核苷酸，所述至少18个连续核苷酸与SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11基本上同一或基本上互补。在某些实施方案中：(a)所述植物是大豆植物，所述基因或所述转录物是大豆PMR5基因或转录物，并且所述多核苷酸分子选自由SEQ ID NO：12-19、57-127以及SEQ ID NO：128组成的组，或所述多核苷酸包含至少18个连续核苷酸，所述至少18个连续核苷酸与SEQ ID NO：8或11基本上同一或基本上互补；(b)所述植物是大麦植物，所述基因或转录物是大麦PMR5基因或转录物，并且所述多核苷酸分子选自由SEQ ID NO：21-37以及SEQ ID NO：38组成的组，或所述多核苷酸包含至少18个连续核苷酸，所述至少18个连续核苷酸与SEQ ID NO：4基本上同一或基本上互补；(c)所述植物是黄瓜植物，所述基因或所述转录物是黄瓜PMR5基因或转录物，并且所述多核苷酸包含至少18个连续核苷酸，所述至少18个连续核苷酸与SEQ IDNO：3或6基本上同一或基本上互补；(d)所述植物是莴苣植物，所述基因或所述转录物是莴苣PMR5基因或转录物，并且所述多核苷酸包含至少18个连续核苷酸，所述至少18个连续核苷酸与SEQ ID NO：1基本上同一或基本上互补；(e)所述植物是玉米植物，所述基因或所述转录物是玉米PMR5基因或转录物，并且所述多核苷酸包含至少18个连续核苷酸，所述至少18个连续核苷酸与SEQ ID NO：7基本上同一或基本上互补；(f)所述植物是番茄植物，所述基因或所述转录物是番茄PMR5基因或转录物，并且所述多核苷酸包含至少18个连续核苷酸，所述至少18个连续核苷酸与SEQ ID NO：2或10基本上同一或基本上互补；(g)所述植物是小麦植物，所述基因或所述转录物是小麦PMR5基因或转录物，并且所述多核苷酸包含至少18个连续核苷酸，所述至少18个连续核苷酸与SEQ ID NO：5基本上同一或基本上互补；或(h)所述植物是水稻植物，所述基因或所述转录物是水稻PMR5基因或转录物，并且所述多核苷酸包含至少18个连续核苷酸，所述至少18个连续核苷酸与SEQ ID NO：9基本上同一或基本上互补。
另一个实施方案涉及一种植物部分，所述植物部分包含外源性多核苷酸，所述外源性多核苷酸包含至少18个连续核苷酸，所述至少18个连续核苷酸与PMR5基因或所述基因的转录物基本上同一或基本上互补，其中所述外源性多核苷酸没有可操作连接至启动子或病毒载体并且不存在于非转基因植物中；并且其中所述植物部分表现出由抑制所述PMR5基因所引起的真菌病抗性和/或线虫抗性的提高。在某些实施方案中，所述多核苷酸选自由SEQ ID NO：12-19、21-38、53-127和128组成的组，或其中所述多核苷酸包含至少18个连续核苷酸，所述至少18个连续核苷酸与SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11基本上同一或基本上互补。在某些实施方案中：(a)所述植物是大豆植物，所述基因或所述转录物是大豆PMR5基因或转录物，并且所述多核苷酸分子选自由SEQ ID NO：12-19、57-127以及SEQ IDNO：128组成的组，或所述多核苷酸包含至少18个连续核苷酸，所述至少18个连续核苷酸与SEQ ID NO：8或11基本上同一或基本上互补；(b)所述植物是大麦植物，所述基因或转录物是大麦PMR5基因或转录物，并且所述多核苷酸分子选自由SEQ ID NO：21-37以及SEQ IDNO：38组成的组，或所述多核苷酸包含至少18个连续核苷酸，所述至少18个连续核苷酸与SEQ ID NO：4基本上同一或基本上互补；(c)所述植物是黄瓜植物，所述基因或所述转录物是黄瓜PMR5基因或转录物，并且所述多核苷酸包含至少18个连续核苷酸，所述至少18个连续核苷酸与SEQ ID NO：3或6、53、54、55或56基本上同一或基本上互补；(d)所述植物是莴苣植物，所述基因或所述转录物是莴苣PMR5基因或转录物，并且所述多核苷酸包含至少18个连续核苷酸，所述至少18个连续核苷酸与SEQ ID NO：1基本上同一或基本上互补；(e)所述植物是玉米植物，所述基因或所述转录物是玉米PMR5基因或转录物，并且所述多核苷酸包含至少18个连续核苷酸，所述至少18个连续核苷酸与SEQ ID NO：7基本上同一或基本上互补；(f)所述植物是番茄植物，所述基因或所述转录物是番茄PMR5基因或转录物，并且所述多核苷酸包含至少18个连续核苷酸，所述至少18个连续核苷酸与SEQ ID NO：2或10基本上同一或基本上互补；(g)所述植物是小麦植物，所述基因或所述转录物是小麦PMR5基因或转录物，并且所述多核苷酸包含至少18个连续核苷酸，所述至少18个连续核苷酸与SEQ IDNO：5基本上同一或基本上互补；或(h)所述植物是水稻植物，所述基因或所述转录物是水稻PMR5基因或转录物，并且所述多核苷酸包含至少18个连续核苷酸，所述至少18个连续核苷酸与SEQ ID NO：9基本上同一或基本上互补。在某些实施方案中，所述植物部分是花、分生组织、胚珠、茎、块茎、果实、花粉囊、花粉、叶片、根部或种子。在某些实施方案中，所述植物部分是种子。还提供了从上述植物部分中的任一种获得的加工植物产品，其中所述加工植物产品相对于未经过处理的对照植物的加工植物产品表现出改进的属性并且其中所述改进的属性是由提高的真菌病抗性和/或线虫抗性所产生。在某些实施方案中，所述加工产品是粗粉、浆料、饲料或食品。另一个实施方案涉及一种表现出真菌病抗性和/或线虫抗性提高的植物，其中用组合物对所述植物进行局部处理，所述组合物包含：(a)至少一种包含至少18个连续核苷酸的多核苷酸，所述至少18个连续核苷酸与PMR5基因或所述基因的转录物基本上同一或基本上互补；以及(b)转移剂；并且其中所述植物表现出由抑制所述PMR5基因所引起的真菌病抗性和/或线虫抗性的提高。
本文还提供了包含转基因的转基因植物、植物部分、植物细胞和加工的植物产品，所述转基因包含与包含至少18个连续核苷酸的多核苷酸可操作连接的异源启动子，所述至少18个连续核苷酸与PMR5基因或PMR5基因的转录物基本上同一或基本上互补。此类转基因可以整合进入转基因植物的基因组，或者以可在植物中增殖的重组病毒基因组提供。在某些实施方案中，所述转基因赋予含有所述转基因的转基因植物或植物部分真菌病抗性和/或线虫抗性的提高。在某些实施方案中，所述多核苷酸选自由SEQ ID NO：12-19、21-38、57-127和128组成的组，编码包含SEQ ID NO：53、54、55、56或其互补序列或由SEQ ID NO：53、54、55、56或其互补序列组成的RNA，编码与SEQ ID NO：53、54、55、56基本上同一或基本上互补的RNA，或者包含至少18个连续核苷酸，所述至少18个连续核苷酸与SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11基本上同一或基本上互补。在某些实施方案中：(a)所述植物是大豆植物，所述基因或所述转录物是大豆PMR5基因或转录物，并且所述多核苷酸分子选自由SEQID NO：12-19、57-127以及SEQ ID NO：128组成的组，或所述多核苷酸包含至少18个连续核苷酸，所述至少18个连续核苷酸与SEQ ID NO：8或11基本上同一或基本上互补；(b)所述植物是大麦植物，所述基因或转录物是大麦PMR5基因或转录物，并且所述多核苷酸分子选自由SEQ ID NO：21-37以及SEQ ID NO：38组成的组，或所述多核苷酸包含至少18个连续核苷酸，所述至少18个连续核苷酸与SEQ ID NO：4基本上同一或基本上互补；(c)所述植物是黄瓜植物，所述基因或所述转录物是黄瓜PMR5基因或转录物，并且所述多核苷酸包含至少18个连续核苷酸，所述至少18个连续核苷酸与SEQ ID NO：3或6、53、54、55或56基本上同一或基本上互补，或编码包含SEQ ID NO：53、54、55或56或者由其组成的RNA；(d)所述植物是莴苣植物，所述基因或所述转录物是莴苣PMR5基因或转录物，并且所述多核苷酸包含至少18个连续核苷酸，所述至少18个连续核苷酸与SEQ ID NO：1基本上同一或基本上互补；(e)所述植物是玉米植物，所述基因或所述转录物是玉米PMR5基因或转录物，并且所述多核苷酸包含至少18个连续核苷酸，所述至少18个连续核苷酸与SEQ ID NO：7基本上同一或基本上互补；(f)所述植物是番茄植物，所述基因或所述转录物是番茄PMR5基因或转录物，并且所述多核苷酸包含至少18个连续核苷酸，所述至少18个连续核苷酸与SEQ ID NO：2或10基本上同一或基本上互补；(g)所述植物是小麦植物，所述基因或所述转录物是小麦PMR5基因或转录物，并且所述多核苷酸包含至少18个连续核苷酸，所述至少18个连续核苷酸与SEQ IDNO：5基本上同一或基本上互补；或(h)所述植物是水稻植物，所述基因或所述转录物是水稻PMR5基因或转录物，并且所述多核苷酸包含至少18个连续核苷酸，所述至少18个连续核苷酸与SEQ ID NO：9基本上同一或基本上互补。在某些实施方案中，所述植物部分是花、分生组织、胚珠、茎、块茎、果实、花粉囊、花粉、叶片、根部或种子。含有转基因的加工的植物产品包括但不限于可获自转基因植物部分的粗粉、浆料、饲料或食品。在某些实施方案中，加工植物产品相对于未经过处理的对照植物的加工植物产品表现出改进的属性并且其中所述改进的属性是由转基因赋予的提高的真菌病抗性和/或线虫抗性所产生。在某些实施方案中，所述加工产品是粗粉、浆料、饲料或食品。本文还提供了用于获得表现出真菌病抗性和/或线虫抗性提高的转基因植物的方法，包括以下步骤：将前述转基因的任何一个引入植物基因组，并选择其中内源性PMR5基因表达受抑制的转基因植物，从而获得表现出真菌病抗性和/或线虫抗性提高的植物。本文还提供了用于提高植物的真菌病抗性和/或线虫抗性的方法，包括培养包含前述转基因任何一个的转基因植物，其中内源性PMR5的表达在真菌和/或线虫存在下受到抑制，其中转基因植物的真菌病抗性和/或线虫抗性与缺乏抑制对照植物中内源性PMR5基因的转基因的对照植物相比得到提高。
附图简述
图1呈现了PMR5蛋白质的自展法(bootstrapped)系统发育树。
图2呈现了用各种液体处理的大麦植物中大麦白粉病对照测量。某些结果用含有如X轴标记所示的某些核酸的液体获得。
图3呈现了用各种液体处理的大麦植物中大麦白粉病对照测量(感染的叶区域的上半部的百分比)。某些结果用含有如X轴标记所示的某些个体寡核苷酸的液体获得。
图4呈现了用各种液体处理的大麦植物中大麦白粉病对照测量(感染的叶区域的百分比)。某些结果用含有如X轴标记所示的某些核酸的液体获得。
图5呈现了用各种液体处理的大豆植物中根癌线虫病对照测量(RKN卵数目/克根组织)。某些结果用含有如X轴标记所示的某些核酸的液体获得。
详述
I.定义
提供以下定义和方法以更好地限定本实施方案以及在实施本申请公开的实施方案中指导本领域的普通技术人员。除非另外指出，否则术语应当根据相关领域的普通技术人员的常规用法来理解。
在以单数形式提供术语的情况下，发明人还考虑了由该术语的复数形式所描述的方面。
如本文所用的术语“DNA”、“DNA分子”、以及“DNA多核苷酸分子”指的是基因组或合成来源的单链DNA或双链DNA分子，如脱氧核糖核苷酸碱基的聚合物或DNA多核苷酸分子。
如本文所用的术语“DNA序列”、“DNA核苷酸序列”、以及“DNA多核苷酸序列”指的是DNA分子的核苷酸序列。
如本文所用的术语“基因”指的是提供转录物的表达或编码转录物的核酸的任何部分。“基因”因此包括但不限于启动子区、5'端非翻译区、可以包括内含子区的转录物编码区、以及3'端非翻译区。
如本文所用的术语“RNA”、“RNA分子”、以及“RNA多核苷酸分子”指的是基因组或合成来源的单链RNA或双链RNA分子，如构成单链或双链区域的核糖核苷酸碱基的聚合物。
除非另有说明，否则在自左向右阅读时，沿5'端向3'端的方向给出了本说明书的文本中的核苷酸序列。本文所用的命名法是美国联邦法规(United States Code ofFederal Regulations)第37篇第1.822条所要求的以及在WIPO标准ST.25(WIPO StandardST.25)(1998年)附录2的表1和表3中的表中所阐述的命名法。
如本文所用的“植物表面”指的是植物的任何外部部分。植物表面因此包括但不限于花、茎、块茎、果实、花粉囊、花粉、叶片、根部或种子的表面。植物表面可以处于植物的附连于植物的其他部分的部分上或处于植物的与植物脱离的部分上。
如本文所用的短语“多核苷酸并非与启动子可操作地连接”指的是多核苷酸并非与由DNA依赖性RNA聚合酶II蛋白或由病毒RNA依赖性RNA聚合酶特异性识别的多核苷酸启动子序列以所述多核苷酸将由DNA依赖性RNA聚合酶II蛋白或病毒RNA依赖性RNA聚合酶转录的方式共价连接。并非与启动子可操作地连接的多核苷酸可以由植物RNA依赖性RNA聚合酶转录。
如本文所用的任何多核苷酸序列SEQ ID NO：12-19、21-37或38虽然在序列表中以ssDNA的形式展示，但涵盖了所有其他多核苷酸形式，如dsDNA等同物、ssDNA等同物、ssRNA等同物、ssRNA互补序列、dsRNA、以及ssDNA互补序列。
如本文所用，当第一核酸序列被置于与第二核酸序列具有功能关系时，第一核酸序列与第二核酸序列“可操作地”接合或“连接”。举例来说，如果启动子提供了RNA或蛋白质编码序列的转录或表达，那么所述启动子与所述RNA和/或所述编码序列可操作地连接。一般来说，可操作地连接的DNA序列是连续的，并且在需要接合两个蛋白质编码区的情况下，处于同一个阅读框中。
如本文所用的短语“有机硅制剂”指的是包含一种或多种有机硅化合物的液体，其中所述液体或其中所含的组分在被局部施用于靶标植物表面的组合物中与多核苷酸组合时使得所述多核苷酸能够进入植物细胞中。有机硅制剂的实例包括但不限于以商标名或“BREAK-”销售的制剂以及表1中所提供的制剂。在某些实施方案中，有机硅制剂能够以容许多核苷酸抑制植物细胞中的靶基因表达的方式使得多核苷酸能够进入植物细胞中。
如本文所用的短语“使得真菌病抗性和/或线虫抗性提高”指的是植物对真菌和/或线虫所诱发的损伤的抗性有任何可测量的提高。在某些实施方案中，在植物或植物部分中真菌病抗性和/或线虫抗性的提高可以通过与并未经过包含多核苷酸和转移剂的组合物处理的对照植物或植物部分进行比较来确定。当在这种背景下使用时，对照植物是没有经过多核苷酸和转移剂处理的植物。这些对照植物将包括但不限于未经过处理的植物或经过假处理的植物。
如本文所用的短语“使得……降低”在植物或植物部分中的转录物或蛋白质的背景下被使用时指的是植物或植物部分中转录物或蛋白质的水平有任何可测量的降低。在某些实施方案中，植物或植物部分中转录物或蛋白质的水平的降低可以通过与并未经过包含多核苷酸和转移剂的组合物处理的对照植物或植物部分进行比较来确定。当在这种背景下使用时，对照植物或植物部分是没有经过多核苷酸和转移剂处理的植物或植物部分。这些对照植物或植物部分将包括但不限于未经过处理或经过假处理的植物和植物部分。
如本文所用的短语“其中所述植物不包含转基因”指的是植物没有包含与多核苷酸可操作地连接的启动子的DNA分子或重组病毒载体。
如本文所用的短语“抑制表达”或“抑制”在基因的背景下使用时指的是由所述基因编码的产物的量和/或活性有任何可测量的降低。因此，基因的表达可以在来自所述基因的转录物的水平降低、由所述基因编码的蛋白质的水平降低、来自所述基因的转录物的活性降低、由所述基因编码的蛋白质的活性降低、前述情况中的任一种、或前述情况的任何组合时受到抑制。在这种背景下，转录物的活性包括但不限于它被翻译成蛋白质和/或发挥任何RNA介导的生物或生化作用的能力。在这种背景下，蛋白质的活性包括但不限于它发挥任何蛋白质介导的生物或生化作用的能力。在某些实施方案中，植物或植物部分中基因表达的抑制可以通过将经过处理的植物的基因产物水平或活性与未经包含多核苷酸和转移剂的组合物处理的对照植物或植物部分进行比较来确定。当在这种背景下使用时，对照植物或植物部分是没有经过多核苷酸和转移剂处理的植物或植物部分。这些对照植物或植物部分将包括但不限于未经过处理或经过假处理的植物和植物部分。
如本文所用的术语“转录物”对应于由基因通过转录过程所产生的任何RNA。基因的转录物因此可以包含可以含有内含子的初级转录产物或可以包含缺乏内含子的成熟RNA。
如本文所用的术语“液体”指的是均匀混合物(如溶液)和不均匀混合物(如悬浮液、胶体、胶束、以及乳液)这两者。
II.概述
本文提供了某些方法和多核苷酸组合物，所述方法和多核苷酸组合物可以向活植物细胞/组织施用以抑制靶基因的表达并且为作物植物提供了提高的真菌病抗性和/或线虫抗性。本文还提供了表现出真菌病抗性和/或线虫抗性的植物和植物部分以及这些植物或植物部分的加工产品。所述组合物可以向植物的表面，如向叶片的表面局部施用，并且包括转移剂。所述方法的各个方面可以应用于各种作物，例如包括但不限于：i)中耕作物植物，包括但不限于玉米、大麦、高粱、大豆、棉花、加拿大油菜(canola)、糖用甜菜、紫花苜蓿、甘蔗、水稻、以及小麦；ii)蔬菜植物，包括但不限于番茄、马铃薯、甜椒、辣椒、甜瓜、西瓜、黄瓜、茄子、花椰菜、西兰花、莴苣、菠菜、洋葱、豌豆、胡萝卜、甜玉米、大白菜、韭菜、茴香、南瓜、西葫芦或倭瓜、萝卜、球芽甘蓝、树蕃茄、青刀豆、干豆、或秋葵；iii)烹调用植物，包括但不限于罗勒、欧芹、咖啡、或茶叶；iv)水果植物，包括但不限于苹果、梨、樱桃、桃、李、杏、香蕉、大蕉、鲜食葡萄、酿酒葡萄、柑桔、鳄梨、芒果、或浆果；v)种植用于观赏或商业用途的树木，包括但不限于果树或坚果树；或vi)观赏植物(例如观赏性开花植物或灌木或草坪草)。本文提供的方法和组合物还可以应用于通过切割、克隆、或嫁接工艺所产生的植物(即并非由种子长成的植物)，包括果树和植物。通过这些工艺产生的果树包括但不限于柑桔和苹果树。通过这些工艺产生的植物包括但不限于鳄梨、番茄、茄子、黄瓜、甜瓜、西瓜和葡萄以及各种观赏植物。
不受理论所束缚，本实施方案的组合物和方法被认为经由RNA介导的基因抑制中所涉及的多种天然的细胞通路中的一种或多种来起作用，如Broder sen和Voinnet(2006),Trends Genetics,22:268-280；Tomari和Zamore(2005)G enes&Dev.,19:517-529；Vaucheret(2006)Genes Dev.,20:759-771；Meins等人(2005)Annu.Rev.Cell Dev.Biol.,21:297-318；以及Jones-Rhoades等人(2006)Annu.Rev.Plant Biol.,57:19-53中大体上所述。RNA介导的基因抑制一般涉及在单个RNA分子内以分子内方式形成的或在两个RNA分子之间以分子间方式形成的双链RNA(dsRNA)中间体。这种较长的dsRNA中间体由RNAa se III家族的核糖核酸酶(Dicer或Dicer样核糖核酸酶)加工成一个或多个较短的双链RNA，所述双链RNA的一条链被并入RNA诱导沉默复合体(“RISC”)中。举例来说，siRNA通路涉及较长的双链RNA中间体被裂解成小干扰RN A(“siRNA”)。siRNA的尺寸被认为在约19至约25个碱基对的范围内，但在植物中最常见的siRNA类别包括含有21至24个碱基对的siRNA(参见Hamilton等人(2002)EMBO J.,21:4671-4679)。
多核苷酸
如本文所用的“多核苷酸”指的是含有多个核苷酸的DNA或RNA分子并且一般指的是“寡核苷酸”(具有18-25个核苷酸的长度的多核苷酸)和具有26个或更多个核苷酸的更长的多核苷酸这两者。实施方案包括如下的组合物，所述组合物包括具有18-25个核苷酸的长度的寡核苷酸(18聚体、19聚体、20聚体、21聚体、22聚体、23聚体、24聚体、或25聚体)；或具有26个或更多个核苷酸的长度的中等长度多核苷酸(具有以下长度的多核苷酸：26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、约65个、约70个、约75个、约80个、约85个、约90个、约95个、约100个、约110个、约120个、约130个、约140个、约150个、约160个、约170个、约180个、约190个、约200个、约210个、约220个、约230个、约240个、约250个、约260个、约270个、约280个、约290个、或约300个核苷酸)；或具有大于约300个核苷酸的长度的长多核苷酸(例如具有以下长度的多核苷酸：约300个至约400个核苷酸、约400个至约500个核苷酸、约500个至约600个核苷酸、约600个至约700个核苷酸、约700个至约800个核苷酸、约800个至约900个核苷酸、约900个至约1000个核苷酸、约300个至约500个核苷酸、约300个至约600个核苷酸、约300个至约700个核苷酸、约300个至约800个核苷酸、约300个至约900个核苷酸、或约1000个核苷酸的长度、或甚至大于约1000个核苷酸的长度，例如长达靶基因的整个长度，包括所述靶基因的编码部分或非编码部分或者编码部分和非编码部分这两者在内)。在多核苷酸是双链的情况下，它的长度可以就碱基对以类似方式描述。
各种实施方案中所用的多核苷酸组合物包括如下的组合物，所述组合物包括寡核苷酸、多核苷酸或两者的混合物，包括：RNA或DNA、或RNA/DNA杂交体、或化学修饰的寡核苷酸或多核苷酸、或其混合物。在某些实施方案中，所述多核苷酸可以是核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的组合，例如主要由核糖核苷酸组成，但具有一个或多个末端脱氧核糖核苷酸的合成多核苷酸，或主要由脱氧核糖核苷酸组成，但具有一个或多个末端双脱氧核糖核苷酸的合成多核苷酸。在某些实施方案中，所述多核苷酸包括非标准核苷酸，如肌苷、硫代尿苷、或假尿苷。在某些实施方案中，所述多核苷酸包括化学修饰的核苷酸。化学修饰的寡核苷酸或多核苷酸的实例是本领域熟知的；参见例如美国专利公布2011/0171287、美国专利公布2011/0171176、美国专利公布2011/0152353、美国专利公布2011/0152346、以及美国专利公布2011/0160082，这些美国专利公布以引用的方式并入本文。说明性实例包括但不限于寡核苷酸或多核苷酸的天然存在的磷酸二酯骨架，所述天然存在的磷酸二酯骨架可以由硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、或甲基膦酸酯核苷酸间键修饰部分或完全地修饰，可以在寡核苷酸或多核苷酸合成中使用修饰的核苷碱基或修饰的糖，并且寡核苷酸或多核苷酸可以用荧光部分(例如荧光素或若丹明(rhodamine))或其他标记(例如生物素)标记。
多核苷酸可以是单链或双链RNA、单链或双链DNA、双链DNA/RNA杂交体、以及其修饰的类似物。在某些实施方案中，在植物细胞中提供单链RNA的多核苷酸可以是：(a)单链RNA分子(ssRNA)；(b)自杂交以形成双链RNA分子的单链RNA分子；(c)双链RNA分子(dsRNA)；(d)单链DNA分子(ssDNA)；(e)自杂交以形成双链DNA分子的单链DNA分子；(f)包括被转录成RNA分子的修饰的Pol III基因的单链DNA分子；(g)双链DNA分子(dsDNA)；(h)包括被转录成RNA分子的修饰的Pol III基因的双链DNA分子；以及(i)双链杂交的RNA/DNA分子，或它们的组合。在某些实施方案中，这些多核苷酸可以包含核糖核酸残基和脱氧核糖核酸残基这两者。在某些实施方案中，这些多核苷酸包括化学修饰的核苷酸或非标准核苷酸。在所述方法的某些实施方案中，所述多核苷酸包括由分子内杂交形成的双链DNA、由分子间杂交形成的双链DNA、由分子内杂交形成的双链RNA、或由分子间杂交形成的双链RNA。在其中多核苷酸是dsRNA的某些实施方案中，反义链将包含至少18个与靶基因基本上互补的核苷酸。在某些实施方案中，所述多核苷酸包括自杂交以形成发夹结构的单链DNA或单链RNA，所述发夹结构具有至少部分呈双链的结构，所述结构包括将与由所靶向的基因转录的RNA杂交以实现抑制作用的至少一个链段。不意图受任何机制束缚，认为这些多核苷酸是单链RNA或将产生单链RNA，所述单链RNA具有至少一个将与由所靶向的基因转录的RNA杂交以实现抑制作用的链段。在某些实施方案中，所述多核苷酸可以与启动子可操作地连接，所述启动子一般是在植物中具有功能性的启动子，例如pol II启动子、pol III启动子、pol IV启动子、或polV启动子。
多核苷酸分子被设计成通过诱导对植物中的内源性基因的调节作用或抑制作用来调节表达，并且被设计成具有与植物的内源性基因的核苷酸序列或与由植物的内源性基因转录的RNA的序列基本上同一或基本上互补的核苷酸序列，所述核苷酸序列可以是编码序列或非编码序列。这些有效的调节表达的多核苷酸分子在本文被称作“一种触发剂或多种触发剂”。“基本上同一”或“基本上互补”意指触发剂多核苷酸(或双链多核苷酸的至少一条链)与内源性基因或与由内源性基因转录的RNA(例如转录物)具有足够的同一性或互补性以抑制内源性基因的表达(例如以使得所述基因转录物和/或所编码的蛋白质的水平或活性降低)。本文提供的方法和组合物的多核苷酸不需要与内源性基因或与由内源性基因所转录的RNA(即转录物)具有100％的同一性或互补性以抑制内源性基因的表达(即以使得基因转录物或所编码的蛋白质的水平或活性降低)。因此，在某些实施方案中，所述多核苷酸或其部分被设计成与靶基因或由靶基因所转录的信使RNA(例如转录物)中至少18个或19个连续核苷酸的序列基本上同一或基本上互补。在某些实施方案中，“基本上同一的”多核苷酸在与内源性靶基因或由靶基因所转录的RNA(例如转录物)中18个或更多个连续核苷酸的序列相比较时具有100％的序列同一性或至少约83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的序列同一性。在某些实施方案中，“基本上互补的”多核苷酸在与靶基因或由靶基因所转录的RNA中18个或更多个连续核苷酸的序列相比较时具有100％的序列互补性或至少约83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的序列互补性。
在某些实施方案中，本文提供的方法和组合物中所用的多核苷酸可以与以下各项中的任一种基本上同一或基本上互补：i)单子叶植物和双子叶植物这两者的PMR5基因的保守区；ii)单子叶植物的PMR5基因的保守区；或iii)双子叶植物的PMR5基因的保守区。与这些保守区基本上同一或基本上互补的这些多核苷酸可以用于在以下各项中的任一种中通过抑制PMR5基因的表达来提高真菌病抗性和/或线虫病抗性：i)双子叶植物和单子叶植物这两者，包括但不限于玉米、大麦、小麦、高粱、水稻、黄瓜、豌豆、苜蓿属种、大豆、胡椒、番茄、以及葡萄；ii)单子叶植物，包括但不限于玉米、大麦、小麦、高粱、以及水稻以及；或iii)双子叶植物，包括但不限于黄瓜、豌豆、苜蓿属种、大豆、胡椒、番茄、以及葡萄。
含有与靶基因或转录物的错配的多核苷酸因此可以用于本文提供的组合物和方法的某些实施方案中。在某些实施方案中，多核苷酸可以包含与所述基因或所述转录物基本上同一或基本上互补的至少19个连续核苷酸，或包含与靶基因或靶基因转录物基本上同一或基本上互补的至少19个连续核苷酸。在某些实施方案中，与内源性靶基因或由所述靶基因转录的RNA(例如转录物)基本上同一或基本上互补的具有19个连续核苷酸的多核苷酸可以与所述靶基因或转录物具有1处或2处错配。在某些实施方案中，含有与内源性靶基因或由所述靶基因转录的RNA具有同一性或互补性的连续19个核苷酸跨度的具有20个或更多个核苷酸的多核苷酸可以与所述靶基因或转录物具有1处或2处错配。在某些实施方案中，与内源性靶基因或由所述靶基因转录的RNA(例如转录物)基本上同一或基本上互补的具有21个连续核苷酸的多核苷酸可以与所述靶基因或转录物具有1处、2处或3处错配。在某些实施方案中，含有与内源性靶基因或由所述靶基因转录的RNA具有同一性或互补性的连续21个核苷酸跨度的具有22个或更多个核苷酸的多核苷酸可以与所述靶基因或转录物具有1处、2处或3处错配。在设计与内源性靶基因或由所述靶基因转录的RNA具有错配的多核苷酸中，可以使用很可能被容许的某些类型以及处在某些位置上的错配。在某些实施方案中，使用腺嘌呤与胞嘧啶或鸟苷与尿嘧啶残基之间所形成的错配，如Du等人,Nucleic AcidsResearch,2005,第33卷,第5期,1671-1677所述。在某些实施方案中，具有19个碱基对的重叠区中的错配可以处在低容许度位置5、7、8或11(从具有19个核苷酸的靶标的5'端开始)上(具有完全容许的核苷酸错配残基)、处在中等容许度位置3、4以及12-17上、和/或处在互补区域的任一端处的高容许度核苷酸位置(即位置1、2、18以及19)上，如Du等人,NucleicAcids Research,2005,第33卷,第5期,1671-1677所述。进一步预期的是，可以在如下的测定中凭经验确定所容许的错配，在所述测定中，经由本文所提供的方法向植物施用多核苷酸并且测定对经过处理的植物的PMR5的表达或真菌病抗性和/或线虫抗性的出现的抑制作用。
在某些实施方案中，多核苷酸分子被设计成与PMR5靶基因的给定靶基因编码或非编码序列的一个等位基因或一个家族成员具有100％的序列同一性或互补性。在其他实施方案中，所述多核苷酸分子被设计成与给定的PMR5靶基因的多个等位基因或家族成员具有100％的序列同一性或互补性。在某些实施方案中，所述多核苷酸因此可以包含与以下序列具有同一性或互补性的至少18个连续核苷酸：SEQ ID NO：1-19、21-38或53-129。在某些实施方案中，所述多核苷酸包含与以下序列基本上同一或基本上互补的至少18个连续核苷酸：SEQ ID NO：1-19、21-38或53-128。
在某些实施方案中，本文提供的多核苷酸组合物和方法通常在经过处理的植物的寿命期间的至少1周或更长的时间段期间并且通常以全身性方式实现对基因表达的调控或调节(例如抑制)。举例来说，在使用本文描述的多核苷酸组合物处理植物叶片的数天内，可以在经过处理的叶片侧面以及上面的其他叶片中以及在顶端组织中检测到初级和转移性siRNA。在某些实施方案中，提供了全身性抑制植物中的基因表达的方法，所述方法包括使用包含至少一种多核苷酸和转移剂的组合物对所述植物进行处理，其中所述多核苷酸包含与编码所述植物的PMR5基因的基因或转录物基本上同一或基本上互补的至少18个或至少19个连续核苷酸，借此使得所述植物或其后代中所述基因的表达与没有经过所述组合物处理的对照植物相比受到全身性抑制。
用于抑制靶基因的组合物可以包含与多种基因或一种或多种基因的多个链段基本上同一或基本上互补的一种或多种多核苷酸。在某些实施方案中，用于抑制靶基因的组合物可以包含与靶基因的多个连续的链段、靶基因的多个非连续的链段、靶基因的多个等位基因、或来自一种或多种物种的多种靶基因基本上同一或基本上互补的一种或多种多核苷酸。
在某些实施方案中，所述多核苷酸包括核苷酸序列(具有18个或更多个核苷酸)的两个或更多个拷贝，其中所述拷贝以串联的方式排列。在另一个实施方案中，所述多核苷酸包括核苷酸序列(具有18个或更多个核苷酸)的两个或更多个拷贝，其中所述拷贝以反向重复方式排列(形成至少部分自身互补的链)。所述多核苷酸可以包括串联的拷贝和反向重复的拷贝这两者。无论以串联方式还是以反向重复方式排列，每一个拷贝均可以与下一个拷贝直接邻接，或拷贝对可以由具有一个或多个核苷酸的任选的间隔区分开。任选的间隔区可以是无关的序列(即与拷贝不基本上同一或基本上互补、与内源性靶基因或由所述内源性靶基因转录的RNA的18个或更多个连续核苷酸的序列既不基本上同一也不基本上互补)。或者，任选的间隔区可以包括与内源性靶基因中与由所述拷贝所靶向的链段相邻的链段互补的序列。在某些实施方案中，所述多核苷酸包括具有约20个至约30个核苷酸的核苷酸序列的两个拷贝，其中该两个拷贝由不长于所述核苷酸序列的长度的间隔区分开。
拼接法
可以通过将基因靶标“拼接”成随机长度片段，例如200-300个多核苷酸的长度来鉴定多核苷酸触发剂分子，所述随机长度片段具有部分重叠的区域，例如沿所述靶基因的长度有25个左右的核苷酸重叠的区域。可以对多个基因靶序列进行比对并且将共同具有同源性的多核苷酸序列区域鉴定为用于多种靶标的潜在的触发剂分子。可以对多个靶序列进行比对并且将具有较差同源性的序列区域鉴定为用于选择性识别靶标的潜在的触发剂分子。为了选择性抑制单个基因，触发剂序列可以选自靶基因特有的区域，所述区域来自于转录区或非编码区域，例如启动子区、3'端非翻译区、内含子等。
将多核苷酸片段沿PMR5基因或家族成员的全长编码区和非翻译区的长度设计成具有200-300个多核苷酸的长度或占靶基因的一定百分比的片段长度的连续重叠片段。将这些片段(呈正义或反义ssDNA或ssRNA、dsRNA、或dsDNA的形式)局部施用以确定在提供产量/质量表型方面的相对有效性。提供所需活性的片段可以被进一步细分成具有50-60个多核苷酸的片段，在提供产量/质量表型方面对这些片段进行评价。具有所需活性的具有50-60个碱基的片段然后可以被进一步细分成具有19-30个碱基的片段，在提供产量/质量表型方面对这些片段进行评价。在确定相对的有效性之后，将所述片段单独使用，或在一个或多个池中组合使用以确定用于提供产量/质量表型的触发剂多核苷酸的有效的触发剂组合物或混合物。
对所关注的作物中基因家族的编码序列和/或非编码序列进行比对并且使用局部施用的多核苷酸(呈正义或反义ssDNA或ssRNA、dsRNA、或dsDNA的形式)来确定它们在提供产量/质量表型方面的相对有效性以对所比对的序列当中来自具有最小同源性的区域的具有200-300个多核苷酸的片段进行评价。将有效的链段进一步细分成具有50-60个多核苷酸的片段，将最小同源性列为优先考虑，并且使用局部施用的多核苷酸进行重新评价。将有效的具有50-60个多核苷酸的片段细分成具有19-30个多核苷酸的片段，将最小同源性列为优先考虑，并且在诱导产量/质量表型方面再次进行评价。在确定相对的有效性之后，将所述片段单独使用，或再次对所述片段与一个或多个其他片段的组合进行评价以确定用于提供产量/质量表型的触发剂多核苷酸的触发剂组合物或混合物。
对所关注的作物中基因家族的编码序列和/或非编码序列进行比对并且使用局部施用的多核苷酸(呈正义或反义ssDNA或ssRNA、dsRNA、或dsDNA的形式)来确定它们在诱导产量/质量表型方面的相对有效性以对所比对的序列当中来自具有最大同源性的区域的具有200-300个多核苷酸的片段进行评价。将有效的链段细分成具有50-60个多核苷酸的片段，将最大同源性列为优先考虑，并且使用局部施用的多核苷酸进行重新评价。将有效的具有50-60个多核苷酸的片段细分成具有19-30个多核苷酸的片段，将最大同源性列为优先考虑，并且在诱导产量/质量表型方面再次进行评价。在确定相对的有效性之后，可以将所述片段单独使用或与一个或多个其他片段组合使用以确定用于提供产量/质量表型的触发剂多核苷酸的触发剂组合物或混合物。
此外，本文提供了用于鉴定用于提高植物的真菌病和/或线虫抗性的优选的多核苷酸的方法。与PMR5基因或所述基因的转录物基本上同一或基本上互补的候选多核苷酸的群体可以通过多种方法产生，包括但不限于本文提供的拼接法、最小同源法、或最大同源法中的任一种。这些多核苷酸群体还可以由随本文以如下序列提供的多核苷酸或基因中的任一种产生或获得：SEQ ID NO：1-19或21-38或53-128。这些多核苷酸群体还可以由与随本文以如下序列提供的基因具有直系同源性的任何基因产生或获得：SEQ ID NO：1-11。这些多核苷酸群体还可以由编码如下蛋白质的任何基因产生或获得，所述蛋白质与表2中的蛋白质(SEQ ID NO：41-48或49)具有直系同源性。前述多核苷酸群体的任何一个也可以通过测试候选多核苷酸经由病毒诱导的基因沉默(VIGS)方法对PMR5的抑制来选择。在某些实施方案中，可以通过病毒诱导的基因沉默(VIGS)方法实现当与转移剂一起应用至植物时可能提供PMR5基因抑制的多核苷酸的选择。一般而言，通过将序列插入克隆的病毒基因组来测试候选PMR5抑制序列，所述克隆的病毒基因组可以被引入靶植物或靶植物细胞以实现PMR5抑制。用于通过VIGS抑制基因靶的各种方法和载体可适用于通过使用测试本文公开的适当的候选PMR5抑制序列抑制PMR5基因。可用于在双子叶植物中进行VIGS的VIGS方法和载体包括但不限于在美国专利号5,922,602、6,635,805、6,369,296和7,229,829中公开的那些，这些专利各自通过引用就其VIGS载体和方法的公开内容整体并入本文。可用于在单子叶植物中进行VIGS的VIGS方法和载体包括但不限于在美国专利号6,800,748中公开的那些，其通过引用就其VIGS载体和方法的公开内容整体并入本文。候选多核苷酸序列可测试用VIGS载体和方法的PMR5抑制，基于克隆的大麦病毒(包括但不限于大麦条斑花叶病毒("BSMV")、早熟禾半潜病毒("PSLV")、烟草环斑病毒("LRSV")、和黄化茅属潜白化病毒("ALBV"))、烟草花叶病毒(TMV)、黄瓜绿斑驳花叶病毒西瓜株系(CGMMV-W)；雀麦草花叶病毒(BMV)、马铃薯Y病毒组(包括但不限于水稻坏死病毒和马铃薯Y病毒(PVY))、水稻东格鲁杆状病毒(RTBV)和双粒病毒组(包括但不限于番茄金花叶病毒(ToGMV))基因组。可以使用的有用的ToGMV载体由Revington等人描述(Plant Cell.1989年10月；1(10)：985–992)。Yan等人(Plant Cell Rep(2012)31:1713–1722)描述的用于通过真空浸润介导的农杆菌感染方法实现VIGS的有用方法可适用于在基于农杆菌的VIGS载体中测试候选PMR5抑制序列。可以将这些多核苷酸在包含来自所述群体的至少一种多核苷酸和转移剂的组合物中向植物的表面局部施用以获得经过处理的植物。鉴定表现出对PMR5基因的抑制作用和/或表现出真菌病和/或线虫抗性的提高的经过处理的植物，从而鉴定提高植物的真菌病和/或线虫抗性的优选的多核苷酸。对基因的抑制作用可以通过用于基因产物(即转录物或蛋白质)的水平和/或活性的任何测定来确定。对于转录物合适的测定包括但不限于半定量或定量逆转录酶(qRT-PCR)测定。对于蛋白质合适的测定包括但不限于半定量或定量免疫测定、生化活性测定、或生物活性测定。在某些实施方案中，可以单独施用多核苷酸。在其他实施方案中，可以多种多核苷酸的池的形式施用多核苷酸。当鉴定一池多核苷酸提供了对PMR5基因的抑制作用和/或真菌病抗性和/或线虫病抗性的提高时，可以在必要或需要时将所述池去除重复并且重新测试以鉴定提高植物的真菌病抗性和/或线虫病抗性的一种或多种优选的多核苷酸。
制备多核苷酸的方法是本领域熟知的。这些制备多核苷酸的方法可以包括体内生物合成、体外酶促合成、或化学合成。在某些实施方案中，RNA分子可以通过体内或体外合成由DNA模板来制备，其中合适的启动子与多核苷酸可操作地连接并且提供了合适的DNA依赖性RNA聚合酶。DNA依赖性RNA聚合酶包括但不限于大肠杆菌(E.coli)或其他细菌的RNA聚合酶以及噬菌体RNA聚合酶，如T7、T3、以及SP6RNA聚合酶。寡核苷酸的商业制剂常常在有义链的3'端上提供两个脱氧核糖核苷酸。长多核苷酸分子可以由可商购获得的试剂盒来合成，例如来自Applied Biosystems/Ambion(德克萨斯州的奥斯汀(Austin,TX))的试剂盒具有在5'端上连接的编码噬菌体T7聚合酶启动子的DNA，所述启动子产生可以被组装成dsRNA的RNA链。或者，dsRNA分子可以由表达盒在具有受调节的或缺乏的RNA酶III酶活性的细菌细胞中产生。长多核苷酸分子还可以由多个RNA或DNA片段组装。在一些实施方案中，设计参数，如雷诺兹评分(Reynolds score)(Reynolds等人,Nature Biotechnology 22,326-330(2004))和图氏法则(Tuschl rule)(Pei和Tuschl,Nature Methods 3(9)：670-676,2006)是本领域已知的并且用于选择在基因沉默方面有效的多核苷酸序列。在一些实施方案中，在选择在基因沉默方面有效的多核苷酸序列中使用多核苷酸序列的随机设计或经验性选择。在一些实施方案中，针对预期植物的基因组DNA对多核苷酸的序列进行筛选以使对其他基因的无意沉默减到最低程度。
虽然可用于本文提供的方法和组合物中的多核苷酸分子的浓度和剂量不存在上限，但一般为了效率将寻找下限有效浓度和剂量。可以在考虑向植物叶片或其他植物部分表面施用的喷洒或处理的体积的情况下对浓度进行调整，所述其他植物部分如花瓣、茎、块茎、果实、花粉囊、花粉、叶片、根部或种子。在一个实施方案中，使用25聚体多核苷酸分子对于草本植物的有用的处理是每棵植物约1纳摩尔(nmol)的多核苷酸分子，例如每棵植物约0.05nmol至1nmol的多核苷酸。用于草本植物的其他实施方案包括每棵植物约0.05至约100nmol、或约0.1至约20nmol、或约1nmol至约10nmol的多核苷酸的有用范围。在某些实施方案中，施用约40至约50nmol的ssDNA多核苷酸。在某些实施方案中，施用约0.5nmol至约2nmol的dsRNA。在某些实施方案中，施用含有约0.5至约2.0mg/mL、或约0.14mg/mL的dsRNA或ssDNA(21聚体)的组合物。在某些实施方案中，施用约0.5至约1.5mg/mL的长dsRNA多核苷酸(即约50至约200个或更多个核苷酸)的组合物。在某些实施方案中，向植物施用约1nmol至约5nmol的dsRNA。在某些实施方案中，向植物局部施用的多核苷酸组合物含有每毫升约0.01至约10毫克、或每毫升约0.05至约2毫克、或每毫升约0.1至约2毫克的浓度的至少一种多核苷酸。在某些实施方案中，施用约0.5至约1.5mg/mL的长dsRNA多核苷酸(即约50至约200个或更多个核苷酸)的组合物。非常大型的植物、树木、或藤本植物可能需要相应更大量的多核苷酸。当使用可以被加工成多个寡核苷酸的长dsRNA分子时，可以使用更低的浓度。为了说明实施方案，倍数1X在应用于寡核苷酸分子时被任意地用来表示每棵植物0.8nmol多核苷酸分子的处理；10X表示每棵植物8nmol的多核苷酸分子；以及100X表示每棵植物80nmol的多核苷酸分子。
本文描述的多核苷酸组合物可单独或与其他组分组合用于组合物中，如包含多核苷酸分子的液体，所述其他组分处于相同的液体中或处于分开施用的提供转移剂的液体中。如本文所用的转移剂是在与多核苷酸在向靶标植物表面局部施用的组合物中组合时使得多核苷酸能够进入植物细胞中的试剂。在某些实施方案中，转移剂是对例如种子、叶片、茎、根部、花或果实的植物组织的表面进行调节以由多核苷酸分子渗透到植物细胞中的试剂。多核苷酸向植物细胞中的转移可以通过先前或同时向植物组织施用多核苷酸转移剂来促进。在一些实施方案中，在施用多核苷酸组合物之后施用转移剂。多核苷酸转移剂使得多核苷酸能够穿过角质层蜡屏障、气孔和/或细胞壁或膜屏障进入到植物细胞中。合适的促进多核苷酸转移到植物细胞中的转移剂包括提高植物外部渗透性或提高植物细胞对寡核苷酸或多核苷酸的渗透性的试剂。这些促进组合物转移到植物细胞中的试剂包括化学剂、或物理剂、或其组合。用于调节或转移的化学剂包括(a)表面活性剂；(b)有机溶剂或有机溶剂的水溶液或水性混合物；(c)氧化剂；(d)酸；(e)碱；(f)油；(g)酶，或它们的组合。所述方法的实施方案可以任选地包括孵育步骤、中和步骤(例如以中和酸、碱或氧化剂，或以使酶失活)、冲洗步骤、或它们的组合。用于对植物进行调节以由多核苷酸渗透的试剂或处理的实施方案包括乳液、反相乳液、脂质体、以及其他胶束样组合物。用于对植物进行调节以由多核苷酸渗透的试剂或处理的实施方案包括抗衡离子或已知与核酸分子相关的其他分子，例如无机铵离子、烷基铵离子、锂离子、多胺，如精胺、亚精胺、或腐胺、以及其他阳离子。可用于对植物进行调节以由多核苷酸渗透的有机溶剂包括DMSO、DMF、吡啶、N-吡咯烷、六甲基磷酰胺、乙腈、二噁烷、聚丙二醇、可与水混溶的或将磷酸核苷酸溶解在非水性体系中的其他溶剂(如合成反应中所用的溶剂)。可以在存在或不存在表面活性剂或乳化剂的情况下使用天然来源的油或合成油，例如植物源性油、作物油(例如可以使用诸如在herbicide.adjuvants.com上在万维网(互联网)上可公开获得的《第9版除草剂佐剂纲要》(9th Compendiu m of Herbicide Adjuvants)中所列的那些)、石蜡油、多元醇脂肪酸酯、或具有由酰胺或多胺(如聚乙烯亚胺或N-吡咯烷)修饰的短链分子的油。转移剂包括但不限于有机硅制剂。
在某些实施方案中，可以使用可以L-77表面活性剂商购获得的有机硅制剂来制备多核苷酸组合物，所述L-77表面活性剂具有CAS号27306-78-1和EPA号：CAL.REG.NO.5905-50073-AA并且目前可从纽约州奥尔巴尼(Albany,New York)的Momentive Performance Materials公司获得。在某些实施方案中，其中使用Silwet L-77有机硅制剂作为对植物叶片或其他植物表面进行的预喷洒处理，新鲜制备的在约0.015重量％至约2重量％(wt％)范围内的浓度(例如约0.01wt％、0.015wt％、0.02wt％、0.025wt％、0.03wt％、0.035wt％、0.04wt％、0.045wt％、0.05wt％、0.055wt％、0.06wt％、0.065wt％、0.07wt％、0.075wt％、0.08wt％、0.085wt％、0.09wt％、0.095wt％、0.1wt％、0.2wt％、0.3wt％、0.4wt％、0.5wt％、0.6wt％、0.7wt％、0.8wt％、0.9wt％、1.0wt％、1.1wt％、1.2wt％、1.3wt％、1.4wt％、1.5wt％、1.6wt％、1.7wt％、1.8wt％、1.9wt％、2.0wt％、2.1wt％、2.2wt％、2.3wt％、2.5wt％)有效地使叶片或其他植物表面准备用于通过表面上的局部施用将多核苷酸分子转移到植物细胞中。在本文提供的方法和组合物的某些实施方案中，使用或提供了一种组合物，所述组合物包含多核苷酸分子以及包含SilwetL-77的有机硅制剂，所述Silwet L-77在约0.015重量％至约2重量％(wt％)的范围内(例如约0.01wt％、0.015wt％、0.02wt％、0.025wt％、0.03wt％、0.035wt％、0.04wt％、0.045wt％、0.05wt％、0.055wt％、0.06wt％、0.065wt％、0.07wt％、0.075wt％、0.08wt％、0.085wt％、0.09wt％、0.095wt％、0.1wt％、0.2wt％、0.3wt％、0.4wt％、0.5wt％、0.6wt％、0.7wt％、0.8wt％、0.9wt％、1.0wt％、1.1wt％、1.2wt％、1.3wt％、1.4wt％、1.5wt％、1.6wt％、1.7wt％、1.8wt％、1.9wt％、2.0wt％、2.1wt％、2.2wt％、2.3wt％、2.5wt％)。在本文提供的方法和组合物的某些实施方案中，使用或提供了一种组合物，所述组合物包含多核苷酸分子和包含Silwet L-77的有机硅制剂，所述Silwet L-77在约0.3重量％至约1重量％(wt％)或约0.5重量％至约1重量％(wt％)的范围内。
在某些实施方案中，下表1中所提供的可商购获得的有机硅制剂中的任一种可以被用作多核苷酸组合物中的转移剂。在某些实施方案中，其中使用表1中的有机硅制剂作为对植物叶片或其他表面进行的预喷洒处理，新鲜制备的在约0.015重量％至约2重量％(wt％)范围内的浓度(例如约0.01wt％、0.015wt％、0.02wt％、0.025wt％、0.03wt％、0.035wt％、0.04wt％、0.045wt％、0.05wt％、0.055wt％、0.06wt％、0.065wt％、0.07wt％、0.075wt％、0.08wt％、0.085wt％、0.09wt％、0.095wt％、0.1wt％、0.2wt％、0.3wt％、0.4wt％、0.5wt％、0.6wt％、0.7wt％、0.8wt％、0.9wt％、1.0wt％、1.1wt％、1.2wt％、1.3wt％、1.4wt％、1.5wt％、1.6wt％、1.7wt％、1.8wt％、1.9wt％、2.0wt％、2.1wt％、2.2wt％、2.3wt％、2.5wt％)有效地使叶片或其他植物表面准备用于通过表面上的局部施用将多核苷酸分子转移到植物细胞中。在本文提供的方法和组合物的某些实施方案中，使用或提供了一种组合物，所述组合物包含多核苷酸分子和表1中的有机硅制剂，所述有机硅制剂在约0.015重量％至约2重量％(wt％)的范围内(例如约0.01wt％、0.015wt％、0.02wt％、0.025wt％、0.03wt％、0.035wt％、0.04wt％、0.045wt％、0.05wt％、0.055wt％、0.06wt％、0.065wt％、0.07wt％、0.075wt％、0.08wt％、0.085wt％、0.09wt％、0.095wt％、0.1wt％、0.2wt％、0.3wt％、0.4wt％、0.5wt％、0.6wt％、0.7wt％、0.8wt％、0.9wt％、1.0wt％、1.1wt％、1.2wt％、1.3wt％、1.4wt％、1.5wt％、1.6wt％、1.7wt％、1.8wt％、1.9wt％、2.0wt％、2.1wt％、2.2wt％、2.3wt％、2.5wt％)。
表1.有机硅制剂的实例
1德国埃森(Essen,Germany)的Evonik Industries AG公司
2纽约州奥尔巴尼的Momentive Performance Materials公司
本文提供的方法和组合物中所使用的有机硅制剂可以包含一种或多种有效的有机硅化合物。如本文所用的短语“有效的有机硅化合物”用于描述有机硅制剂中存在的使得多核苷酸能够进入植物细胞中的任何有机硅化合物。在某些实施方案中，有效的有机硅化合物能够以容许多核苷酸介导的对植物细胞中的靶基因表达的抑制作用的方式使得多核苷酸能够进入植物细胞中。一般而言，有效的有机硅化合物包括但不限于可以包含以下各项的化合物：i)共价连接的三硅氧烷头基；ii)共价连接的烷基连接基团，包括但不限于正丙基连接基团；iii)共价连接的聚二醇链；iv)端基。这些有效的有机硅化合物的三硅氧烷头基包括但不限于七甲基三硅氧烷。烷基连接基团可以包括但不限于正丙基连接基团。聚二醇链包括但不限于聚乙二醇或聚丙二醇。聚二醇链可以包含提供约“7.5”的平均链长“n”的混合物。在某些实施方案中，平均链长“n”可以从约5至约14变动。端基可以包括但不限于烷基，如甲基。有效的有机硅化合物被认为包括但不限于三硅氧烷乙氧基化物表面活性剂或聚氧化烯修饰的七甲基三硅氧烷。
(化合物I：聚氧化烯七甲基三硅氧烷，平均n＝7.5)。
被认为无效的一种有机硅化合物包含下式：
在某些实施方案中，在本文提供的方法和组合物中使用包含有机硅化合物的有机硅制剂，所述有机硅化合物包含三硅氧烷头基。在某些实施方案中，在本文提供的方法和组合物中使用包含有机硅化合物的有机硅制剂，所述有机硅化合物包含七甲基三硅氧烷头基。在某些实施方案中，在本文提供的方法和组合物中使用包含化合物I的有机硅组合物。在某些实施方案中，在本文提供的方法和组合物中使用包含化合物I的有机硅组合物。在本文提供的方法和组合物的某些实施方案中，使用或提供了一种组合物，所述组合物包含多核苷酸分子和一种或多种有效的有机硅化合物，所述一种或多种有效的有机硅化合物在约0.015重量％至约2重量％(wt％)的范围内(例如约0.01wt％、0.015wt％、0.02wt％、0.025wt％、0.03wt％、0.035wt％、0.04wt％、0.045wt％、0.05wt％、0.055wt％、0.06wt％、0.065wt％、0.07wt％、0.075wt％、0.08wt％、0.085wt％、0.09wt％、0.095wt％、0.1wt％、0.2wt％、0.3wt％、0.4wt％、0.5wt％、0.6wt％、0.7wt％、0.8wt％、0.9wt％、1.0wt％、1.1wt％、1.2wt％、1.3wt％、1.4wt％、1.5wt％、1.6wt％、1.7wt％、1.8wt％、1.9wt％、2.0wt％、2.1wt％、2.2wt％、2.3wt％、2.5wt％)。
在某些实施方案中，包含有机硅制剂的多核苷酸组合物可以包含盐，如氯化铵、四丁基溴化膦鎓、和/或硫酸铵。可以在多核苷酸组合物中提供约0.5％至约5％(w/v)的浓度的氯化铵、四丁基溴化膦鎓和/或硫酸铵。还可以在包含有机硅制剂的多核苷酸组合物中使用约1％至约3％、或约2％(w/v)的氯化铵、四丁基溴化膦鎓和/或硫酸铵浓度。在某些实施方案中，所述多核苷酸组合物可以包含大于或等于300毫摩尔/升的浓度的铵盐。在某些实施方案中，包含有机硅制剂的多核苷酸组合物可以包含约80至约1200mM或约150mM至约600mM的浓度的硫酸铵。
在某些实施方案中，所述多核苷酸组合物还可以包含磷酸盐。所述组合物中所使用的磷酸盐包括但不限于磷酸钙、磷酸镁、磷酸钾或磷酸钠盐。在某些实施方案中，所述多核苷酸组合物可以包含至少约5毫摩尔/升、至少约10毫摩尔/升、或至少约20毫摩尔/升的浓度的磷酸盐。在某些实施方案中，所述多核苷酸组合物将包含约1mM至约25mM范围内或约5mM至约25mM范围内的磷酸盐。在某些实施方案中，所述多核苷酸组合物可以包含至少约5毫摩尔/升、至少约10毫摩尔/升、或至少约20毫摩尔/升的浓度的磷酸钠。在某些实施方案中，所述多核苷酸组合物可以包含约5毫摩尔/升、约10毫摩尔/升、或约20毫摩尔/升的浓度的磷酸钠。在某些实施方案中，所述多核苷酸组合物将包含约10mM至约160mM范围内或约20mM至约40mM范围内的磷酸钠盐。在某些实施方案中，所述多核苷酸组合物可以包含具有约6.8的pH值的磷酸钠缓冲液。
在某些实施方案中，可以用于本文提供的多核苷酸组合物中的其他有用的转移剂或转移剂的佐剂包括表面活性剂和/或其中所含的有效的分子。表面活性剂和/或其中所含的有效的分子包括但不限于脂肪酸(如牛脂或牛脂胺或磷脂)的钠盐或锂盐和有机硅表面活性剂。在某些实施方案中，包含转移剂的多核苷酸组合物与抗衡离子或已知与核酸分子相关的其他分子一起配制。说明性实例包括但不限于四烷基铵离子、三烷基铵离子、锍离子、锂离子、以及多胺，如精胺、亚精胺或腐胺。在某些实施方案中，所述多核苷酸组合物与非多核苷酸除草剂一起配制。非多核苷酸除草剂分子包括但不限于草甘膦(glyphosate)；植物生长素样苯甲酸除草剂，包括麦草畏(dicamba)、草灭平(chloramben)以及TBA；草铵膦(glufosinate)；植物生长素样除草剂，包括苯氧基羧酸除草剂、吡啶羧酸除草剂、喹啉羧酸除草剂、嘧啶羧酸除草剂、以及乙基草除灵(benazolin-ethyl)除草剂；磺酰脲；咪唑啉酮；溴苯腈(bromoXynil)；德拉喷(delapon)；环己二酮(cyclohezanedione)；原卟啉原氧化酶抑制剂；以及4-羟苯基-丙酮酸双加氧酶抑制性除草剂。
在某些实施方案中，组合物中所用的与PMR5靶基因或转录物基本上同一或基本上互补的多核苷酸将构成组合物中的主要核酸。因此，在某些实施方案中，以质量或摩尔浓度计，与靶基因或转录物基本上同一或基本上互补的多核苷酸将构成组合物中所提供的核酸的至少约50％、75％、95％、98％、或100％。然而，在某些实施方案中，以质量或摩尔浓度计，与靶基因或转录物基本上同一或基本上互补的多核苷酸可以构成组合物中所提供的核酸的至少约1％至约50％、约10％至约50％、约20％至约50％、或约30％至约50％。还提供了如下的组合物，其中以质量或摩尔浓度计，与靶基因或转录物基本上同一或基本上互补的多核苷酸可以构成组合物中所提供的核酸的至少约1％至100％、约10％至100％、约20％至约100％、约30％至约50％、或约50％至100％。
在共同转让的美国专利申请号13/042,856(US20110296556)中公开了如下的多核苷酸，所述多核苷酸包括ssDNA、dsDNA、ssRNA、dsRNA、或RNA/DNA杂交体，与某些植物靶基因或转录物基本上同一或互补并且可以用于含有转移剂的组合物中以在向植物局部施用时抑制那些靶基因，所述转移剂包括但不限于有机硅制剂。在共同转让的美国专利申请号13/042,856中还公开了各种多核苷酸除草剂分子；组合物，所述组合物包含那些多核苷酸除草剂分子和转移剂，所述转移剂包括但不限于有机硅制剂；以及方法，借此通过向植物局部施用这些组合物来获得除草作用，并且那些多核苷酸除草剂分子、组合物以及方法以引用的方式整体并入本文。编码可以提供对除草剂的耐受性和/或作为除草剂的靶标的蛋白质的基因在本文中被统称为“除草剂靶基因”。除草剂靶基因包括但不限于5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)、草甘膦氧化还原酶(GOX)、草甘膦脱羧酶、草甘膦-N-乙酰转移酶(GAT)、麦草畏单加氧酶、草铵膦乙酰转移酶(phosphinothricin acetyltransferase)、2,2-二氯丙酸脱卤素酶、乙酰羟酸合酶、乙酰乳酸合酶、卤代芳基腈水解酶、乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)、二氢蝶酸合酶、八氢番茄红素去饱和酶(PDS)、原卟啉IX加氧酶(PPO)、羟苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)、对氨基苯甲酸合酶、谷氨酰胺合酶、纤维素合酶、β微管蛋白、以及丝氨酸羟甲基转移酶基因。在共同转让的美国专利申请号13/042,856(US20110296556)中证实了在含有除草剂靶基因的植物上施用包含与某些除草剂靶基因基本上同一或互补的多核苷酸和转移剂的某些组合物的作用由于后续施用与所述多核苷酸靶向相同基因的除草剂而得到增强或提高。举例来说，在共同转让的美国专利申请号13/042,856(US20110296556)中公开的实验中，包含靶向EPSPS除草剂靶基因的多核苷酸的组合物由草甘膦增强。
在本文公开的组合物和方法的某些实施方案中，包含多核苷酸和转移剂的组合物因此还可以包含第二多核苷酸，所述第二多核苷酸包含与赋予除草剂抗性的蛋白质的转录物基本上同一或基本上互补的至少19个连续的核苷酸。在某些实施方案中，第二多核苷酸不包含与编码靶标植物的赋予对所述除草剂分子的抗性的蛋白质的转录物基本上同一或基本上互补的多核苷酸。因此，在一个非限制性实施方案中，第二多核苷酸可以与编码野草中赋予除草剂抗性的蛋白质的转录物(如编码EPSPS的转录物)基本上同一或基本上互补，但将不与编码作物植物中赋予对该相同的除草剂的抗性的蛋白质的转录物基本上同一或基本上互补。
在某些实施方案中，包含转移剂的多核苷酸组合物可以包含甘油。在组合物中可以提供约0.1％至约1％(w/v或v/v)的浓度的甘油。在包含转移剂的多核苷酸组合物中还可以使用约0.4％至约0.6％、或约0.5％(w/v或v/v)的甘油浓度。
在某些实施方案中，包含转移剂的多核苷酸组合物还可以包含有机溶剂。这些有机溶剂包括但不限于DMSO、DMF、吡啶、N-吡咯烷、六甲基磷酰胺、乙腈、二噁烷、聚丙二醇、可与水混溶的或将磷酸核苷酸溶解在非水性体系中的其他溶剂(如合成反应中使用的溶剂)。
在某些实施方案中，包含转移剂的多核苷酸组合物还可以在存在或不存在表面活性剂或乳化剂的情况下包含天然来源的油或合成油。这些油包括但不限于植物源性油、作物油(如可在www.herbicide.adjuvants.com在线公开获得的《第9版除草剂佐剂纲要》(9thCompendium of Herbicide Adjuvants)中所列的那些)、石蜡油、多元醇脂肪酸酯、或具有由酰胺或多胺(如聚乙烯亚胺或N-吡咯烷)修饰的短链分子的油。
在一些实施方案中，方法包括一次或多次施用包含多核苷酸和转移剂或其中所含的一种或多种有效性组分的组合物。在所述方法的某些实施方案中，转移剂或其中所含的一种或多种有效性组分的一次或多次施用可以在包含多核苷酸和转移剂的组合物的一次或多次施用之前。在其中转移剂和/或其中所含的一种或多种有效的分子本身被用作预处理或包括多核苷酸的组合物的一部分的实施方案中，所述多核苷酸分子的实施方案是双链RNA寡核苷酸、单链RNA寡核苷酸、双链RNA多核苷酸、单链RNA多核苷酸、双链DNA寡核苷酸、单链DNA寡核苷酸、双链DNA多核苷酸、单链DNA多核苷酸、化学修饰的RNA或DNA寡核苷酸或多核苷酸或其混合物。
本文描述的组合物和方法可用于调节或抑制植物细胞或植物中内源性PMR5靶基因或转基因PMR5靶基因的表达。在本文提供的方法和组合物的某些实施方案中，PMR5靶基因的表达可以被完全地、部分地和/或短暂地抑制以使得真菌病抗性和/或线虫抗性提高。在各种实施方案中，PMR5靶基因包括编码(编码蛋白质的或可翻译的)序列、非编码(不可翻译的)序列、或编码序列和非编码序列这两者。在一些实施方案中，组合物可以包括被设计成靶向多种PMR5基因、或一种或多种PMR5基因的多个链段的多核苷酸和寡核苷酸。所述靶基因可以包括PMR5靶基因的多个连续的链段、PMR5靶基因的多个非连续的链段、靶基因的多个等位基因、或来自一种或多种物种的多种PMR5靶基因。PMR5靶基因包括但不限于SEQID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11的内源性PMR5植物基因。PMR5靶基因包括但不限于编码与SEQ ID NO：41-48或49的蛋白质具有直系同源性的蛋白质的PMR5植物基因。PMR5靶基因包括但不限于编码SEQ ID NO：41-48或49的蛋白质或具有约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代、缺失或插入的基本上同源的蛋白的PMR5植物基因。
靶基因和含有那些靶基因的植物可以从以下各项获得：i)中耕作物植物，包括但不限于玉米、大豆、棉花、加拿大油菜、糖用甜菜、紫花苜蓿、甘蔗、水稻、以及小麦；ii)蔬菜植物，包括但不限于番茄、马铃薯、甜椒、辣椒、甜瓜、西瓜、黄瓜、茄子、花椰菜、西兰花、莴苣、菠菜、洋葱、豌豆、胡萝卜、甜玉米、大白菜、韭菜、茴香、南瓜、西葫芦或倭瓜、萝卜、球芽甘蓝、树蕃茄、青刀豆、干豆、或秋葵；iii)烹调用植物，包括但不限于罗勒、欧芹、咖啡、或茶叶；iv)水果植物，包括但不限于苹果、梨、樱桃、桃、李、杏、香蕉、大蕉、鲜食葡萄、酿酒葡萄、柑桔、鳄梨、芒果、或浆果；v)种植用于观赏或商业用途的树木，包括但不限于果树或坚果树；或vi)观赏植物(例如观赏性开花植物或灌木或草坪草)。本文提供的方法和组合物还可以应用于通过切割、克隆、或嫁接工艺所产生的植物(即并非由种子长成的植物)，包括果树和植物，包括但不限于柑桔、苹果、鳄梨、番茄、茄子、黄瓜、甜瓜、西瓜和葡萄以及各种观赏植物。本文提供了表现出由抑制PMR5基因表达引起的真菌病抗性和/或线虫抗性提高的这些中耕作物植物、蔬菜植物、烹调用植物、水果植物、树木植物或观赏植物。本文还提供了表现出由抑制PMR5基因表达引起的真菌病抗性和/或线虫抗性提高的这些中耕作物植物、蔬菜植物、烹调用植物、水果植物、树木植物或观赏植物部分或加工植物产品。这些植物部分可以包括但不限于花、茎、块茎、果实、花粉囊、分生组织、胚珠、花粉、叶片、或种子。由植物部分获得的这些加工植物产品可以包括但不限于粗粉、浆料、饲料、或食品。
提供了一种用于调节或抑制植物的PMR5基因的表达的方法，所述方法包括(a)对植物进行调节以由多核苷酸渗透，以及(b)使用多核苷酸分子对植物进行处理，其中所述多核苷酸分子包括在反义或正义取向上由PMR5靶基因克隆或以其他方式鉴定的具有18个或更多个连续核苷酸的至少一个链段，借此多核苷酸分子渗透到植物内部并且诱导对靶基因的调节作用。可以分开地或在单个步骤中进行调节和多核苷酸施用。当在分开的步骤中进行调节和多核苷酸施用时，所述调节可以在施用多核苷酸之前或可以在施用多核苷酸之后数分钟、数小时、或数天内进行。在一些实施方案中，可以对同一植物进行不止一个调节步骤或不止一次多核苷酸分子施用。在所述方法的实施方案中，所述链段可以由以下各项克隆或鉴定：PMR5靶基因的(a)编码(编码蛋白质的)部分；(b)非编码部分(启动子和其他基因相关分子)；或(c)编码部分和非编码部分这两者。非编码部分包括DNA，如启动子区或由提供RNA调控分子的DNA转录的RNA，包括但不限于：内含子、5'端或3'端非翻译区、以及微小RNA(miRNA)、反式作用siRNA、天然反义siRNA、以及具有调控功能的其他小RNA或具有结构或酶功能的RNA，包括但不限于：核糖酶、核糖体RNA、t-RNA、适体、以及核糖开关。在某些实施方案中，其中组合物中所用的多核苷酸包含与内源性靶基因的启动子的至少18个连续核苷酸基本上同一或基本上互补的启动子序列，所述多核苷酸的启动子序列并不与由所述启动子序列转录的另一个序列可操作地连接。
本文提供的包含多核苷酸和转移剂的组合物可以通过任何适宜的方法局部施用于植物或植物部分，例如用粉末或用液体组合物喷洒或涂覆，所述液体组合物包括乳液、悬浮液或溶液中的任一种。可以对植物或植物部分表面的全部或任何一部分进行这些局部施用的喷洒或涂覆。类似地，包含转移剂的组合物或其他预处理在某些实施方案中可以通过任何适宜的方法施用于植物或植物部分，例如喷洒或涂抹溶液、乳液或悬浮液。本文提供的包含多核苷酸和转移剂的组合物可以局部施用于植物部分，所述植物部分包括但不限于花、茎、块茎、分生组织、胚珠、果实、花粉囊、花粉、叶片或种子。
本文具体提供了包含多核苷酸和转移剂的组合物向种子的施用。可以通过喷洒、喷雾、浸泡等使种子与这些组合物接触。
在某些实施方案中，向植物、植物部分或特别是种子施用包含多核苷酸和转移剂的组合物可以使得源自于那些经过处理的植物、植物部分或种子的后代植物、植物部分或种子的真菌病抗性和/或线虫抗性提高。在某些实施方案中，源自于那些经过处理的植物、植物部分或种子的后代植物、植物部分或种子将表现出由抑制PMR5基因的表达引起的真菌病抗性和/或线虫抗性的提高。在某些实施方案中，本文提供的方法和组合物可以使得后代植物或种子的真菌病抗性和/或线虫抗性由于在表观遗传学上遗传的对PMR5表达的抑制作用而提高。在某些实施方案中，这些后代植物表现出由在表观遗传学上遗传的对PMR5基因表达的抑制作用所引起的真菌病抗性和/或线虫抗性的提高，这并不是由转基因(其中所述多核苷酸与启动子、病毒载体可操作地连接)或所述多核苷酸的拷贝被整合到植物的染色体DNA中的非原生位置中所引起。在设法不受理论限制的情况下，源自于那些经过处理的植物、植物部分或种子的后代植物或种子可以经由表观遗传学机制而表现出真菌病抗性和/或线虫抗性的提高，所述表观遗传学机制提供了表观遗传学条件的传播，其中在后代植物、植物部分或植物种子中存在对PMR5基因表达的抑制。在某些实施方案中，由于在表观遗传学上遗传的对PMR5基因表达的抑制作用而表现出真菌病抗性和/或线虫抗性提高的后代植物或种子还可以在所述植物的内源性PMR5基因中表现出甲基化增加，以及特别是，胞嘧啶残基的甲基化增加。由于在表观遗传学上遗传的对PMR5基因表达的抑制作用而表现出真菌病抗性和/或线虫抗性提高的后代植物的植物部分(包括种子)在某些实施方案中也可以表现出内源性PMR5基因中的甲基化增加，以及特别是胞嘧啶残基的甲基化增加。在某些实施方案中，可以将表现出真菌病抗性和/或线虫抗性提高的植物中编码内源性PMR5基因的DNA中的DNA甲基化水平与没有表现出真菌病抗性和/或线虫抗性提高的对照植物相比较以将存在真菌病抗性和/或线虫抗性的提高与在表观遗传学上遗传的对PMR5基因表达的抑制作用相关联以及鉴定包含在表观遗传学上遗传的真菌病抗性和/或线虫抗性提高的植物。
可以使用将组合物喷洒到植物或植物部分上的各种方法来向植物表面局部施用包含转移剂的包含多核苷酸的组合物。在田地中，可以使用在作物上方延伸并且向植物表面递送组合物的喷管或使用在广泛的区域内分配组合物的无喷管式喷洒器来施用组合物。在某些实施方案中还可以使用被适配用于定向、四散或带状喷洒的农业喷洒器。还可以使用被适配用于对植物的特定部分喷洒的喷洒器，所述特定部分包括但不限于叶片、叶片的下面、花、茎、雄性生殖器官(如雄穗)、分生组织、花粉、胚珠等。还可以在空中，如通过作物喷粉飞机递送组合物。在某些实施方案中，可以使用经过校准以递送适当速率的组合物的加压背负式喷洒器来递送喷洒剂。在某些实施方案中，这种背负式喷洒器是具有约0.25MPa的喷洒压力的二氧化碳加压的喷洒器，所述喷洒器具有11015号扁平扇形或等同的喷嘴，所述喷嘴具有定制的单喷嘴组件(以使浪费减到最低程度)和/或可以使用任何单喷嘴喷洒器，所述单喷嘴喷洒器在3至12英寸高的生长的植物的植冠上提供60cm的有效喷幅。可以使用具有11001XR或等同的喷嘴的履带式喷洒器或实验室喷洒器以确定的速率递送样品溶液来对温室或生长室中的植物进行处理。非限制性速率是在约0.25MPa的压力下约140L/ha。
在某些实施方案中，还考虑了可以使用包含转移剂的包含多核苷酸的组合物对植物部分进行喷洒。可以在收获前或收获后对这些植物部分进行喷洒以在植物部分中提供由抑制PMR5基因表达所引起的真菌病抗性和/或线虫抗性的提高。可以通过如先前所述的喷洒向与植物附连的植物部分局部施用组合物。可以通过如先前所述的喷洒或通过替代方法向脱离植物的植物部分局部施用组合物。用于向脱离的部分施用组合物的替代方法包括但不限于通过输送带或输送槽使植物部分经过喷洒器，或将植物部分浸在组合物中。
可以依照要求和/或根据需要在一个或多个发育期向植物或植物部分施用包含多核苷酸和转移剂的组合物。在某些实施方案中提供了组合物向发芽前的种子和/或发芽后的幼苗的施用。可以通过包括但不限于以下各项的方法用本文提供的多核苷酸组合物处理种子：喷洒、浸泡、或使得多核苷酸组合物包覆种子、由种子渗吸和/或摄取的任何方法。可以使用种子分批处理系统或连续流处理系统用多核苷酸组合物处理种子。种子包覆系统至少描述于美国专利号6,582,516、5,891,246、4,079,696、以及4,023,525中。还可以在实验室或商业规模的处理设备中实现种子处理，如转筒、混合器、或盘式造粒机。用于处理种子的多核苷酸组合物可以含有一种或多种其他理想的组分，包括但不限于液体稀释剂、用作多核苷酸的基质的粘结剂、用于在胁迫条件期间保护种子的填充剂、以及用于提高包衣的柔性、粘着性和/或铺展性的增塑剂。另外，对于含有很少或不含填充剂的油性多核苷酸组合物，可以添加干燥剂，如碳酸钙、高岭土或膨润土、珍珠岩、硅藻土或任何其他吸附性物质。这些组分用于种子处理的用途描述于美国专利号5,876,739中。可以将另外的成分并入用于种子处理的多核苷酸组合物中。这些成分包括但不限于：常规的粘着剂；分散剂，如甲基纤维素(例如Methocel A15LV或Methocel A15C，用作用于种子处理的组合的分散剂/粘着剂)、聚乙烯醇(例如Elvanol 51-05)、卵磷脂(例如Yelkinol P)、聚合分散剂(例如聚乙烯吡咯烷酮/乙酸乙烯酯PVPNA S-630)；增稠剂(例如提高粘度并且减少粒子悬浮液沉降的粘土增稠剂，如Van Gel B)；乳液稳定剂；表面活性剂；防冻化合物(例如脲)；染料；着色剂等，它们可以与包含多核苷酸和转移剂的组合物组合。可以向种子施用的组合物中所用的另外的成分可以见于McCutcheon's,第1卷,“Emulsifiers and Detergents”,MCPublishing Company,Glen Rock,N.J.,U.S.A.,1996；以及McCutcheon's,第2卷,“Functional Materials”,MC Publishing Company,Glen Rock,N.J.,U.S.A.,1996中。向种子施用组合物的方法以及可以用于处理种子的农药组合物描述于美国专利申请公布20080092256中，该美国专利申请公布以引用的方式整体并入本文。
在某些实施方案中提供了在植物发育的营养生长期的早期、中期以及后期施用组合物。在某些实施方案中还提供了在繁殖期的早期、中期以及后期施用组合物。还提供了在不同的成熟期向植物部分施用组合物。
包括下列实施例以说明某些实施方案。本领域技术人员根据本公开应当了解的是，可以在所公开的具体实施方案中作出许多变化并且仍获得同样的或类似的结果而不背离本发明的精神和范围。
实施例
实施例1.与PMR5靶基因序列相关的多核苷酸。
靶PMR5基因和/或转录物提供于表2和序列表。这些基因和由PMR5基因编码的蛋白质序列(表3)可以被用于鉴定并未随本文提供的其他植物的直系同源PMR5基因和转录物。这些直系同源基因和它们的转录物然后可以用作本文提供的多核苷酸的靶标或用作被特定设计成靶向所述直系同源基因或转录物的多核苷酸的来源。
靶PMR5多核苷酸分子至少存在于表2中所提供的植物的基因组中。表3中所提供的PMR5基因或它们的相应转录物可以被用作多核苷酸组合物的靶标，所述多核苷酸组合物包含具有与那些基因或转录物基本上同一或基本上互补的至少18个连续核苷酸的多核苷酸。表2和表3中分别提供的蛋白质和基因或那些蛋白质或基因内所含的序列还可以被用于获得未在表2和3中列出的植物的直系同源PMR5基因。这些直系同源基因和它们的转录物然后可以用作本文提供的多核苷酸的靶标或用作被特定设计成靶向所述直系同源基因或转录物的多核苷酸的来源。
表2.靶PMR5基因序列
表3.靶基因编码的蛋白序列
序列表含有来自表2的所示的植物物种的靶PMR5DNA序列。对于具有序列表中所提供以及表2中所列的DNA序列的每一种基因，将呈正义和/或反义取向的多核苷酸，如单链或双链DNA或RNA片段与有机硅制剂混合。将向植物局部施用这些组合物以使得靶基因在指定的植物中表达以获得表现出疾病抗性的植物。具体来说，将经由施用这些组合物来获得对白粉病、霜霉病和/或锈病感染和/或线虫具有抗性的植物。
实施例2.可用于减少各种植物中PMR5表达的多核苷酸
可以用于减少各种植物中PMR5基因的表达的一组多核苷酸随本文以SEQ ID NO：12-19、21-37或38提供。SEQ ID NO：12-19、21-37或38描述了靶向来自大豆和大麦的PMR5序列的编码区并且可用于使用本文所述的方法来下调PMR5表达的ssDNA寡核苷酸和正义/反义双链RNA。PMR5基因的其他区域也可以被靶向以改变表达，包括使用针对编码区和/或靶向启动子区的反义DNA寡核苷酸，使用正义/反义dsRNA、正义或反义ssDNA以及正义/反义双链DNA。举例来说，可以使用包含与以下序列基本上同一或基本上互补的至少18个连续核苷酸的多核苷酸来下调那些PMR5基因的表达：SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11。
实施例3.局部寡核苷酸施用和白粉病测试方法
将大麦种子(Perry品种)种植在生长室中的2英寸花盆中约1/4”进入土壤，并在25℃下生长，以50％湿度中16小时光循环。在多核苷酸施用之前随机化植物。通过移液管施用来进行多核苷酸(ssDNA寡聚物和/或dsRNA)的施用，其中将含有核苷酸的5μL溶液施用至第一叶的两侧。施用的核苷酸溶液由Gibco超纯水中～3-15nmol每种ssDNA寡核苷酸或～0.5-1nmol dsRNA、0.1-0.3％Silwet L-77、5mM NaPO4和1％AMS组成。多核苷酸的实例包括包含与SEQ ID NO：4基本上同一或互补的至少18个连续核苷酸的多核苷酸。多核苷酸的实例还包括SEQ ID NO：21-37和38的多核苷酸。处理后两天，使幼苗感染大麦白粉菌(布氏白粉菌大麦专化型(Blumeria graminis f.sp.hordei))。感染的生长室设置如下：23℃，以70％湿度中12小时光循环。在感染后七天时，根据覆盖有白粉菌的叶片面积的百分比评定疾病严重度。
使用ANOVA单因子分析来分析数据(α＝0.1)。计算1/2LSD，并且针对条形图产生自定义误差棒。百分比疾病减少与制剂空白和核酸对照相比较。
将黄瓜种子种植在3英寸的正方形花盆中并且在出苗之后疏苗到每个花盆一棵植物。当第一片真叶完全展开并且第二片叶片打开时，向第一片真叶或子叶施用针对所关注的靶基因的启动子和/或靶向编码区的多核苷酸溶液，如ssDNA和/或dsRNA寡聚物。举例来说，多核苷酸的实例包括包含与SEQ ID NO：3或6基本上同一或互补的至少18个连续核苷酸的多核苷酸。施用的核苷酸溶液由以下组成：在40微升的最终体积的水中的6-20nm的每一种ssDNA寡核苷酸或0.5-4nm的dsRNA、0.1％至0.3％L77Silwet、50mM NaPO4。两天后，将整个黄瓜植物用从有病的植物上抖落的一阵黄瓜白粉菌(单丝壳白粉菌(Sphaerothecafuliginea))干孢子接种。在10天后以及以随后的时间间隔对经过处理的叶片以及后续的叶片上的疾病严重程度进行评价。
将番茄种子种植在3英寸的正方形花盆中并且在出苗之后疏苗到每个花盆一棵植物。用在30微升最终体积的水中的6-20nm的每一种ssDNA寡核苷酸或0.5-4nm dsRNA、0.2％-0.5％L77silwet、50mM NaPO4、1％硫酸铵对两周大的番茄幼苗进行处理。多核苷酸的实例包括包含与SEQ ID NO：2或10基本上同一或互补的至少18个连续核苷酸的多核苷酸。在喷洒后的2到4天时，将植物用番茄白粉菌(新番茄粉孢菌(Oidium neolycopersici))的干孢子接种并且在感染后的13天时，针对覆盖有白粉菌的叶片面积的百分比对疾病发展进行评定。
实施例4.通过局部施用汇集的寡核苷酸来防止大麦感染白粉病
基本上如实施例3中描述的，将大麦种子种植在温室中的2英寸花盆中。六天后，根据表4所示方法用所示的寡聚物或对照制剂处理大麦幼苗，其中将4μl所示溶液施用至叶的两侧。用所示ssDNA寡核苷酸的处理1-12方法描述于表5。使用的ssDNA寡核苷酸的描述提供于表6。在处理后约2天，使幼苗感染大麦白粉菌(布氏白粉菌大麦专化型)的孢子并且在感染后的7天时，针对覆盖有白粉菌的叶片面积的百分比对疾病发展进行评定。这项分析的结果分别示于图1、2和相应的表7和8中。表7的ANOVA统计计算显示于表9，并且具有LSD条柱的相应图显示于图1。表8的ANOVA统计计算显示于表10，并且具有LSD条柱的相应图显示于图2。
表4.制剂
组分 终浓度
PMR5或对照触发剂寡核苷酸 1.52nmol
NaPO4 5mM
AMS(硫酸铵) 1％
Silwet 0.25％
表5.处理
1T4783-85是随机产生的寡聚物，其不以100％同一性在>＝20bp匹配黄瓜、棉花、番茄、甜瓜、莴苣、大麦、大豆、玉米基因组(阴性对照)。
2GFP_AS是针对Aqueoria绿色荧光蛋白的寡核苷酸(SEQ ID NO:20)(阴性对照)。
3DEGEN是简并寡核苷酸的混合物(阴性对照)。
4MLO是靶向大麦(霉病抗性基因座O)基因的阳性对照寡核苷酸(SEQ ID NO:39)。
表6.使用的寡核苷酸
表7.完整叶测定的结果
表8.上半叶分析的结果
表9.表7数据的ANOVA分析(单因子)
表10.表8数据的ANOVA分析(单因子)
图1和2显示，相对于单独的Silwet制剂(空白)、与简并寡聚物混合物组合的Silwet制剂、或与对照GFP(绿色荧光蛋白)寡核苷酸(SEQ ID NO:20)组合的Silwet制剂，在用含有某些大麦PMR5反义DNA寡核苷酸的Silwet制剂处理的植物中的百分比疾病面积数字上下降。
图2显示，相对于单独的Silwet制剂(空白)和与对照GFP(绿色荧光蛋白)寡核苷酸(SEQ ID NO:20)组合的Silwet制剂，在用含有某些大麦PMR5反义DNA寡核苷酸的Silwet制剂处理的植物中的百分比叶疾病面积下降统计学上显著的水平。
实施例5.通过局部施用单PMR5寡核苷酸而防止大麦感染白粉菌
基本上如实施例3所述，将大麦种子种植在温室中的2英寸花盆中。六天后，根据表11所示方法用所示的寡聚物或对照制剂处理大麦幼苗，其中将4μl所示溶液施用至叶的两侧。用所示ssDNA寡核苷酸的处理1-9方法描述于表12。使用的ssDNA寡核苷酸的描述提供于表13。寡核苷酸处理后约2天，使幼苗感染大麦白粉菌(布氏白粉菌大麦专化型)的孢子并且在感染后7天，针对覆盖有白粉菌的叶片面积的百分比对疾病发展进行评定。这项分析的结果分别示于图3、4和相应的表14和15中。表14的ANOVA统计计算显示于表16，并且具有LSD条柱的相应图显示于图3。表15的ANOVA统计计算显示于表17，并且具有LSD条柱的相应图显示于图4。
表11.制剂
组分 终浓度
PMR5或对照触发剂寡核苷酸 1.14nmol
NaPO<sub>4</sub> 5mM
AMS(硫酸铵) 1％
Silwet 0.25％
表12.处理
表13.使用的寡核苷酸
寡聚物名称 序列 SEQ ID NO: 长度
T4784 ACGACTCTGCTTATTATACTCGGTC 51 25
T9157 GGAGTCCGGGCGGCCATAGAGCTGG 24 25
T9158 CGGCTTCCAGCGGTACCGGAGGTAG 25 25
T9159 GTCAAACCTGGGTAGCTCGCAGCTG 26 25
表14.完整叶测定的结果
处理 计数 总和 平均百分比疾病 方差
未处理的 6 90 15 7.5
空白 6 73 12.2 49.66667
GFP_AS 6 43.5 7.25 9.275
T4784 6 34.5 5.75 11.775
T4211 6 24 4 30
T9157-59 6 42.5 7.08 35.14167
T9157 6 29 4.83 2.866667
T9158 6 38.5 6.42 5.941667
T9159 6 28 4.67 19.46667
表15.上半叶分析的结果
概述
组 计数 总和 平均百分比疾病 方差
未处理的 6 118.5 19.75 83.275
空白 6 104 17.3 66.86667
GFP_AS 6 54.5 9.08 111.5417
T4784 6 33 5.5 15
T4211 6 6.5 1.08 0.941667
T9157-59 6 13.5 2.25 3.475
T9157 6 12 2 1.4
T9158 6 25 4.17 3.266667
T9159 6 26.5 4.42 8.241667
表16.表14数据的ANOVA分析(单因子)
表17.表15数据的ANOVA分析(单因子)
图3和4显示，相对于单独的Silwet制剂(空白)或与对照GFP(绿色荧光蛋白)寡核苷酸(SEQ ID NO:20)组合的Silwet制剂，在用含有某些大麦PMR5反义DNA寡核苷酸的Silwet制剂处理的植物中的百分比疾病面积数字上下降。
图4显示，相对于单独的Silwet制剂(空白)和与对照GFP(绿色荧光蛋白)寡核苷酸(SEQ ID NO:20)组合的Silwet制剂，在用含有某些大麦PMR5反义DNA寡核苷酸的Silwet制剂处理的植物中的百分比疾病面积下降统计学上显著的水平。
实施例6.局部寡核苷酸施用和线虫测试方法
向叶片施用寡核苷酸以进行线虫控制
用针对所关注的靶基因的启动子和/或靶向编码区的核苷酸(ssDNA和/或dsRNA寡聚物)对在沙中生长的十天大的黄瓜植物点样。施用的核苷酸溶液由以下组成：在40uL的最终体积的水中的6-20nm的每一种ssDNA或0.5-1nm的dsRNA、0.1％L77silwet、50mM NaPO4。用20uL的核苷酸溶液对两片子叶或叶片点样，每棵植物总共40uL。在6-24小时之后，将1000个蠕虫状卵或1000条J2南方根结线虫(Meloidogyne incognita)(RKN)接种到每一个花盆中。然后将对测试植物的浇水仅限于防止枯萎所需的水，持续24小时的时间。在24小时受限的浇水之后，进行正常的地下灌溉浇水，持续测试的持续时间。在接种之后约14天时通过将沙从根部洗掉来收获黄瓜植物。使用下列量表指定根瘿评级和目视植物毒性评级：根瘿评级量表(根瘿：受瘿害的根质量％)：0＝0％-5％；1＝6％-20％；2＝21％-50％；以及3＝51％-100％。还指定了目视植物毒性量表(Vis.tox；与对照组相比根质量的目视减少)：rs1＝轻度生长迟缓；rs2＝中度生长迟缓；rs3＝重度生长迟缓。
使用大豆孢囊线虫(SCN)在大豆中进行的实验类似于黄瓜RKN测定，不同之处在于下列变化。将大豆种子种植在两英寸的正方形塑料花盆中的100％沙中。在种植后的约10至12天时大豆展现出开始出苗的第一片三叶时，施用寡核苷酸溶液。在施用寡核苷酸溶液后的至少六小时之时，将线虫大豆孢囊线虫(SCN)接种物(1000个蠕虫状卵或1000条J2)施加于花盆中。然后将对测试植物的浇水仅限于防止枯萎所需的水，持续24小时的时间。在24小时受限的浇水之后，进行正常的地下灌溉浇水，持续测试的持续时间。在接种后的二十八天时收获植物并且对孢囊进行计数。
使用病变线虫在玉米中进行的实验类似于上述，不同之处在于下列变化。玉米植物生长在4英寸深的花盆中的沙:蒙脱石混合物(2:1)中(伊利诺伊州布法罗格罗韦(Buffalo Grove,IL)的Profile Products有限公司的TurfaceTM MVP)。当植物约8-10大时，用寡核苷酸溶液进行处理。在接种寡核苷酸溶液后的至少六小时之时，将植物用2gm的侵扰玉米根部的斯氏短体线虫(P.scribneri)接种，然后在7天后将所述玉米根部从花盆中取出。然后在接种后将对测试植物的浇水仅限于防止枯萎所需的水，持续24小时的时间。在24小时受限的浇水之后，进行所需要的正常的地下灌溉浇水，持续测试的持续时间。在接种后的12-14天时，收获植物并且在雾罩中从切碎的根部中提取线虫，持续6天。
向种子施用寡核苷酸以进行线虫控制
将黄瓜种子在针对所关注的靶标的启动子和/或靶向所关注的靶标的编码区的核苷酸(ssDNA和/或dsRNA寡聚物)中浸泡约5-72小时。还可以将种子在寡核苷酸溶液中浸泡之前在水中浸泡几个小时。浸泡溶液由最终体积200uL的在水中的20nm的每一种ssDNA或0.03-1nm的dsRNA核苷酸、.1％的silwet L77、50mM NaPO4组成。黄瓜种子的胚根在72小时内出现，之后将种子放在发芽纸上直到根长是约2英寸为止。将幼苗移植到沙小瓶中以在24小时后进行RKN接种。将10mL的干砂添加到每一个小瓶中并且通过倾斜小瓶并且将幼苗沿正确的取向放置以使得子叶刚好处在沙的上方，然后向回倾斜以用沙覆盖胚根来种植幼苗。将3.3ml的水添加到每一个小瓶中并且将小瓶放在支架中荧光灯组下。在每一个管中在50uL的去离子水或泉水中接种500个蠕虫状卵或300条J2RKN。在接种后10至12天时通过将沙从根部洗掉来收获黄瓜植物。使用下列量表来指定根瘿评级和目视植物毒性评级：根瘿评级量表(根瘿：受瘿害的根质量％)：0＝0％-5％；1＝6％-20％；2＝21％-50％；以及3＝51％-100％。然后计算三次重复的根瘿评级的平均值：绿色＝0.00-0.33(无根瘿)；黄色＝0.67-1.33(轻度受瘿害)；橙色＝1.67-2.33(中度受瘿害)；红色＝2.67-3.00(重度受瘿害)。还指定了目视植物毒性量表(Vis.tox；与对照组相比根质量的目视减少)：rs1＝轻度生长迟缓；rs2＝中度生长迟缓；rs3＝重度生长迟缓。
使用大豆孢囊线虫(SCN)在大豆中进行的实验类似于RKN测定，不同之处在于下列变化。在5-72小时的浸泡之后，将大豆种子种植在两英寸的正方形塑料花盆中的100％沙中。还可以将种子在寡核苷酸溶液中浸泡之前在水中浸泡几个小时。在种植大豆种子后的七天时，将线虫大豆孢囊线虫(SCN)接种物(1000个蠕虫状卵或1000条J2)施加于花盆中。然后将对测试植物的浇水仅限于防止枯萎所需的水，持续24小时的时间。在24小时受限的浇水之后，进行正常的地下灌溉浇水，持续测试的持续时间。在接种后的二十八天时收获测试并且对孢囊进行计数。
使用病变线虫在玉米中进行的实验类似于上述，不同之处在于下列变化。在5-72小时的浸泡之后，将玉米种子种植在4英寸深的花盆中的沙:蒙脱石混合物(2:1)中(TurfaceTMMVP,Profile Products,LLC.,Buffalo Grove,IL)。还可以将种子在寡核苷酸溶液中浸泡之前在水中浸泡几个小时。在播种时施加2gm侵扰玉米根部的根部斯氏短体线虫的接种物并且在7天之后将玉米根部从花盆中取出。然后在接种后将对测试植物的浇水仅限于防止枯萎所需的水，持续24小时的时间。在24小时受限的浇水之后，进行所需要的正常的地下灌溉浇水，持续测试的持续时间。在接种后的12-14天时，收获植物并且在雾罩中从切碎的根部中提取线虫，持续6天。
使用下列溶液由孵化碗制备RKN和SCN J2：RKN溶液：1L曝气自来水、1ml的50mg/ml卡那霉素(kanamycin)、0.5ml的20mg/ml抑霉唑硫酸盐(imazalil sulfate)；SCN溶液：1L曝气自来水、1ml的50mg/ml卡那霉素、0.5ml的20mg/ml抑霉唑硫酸盐、1430mg硫酸锌。
孵化碗是高压消毒的6oz碗，衬有筛网和纸滤器。将约20ml的适当的孵化溶液倒入每一个碗中。然后将卵放在碗中并且用箔覆盖。然后将碗放在25℃孵育箱中过夜。第二天，提取孵化的J2，根据需要添加额外的溶液并且放回孵育箱中。每一个碗被使用2周，然后被处置。
实施例7.防止大豆感染根癌线虫(RKN)
处于单子叶期的大豆种W2与所示对照和测试溶液(表18)接触并在24小时之后用2500个南方根结线虫卵接种。所示量的寡聚物提供于5mM NaPO4、1％硫酸铵和0.25％SilwetTM(wt百分比)。将4ssDNA/池的池中含有表19的ssDNA寡核苷酸的大约50μl溶液施用至每种植物，并且使4种植物经受每种处理。在处理后约1天，将大约2500RKN(南方根结线虫(M.incognita))接种进入土壤。在感染后大约25天记录根重量和卵计数(表20)。通过对比表21和图5所示每组的生成的卵数目/克根组织来分析RKN感染。表21和图5的ANOVA分析，卵/克根数据提供于表22。
表18.处理
表19.使用的寡核苷酸
表20.根重量数据的概述
表21.每克根的卵
表22.卵/克根数据的ANOVA分析
实施例8.黄瓜幼苗对根癌线虫的抗性
将黄瓜种子(Straight Eight,Burpee Seeds,Warminster,PA,USA)以4粒种子/孔浸泡入24孔板(平底)。200uL浸泡溶液含有UltrapureTMGibco水、20mM NaPO4缓冲剂和核苷酸(ssDNA(最高浓度80nmol)和/或dsRNA(最高浓度0.15nmol)寡聚物)，在摇摆器上室温(～25℃)下持续大约72小时。该测定中省略表面活性剂。对照包括阴性对照触发剂分子(例如，不靶向内源性黄瓜序列的GFP或简并寡聚物)和单独缓冲剂。黄瓜种子根部在72小时内出现，然后将种子放在含有20mL自来水的出芽包(cygTMSeed Germination Pouches,MegaInternational,Saint Paul,Minnesota；英特网上mega-international.com/tech.htm)上，在25℃持续3天，具有12小时光循环。根长度大约2英寸，此时可以评估处理对根作用的观察。三天后将幼苗移植至沙瓶。通过以下步骤而进行“QuickSand”测定：向每个玻璃平底管形瓶添加10mL干沙，通过倾斜管形瓶而种植幼苗，设置幼苗取向使得子叶刚好高于沙，然后向回倾斜以用沙覆盖根。向每个管形瓶添加大约3.5ml水，并将管形瓶放入室温下荧光灯管下的支架中。三天后，将250条J2南方根结线虫以50至200uL充气自来水接种到每一个管中。在接种后10至11天，通过从根洗掉沙而进行黄瓜植物的收获。使用以下量表分配根瘿等级和视觉植物毒性等级：瘿等级量表(瘿：％瘿化根质量)：0＝0-5％；1＝6-20％；2＝21-50％；和3＝51-100％。还分配了视觉植物毒性量表(Vis.tox；与对照相比的根质量视觉减少)：rs1＝温和矮化；rs2＝中度矮化；rs3＝严重矮化。然后进行以下计算以确定效力：至少三次重复的平均值，四次重复的标准偏差，与对照相比的％减少，单因子ANOVA测试，数据的1/2LSD值。
以0.06nmol/每种dsRNA和0.15nmol/每种dsRNA在前述黄瓜幼苗测定中针对RKN控制测试dsRNA T6860(SEQ ID NO:53)、T6861(SEQ ID NO:54)、T6862(SEQ ID NO:55)和T6863(SEQ ID NO:56)的池(表23)。
表23. PMR5dsRNA池对PKN的控制
Anova：单因子分析提供于表24、25和26。
表24. Anova：概述。
表25 ANOVA
变化来源 SS df MS F P值 F crit
组间 115.1635 3 38.38783 0.074216 0.970689 6.591382
组内 2068.984 4 517.246
总计 2184.148 7
表26. ANOVA分析
差异的标准偏差 8.04088
df 2.132 表
LSD 17.14316
1/2LSD 8.571578
还以0.06nmol/每种dsRNA和0.15nmol/每种dsRNA在前述黄瓜幼苗测定中针对RKN控制测试了个体dsRNA分子T6860(SEQ ID NO:53)、T6861(SEQ ID NO:54)、T6862(SEQ IDNO:55)和T6863(SEQ ID NO:56)(表27)。
表27.个体dsRNA处理结果
实施例9.大豆中疫霉菌(Phytophthora)根腐病的控制
测试了针对PMR5基因的启动子(prm)或编码区(CDS)的DNA寡聚物控制大豆疫霉菌根腐病(PRR)的能力。疾病发展是良好的，因为非接种对照根是未用寡聚物处理的仅接种根3倍大。在该测试中，所有植物通过在接种之前地下灌溉一次而施用氮肥，并且不是萎黄病。在处理14中，还在接种之前向花盆中直接添加小量肥料。
通过以下计算根率损失：
非接种的根重量–处理的根重量＝根重量损失。
池T6702-T6705具有比空白制剂统计学上较少的根损失，指示该池中寡聚物的一种或多种赋予对大豆疫霉菌根腐病的控制。
表28.根重量损失中的百分比减少
图例：prm＝启动子；CDS＝编码序列
表29.百分比根重量增加
实施例10.使用VIGS选择抑制PMR5基因表达的多核苷酸
为了选择可能抑制内源性PMR5基因的候选多核苷酸，将多聚核苷酸序列引入番茄金花叶病毒(ToGMV)载体并测试其在植物中提供内源性PMR5基因的病毒诱导的基因沉默的能力。随后筛选表现出VIGS介导的PMR5抑制的多聚核苷酸序列与转移剂一起施用至植物时抑制PMR5表达的能力。
可以使用针对Yan等人Plant Cell Rep(2012)31:1713–1722中描述的病毒诱导的基因沉默方案的出芽真空侵入介导的农杆菌接种法的改良。表面灭菌的番茄种子首先在加头孢噻肟的1/4Murashige-Skoog培养基上出芽。大约3天之后，含有ToGMoV:PMR5抑制序列的农杆菌组分A和ToGMoV组分B各自分别接种进入含有适当浓度壮观霉素、庆大霉素和氯霉素的10mL Luria Broth中，并在24℃下振摇约1-2天以制备含有ToGMoV载体组分的农杆菌接种物。已知A基因组组分编码病毒DNA复制所必需的病毒功能，而B基因组组分指定病毒经感染植物传播所必需的功能(Revington等人Plant Cell.1989年10月；1(10)：985–992)。在生长约1至2天之后，通过离心沉淀农杆菌并在浸润缓冲液(10mM MES，10mM MgCl，100uM乙酰丁香酮)中重悬至最终0.05的OD600。以1:1比率混合农杆菌A组分和B组分以供使用，并且还制备了仅浸润缓冲液对照(Mock)。然后使A和B组分混合物以及模拟浸润缓冲液对照在室温(～25℃)孵育3-4小时。将大约3ml每种样品(即，具有给定测试PMR5抑制序列的ToGMV载体)转移进入小微量滴定板。通常，1个微量滴定板(6-24孔)用于含有给定测试PMR5抑制序列的每个测试ToGMV载体，并且1个微量滴定板用于模拟对照(仅浸润缓冲液)。向每个孔添加约3-5个芽，抽真空10秒钟，然后停止。然后重复另外两次抽真空和停止。将真空浸润的芽种植入土壤，小心不要交叉污染样品。这可以通过更换手套并且使用新镊子来完成。种植的芽用湿度穹顶覆盖并置于室温(～25℃)过夜以恢复。一天后，将放入花盆的芽转移至生长室。通过挑战用含有提供内源性PMR5基因抑制但是在经受模拟对照(仅浸润缓冲液)的植物中未观察到的序列的ToGMV载体或含有不提供内源性PMR5基因抑制的序列的ToGMV载体植物感染的花盆植物，可以观察与PMR5抑制相关的表型(即，真菌和/或线虫抗性)。

Claims (16)

1.一种用于产生表现出真菌病抗性提高的大豆植物的方法，所述方法包括向大豆植物表面局部施用组合物，所述组合物包含：
a.(i)至少一种长度为25至95个核苷酸的多核苷酸，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO:73同一或互补的25个连续核苷酸的链段；
(ii)至少一种长度为25至95个核苷酸的多核苷酸，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO:74同一或互补的25个连续核苷酸的链段；
(iii)至少一种长度为25至95个核苷酸的多核苷酸，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO:75同一或互补的25个连续核苷酸的链段；和
(iv)至少一种长度为25至95个核苷酸的多核苷酸，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO:76同一或互补的25个连续核苷酸的链段，
其中所述多核苷酸(i)、(ii)、(iii)和(iv)没有可操作连接至启动子或病毒载体，并且其中所述多核苷酸未被整合到植物染色体中，以及
b.转移剂，其中所述大豆植物表现出由抑制大豆PMR5基因所引起的真菌病抗性的提高。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述多核苷酸(i)、(ii)、(iii)和(iv)包括正义ssDNA、正义ssRNA、dsRNA、dsDNA、双链DNA/RNA杂交体、反义ssDNA、或反义ssRNA。
3.如权利要求1所述的方法，其中至少一种所述多核苷酸(i)、(ii)、(iii)和(iv)的长度为25个核苷酸。
4.如权利要求1所述的方法，其中每一种所述多核苷酸(i)、(ii)、(iii)和(iv)的长度为25个核苷酸。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述组合物还包含非多核苷酸除草剂分子、多核苷酸除草剂分子、抑制除草剂靶基因的多核苷酸、杀虫剂、杀真菌剂、杀线虫剂、或其组合。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述组合物还包含非多核苷酸除草剂分子并且所述大豆植物对所述除草剂分子具有抗性。
7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述转移剂包括有机硅制剂。
8.一种组合物，所述组合物包含：
(i)长度为25至95个核苷酸的多核苷酸分子，所述多核苷酸分子包含与SEQ ID NO:73同一或互补的25个连续核苷酸的链段；
(ii)长度为25至95个核苷酸的多核苷酸分子，所述多核苷酸分子包含与SEQ ID NO:74同一或互补的25个连续核苷酸的链段；
(iii)长度为25至95个核苷酸的多核苷酸分子，所述多核苷酸分子包含与SEQ ID NO:75同一或互补的25个连续核苷酸的链段；和
(iv)长度为25至95个核苷酸的多核苷酸分子，所述多核苷酸分子包含与SEQ ID NO:76同一或互补的25个连续核苷酸的链段；
其中所述多核苷酸(i)、(ii)、(iii)和(iv)并非与启动子或病毒载体可操作地连接；以及转移剂。
9.如权利要求8所述的组合物，其中至少一种所述多核苷酸(i)、(ii)、(iii)和(iv)的长度为25个核苷酸。
10.如权利要求8所述的组合物，其中所述组合物还包含非多核苷酸除草剂分子、多核苷酸除草剂分子、抑制除草剂靶基因的多核苷酸、杀虫剂、杀真菌剂、杀线虫剂、或其组合。
11.如权利要求8所述的组合物，其中所述转移剂是有机硅制剂。
12.如权利要求8至11中任一项所述的组合物，其中所述多核苷酸并非与生物射弹粒子以物理方式结合。
13.一种制备组合物的方法，所述方法包括组合至少以下的步骤：
a)(i)长度为25至95个核苷酸的多核苷酸分子，所述多核苷酸分子包含与SEQ ID NO:73同一或互补的25个连续核苷酸的链段；
(ii)长度为25至95个核苷酸的多核苷酸分子，所述多核苷酸分子包含与SEQ ID NO:74同一或互补的25个连续核苷酸的链段；
(iii)长度为25至95个核苷酸的多核苷酸分子，所述多核苷酸分子包含与SEQ ID NO:75同一或互补的25个连续核苷酸的链段；和
(iv)长度为25至95个核苷酸的多核苷酸分子，所述多核苷酸分子包含与SEQ ID NO:76同一或互补的25个连续核苷酸的链段；
其中所述多核苷酸(i)、(ii)、(iii)和(iv)没有可操作连接至启动子或病毒载体；以及，
b)转移剂。
14.如权利要求13所述的方法，其中通过体内生物合成、体外酶促合成、或化学合成获得所述多核苷酸(i)、(ii)、(iii)和(iv)。
15.如权利要求13所述的方法，其中所述方法还包括将所述多核苷酸和所述转移剂与非多核苷酸除草剂分子、多核苷酸除草剂分子、杀虫剂、杀真菌剂和/或杀线虫剂中的至少一种组合。
16.如权利要求13至15中任一项所述的方法，其中所述转移剂是有机硅制剂。
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