CN107922466A - 通过抑制hxt1基因表达来防治锈菌真菌的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于防治植物真菌病原体，尤其是锈菌的方法和组合物，所述方法通过抑制所述植物真菌病原体的一种或多种生物学功能，尤其是通过使用RNA干扰(RNAi)以抑制真菌HXT1基因来防治。

Description

通过抑制HXT1基因表达来防治锈菌真菌的方法和组合物

本发明涉及用于防治植物真菌病原体，尤其是锈菌的方法，所述方法通过抑制所述植物真菌病原体的一种或多种生物学功能，尤其是通过使用RNA干扰(RNAi)以抑制真菌HXT1基因来防治。

本发明为此类防治提供使用针对真菌基因，尤其是锈菌真菌基因的RNAi的方法和组合物。本发明还涉及制备耐受真菌病原体，尤其是锈菌的转基因植物的方法，以及由此产生的转基因植物和种子。

技术背景

包括真菌、细菌、病毒的植物病原体引起栽培作物的许多病害，这可导致明显的作物损失，通常认为所述损失为预期产量的20-40％。

锈病是由柄锈菌(Pucciniales)目的真菌担子菌病原体引起的植物病害。它们被认为是农业中最有害的植物病原体之一。其构成了一组具有破坏性的植物病原体，导致全世界的谷类和豆类作物的巨大损失(Brown和2002，Science 297：537-541)。在2012年，当感染谷物的柄锈菌属种(Puccinia spp.)被指出在前十种真菌病原体中位居第三时，它们的重要性得以突显(Dean et al.，2012，Mol.Plant Path.13:414-430)。具有经济重要性的锈病的实例包括由以下物种的真菌引起的那些：小麦上的禾柄锈菌(Puccinia graminis)、条形柄锈菌(Puccinia striiformis)或Puccinia triticina，豆类上的菜豆单胞锈菌(Uromyces phaseoli)和疣顶单胞锈菌(Uromyces appendiculatus)，或者大豆上的豆薯层锈菌(Phakopsora pachyrhizi)。

亚洲大豆锈病是由真菌豆薯层锈菌引起的大豆作物的病害。近几年，这种病害在种植有大豆作物的许多地区已经急剧蔓延，并且造成这些作物的严重损失(Hartman etal.，2011，Food Security 3:5-17)。

至今为止，防治真菌植物病原体，特别是亚洲大豆锈菌的最有效手段是化学杀真菌剂。然而人们感兴趣的是探究对抗植物病原体的替代解决方案。

除了抑制某些重要的真菌酶的生物活性(其为大多数杀真菌剂的作用模式)以外，抑制真菌生长和/或病原性所必需的基因的表达可是替代的目的方法。实现这种方法的一种方式是首先需要鉴定出要抑制的适当的基因，然后使用被称为RNA干扰或RNAi的生物机制。RNAi是存在于包括植物的大多数真核生物(其携带或产生所谓的“双链RNA”或“dsRNA”)中的自然机制，用于抵御某些类型的的微生物，特别是病毒。它不仅降解dsRNA，而且如果dsRNA在核酸序列上与由这种侵入微生物表达的RNA(例如，编码特定蛋白质的信使RNA(mRNA))相同，则该dsRNA的表达将引发RNAi细胞机制(machinery)，然后抑制mRNA翻译成蛋白质。

因此，这样的序列在生物体细胞中的表达，即所述序列在核酸序列上与所述生物体的靶基因同源并且能产生双链RNA分子(dsRNA)，使得可以非常特异性地抑制该基因的表达(Xiao et al.,2003,Plant Mol Biol.,52:957-66)。

dsRNA仅在与该dsRNA序列相同的区域内引起同源RNA的特异性降解(Zamore etal.,2000,Cell.101:25-33；Tang et al.,2003,Genes Dev.17:49-63)。所述dsRNA为这样一种RNA分子：含有双链RNA分子(通常为数百个碱基对(bp))，并且包括正义链和互补反义链。一旦在细胞中，所述dsRNA就会被降解成通常为18-25个核苷酸的RNA片段，称为小干扰RNA(siRNA)。为了使RNAi机制起作用，因此相对于要抑制的靶RNA，所得的siRNA应表现出高度的序列同一性；但是，siRNA和靶RNA的相应部分之间的3-4个核苷酸的错配仍然可以使该系统运行(Tang et al.,2003,Genes Dev.17:49-63)。

RNAi已被证实在将dsRNA注射入秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)时是有效的(Fire et al.,1998,Nature 391:806-811；Montgomery et al.,1998,PNAS 95:15502-15507；WO99/32619)。还在给昆虫喂食表达与所述昆虫靶基因对应的小dsRNA的细菌时，提及了对所述昆虫靶基因表达的抑制(WO 01/37654)。

为了不同的目的，在植物中进行dsRNA的引入，例如用于诱导内源靶基因的沉默(Hamilton et al.,1998,Plant J.15:737-746,WO99/15682)，通过使用表达与病毒基因基本相同的dsRNA的转基因的方式来诱导对RNA病毒的抗性(Waterhouse et al.,1998,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:13959-13964；Pandolfini et al.,2003,Biotechnol.,25；3(1):7,WO98/36083,WO99/15682,US 5,175,102)，也用于诱导对线虫的抗性(Chuang和Meyerowitz,2000,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:4985-4990,WO01/96584)或另外对于细菌土壤杆菌属种(Agrobacterium sp.)的抗性(WO00/26346,Escobar et al.,2001,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98(23):13437-13442)。最近，已证明表达与真菌的生长或其病原性所必需的真菌基因具有基本相同的序列的dsRNA的植物也可诱导针对该真菌的植物抗性(WO 2005/071091)。

然而，自从那时开始，关于RNAi-介导的针对植物病原真菌的抗性或耐受性，仅存在一些初步结果，并且没有商业实例，其中双链(dsRNA)或小干扰(siRNA)分子在植物中表达，或作为外用组合物的部分施用于种子、植物或施用于植物的果实或土壤、或施用于植物生长或需要其生长的惰性物质中。

困难之一是要发现合适的靶基因，其通过dsRNA或siRNA的抑制引起有效水平的病害防治，其最高至适用于商业应用的水平，而对于表达所述dsRNA或siRNA的植物或者施用了包含所述dsRNA或siRNA的组合物的植物不存在有害作用。

发明内容

出乎意料地，本发明人证明了，通过RNAi机制，尤其是使用dsRNA对真菌HXT1基因的表达的抑制会使所述病原性真菌的感染、生长、发育、繁殖和/或病原性减弱，这可最终引起对于受感染植物的病害的完全防治。

HXT1基因属于己糖转运蛋白家族。己糖转运蛋白是在活体营养植物病原性真菌的吸器中所表达的重要蛋白质。Voegele et al.(2001，PNAS 98：8133-8138)已经证明，HXT1蛋白优选在锈菌真菌蚕豆单胞锈菌(Uromyces fabae)的吸器中表达，并且在这种专用于从受感染植物摄入营养的真菌结构中，它实际上是表达最丰富的蛋白质之一。这些作者认为，几乎仅存在于真菌吸器中的HXT1基因使得这种己糖转运蛋白成为其寄主植物上锈菌真菌蚕豆单胞锈菌发育的关键。

十年后，Yin et al.(2011，MPMI24：554-561)使用靶向锈菌真菌条形柄锈菌和禾柄锈菌的某些基因的dsRNA，测试了RNAi机制的病害防治潜力。使用被称为VIGS(病毒诱导的基因沉默)的病毒短暂dsRNA递送系统使dsRNA与真菌细胞接触。据报道，经测试的基因之一(PSTha12O3)与Voegele et al.(2001,PNAS 98:8133-8138)在蚕豆单胞锈菌中鉴定的HXT1基因同源。Yin et al.(2011，MPMI24：554-561)已报道，经测试的不同基因显示出不同的沉默水平，如通过这些基因的RNA转录物的表达水平所测量的。然而，一些测试基因显示出良好的沉默水平，尤其是在真菌吸器中天然大量表达的基因，并且基因PSTha12O3为基因表达水平上降低最明显的基因。然而，在研究小麦植物上柄锈菌属(Puccinia)锈病的进展时，对于所有的测试基因，这些作者并没有观察到在病情进展方面的任何减轻，即使是对于所观察到的就转录产物丰度而言最沉默的HXT1同源基因。

这些先前的发现说明，虽然已鉴定出某些基因可能是真菌生长和/或病原性所必需的，但是这些基因的有效沉默及随后病情进展的减轻从未确定。Yin et al.(2011，MPMI24：554-561)表明，使用RNAi而进行的有效病害防治可能涉及更多的因素，不仅仅只是适当的靶基因。

本发明的发明人仍然进一步探讨了针对HXT1基因的RNAi(正如Yin et al.(2011，MPMI24：554-561)所遇到的)——尽管在使用针对这种真菌靶基因而设计的dsRNA时HXT1基因被有效沉默——并未引起相关的锈病病情进展的有效减轻的原因。

而且，Yin et al.(2011,MPMI 24:554-561)的发现教导了HXT1基因表达的抑制不会产生病害防治或减轻，针对这一发现，本发明人出乎意料地已鉴定，在Yin et al.(2011,MPMI 24:554-561)中用于设计dsRNA的两种柄锈菌属物种各自在其基因组中携带有两条与HXT1具有同源性的序列，并且这些作者已选择进行他们的RNAi实验的那一条序列并不是对应于Voegele et al.(2001,PNAS 98:8133-8138)中鉴定出的编码HXT1蛋白的序列的那条序列。当然，该发现对Yin et al.(2011,MPMI 24:554-561)中所示的“HXT1-同系物”序列是否编码有效的己糖转运蛋白，或至少编码有效的HXT1样蛋白，提出了质疑。

当使用来自其他真菌锈菌物种豆薯层锈菌的HXT1序列时，所述序列对应于Voegele et al.(2001,PNAS 98:8133-8138)在蚕豆单胞锈菌中鉴定的HXT1序列并且也对应于在两种柄锈菌属物种中鉴定的序列(但不是Yin et al.2011,MPMI 24:554-561中所使用的序列)，本发明的发明人进一步证实，在大豆植物(豆薯层锈菌的宿主植物)中使用表达针对所述序列的dsRNA的VIGS构建体不仅会引起对应的mRNA转录物表达的降低，而且也会引起植物病害的有效减少。

因此，本发明提供了一种dsRNA分子，其包含：i)第一条RNA链，其包含第一部分，所述第一部分具有的核苷酸序列与由真菌HXT1基因转录的mRNA的核苷酸序列中的至少18个连续核苷酸基本相同，和ii)第二条RNA链，其包含第二部分，所述第二部分具有的核苷酸序列与所述第一条链的第一部分的所述核苷酸序列基本互补。因此，所述第一和第二部分在其具有基本序列互补性的范围内配对在一起，由此形成dsRNA分子。所述第一条和第二条RNA链可以直接彼此连接或通过中间RNA序列彼此连接，然后构成单链RNA分子，其通过基本上互补的部分配对在一起时自身折叠而成为dsRNA。

或者，本发明还可提供了一种RNA分子，其包含：i)第一部分，其具有的核苷酸序列与由真菌HXT1基因转录的mRNA的核苷酸序列中的至少18个连续核苷酸基本相同，和ii)第二部分，其具有的核苷酸序列与所述第一条链的第一部分的所述核苷酸序列基本互补。这种RNA分子可能通过其基本上互补部分的配对而发生自身折叠，由此形成dsRNA分子。

如本文所用的，“RNAi”或“RNA干扰”可互换，指的是由双链RNA(dsRNA)介导的序列特异性基因沉默的过程。如本文所用的，“dsRNA”或“双链RNA”是指由于每条链或其某些部分之间的连续核苷酸序列互补性而得到的部分双链或完全双链的RNA分子。RNA干扰的过程已在文献中充分描述，尤其涉及Dicer酶，它将长dsRNA分子切成约20个核苷酸的小片段dsRNA，称为microRNA(miRNA)和短干扰RNA(siRNA)。这些miRNA和siRNA变成未配对的，并且其中一条链与被称为RISC(RNA-诱导的沉默复合物)的酶复合物相互作用。RISC含有一种催化酶，命名为Argonaute，其切割具有RISC所结合的siRNA链的互补序列的mRNA分子，从而引起这种mRNA分子的转录后基因沉默。双链RNA可具有不同的形状或长度，因此也可以不同的名称在文献中或被技术人员所提及，所述名称例如小或短干扰RNA(siRNA)、短干扰核酸(siNA)、微小RNA(miRNA)、环状干扰RNA(ciRNA)、或短发夹RNA(shRNA)。

也如本文所用，术语“核酸”和“多核苷酸”是指直链、单链或双链的RNA或DNA。当合成产生dsRNA时，较不常见的碱基，如肌苷、5-甲基胞嘧啶、6-甲基腺嘌呤、次黄嘌呤等也能用于改善碱基配对。例如，含有尿苷和胞苷的C-5丙炔类似物的多核苷酸已经显示出以相比其天然存在的等同碱基更高的亲和力来结合RNA，并且是基因表达的有效抑制剂。也可以进行其它的修饰，如磷酸二酯主链、锁核酸或RNA的核糖基团中2’-羟基的修饰。

如本文所用，术语“基本相同”或“对应”是指两种多核苷酸的核苷酸序列之间或两种多肽的氨基酸序列之间的序列同一性。根据本发明，两种多核苷酸具有至少70％的核苷酸序列同一性，并且两种多肽具有至少70％的氨基酸序列同一性。70％的核苷酸序列或氨基酸序列同一性意指在所考虑的所述多核苷酸或所述多肽的各自长度内，两种多核苷酸的70％核苷酸或两种多肽的70％氨基酸是相同的。优选地，两种多核苷酸或两种多肽各自的核苷酸序列同一性或氨基酸序列同一性为至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。

如本文所用，用于本发明dsRNA的术语“基本相同”意指dsRNA的一条链或其一部分的RNA序列与由真菌HXT1基因转录的mRNA中的18个或更多个连续核苷酸具有的序列同一性为至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、96％、97％、98％、99％或100％。“18个或更多个核苷酸”意指一部分，其为由真菌HXT1基因转录的mRNA中至少约18、19、20、21、22、23、24、25、50、100、200、300、400、500、1000、1500或2000个连续碱基或最多至其全长。因此，与真菌HXT1基因具有基本序列同一性的部分的长度通常决定所述dsRNA分子的第一和第二部分的长度。

如本文所用，“互补”核苷酸序列是指这样的两条单链核苷酸序列，按照标准沃森&克里克互补规则在其各自序列的某一连续部分(或基本连续部分)以内的核苷酸碱基是互补的，从而能够在其各自互补部分内彼此配对或杂交。具体地，嘌呤碱基与嘧啶碱基配对，更具体地，鸟嘌呤碱基与胞嘧啶碱基配对(G:C)并且在DNA中腺嘌呤碱基与胸腺嘧啶碱基配对(A:T)，或在RNA中腺嘌呤碱基与尿嘧啶碱基配对(A:U)。应理解，两条多核苷酸即使彼此不是完全互补的，也可彼此配对或杂交，条件是每条多核苷酸至少有一个区域与另一条基本互补，或具有足够数量的互补碱基。如本文所用的，在本发明的上下文中，术语“基本互补”意指两条具有相似长度的多核苷酸(或其部分)的核苷酸序列在它们各自的核苷酸上有至少80％是互补的，即它们在其各自的核苷酸中至少有80％的核苷酸能够与在另一条核苷酸序列的对应位置处的互补核苷酸配对或杂交。优选地，两条多核苷酸的核苷酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多或全部的核苷酸是互补的。或者，“基本互补”意指两条多核苷酸序列可以在高度严格条件下杂交。

按照本发明，dsRNA的第一条链和第二条链，或其第一和第二部分，可以有相同的大小。或者，第一条链的大小可以大于第二条链的大小。例如，第一条链的大小可以大于第二条链的大小约200个核苷酸。在本发明的另一方面，第二条链的大小大于第一条链的大小。

各RNA链的互补部分可以是RNA链的全长，则碱基配对发生在RNA链的全长上，或各RNA链的互补部分可以短于RNA链，则碱基配对仅发生在RNA链的序列互补部分。

在本发明的一个具体实施方案中，所述真菌HXT1基因为锈菌HXT1基因。

因此，本发明提供了一种dsRNA分子，其包含：

i)第一条RNA链，其包含第一部分，所述第一部分具有的核苷酸序列与由真菌HXT1基因转录的mRNA的核苷酸序列中的至少18个连续核苷酸基本相同，和

ii)第二条RNA链，其包含第二部分，所述第二部分具有的核苷酸序列与所述第一条链的第一部分的所述核苷酸序列基本互补，

其中所述真菌HXT1基因为锈菌HXT1基因。

在本发明的上下文中，“锈菌”或“真菌锈菌”意指种系发生的柄锈菌目的植物病原体。因此，“锈菌HXT1基因”为编码HXT1蛋白的基因，并且源自种系发生的柄锈菌目的真菌物种。种系发生的柄锈菌目的示例性物种为豆薯层锈菌、蚕豆单锈胞菌、条形柄锈菌、Puccinia triticina和禾柄锈菌。因此，锈菌HXT1基因为源自(即天然存在于)这些物种之一的基因。根据本发明，优选的锈菌HXT1基因是豆薯层锈菌物种的HXT1基因。

在具体的实施方案中，本发明提供了一种dsRNA，其包含：

i)第一条RNA链，其包含第一部分，所述第一部分具有的核苷酸序列与由真菌锈菌HXT1基因转录的mRNA的核苷酸序列中的至少18个连续核苷酸基本相同，和

ii)第二条RNA链，其包含第二部分，所述第二部分具有的核苷酸序列与所述第一条链的第一部分的所述核苷酸序列基本互补，其中所述真菌锈菌HXT1基因选自：

a)包含SEQ ID NO：1、3、5、7和9所示序列的多核苷酸；

b)编码具有SEQ ID NO：2、4、6、8和10所示序列的多肽的多核苷酸；

c)与具有SEQ ID NO：1、3、5、7和9所示序列的多核苷酸有至少70％序列同一性的多核苷酸；

d)编码与具有SEQ ID NO：2、4、6、8和10所示序列的多肽有至少70％序列同一性的多肽的多核苷酸；

e)在严格条件下与具有SEQ ID NO：1、3、5、7和9所示序列的多核苷酸杂交的多核苷酸；

根据本发明，术语“序列同一性”应理解为一种多肽的氨基酸或一种多核苷酸的核苷酸具有的与另一种多肽的氨基酸或另一种多核苷酸的核苷酸相同的数量，以所考虑的所述多肽或多核苷酸的长度中的氨基酸或核苷酸的总数量的百分比表示。优选通过使用基于全局或局部比对算法的适当序列比对计算机程序，将本发明的多肽或多核苷酸的序列与其他多肽或多核苷酸比较来确定序列同一性。

如果比较不同长度的多肽或多核苷酸，序列同一性的百分比是通过这样的方式确定，即较短序列分别具有的与较长序列共同的氨基酸或核苷酸的数量决定了确定序列同一性的百分比的长度。这些计算机程序通常使用Needleman和Wunsch全局比对算法以在它们的全长范围内比对两条序列，使匹配的数量最大化并且空位的数量最小化。通常使用默认参数，其中空位产生罚分(gap creation penalty)＝10，空位延伸罚分(gap extensionpenalty)＝0.5(对于核苷酸和蛋白质比对)。优选地，通过计算机程序ClustalW确定同一性，该软件已被熟知并且是公众可用的(Thompson et al.,1994,Nucleic Acids Research22,4673-4680)。ClustalW在http://www.ebi.ac.uk/tools/clustalW2/index.html上可公开获得。优选地，使用ClustalW的计算机程序的2.1版来确定本发明的蛋白和其它蛋白之间的同一性。为此，必须设定以下参数：KTUPLE＝1、TOPDIAG＝5、WINDOW＝5、PAIRGAP＝3、GAPOPEN＝10、GAPEXTEND＝0.05、GAPDIST＝8、MAXDIV＝40、MATRIX＝GONNET、ENDGAPS(OFF)、NOPGAP、NOHGAP。

优选地，使用ClustalW计算机程序的2.1版来确定本发明的核酸分子的核苷酸序列和例如其它核酸分子的核苷酸序列之间的同一性。为此，必须设定以下参数：KTUPLE＝2、TOPDIAGS＝4、PAIRGAP＝5、DNAMATRIX:IUB、GAPOPEN＝10、GAPEXT＝5、MAXDIV＝40、转换(TRANSITIONS)：未加权的(unweighted)。

根据本发明，术语“在严格条件下杂交”是指这样的条件：在该条件下，相比于与其他多核苷酸杂交，多核苷酸(通常设计为探针)以可检测的更高程度与另一多核苷酸杂交(例如高于背景至少2倍)。严格的条件是序列依赖性的，并且随环境而不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可以鉴定在序列上与多核苷酸探针100％相同的多核苷酸(同源探测)。或者，可以调整严格条件以允许序列中的一些错配，以便检测具有较低程度序列同一性的多核苷酸(异源探测)。通常，多核苷酸探针的长度小于约1000个核苷酸，长度优选小于500个核苷酸。

通常，选择严格条件为，比在确定的离子强度和pH下特定序列的热解链点(Tm)还低约5℃。Tm为50％的靶序列与完全匹配的探针杂交的温度(在确定的离子强度和pH下)。通常所选择的严格条件为在pH7下盐浓度约为0.02摩尔，温度为至少60℃。降低盐浓度和/或升高温度都使严格性增强。RNA-DNA杂交的严格条件(使用例如100nt的探针的Northern印迹)为例如包括在63℃下于0.2×SSC中洗涤至少一次，时间持续20min的那些条件或等同条件。用于DNA-DNA杂交的严格条件(使用例如100nt的探针的Southern印迹)为例如包括在温度至少50℃、通常约55℃下于0.2×SSC中洗涤至少一次(通常2次)，时间持续20min的那些条件，或等同条件。还参见Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning:A LaboratoryManual,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,和Sambrook and Russell(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3版,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,NY；及Ausubel et al.(1994)Current Protocols in Molecular Biology,CurrentProtocols,USA中的第1和2卷。

严格条件也可以通过添加去稳定剂如甲酰胺来实现。示例性的低严格条件包括在37℃下用30-35％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液杂交，并在50-55℃下于1×至2×SSC(20×SSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)中洗涤。示例性的中等严格条件包括在37℃下于40至45％甲酰胺、1.0M NaCl、1％SDS中杂交，并在55-60℃下在0.5×至1×.SSC中洗涤。示例性的高度严格条件包括在37℃下于50％>甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中杂交，并在60-65℃下于0.1×.SC中洗涤。任选地，洗涤缓冲液可包含约0.1％至约1％SDS。杂交的持续时间通常小于约24小时，常常约4至约12小时。

可以按照本领域技术人员所熟知的现有技术中的常用方法进行杂交(尤其是Sambrook et al.,2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3版,Cold SpringHarbor Laboratory Press,NY)。

在本发明的具体实施方案中，可以预防方式(即还没有出现植物被锈菌感染)或治愈方式(即植物已被锈菌感染)，将dsRNA分子施用于待保护的植物或作物上。本发明因此也涉及包含有效且非植物毒性量的本文定义的dsRNA分子的组合物。

本发明的dsRNA分子可通过经典化学合成或固相DNA合成、通过体外转录来制备，或可以在活体生物体如动物细胞、细菌、酵母或植物中通过异源(即重组)表达来产生(Aalto et al,2007RNA 13:422-429)。

本发明因此涉及产生本文定义的dsRNA分子的转基因生物，优选转基因微生物。

因此，本发明也涉及遗传构建体，其包含至少一种DNA分子以及在5’和任选的在3’位置的异源调控元件，特征在于DNA分子编码能够形成本文定义的dsRNA分子的RNA转录物。本发明也涉及克隆和/或表达载体，特征在于其含有至少一个所述的遗传构建体。

表述“有效且非植物毒性量”是指本发明组合物的量，所述量足以防治或者破坏作物上存在的或易在作物上出现的病原体，且不会使所述作物产生任何明显的植物毒性症状。该量可在宽范围内变化，取决于以下因素：待防治的病原体、作物类型、气候条件和包含在本发明组合物中的化合物。该量可通过在温室或田间进行系统性试验来确定，这是在本领域技术人员的能力范围内。

因此，还提供了一种组合物，该组合物包含：有效且非植物毒性量的如本文定义的dsRNA分子(作为活性成分)以及农业上可接受的担体(support)、载体、填料和/或表面活性剂。

根据本发明，术语“担体”表示天然或合成的有机或无机化合物，其与活性成分即dsRNA组合或联合以使所述活性成分更易于施用到植物上。因此，该担体通常是惰性的，并且应是农业上可接受的。所述担体可以是固体或液体。合适的担体的实例包括粘土、天然或合成的硅酸盐、二氧化硅、树脂、蜡、固体肥料、水、醇类(特别是丁醇)、有机溶剂、矿物油和植物油及其衍生物。也可以使用此类担体的混合物。

根据本发明的组合物也可以包含另外的组分，例如但不限于表面活性剂、保护性胶体、粘合剂、增稠剂、触变剂、渗透剂、稳定剂、螯合剂。更一般而言，所述活性化合物可与符合常用配制技术的任何固体或液体添加剂组合。

通常，本发明的组合物可包含0.05-99重量％的活性成分，优选10-70重量％。

根据本发明的组合物可以各种形式使用，例如气溶胶分散剂、胶囊悬浮剂、冷雾浓缩剂、可撒粉剂、可乳化的浓缩剂、水包油乳液、油包水乳液、包封的颗粒、精细颗粒、种子处理用可流动浓缩剂(flowable concentrate)、气体(加压条件下)、气体发生剂、颗粒、热雾浓缩剂、大颗粒、微颗粒、油可分散性粉剂、油混溶性可流动浓缩剂、油混溶性液体、糊料、植物小棒、干种子处理用粉剂、经农药涂覆的种子、可溶浓缩物、可溶粉剂、种子处理液剂、悬浮浓缩剂(可流动浓缩剂)、超低容量(ULV)液体、超低容量(ULV)悬浮液、水可分散性颗粒或片剂、浆液处理用水可分散粉剂、水溶性颗粒或片剂、种子处理用水溶性粉剂、以及可润湿性粉剂。这些组合物不仅包括通过合适的设备(例如喷雾器或撒粉设备)即可施用至待处理的植物或种子上的组合物，还包括在施用于作物之前必须进行稀释的浓缩型的商业组合物。

根据本发明的dsRNA也可以混以一种或多种其他植物保护化合物或植物生长促进化合物，如杀真菌剂、除草剂、杀虫剂、杀线虫剂、杀螨剂、杀软体动物剂、抗性诱导剂、安全剂、信号化合物、生物品、信息素活性物质或其它具有生物活性的化合物。由此获得的混合物的活性谱更广。与其它杀真菌剂化合物的混合物尤其有益。

根据本发明的另一个具体实施方案，在待保护的植物中引入或产生dsRNA。在引入到植物中之后，dsRNA可通过植物细胞的RNAi加工机制而被进一步加工成所谓的小dsRNA片段(siRNA)，并且随后可以分布于整个植物中，由此保护植物免受真菌锈菌病原体的感染。在真菌细胞摄入更长的dsRNA后，所述引入的dsRNA也可以通过真菌细胞的RNAi加工机制而被加工成siRNA。

或者，通过使用DNA分子或遗传构建体稳定或瞬时遗传转化植物细胞而在植物中产生dsRNA，使得dsRNA以组织、时间、空间或诱导型的方式表达，然后还可以通过植物细胞的RNAi加工机制而被加工成小的dsRNA片段(siRNA)。在真菌细胞摄入更长的dsRNA后，所产生的dsRNA也可以通过真菌细胞的RNAi加工机制而被加工成siRNA。

在被称为病毒诱导基因沉默(VIGS)的方法中，瞬时遗传转化可以使用重组植物病毒来进行。许多VIGS载体可用于诱导植物中重组DNA或RNA分子的瞬时表达(Purkayasthaet al.,2009,Plant Physiol.Biochem.47:967-976)。用于在大豆植物中表达本发明的dsRNA的优选VIGS载体为豆荚斑点病毒(BPMV；Zhang et al.,2010,Plant Physiol.153:52-65)。

因此，本发明也涉及能够在植物细胞内产生本发明的dsRNA的遗传构建体或嵌合基因。所述的遗传构建体或嵌合基因包含至少一种DNA分子以及在5’和任选的在3’位置上的能够在植物中起作用的异源调控元件，特征在于该DNA分子一旦在植物中表达，就能够形成本文定义的dsRNA分子。

在一个具体的实施方案中，所述遗传构建体或嵌合基因包含：

-在植物细胞中起作用的启动子调控元件，其可操作地连接到

-DNA分子，当其被转录时产生RNA分子，所述RNA分子在转录方向上包含具有正义方向上的核苷酸序列的第一部分和具有反义方向上的核苷酸序列的第二部分，所述在正义方向上的第一部分的核苷酸序列由与真菌锈菌HXT1基因转录的mRNA中的至少18个连续核苷酸基本相同的核苷酸序列组成，并且所述在反义方向上的第二部分的核苷酸序列由与所述正义方向上的第一部分的核苷酸序列基本互补(尽管是在反义方向上)的核苷酸序列组成，所述基本互补使得mRNA分子的第一部分和第二部分杂交在一起，从而能够形成dsRNA，和

-任选的终止子调控元件。

因此，所述遗传构建体或嵌合基因包含：

-在植物细胞中起作用的启动子调控元件，其可操作地连接到

-DNA分子，其在转录方向上包含具有正义方向上的核苷酸序列的第一部分和具有反义方向上的核苷酸序列的第二部分，所述在正义方向上的第一部分的核苷酸序列由与真菌锈菌HXT1基因的核苷酸序列中的至少18个连续核苷酸基本相同的核苷酸序列组成，并且所述在反义方向上的第二部分的核苷酸序列由与所述正义方向上的第一部分的核苷酸序列基本互补(尽管是在反义方向上)的核苷酸序列组成，和

-任选的终止子调控元件。

“正义方向”意指，对于待转录的给定DNA分子或给定的RNA分子，其核苷酸序列以5'至3'方向取向。“反义方向”意指核苷酸序列以DNA或RNA分子的3'至5'方向取向。DNA分子通常为双链，在这种DNA分子上待转录的各部分(例如基因的编码序列)均在一条DNA链上具有正义方向上的核苷酸序列，在另一条DNA链上具有反义方向上的互补核苷酸序列。在本发明的上下文中，为使其转录成将要形成dsRNA的RNA而设计的DNA分子在同一链上含有两个基本互补的部分，一个部分在正义方向上并且与其基本互补的部分在反义方向上。因此，由这种DNA分子转录的(单链)RNA是由一条单链组成，所述链包含正义方向上的转录部分和反义方向上的其基本互补部分，因此可以通过自身折叠和基本互补部分的配对而转化为dsRNA。

根据本发明的遗传构建体或嵌合基因的DNA序列可具有几种不同的设计。

根据第一实施方案，DNA分子包含两个核酸部分，一个部分具有正义取向的核苷酸序列，另一个部分具有反义取向的核苷酸序列，它们被间隔子或内含子隔开。具有正义取向的其核苷酸序列的核酸部分与真菌锈菌HXT1基因的核苷酸序列的至少18个连续核苷酸基本相同，具有反义取向的其核苷酸序列的核酸部分与具有正义取向的其核苷酸序列的部分基本互补，并且间隔子或内含子并不与另外两个核酸部分的核苷酸序列表现出任何序列同一性。植物细胞中这种DNA序列的转录产生了对应于“正义/间隔子(或内含子)/反义”构建体的长单链RNA分子。所述长RNA转录物可以通过RT-PCR检测。由于这两个RNA部分的正义和反义核苷酸序列基本上呈序列互补性，因此它们会彼此自然配对或杂交以形成dsRNA，由此该dsRNA为折叠的RNA，并且隔开这两个互补部分的间隔子或内含子RNA序列形成一个环，从而引起所谓的“发夹”型dsRNA的形成。随后通过酶复合物“DICER”将dsRNA降解为小dsRNA(siRNA)，其为具有19-25个碱基大小的小双链RNA。然后将这些siRNA在RNAi酶促机制中加工，以便最终与真菌细胞中真菌HXT1基因的转录mRNA配对，从而导致其降解。但是对于所发生的从植物细胞摄入到真菌细胞，是在该加工的哪一阶段，及因此是何种确切元件(dsRNA、siRNA...)，仍尚未知晓。

根据另一个实施方案，DNA分子包含两个核酸部分，一个部分具有正义取向的核苷酸序列，另一个部分具有反义取向的核苷酸序列，两个序列彼此直接连续(即未被任何间隔子、内含子或其他核酸元件隔开)。具有正义取向的核苷酸序列的核酸部分与真菌锈菌HXT1基因的核苷酸序列的至少18个连续核苷酸基本相同，具有反义取向的核苷酸序列的核酸部分与具有正义取向的核苷酸序列的部分以其中的一部分或更多部分基本互补，两个核酸部分具有不同的长度，并且最长部分的额外部分包含这样的核苷酸序列，该核苷酸序列并不与另一(局部互补)部分的核苷酸序列表现出任何序列互补性。因此，一旦正义取向的部分和反义取向的部分沿着其互补部分杂交时，环结构就会通过最长部分的额外部分形成，所述最长部分的额外部分并不与其他部分表现出任何序列互补性。植物细胞中这种DNA序列的转录产生了对应于“正义/反义”构建体的长单链RNA分子。所述长RNA转录物可以通过RT-PCR检测。由于这两个RNA部分的正义和反义核苷酸序列基本上呈序列互补性，因此它们会彼此自然配对或杂交以形成dsRNA，由此该dsRNA为折叠的RNA，并且与最长部分的额外部分对应的RNA部分形成一个环，从而引起所谓的“发夹”型dsRNA的形成。随后通过酶复合物“DICER”将dsRNA降解为小dsRNA(siRNA)，其为具有19-25个碱基大小的小双链RNA。然后将这些siRNA在RNAi酶促机制中加工，以便最终与真菌细胞中真菌HXT1基因的转录mRNA配对，从而导致其降解。但是对于所发生的从植物细胞摄入到真菌细胞，是在该加工的哪一阶段，及因此是何种确切元件(dsRNA、siRNA...)，仍尚未知晓。

根据另一个实施方案，所述遗传构建体包含：

-在植物细胞中起作用的两个启动子调控序列，其中第一启动子调控序列可操作地连接到第一DNA分子，当其转录时产生的第一RNA分子至少包含正义方向上的第一核酸部分，以及第二启动子调控序列可操作地连接到第二DNA分子，当其转录时产生的第二RNA分子至少包含反义方向上的第二核酸部分，所述第二核酸部分与第一核酸部分基本互补，并且其中所述正义方向上的第一核酸部分包含的核苷酸序列与真菌锈菌HXT1基因转录的mRNA的核苷酸序列中的至少18个连续核苷酸基本相同，和

-任选的终止子调控序列。

在该具体实施方案中，所述遗传构建体可包含两个嵌合基因，一个嵌合基因包含可操作地连接到第一DNA分子的第一启动子调控序列和任选的终止子调控序列，当所述第一DNA分子转录时产生的第一RNA分子至少包含正义方向上的第一核酸部分，所述正义方向上的第一核酸部分与真菌锈菌HXT1基因转录的mRNA中的至少18个连续核苷酸基本相同；第二个嵌合基因包含可操作地连接到第二DNA分子的第二启动子调控序列和任选的终止子调控序列，当所述第二DNA分子转录时产生的第二RNA分子至少包含反义方向上的第二核酸部分，所述反义方向上的第二核酸部分与所述正义方向上的第一核酸部分基本互补。

将这两个嵌合基因优选(但不是必须)共同引入植物细胞中，以优化两条RNA单链杂交形成dsRNA。

当使用两个启动子调控序列来设计遗传构建体时，第一和第二启动子调控序列可是不同的或相同的，优选是不同的。

本发明还涉及用于转化植物的克隆和/或表达载体，特征在于其含有至少一个本文定义的嵌合基因和遗传构建体。

本发明还涉及一种转基因植物细胞，其包含本发明的DNA分子或遗传构建体，从而表达如本文定义的本发明的dsRNA分子。

在可应用本发明的植物中，可提及的主要田间作物为例如玉米(Zea mays)、大豆(Glycine max)、棉花(陆地棉(Gossypium hirsutum))、芸苔属油菜(Brassica oilseeds)，例如甘蓝型油菜(Brassica napus)(例如油菜(canola))，芜青(Brassica rapa)，褐芥菜(B.juncea)(例如芥末)和埃塞俄比亚芥(Brassica carinata)、稻(水稻(Oryza sativa))、小麦(小麦属种(Triticum ssp.)，特别是普通小麦(Triticum aestivum))、甜菜(饲用甜菜(Beta vulgaris))、甘蔗(糖蔗(Saccharum Officinarum))、燕麦(燕麦(Avena sativa))、黑麦(黑麦(Secale cereale))、大麦(大麦(Hordeum vulgare))、小米、黑小麦、亚麻、藤本植物和以下各种植物类群的各种水果和蔬菜，例如蔷薇科种(Rosaceae sp.)(例如，仁果类水果，如苹果和梨，还有核果，如杏、樱桃、扁桃和桃子，浆果类水果，如草莓)、茶蔗子科种(Ribesioidae sp.)、胡桃科种(Juglandaceae sp.)、桦木科种(Betulaceae sp.)、漆树科种(Anacardiaceae sp.)、山毛榉科种(Fagaceae sp.)、桑科种(Moraceae sp.)、木犀科种(Oleaceae sp.)、猕猴桃科种(Actinidaceae sp.)、樟科种(Lauraceae sp.)、芭蕉科种(Musaceae sp.)(例如香蕉树和种植物)、茜草科种(Rubiaceae sp.)(例如咖啡豆)、山茶科种(Theaceae sp.)、梧桐科种(Sterculiceae sp.)、芸香科种(Rutaceae sp.)(例如柠檬、橙子和葡萄柚)；茄科种(Solanaceae sp.)(例如，西红柿、土豆、辣椒、茄子)、百合科种(Liliaceae sp.)、菊科种(Compositiae sp.)(例如莴苣、朝鲜蓟和菊苣，包括根菊苣、苦苣和常见菊苣)、伞形科种(Umbelliferae sp.)(例如胡萝卜、香菜、芹菜和块根芹菜)、葫芦科种(Cucurbitaceae sp.)(例如黄瓜，包括腌黄瓜、南瓜、西瓜、葫芦和甜瓜)、葱科种(Alliaceae sp.)(例如洋葱和韭菜)、十字花科种(Cruciferae sp.)(例如白球甘蓝、红球甘蓝、西兰花、菜花、抱子甘蓝、小唐菜、甘蓝、萝卜、辣根、水芹、大白菜)、豆科种(Leguminosae sp.)(例如花生、豌豆和豆类，例如攀爬豆类(climbing beans)和蚕豆)、藜科种(Chenopodiaceae sp.)(例如饲用甜菜(mangold)、莙荙菜(spinach beet)、菠菜、甜菜根)；锦葵科种(Malvaceae)(例如秋葵)、天门冬科(Asparagaceae)(例如芦笋)、园艺作物和森林作物；观赏植物；以及这些作物的遗传修饰的同系物。可应用本发明的确切植物为易于受包含本发明的HXT1基因及如本文所定义的真菌，优选锈菌感染的植物。

应用本发明的优选植物为大豆植物。因此，在本发明的一个具体实施方案中，所述转基因植物细胞为大豆植物细胞。

本发明也涉及转基因植物、种子或其部分，其包含根据本发明的转基因植物细胞。

在本发明的一个具体实施方式中，转基因植物、种子或其部分是大豆植物、种子或其部分。

术语“嵌合基因”、“遗传构建体”或“表达盒”通常意欲指包含基因的基本元件(即启动子、编码序列和终止子)的人造基因，所述元件来自自然界中存在的至少两种不同基因和/或来自至少两种不同生物的相同基因(即，编码具有相同功能的蛋白质)。典型的“嵌合基因”、“遗传构建体”或“表达盒”包含在转录方向上彼此功能性相连的下述序列：在植物细胞中起作用的启动子调控序列、能够转录为RNA的DNA序列、以及任选地在植物细胞中起作用的终止子。

表述“嵌合基因”、“遗传构建体”或“表达盒”也可包括编码蛋白质或mRNA的序列，所述序列不直接连接启动子调控序列，但例如属于含有在同一启动子调控序列的控制下的数个编码序列的多顺反子构建体的部分。在此情况下，将所述在启动子调控序列的控制下的各编码序列设计为“嵌合基因”或“表达盒”。

根据本发明，表达“彼此功能性连接”意指所述嵌合基因的遗传元件彼此相连以使它们的功能协调且能表达编码序列。例如，当能确保所述编码序列表达时——即将其转录为RNA，无论是mRNA(然后编码蛋白质)还是其他类型的RNA(例如dsRNA)——启动子就与编码序列功能性连接。可用本领域技术人员熟知的技术，特别是Sambrook et al.(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress,NY)中记载的那些，进行本发明的嵌合基因的构建及其各元件的组装。组成此嵌合基因的调控元件的选择基本上取决于它们必须在其中起作用的植物和细胞的类型，本领域技术人员有能力选择在给定植物中起作用的调控元件。

本发明的嵌合基因可含有的启动子可能是组成型或诱导型、空间或时间调控的启动子。

可用于本发明的嵌合基因中的组成型启动子，可提及的为，例如细菌启动子，如章鱼碱合成酶基因的启动子或胭脂氨酸合酶基因的启动子(Sanders et al.,1987,Nucl.Acids Res.15:1543-1548)，病毒启动子，例如花椰菜花叶病毒的19S或35S RNA的基因控制转录启动子(CaMV；Lawton et al.,1987,Plant Mol.Biol.9:315-324；Odell etal.,1985,Nature,313:810-812)或木薯叶脉花叶病毒启动子(CsVMV；如专利申请WO97/48819中所述)。在植物来源的启动子中，可提及的核酮糖二羧化酶/加氧酶(RuBisCO)小亚基基因的启动子，如申请EP 0 507 698中所述的组蛋白基因的启动子，或水稻肌动蛋白基因的启动子(Wang et al.,1992,Mol.Cell.Biol.,12:3399-3406；US 5,641,876)。

可用于本发明的嵌合基因中的诱导型启动子，可提及的为，例如编码生长素结合蛋白的基因的启动子(Schwob et al.,1993,Plant J.4:423-432)，编码UDP-葡萄糖黄酮糖基转移酶的基因的启动子(Ralston et al.,1988,Genet.,119:185-197)，编码MIP蛋白酶抑制剂的基因的启动子(Cordero et al.,1994,Plant J.,6:141-150)或编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的基因的启动子(Martinez et al.,1989,J.Mol.Biol.,208:551-565；Quigleyet al.,1989,J.Mol.Evol.,29:412-421；Kohler et al.,1995,Plant Mol.Biol.,29:1293-1298)。

可用于本发明的嵌合基因中的组织特异性启动子，可提及的为，例如根特异性启动子，例如专利申请WO 00/29594中所记载的；花特异性启动子，如专利申请WO 98/22593、WO 99/15679或WO 99/43818中所记载的那些，或果实特异性启动子，特别是种子特异性启动子，如专利申请WO 91/13993、WO 92/17580、WO 98/45460、WO 98/45461或WO 99/16890中所记载的那些。

术语“终止子调控序列”旨在意指在植物细胞或植物中起作用的任意序列，也包含聚腺苷酸化序列，无论它们是细菌来源，例如根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的nos或ocs终止子，或是病毒来源，例如CaMV 35S终止子，或是植物来源，例如在申请EP0633317中记载的组蛋白终止子。

可以根据本发明的构建体或用于细胞或植物的转化并且包含所述构建体的质粒中存在的选择性标记基因来进行选择步骤以鉴定已整合有本发明构建体的转化细胞和/或植物。选择性标记基因可以是在转录方向功能性连接有以下元件的嵌合基因的形式：在植物细胞中起作用的启动子调控序列，编码选择性标记的序列，和在植物细胞中起作用的终止子调控序列。

在可以使用的选择性标记物中，可提及的为，含有抗生素抗性基因的标记物，例如潮霉素磷酸转移酶基因的标记物(Gritz et al.,1983,Gene 25:179-188)、诱导对卡那霉素抗性的新霉素磷酸转移酶II基因的标记物(Wirtz et al.,1987,DNA,6:245-253)或氨基糖苷3”-腺苷转移酶基因的标记物，但也包含含有除草剂耐受基因的标记物，如耐受双丙氨磷的bar基因(White et al.,1990,Nucl.Acids Res.18:1062)、耐受草甘膦的EPSPS基因(US 5,188,642)或耐受异噁唑类的HPPD基因(WO 96/38567)。还可提及的为编码易于辨识的酶(如GUS酶、GFP蛋白)的基因或在转化的细胞中编码调控色素产生的色素或酶的基因。这样的标记基因具体记载于专利申请WO 91/02071、WO 95/06128、WO 96/38567和WO 97/04103中。

本发明还涉及制备能够表达引发对真菌锈菌HXT1基因抑制的dsRNA的转基因植物细胞或植物的方法，其中所述方法包括用本发明的嵌合基因或遗传构建体转化植物细胞的步骤。

该方法还包括选择已经转化的植物细胞的步骤。

在本发明的一个具体实施方案中，本发明涉及制备能够表达如根据本发明所述的dsRNA的转基因植物细胞或植物的方法，其中所述方法包含利用本发明的嵌合基因或遗传构建体转化植物细胞的步骤。优选地，所述植物细胞为大豆植物细胞或者所述植物为大豆植物。

为得到本发明的细胞或植物，本领域技术人员可使用大量已知转化方法中的一种。

这些方法中的一种包括使待转化的宿主生物体的细胞或组织与聚乙二醇(PEG)和本发明的载体接触(Chang和Cohen,1979,Mol.Gen.Genet.168:111-115；Mercenier和Chassy,1988,Biochimie 70:503-517)。另一种方法是电穿孔，包括将待转化细胞或组织与本发明的载体置于电场中(Andreason和Evans,1988,Biotechniques 6:650-660；Shigekawa和Dower,1989,Aust.J.Biotechnol.3:56-62)。另一方法包括将所述载体通过显微注射直接注入细胞或组织(Gordon和Ruddle,1985,Gene 33:121-136)。有利地，可以使用“生物射弹”方法。其包含在用吸附有本发明载体的颗粒轰击细胞或组织(Bruce et al.,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:9692-9696；Klein et al.,1992,Biotechnology 10:286-291；US4,945,050)。优选地，可以使用土壤杆菌属(Agrobacterium)的细菌进行植物细胞或组织的转化，优选通过用根癌土壤杆菌(A.tumefaciens)(Knopf,1979,Subcell.Biochem.6:143-173；Shaw et al.,1983,Gene 23:315-330)或毛根土壤杆菌(A.rhizogenes)(Bevan和Chilton,1982,Annu.Rev.Genet.16:357-384；Tepfer和Casse-Delbart,1987,Microbiol.Sci.4:24-28)来感染所述植物的细胞或组织。优选地，按照由Hiei et al.(1994,Plant J.6:271-282)所记载的方案来用根癌土壤杆菌转化植物细胞或组织。本领域技术人员会根据待转化的宿主生物体的性质来选择合适的方法。

本发明的植物含有上述的转化的植物细胞。具体地，可以通过上述转化的植物细胞的再生得到转化的植物。通过任何合适的方法而获得再生，其取决于植物物种的性质。

本发明还涉及转化植物或其部分，以及通过栽培和/或杂交上述再生植物而得到的植物或其部分，并且涉及转化植物的种子。

本发明还涉及由本发明的植物、其部分或种子获得的最终产品例如粕(meal)、油或纤维。

本发明也包括这些植物的部分，以及这些植物的后代。术语“这些植物的部分”旨在意指这些植物的任何器官，不论是地面上或地面下。地面上的器官有：茎、叶和包括雄性和雌性生殖器的花。地面下的器官主要是根，但其也可以是块茎。术语“后代”主要旨在意指含本发明的植物互相繁殖所产生胚胎的种子。术语“后代”可扩大到由本发明的转化植物之间杂交或与之杂交而产生的每一个新一代所形成的所有种子。后代和种子也可通过所述转化植物的无性繁殖获得。本发明的种子可用农用化学组合物包衣，该农用化学组合物包含至少一种具有选自杀真菌剂、除草剂、杀虫剂、杀线虫剂、杀菌剂或杀病毒剂活性的活性的有效产品。

本发明还涉及防治植物病原体的方法，包括向所述病原体提供根据本发明的并且如本文所定义的dsRNA分子，或包含所述dsRNA的组合物。优选地，所述植物病原体为真菌锈菌。

在本发明的上下文中，真菌锈菌特别是分类的柄锈菌目的真菌，更具体地为柄锈菌属，优选禾柄锈菌、条形柄锈菌或Puccinia triticina，或单胞锈菌属，优选菜豆单胞锈菌或疣顶单胞锈菌，或者层锈菌属(Phakopsora)，优选豆薯层锈菌。

本发明还包括植物、优选作物植物的处理方法，特征在于将有效且非植物毒性量的本发明dsRNA分子或本发明组合物施用于植物生长或能够生长的土壤中、植物的叶和/或植物果实或所述植物的种子上。

本发明还涉及防治植物、作物或种子病原体，尤其是真菌锈菌的方法，其特征在于将农艺学上有效且非植物毒性量的本发明dsRNA分子或本发明组合物施用于植物生长或能够生长的土壤中、植物的叶和/或植物果实或所述植物的种子上。

在本发明的上下文中，可以种子处理、叶部施用、茎部施用、浸透或滴灌施用(化学灌溉)的方式施用于种子、植物或植物果实，或已种植或想要在其中种植植物的土壤或惰性基质(例如无机基质，如砂、石棉、玻璃棉；膨胀矿物质，例如珍珠岩、蛭石、沸石或膨胀粘土)、浮石、火成碎屑物质或材料、合成的有机基质(例如聚氨酯)、有机基质(例如泥炭、堆肥、树木废产物(例如椰壳、木纤维或木屑、树皮))或液体基质(例如浮动水培系统、营养液膜技术、气栽体系)。

本发明因此涉及防治植物病原体，尤其是真菌锈菌的方法，其特征在于将有效且非植物毒性量的本发明dsRNA分子或本发明组合物施用于植物生长或能够生长的土壤中、植物的叶和/或植物果实或所述植物的种子上。

出于本发明的目的，作为本发明主题的农合物可通过如下的各种处理方法施用于植物：

·向所述植物的地上部分喷涂包含一种所述组合物的液体，

·在所述植物周围采用喷粉、向土壤中掺入颗粒或粉末、喷雾方式，

并且在所述植物是树木的情况下采用注射或涂抹方式，

·借助包含一种所述组合物的植物保护混合物，对所述植物的种子进行涂覆或膜涂覆。

根据本发明的方法可是治愈、预防或根除的方法。

本发明处理方法中常施用的活性dsRNA化合物的剂量通常且有利地为：

·对于叶部处理：0.0001-10,000g/ha，优选0.0001-1,000g/ha，更优选为0.001-300g/ha；在浸透或滴灌施用的情况下，所述剂量甚至可减少，尤其是当使用惰性基质(例如石棉或珍珠岩)时；

·对于种子处理：0.0001-200g/100kg种子，优选0.001-150g/100kg种子；

·对于土壤处理：0.0001-10,000g/ha，优选0.001-5,000g/ha。

本文所示的剂量是作为本发明方法的说明性实例给出。本领域技术人员知道如何根据待处理植物或作物的性质调节施用剂量。

在具体条件下，例如根据待处理或防治的病原体的性质，较低剂量可提供足够的保护。某些气候条件、抗性或其它因素如病原体的性质或例如植物受到这些病原体侵染的程度可能要求更高剂量的组合活性成分。最佳剂量通常取决于若干因素，例如待处理的病原体的类型，受侵染植物或植物材料的类型或发育水平，植被密度或者施用方法。

本发明的dsRNA可与另一种植物保护化合物或植物生长促进化合物混合使用，所述植物保护化合物或植物生长促进化合物以常用的剂量使用。

所述植物保护化合物或植物生长促进化合物可以是杀真菌剂、除草剂、杀虫剂、杀线虫剂、杀螨剂、杀软体动物剂、抗性诱导剂、安全剂或生物学化合物或其他具有作物保护活性的化合物。

本发明的处理方法还可用于处理繁殖材料(如块茎或根茎等)，以及种子、幼苗或移植幼苗以及植物或移植植物。该处理方法也可用于处理根。本发明的处理方法也可用于处理植物的地上部分，例如有关植物的树干、茎或梗、叶、花和果实，以及通常易受真菌感染的各材料(例如，由于储存，如干草)。

本发明还涉及抑制植物病原体，尤其是真菌锈菌，HXT1基因表达的方法，包括以下步骤：

i)用本发明的嵌合基因转化植物细胞；

ii)将由此转化的细胞，或由此再生的任何植物，置于允许所述嵌合基因转录的条件下，

iii)将所述细胞或植物与病原体接触。

根据本发明，可处理所有植物和植物部分。植物是指所有的植物和植物群体，例如想要的和不想要的野生植物、栽培植物和植物品种(无论是否被植物品种或植物培育者权利保护)。栽培植物和植物品种可为通过常规繁殖和育种方法获得的植物，所述方法可辅助或补充以一种或多种以下生物技术方法，例如：通过使用双单倍体、原生质体融合、随机和定向诱变、分子或遗传标记或利用生物工程和遗传工程方法。“植物部分”是指所有地上和地下部分以及植物的器官，例如芽、叶、花和根，其中列出例如叶、针状叶、茎干、树枝、花、果实体、果实和种子以及根、球茎和根状茎。作物以及无性和有性繁殖材料(例如插枝、球茎、根状茎、长匐茎和种子)也属于植物部分。

本发明的处理方法可用于处理经遗传改造的有机体(GMOs)，例如植物或种子。经遗传改造的植物(或转基因植物)是已有异源基因稳定整合入基因组中的植物。表述“异源基因”主要意指如下基因，其在植物外部提供或组装并且当被引入细胞核、叶绿体或线粒体基因组中时，通过表达目的蛋白或多肽或通过下调或沉默植物中存在的其它基因(使用例如反义技术、共抑制技术或RNA干扰-RNAi-技术或微RNA-miRNA-技术)来赋予经转化的植物新的或改进的农艺学性质或其它性质。位于基因组中的异源基因也称作转基因。由植物基因组中的特定位置定义的转基因称作转化或转基因事件。

根据植物物种或植物栽培种、其位置和生长条件(土壤、气候、生长期、营养)，本发明的处理还可产生超叠加(“协同”)效果。因此，例如，本发明可使用的活性化合物和组合物的施用比率减少和/或活性谱拓宽和/或活性提高、植物生长更好、对高温或低温的耐受性增加、对干旱或对水或土壤含盐量的耐受性提高、开花性能提高、采收更容易、成熟加速、采收产量更高、果实更大、植物高度更高、叶子颜色更绿、开花更早、采收的产物的品质更高和/或营养价值更高、果实中的糖浓度更高、收获的产物的储存稳定性和/或加工性能更好都是可能的，其超过实际预期的效果。

在某些施用率下，本发明的活性化合物结合物还可在植物中具有强化效果。因此，它们还可适用于调动植物防御系统抵抗不希望的微生物的攻击。这可能(如果合适)是本发明结合物的活性(例如抵抗真菌)增强的原因之一。在本发明的上下文中，植物加强(抗性诱导)物质应理解为意指能刺激植物的防御系统的那些物质或物质的结合物，其刺激方式使被处理的植物在随后被接种不想要的微生物时对这些微生物表现出明显的抵抗性。在此情况中，不想要的微生物应理解为意指植物病原真菌、细菌和病毒。因此，本发明的物质可用于保护植物，使其在经过所述处理后的一段时间内能抵抗上述病原体的攻击。在使用活性化合物处理植物后，实现保护的这段时间通常为1-10天，优选1-7天。

本发明优选的待处理的植物和植物栽培种包括具有赋予这些植物特别有利、有用性状的遗传材料(无论通过育种和/或生物技术方式获得)的所有植物。

本发明还优选的待处理的植物和植物栽培种对一种或多种生物胁迫具有抗性，即所述植物对于动物和微生物虫害显示出良好的防御性，例如对抗线虫、昆虫、螨虫、植物病原性真菌、细菌、病毒和/或类病毒。

抗线虫或昆虫的植物的实例记载于例如美国专利申请11/765,491、11/765,494、10/926,819、10/782,020、12/032,479、10/783,417、10/782,096、11/657,964、12/192,904、11/396,808、12/166,253、12/166,239、12/166,124、12/166,209、11/762,886、12/364,335、11/763,947、12/252,453、12/209,354、12/491,396、12/497,221、12/644,632、12/646,004、12/701,058、12/718,059、12/721,595、12/638,591中。

本发明的待处理的植物和植物品种还可以是对一种或多种非生物胁迫具有抗性的那些植物。非生物胁迫条件可包括，例如，干旱、低温暴露、热暴露、渗透胁迫、水淹、土壤盐度增加、矿物质暴露增加、臭氧暴露、强光暴露、限制性供应氮营养素、限制性供应磷营养素、避荫。

本发明的待处理的植物和植物栽培种还可以是特征为产量增加的那些植物。所述植物中的产量增加的原因可以是，例如，经改善的植物生理学、生长和发育(例如水利用效率、持水效率)、经改善的氮利用、增强的碳同化、经改善的光合作用、提高的发芽效率和加速成熟。产量还可受经改善的植物结构(在胁迫和非胁迫条件下)影响，其包括但不限于，早开花、对杂交种子生产的开花控制，幼苗活力、植物大小、节间数量及距离、根生长、种子大小、果实大小、豆荚大小、豆荚或穗数量、每穗或豆荚的种子数量、种子质量(seed mass)、提高的种子填充、减少的种子分散、减少的豆荚开裂和耐倒伏性。其它产量特性包括种子组成，例如碳水化合物含量、蛋白质含量、油含量及组成、营养价值、抗营养化合物的减少、经改善的加工性和更好的贮备稳定性。

本发明可处理的植物是如下的杂交植物，其已经表达出杂种优势或杂交活力的特征，从而通常得到更高产量、活力、健康和对生物和非生物胁迫的抗性。此类植物通常通过近交雄性不育亲本(雌性亲本)与另一近交雄性可育亲本(雄性亲本)杂交获得。杂交种子通常从雄性不育植物收获并出售给种植者。雄性不育植物有时可(例如在玉米中)通过去雄产生，即机械去除雄性生殖器官(或雄花)，但更通常地，雄性不育是由植物基因组中的遗传决定簇产生。在这种情况下，以及特别是当种子是从杂交植物收获的所需产物时，确保杂交植物中的雄性能育性得以完全恢复通常是有用的。这可通过确保雄性亲本具有合适的能育性恢复基因来实现，所述能育性恢复基因能够恢复包含造成雄性不育的遗传决定簇的杂交植物中的雄性能育性。雄性不育的遗传决定簇可位于细胞质中。例如，细胞质雄性不育(CMS)的实例为例如在芸苔属(Brassica)物种中所记载的(WO 92/05251、WO 95/09910、WO 98/27806、WO 05/002324、WO 06/021972和US 6,229,072)。然而，雄性不育的遗传决定簇也可位于细胞核基因组中。雄性不育植物也可由植物生物技术方法(例如基因工程)获得。WO89/10396中记载了获得雄性不育植物的特别有用的方法，其中，例如核糖核酸酶(例如芽孢杆菌RNA酶)在雄蕊的绒毡层细胞中选择性地表达。然后能育性可通过在绒毡层细胞中表达核糖核酸酶抑制剂(例如芽胞杆菌RNA酶抑制剂)来得到恢复(例如WO91/02069)。

本发明可处理的植物或植物栽培种(由植物生物技术方法如通过基因工程获得)是除草剂耐受植物，即对一种或多种给定的除草剂具有耐受性的植物。这些植物可通过遗传转化获得，或通过选择包含赋予这种除草剂耐受性的突变的植物获得。

抗除草剂植物为例如耐草甘膦植物，即对除草剂草甘膦或其盐具有耐受性的植物。可通过不同的方法使植物对草甘膦具有耐受性。例如，草甘膦耐受性植物可通过用5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)的编码基因转化植物来获得。这些EPSPS基因的实例为鼠伤寒沙门菌(Salmonellaty phimurium)的AroA基因(突变体CT7)(Comai et al.,1983,Science 221:370-371)、农杆菌属种(Agrobacterium sp.)的CP4基因(Barry etal.,1992,Curr.Topics Plant Physiol.7:139-145)、编码牵牛花EPSPS的基因(Shah etal.,1986,Science,233:478-481)、编码番茄EPSPS的基因(Gasser et al.,1988,J.Biol.Chem.263:4280-4289)或编码牛筋草(Eleusine)EPSPS的基因(WO 01/66704)。还可为突变的EPSPS，如在例如EP 0837944、WO 00/66746、WO 00/66747或WO 02/26995中所述。草甘膦耐受性植物还可通过表达编码草甘膦氧化还原酶的基因来获得，如US 5,776,760和US 5,463,175中所述。草甘膦耐受性植物还可通过表达编码草甘膦乙酰基转移酶的基因来获得，在例如WO 02/036782、WO 03/092360、WO 2005/012515和WO 2007/024782中所述。耐草甘膦植物还可通过选择包含上述基因的天然存在的突变的植物来获得，如在例如WO 01/024615或WO 03/013226中所述。表达赋予草甘膦耐受性的EPSPS基因的植物记载于例如美国专利申请11/517,991、10/739,610、12/139,408、12/352,532、11/312,866、11/315,678、12/421,292、11/400,598、11/651,752、11/681,285、11/605,824、12/468,205、11/760,570、11/762,526、11/769,327、11/769,255、11/943801或12/362,774中。包含能赋予草甘膦耐受性的其它基因(例如脱羧酶基因)的植物记载于例如美国专利申请11/588,811、11/185,342、12/364,724、11/185,560或12/423,926中。

其它除草剂耐受性植物为例如对抑制酶谷氨酰胺合成酶的除草剂(例如双丙氨磷、草胺膦或草丁膦)具有耐受性的植物。这些植物可通过表达解除所述除草剂的毒性的酶或抵抗抑制的突变谷氨酰胺合成酶来获得，在例如美国专利申请11/760,602中所述。一种此类有效的解毒酶为编码草胺膦乙酰基转移酶的酶(例如链霉菌属(Streptomyces)物种的bar或pat蛋白)。表达外源草胺膦乙酰基转移酶的植物记载于例如美国专利5,561,236、5,648,477、5,646,024、5,273,894、5,637,489、5,276,268、5,739,082、5,908,810和7,112,665中。

其它除草剂耐受性植物还有对抑制羟基苯基丙酮酸双氧化酶(HPPD)的除草剂具有耐受性的植物。HPPD是一种针对对羟基苯丙酮酸(HPP)转化成尿黑酸盐的反应进行催化的酶。耐受HPPD抑制剂的植物可使用编码天然存在的抗HPPD酶的基因，或编码突变或嵌合HPPD酶的基因来转化，如WO 96/38567、WO 99/24585、WO 99/24586、WO 09/144079、WO 02/046387或US 6,768,044中所述。对HPPD抑制剂的耐受性还可通过用编码某些能够形成尿黑酸盐的酶的基因转化植物来获得，尽管HPPD抑制剂可抑制天然HPPD酶。WO 99/34008和WO02/36787中记载了此类植物和基因。植物对HPPD抑制剂的耐受性还可通过用编码具有预苯酸脱氢酶(PDH)活性的酶的基因联同编码耐HPPD酶的基因来转化植物以改进，如WO 04/024928中所述。另外，通过向其基因组添加编码能够代谢或降解HPPD抑制剂的酶(例如CYP450酶，如WO 2007/103567和WO 2008/150473中所述)的基因可使植物更耐受HPPD抑制剂除草剂。

对除草剂具有抗性的其它植物是对乙酰乳酸合酶(ALS)抑制剂具有耐受性的植物。已知的ALS抑制剂包括，例如磺酰脲、咪唑并啉酮、三唑并嘧啶、嘧啶氧基(硫基)苯甲酸酯/盐、和/或磺酰基氨基羰基三唑啉酮除草剂。已知ALS酶(也称作乙酰羟基酸合酶，AHAS)中的不同突变会赋予对不同除草剂和除草剂组的耐受性，如例如Tranel和Wright(2002,Weed Science 50:700-712)，以及美国专利5,605,011、5,378,824、5,141,870和5,013,659中所述。耐磺酰脲植物和耐咪唑并啉酮植物的生产记载于美国专利5,605,011、5,013,659、5,141,870、5,767,361、5,731,180、5,304,732、4,761,373、5,331,107、5,928,937和5,378,824、以及WO 96/33270中。其它耐咪唑并啉酮的植物还记载于例如WO 2004/040012、WO2004/106529、WO 2005/020673、WO 2005/093093、WO 2006/007373、WO 2006/015376、WO2006/024351和WO 2006/060634中。其它耐磺酰脲和耐咪唑并啉酮的植物还记载于例如WO2007/024782和美国专利申请61/288958中。

其它咪唑并啉酮和/或磺酰脲耐受性植物可通过诱导突变、在存在除草剂的情况下选择细胞培养物或突变育种来获得，如例如US 5,084,082(对于大豆)、WO 97/41218(对于水稻)、US 5,773,702和WO 99/057965(对于甜菜)、US 5,198,599(对于莴苣)、或WO 01/065922(对于向日葵)中所述。

本发明还可处理的植物或植物栽培种(由植物生物技术方法如基因工程获得)为昆虫抗性转基因植物，即抵抗某些目标昆虫的攻击的植物。这些植物可通过遗传转化，或通过选择包含赋予该昆虫抗性的突变的植物来获得。

本文中所用的“昆虫抗性转基因植物”包括含有至少一种转基因的任何植物，所述转基因包含编码如下物质的编码序列：

1)来自苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)的杀虫晶体蛋白或其杀虫部分，例如Crickmore等(1998，Microbiology and Molecular Biology Reviews，62，807-813)列出的杀虫晶体蛋白(由Crickmore等的“苏云金芽孢杆菌毒素命名”(2014)进行了更新，http://www.btnomenclature.info/)，或其杀虫部分，例如Cry蛋白类的蛋白Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1B、Cry1C、Cry1D、Cry1F、Cry2Ab、Cry3Aa或Cry3Bb或其杀虫部分(例如，EP-A 1999 141和WO 2007/107302)，或者由合成基因编码的这类蛋白，例如记载于美国专利申请12/249,016中；或

2)来自苏云金芽孢杆菌的晶体蛋白或其部分，其在来自苏云金芽孢杆菌的第二其它晶体蛋白或其部分存在下具有杀虫性，例如由Cry34和Cry35晶体蛋白组成的二元毒素(Moellenbeck et al.,2001,Nat.Biotechnol.19:668-672；Ping et al.,2006,AppliedEnvironm.Microbiol.71:1765-1774)或由Cry1A或Cry1F蛋白和Cry2Aa或Cry2Ab或Cry2Ae蛋白组成的二元毒素(美国专利申请12/214,022和EP-A 2 300 618)；或3)包含来自苏云金芽孢杆菌的不同杀虫晶体蛋白部分的杂合杀虫蛋白，例如上述1)的蛋白的杂合子或上述2)的蛋白的杂合子，例如由玉米事件MON89034产生的Cry1A.105蛋白(WO 2007/027777)；或

4)上述1)至3)中任一项的蛋白，其中一些(特别是1-10个)氨基酸被另一种氨基酸替换以获得对目标昆虫物种的更高杀虫活性，和/或扩展受影响的目标昆虫物种的范围，和/或由于在克隆或转化过程中在编码DNA中引入的改变，例如玉米事件MON863或MON88017中的Cry3Bb1蛋白，或玉米事件MIR604中的Cry3A蛋白；或

5)来自苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)或蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)的杀虫分泌蛋白，或其杀虫部分，例如在http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/vip.html中所列的营养期杀虫(VIP)蛋白，例如来自VIP3Aa蛋白类的蛋白；或

6)来自苏云金芽孢杆菌或蜡样芽孢杆菌的分泌蛋白，该蛋白在来自苏云金芽孢杆菌或蜡样芽孢杆菌的第二分泌蛋白存在下具有杀虫性，例如由VIP1A和VIP2A蛋白组成的二元毒素(WO 94/21795)；或

7)包含来自苏云金芽孢杆菌或蜡样芽孢杆菌的不同分泌蛋白的多个部分的杂合杀虫蛋白，例如上述1)中蛋白的杂合子或上述2)中蛋白的杂合子；或

8)上述5)至7)中任一项的蛋白，其中一些(特别是1-10个)氨基酸被另一种氨基酸替换以获得对目标昆虫物种的更高杀虫活性，和/或扩展受影响的目标昆虫物种的范围，和/或由于在克隆或转化过程中在编码DNA中引入的改变(同时仍编码杀虫蛋白)，例如玉米事件COT102中的VIP3Aa蛋白；或

9)来自苏云金芽孢杆菌或蜡样芽孢杆菌的分泌蛋白，该蛋白在来自苏云金芽孢杆菌的晶体蛋白存在下具有杀虫性，例如由VIP3和Cry1A或Cry1F组成的二元毒素(美国专利申请61/126083和61/195019)，或由VIP3蛋白和Cry2Aa或Cry2Ab或Cry2Ae蛋白组成的二元毒素(美国专利申请12/214,022和EP-A 2 300 618)。

10)上述9)的蛋白，其中一些(特别是1-10个)氨基酸被另一种氨基酸替换以获得对目标昆虫物种的更高杀虫活性，和/或扩展受影响的目标昆虫物种的范围，和/或由于在克隆或转化过程中在编码DNA中引入的改变(同时仍编码杀虫蛋白)。

当然，如本文所用，昆虫抗性转基因植物还包括包含编码上述1-10类中任一种蛋白的基因的组合的任意植物。在一种实施方案中，昆虫抗性植物包含超过一种编码上述1-10类中的任一种蛋白的转基因，从而在使用针对不同目标昆虫物种的不同蛋白时扩展受影响的目标昆虫物种的范围，或通过使用对相同目标昆虫物种具有杀虫性但具有不同作用模式(例如在昆虫中结合不同的受体结合位点)的不同蛋白来延迟植物的昆虫抗性发展。

如本文所用，“昆虫抗性转基因植物”还包括含有至少一种转基因的任何植物，所述转基因包含表达后产生双链RNA的序列，该双链RNA在被植物虫害摄取后能抑制该植物虫害的生长，如在例如WO 2007/080126、WO 2006/129204、WO 2007/074405、WO 2007/080127和WO 2007/035650中所述。

还可根据本发明处理的植物或植物栽培种(由植物生物技术方法如基因工程获得)可耐受非生物胁迫。此类植物可通过遗传转化，或通过选择包含赋予该胁迫抗性的突变的植物来获得。特别有用的胁迫耐受性植物包括：

1)包含能够减少植物细胞或植物中多聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)基因的表达和/或活性的转基因的植物，如WO 00/04173、WO 2006/045633、EP-A 1 807 519或EP-A 2 018431中所述。

2)包含能够减少植物或植物细胞中的PARG编码基因的表达和/或活性的胁迫耐受增强性转基因的植物，如例如WO 2004/090140中所述。

3)含有一种胁迫耐受增强性转基因的植物，该转基因编码烟酰胺腺嘌呤二核苷酸补救合成路径的植物功能酶，包括烟酰胺酶、烟酸磷酸核糖基转移酶、烟酸单核苷酸腺苷转移酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷合成酶或烟酰胺磷酸核糖基转移酶，如例如EP-A 1 794 306、WO2006/133827、WO 2007/107326、EP-A 1 999 263或WO 2007/107326中所述。

还可根据本发明处理的植物或植物栽培种(由植物生物技术方法如基因工程获得)显示出改变的所收获的产品的数量、品质和/或储存稳定性，和/或改变的所收获的产品的具体成分的性质，例如：

1)合成改性淀粉的转基因植物，其改性淀粉的物理化学性质，尤其是直链淀粉含量或直链淀粉/支链淀粉比、支化程度、平均链长、侧链分布、粘度表现、胶凝强度、淀粉颗粒尺寸和/或淀粉颗粒形貌，与野生型植物细胞或植物中的合成淀粉相比有所改变，从而其更适合于具体的应用。所述合成改性淀粉的转基因植物在以下文献中公开：例如EP-A 0 571427、WO 95/04826、EP-A 0 719 338、WO 96/15248、WO 96/19581、WO 96/27674、WO 97/11188、WO 97/26362、WO 97/32985、WO 97/42328、WO 97/44472、WO 97/45545、WO 98/27212、WO 98/40503、WO 99/58688、WO 99/58690、WO 99/58654、WO 00/08184、WO 00/08185、WO 00/08175、WO 00/28052、WO 00/77229、WO 01/12782、WO 01/12826、WO 02/101059、WO 03/071860、WO 04/056999、WO 05/030942、WO 2005/030941、WO 2005/095632、WO 2005/095617、WO 2005/095619、WO 2005/095618、WO 2005/123927、WO 2006/018319、WO2006/103107、WO 2006/108702、WO 2007/009823、WO 00/22140、WO 2006/063862、WO 2006/072603、WO 02/034923、WO 2008/017518、WO 2008/080630、WO 2008/080631、EP07090007.1、WO 2008/090008、WO 01/14569、WO 02/79410、WO 03/33540、WO 2004/078983、WO 01/19975、WO 95/26407、WO 96/34968、WO 98/20145、WO 99/12950、WO 99/66050、WO99/53072、US 6,734,341、WO 00/11192、WO 98/22604、WO 98/32326、WO 01/98509、WO 01/98509、WO 2005/002359、US 5,824,790、US 6,013,861、WO 94/04693、WO 94/09144、WO 94/11520、WO 95/35026、WO 97/20936、WO 2010/012796、WO 2010/003701，

2)合成非淀粉碳水化合物聚合物的转基因植物，或与未经过遗传修饰的野生型植物相比合成具有改变的性质的非淀粉碳水化合物聚合物的转基因植物。实例为产生多聚果糖(尤其是菊糖和果聚糖类型)的植物，如EP-A 0 663 956、WO 96/01904、WO 96/21023、WO98/39460和WO 99/24593中所公开的；产生α-1,4-葡聚糖的植物，如WO 95/31553、US2002031826、US 6,284,479、US 5,712,107、WO 97/47806、WO 97/47807、WO 97/47808和WO00/14249中所公开的；产生α-1,6-支化α-1,4-葡聚糖的植物，如WO 00/73422中所公开的；产生交替糖(alternan)的植物，如WO 00/47727、WO 00/73422、EP 06077301.7、US 5,908,975和EP-A 0 728 213中所公开的；

3)产生透明质酸的转基因植物，如例如WO 2006/032538、WO 2007/039314、WO2007/039315、WO 2007/039316、JP-A2006-304779和WO 2005/012529中所公开的。

4)转基因植物或杂交植物，例如具有以下特性的洋葱，所述特性例如“高可溶性固体含量”、“低刺激性”(LP)和/或“储存时间长”(LS)，如美国专利申请12/020,360和61/054,026中所述。

还可根据本发明处理的植物或植物栽培种(由植物生物技术方法如基因工程获得)是具有改变的纤维特性的植物，例如棉花植物。这些植物可通过遗传转化，或通过选择包含赋予该改变的纤维特性的突变的植物来获得，包括：

a)包含改变形式的纤维素合酶基因的植物，例如棉花植物，如WO 98/000549中所述。

b)包含改变形式的rsw2或rsw3同源核酸的植物，例如棉花植物，如WO 2004/053219中所述。

c)具有增加的蔗糖磷酸合酶表达的植物，例如棉花植物，如WO 01/17333中所述

d)具有增加的蔗糖合酶表达的植物，例如棉花植物，如WO 02/45485中所述。

e)植物，例如棉花植物，其中在纤维状细胞基底的胞间连丝门控时机改变，例如通过下调纤维选择性β-1,3-葡聚糖酶来实现，如WO 2005/017157中所述，或如WO 2009/143995中所述。

f)具有改变的反应性的纤维(例如通过表达包含nodC的N-乙酰基葡糖胺转化酶基因和几丁质合成酶基因)的植物，例如棉花植物，如WO 2006/136351中所述。

还可根据本发明处理的植物或植物栽培种(由植物生物技术方法如基因工程获得)是具有改变的油特性的植物，例如油菜或相关芸苔属植物。这类植物可通过遗传转化或通过选择含有赋予这种改变的油特性的突变的植物来获得，这类植物包括：

a)产生具有高油酸含量的油的植物，例如油菜植物，如例如US 5,969,169、US 5,840,946或US 6,323,392或US 6,063,947中所述，

b)产生具有低亚麻酸含量的油的植物，例如油菜植物，如US 6,270,828、US 6,169,190或US 5,965,755中所述，

c)产生具有低水平饱和脂肪酸的油的植物，例如油菜植物，如例如US 5,434,283或美国专利申请12/668303中所述。

还可根据本发明处理的植物或植物栽培种(由植物生物技术方法如基因工程获得)是具有改变的种子落粒特征(seed shattering characteristics)的植物，例如油菜或相关芸苔属植物。这类植物可通过遗传转化或通过选择含有赋予这种改变的种子落粒特征的突变的植物来获得，并且这类植物包括例如具有延迟的或降低的种子落粒性的油菜的植物，如美国专利申请61/135,230、WO 2009/068313和WO 2010/006732中所述。

还可根据本发明处理的植物或植物栽培种(可通过植物生物技术方法，如基因工程获得)是具有改变的翻译后蛋白质修饰模式的植物，例如烟草植物，例如WO 2010/121818和WO 2010/145846中所述。

可根据本发明处理的特别有用的转基因植物是含转化事件或转化事件组合的植物，它们是向美国农业部(USDA)动植物卫生检验局(APHIS)请求在美国非管制身份的对象，无论这些请求被准予或仍然处在待审中。该信息可随时很容易地从APHIS(美国马里兰州利弗代尔市利弗路4700号(邮编20737)(4700River Road,Riverdale，MD,20737，USA))获得，例如在其互联网站上(URL http://www.aphis.usda.gov/brs/not_reg.html)。截止到本申请的提交日，被APHIS审理中或被APHIS准予的要求非管制身份的请求是包括以下信息的请求：

-请求(Petition)：请求的识别号。转化事件的技术描述可在各请求文件中找到，而这些请求文件可根据该请求号从APHIS得到，例如从APHIS网站上获得。这些描述以引用的形式纳入本文。

-请求的延长(Extension of Petition)：对之前的请求要求延长。

-机构(Institution)：提交请求的实体的名称。

-管制项目(Regulated article)：涉及的植物物种。

-转基因表型(Transgenic phenotype)：通过转化事件赋予植物的性状。

-转化事件或系(Transformation event or line)：要求非管制身份的一个或多个事件(有时称为一个或多个系)的名称。

-APHIS文档：与请求相关的APHIS出版的各种文件，它们可以是APHIS要求的。

其它特别有用的含单个转化事件或转化事件组合的植物例如在各个国家或区域性管理机构的数据库中列出(参见，例如http://gmoinfo.jrc.it/gmp_browse.aspx和http://www.agbios.com/dbase.php)。

可根据本发明处理的特别有用的转基因植物是包含转化事件，或转化事件的组合的植物，所述转化事件示于例如来自各个国家或区域管理机构的数据库中，包括事件1143-14A(棉花，昆虫防治，未保藏，记载于WO 2006/128569)；事件1143-51B(棉花，昆虫防治，未保藏，记载于WO 2006/128570)；事件1445(棉花，耐除草剂，未保藏，记载于US-A2002-120964或WO 02/034946)；事件17053(水稻，耐除草剂，保藏为PTA-9843，记载于WO 2010/117737)；事件17314(水稻，耐除草剂，保藏为PTA-9844，记载于WO 2010/117735)；事件281-24-236(棉花，昆虫防治-耐除草剂，保藏为PTA-6233，记载于WO 2005/103266或US-A2005-216969)；事件3006-210-23(棉花，昆虫防治-耐除草剂，保藏为PTA-6233，记载于US-A2007-143876或WO 2005/103266)；事件3272(玉米，品质性状，保藏为PTA-9972，记载于WO 2006/098952或US-A2006-230473)；事件40416(玉米，昆虫防治-耐除草剂，保藏为ATCC PTA-11508，参见WO2011/075593)；事件43A47(玉米，昆虫防治-耐除草剂，保藏为ATCC PTA-11509，记载于WO2011/075595)；事件5307(玉米，昆虫防治，保藏为ATCC PTA-9561，记载于WO2010/077816)；事件ASR-368(剪股颖，耐除草剂，保藏为ATCC PTA-4816，记载于US-A2006-162007或WO2004/053062)；事件B16(玉米，耐除草剂，未保藏，记载于US-A2003-126634)；事件BPS-CV127-9(大豆，耐除草剂，保藏为NCIMB No.41603，记载于WO 2010/080829)；事件CE43-67B(棉花，昆虫防治，保藏为DSM ACC2724，记载于US-A2009-217423或WO 2006/128573)；事件CE44-69D(棉花，昆虫防治，未保藏，记载于US-A2010-0024077)；事件CE44-69D(棉花，昆虫防治，未保藏，记载于WO 2006/128571)；事件CE46-02A(棉花，昆虫防治，未保藏，记载于WO 2006/128572)；事件COT102(棉花，昆虫防治，未保藏，记载于US-A2006-130175或WO 2004/039986)；事件COT202(棉花，昆虫防治，未保藏，记载于US-A2007-067868或WO 2005/054479)；事件COT203(棉花，昆虫防治，未保藏，记载于WO 2005/054480)；事件DAS40278(玉米，耐除草剂，保藏为ATCC PTA-10244，记载于WO 2011/022469)；事件DAS-59122-7(玉米，昆虫防治-耐除草剂，保藏为ATCC PTA11384，记载于US-A2006-070139)；事件DAS-59132(玉米，昆虫防治-耐除草剂，未保藏，记载于WO 2009/100188)；事件DAS68416(大豆，耐除草剂，保藏为ATCC PTA-10442，记载于WO 2011/066384或WO 2011/066360)；事件DP-098140-6(玉米，耐除草剂，保藏为ATCC PTA-8296，记载于US-A2009-137395或WO 2008/112019)；事件DP-305423-1(大豆，品质性状，未保藏，记载于US-A2008-312082或WO 2008/054747)；事件DP-32138-1(玉米，杂交体系，保藏为ATCC PTA-9158，记载于US-A2009-0210970或WO 2009/103049)；事件DP-356043-5(大豆，耐除草剂，保藏为ATCCPTA-8287，记载于US-A2010-0184079或WO 2008/002872)；事件EE-1(茄子，昆虫防治，未保藏，记载于WO 2007/091277)；事件FI117(玉米，耐除草剂，保藏为ATCC209031，记载于US-A2006-059581或WO 98/044140)；事件GA21(玉米，耐除草剂，保藏为ATCC209033，记载于US-A2005-086719或WO 98/044140)；事件GG25(玉米，耐除草剂，保藏为ATCC209032，记载于US-A2005-188434或WO 98/044140)；事件GHB119(棉花，昆虫防治-耐除草剂，保藏为ATCCPTA-8398，记载于WO 2008/151780)；事件GHB614(棉花，耐除草剂，保藏为ATCCPTA-6878，记载于US-A2010-050282或WO 2007/017186)；事件GJ11(玉米，耐除草剂，保藏为ATCC209030，记载于US-A2005-188434或WO 98/044140)；事件GM RZ13(甜菜，抗病毒性，保藏为NCIMB-41601，记载于WO 2010/076212)；事件H7-1(甜菜，耐除草剂，保藏为NCIMB41158或NCIMB41159，记载于US-A2004-172669或WO 2004/074492)；事件JOPLIN1(小麦，耐病性，未保藏，记载于US-A2008-064032)；事件LL27(大豆，耐除草剂，保藏为NCIMB41658，记载于WO2006/108674或US-A2008-320616)；事件LL55(大豆，耐除草剂，保藏为NCIMB41660，记载于WO 2006/108675或US-A2008-196127)；事件LLcotton25(棉花，耐除草剂，保藏为ATCC PTA-3343，记载于WO 03/013224或US-A2003-097687)；事件LLRICE06(水稻，耐除草剂，保藏为ATCC-23352，记载于US 6,468,747或WO 00/026345)；事件LLRICE601(水稻，耐除草剂，保藏为ATCC PTA-2600，记载于US-A2008-2289060或WO 00/026356)；事件LY038(玉米，品质性状，保藏为ATCC PTA-5623，记载于US-A2007-028322或WO 2005/061720)；事件MIR162(玉米，昆虫防治，保藏为PTA-8166，记载于US-A2009-300784或WO2007/142840)；事件MIR604(玉米，昆虫防治，未保藏，记载于US-A2008-167456或WO2005/103301)；事件MON15985(棉花，昆虫防治，保藏为ATCC PTA-2516，记载于US-A2004-250317或WO02/100163)；事件MON810(玉米，昆虫防治，未保藏，记载于US-A2002-102582)；事件MON863(玉米，昆虫防治，保藏为ATCC PTA-2605，记载于WO 2004/011601或US-A2006-095986)；事件MON87427(玉米，授粉控制，保藏为ATCC PTA-7899，记载于WO 2011/062904)；事件MON87460(玉米，胁迫耐受性，保藏为ATCCPTA-8910，记载于WO 2009/111263或US-A2011-0138504)；事件MON87701(大豆，昆虫防治，保藏为ATCC PTA-8194，记载于US-A2009-130071或WO 2009/064652)；事件MON87705(大豆，品质性状-耐除草剂，保藏为ATCC PTA-9241，记载于US-A2010-0080887或WO2010/037016)；事件MON87708(大豆，耐除草剂，保藏为ATCC PTA9670，记载于WO 2011/034704)；事件MON87754(大豆，品质性状，保藏为ATCCPTA-9385，记载于WO 2010/024976)；事件MON87769(大豆，品质性状，保藏为ATCC PTA-8911，记载于US-A2011-0067141或WO2009/102873)；事件MON88017(玉米，昆虫防治-耐除草剂，保藏为ATCC PTA-5582，参见US-A2008-028482或WO 2005/059103)；事件MON88913(棉花，耐除草剂，保藏为ATCC PTA-4854，记载于WO 2004/072235或US-A2006-059590)；事件MON89034(玉米，昆虫防治，保藏为ATCCPTA-7455，记载于WO 2007/140256或US-A2008-260932)；事件MON89788(大豆，耐除草剂，保藏为ATCC PTA-6708，记载于US-A2006-282915或WO 2006/130436)；事件MS11(油菜，授粉控制-耐除草剂，保藏为ATCC PTA-850或PTA-2485，记载于WO 01/031042)；事件MS8(油菜，授粉控制-耐除草剂，保藏为ATCC PTA-730，记载于WO 01/041558或US-A2003-188347)；事件NK603(玉米，耐除草剂，保藏为ATCC PTA-2478，记载于US-A2007-292854)；事件PE-7(水稻，昆虫防治，未保藏，记载于WO 2008/114282)；事件RF3(油菜，授粉控制-耐除草剂，保藏为ATCCPTA-730，记载于WO 01/041558或US-A2003-188347)；事件RT73(油菜，耐除草剂，未保藏，记载于WO 02/036831或US-A2008-070260)；事件T227-1(甜菜，耐除草剂，未保藏，记载于WO02/44407或US-A2009-265817)；事件T25(玉米，耐除草剂，未保藏，记载于US-A2001-029014或WO 01/051654)；事件T304-40(棉花，昆虫防治-耐除草剂，保藏为ATCCPTA-8171，记载于US-A2010-077501或WO 2008/122406)；事件T342-142(棉花，昆虫防治，未保藏，记载于WO 2006/128568)；事件TC1507(玉米，昆虫防治-耐除草剂，未保藏，记载于US-A2005-039226或WO 2004/099447)；事件VIP1034(玉米，昆虫防治-耐除草剂，保藏为ATCCPTA-3925.，记载于WO 03/052073)，事件32316(玉米，昆虫防治-耐除草剂，保藏为PTA-11507，记载于WO 2011/084632)，事件4114(玉米，昆虫防治-耐除草剂，保藏为PTA-11506，记载于WO 2011/084621)。

本发明的组合物还可用于针对易于在木材上或木材内部生长的真菌病害。术语“木材”意指所有类型的木质物种、以及意欲用于建筑的这种木材的所有类型的加工产品，例如实木、高密度木材、层压木材和胶合板。本发明处理木材的方法主要包括接触一种或多种本发明化合物或本发明组合物；这包括例如直接施用、喷涂、浸渍、注射或任意其它适合的方法。

序列表：

SEQ ID NO:1:编码豆薯层锈菌的HXT1蛋白的基因的核苷酸序列

SEQ ID NO:2:豆薯层锈菌的HXT1蛋白的氨基酸序列

SEQ ID NO:3:编码蚕豆单胞锈菌的HXT1蛋白的基因的核苷酸序列

SEQ ID NO:4:蚕豆单胞锈菌的HXT1蛋白的氨基酸序列

SEQ ID NO:5:编码条形柄锈菌的HXT1蛋白的基因的核苷酸序列

SEQ ID NO:6:条形柄锈菌的HXT1蛋白的氨基酸序列

SEQ ID NO:7:编码禾柄锈菌的HXT1蛋白的基因的核苷酸序列

SEQ ID NO:8:禾柄锈菌的HXT1蛋白的氨基酸序列

SEQ ID NO:9:编码Puccinia triticina的HXT1蛋白的基因的核苷酸序列

SEQ ID NO:10:Puccinia triticina的HXT1蛋白的氨基酸序列

将通过以下实验实施例，使本发明的各个方面得以更充分地理解。

以下所述的所有方法或操作以示例的方式给出并且对应于从实现相同结果的各种可行方法中做出的选择。该选择对于结果的质量没有影响，因此本领域技术人员可以使用任意合适方法来实现相同的结果。具体地，除非在实施例中另外说明，按照Sambrook和Russel(2001，Molecular cloning:A laboratory manual，第3版，冷泉港实验室出版社，纽约)，Ausubel et al.(1994，Current Protocols in Molecular Biology，Currentprotocols，USA,第1卷和第2卷)，和Brown(1998，Molecular Biology LabFax，第2版，学术出版社，英国)中所述的标准实验方案进行所有采用的重组DNA技术。用于植物分子生物学的标准材料和方法记载于Croy R.D.D.(1993，Plant Molecular Biology LabFax，BIOS科学出版有限公司(BIOS Scientific Publications Ltd)(英国)和Blackwell科学出版公司(Blackwell Scientific Publications)(英国))中。PCR(聚合酶链反应)的标准材料和方法也记载于Dieffenbach和Dveksler(1995，PCR Primer：A laboratory manual，冷泉港实验室出版社，纽约)和McPherson et al.(2000，PCR-Basics:From background to bench，第1版，Springer Verlag，德国)中。

实施例

实施例1：豆薯层锈菌的HXT1基因的鉴定

为了获得HXT1的豆薯层锈菌直系同源物，在由Link et al.(2013,MolecularPlant Pathology,15:379-93)创建的加注释的吸器转录物组中搜索己糖转运蛋白直系同源物。一种候选的己糖转运蛋白contig_05320表现出与蚕豆单胞锈菌HXT1及来自禾柄锈菌小麦专化型(Puccinia graminis f.sp.Tritici)和Melampsora larici-populina的候选己糖转运蛋白的同源性。使用蚕豆单胞锈菌基因组数据(Link et al.2014,Frontiers inPlant Science,29；5:587)进行的交互BLAST检索证实contig_05320是与蚕豆单胞锈菌HXT1最接近的同源物。

实施例2：用于VIGS的载体构建

为了成功实现VIGS，必须使用在宿主植物上已经建立好的病毒系统。对于大豆，已建立了用于VIGS和外源基因的瞬时表达的豆荚斑点病毒(BPMV)(Zhang et al.,2010,Plant Physiology,153:52–65)。类似于Panwar et al.(2013,Plant Molecular Biology,81:595–608)中的方法——他们使用已经建立的载体(BSMV)，我们选择调整BPMV系统，用于VIGS。

我们的BPMV沉默质粒载体在编码小外壳蛋白的序列和终止子序列之间含有BamHI克隆位点(图1)。对于沉默构建体，采用豆薯层锈菌的HXT1基因上的特异性引物，针对从被感染的植物材料中制备的RNA进行了RT-PCR，并将PCR产物插入BamHI位点。然后使用电穿孔将质粒转化到大肠杆菌DH5α中以进行扩增。由于克隆进入pBPMV质粒不是定向的，因此使用菌落PCR测试插入物的取向。也对正确的构建体测序。将这两种构建体——具有正义和反义方向的插入——用于沉默实验。

BPMV基因组由两条正链RNA组成，其中RNA2被用于克隆。对于植物接种，使用粒子轰击将三种含有BPMV RNA1(用于加强感染的大豆花叶病毒)的质粒和沉默构建体同时递送到大豆初生叶中。

对于粒子轰击，将11日龄的幼苗(初生叶完全发育，但不会进一步发育)转移到生物射弹装置的真空室中，并由具有用于茎的凹槽的塑料托盘支撑叶子。将叶子平放在有金属网的托盘上。我们使用1.0μm的金颗粒，1,100-psi的爆破片(rupture disks)并且距离为6cm。在粒子轰击之前，将室抽空到-25英寸汞柱。之后，使植物湿润并在100％湿度下保持过夜，然后置于22℃和16h光照标准温室条件下。

采收严重感染病毒的叶子，并将汁液用于对其他植物的第二次摩擦接种。随后用豆薯层锈菌夏孢子(P.pachyrhizi urediospores)接种这些植物的三叶叶片。

实施例3：HXT1基因的表达水平的测量

为了评估沉默作用，当初生叶已完全发育时通过摩擦初生叶，使植物接种病毒。对于每次筛选，对20株植物使用沉默构建体，5株植物使用空载体，将3株植物作为未感染的对照。以随机分布的形式将植物保存在温室中。一旦第三个三叶叶片完全发育，将第二和第三个三叶叶片的小叶用豆薯层锈菌夏孢子喷雾接种。我们使用由2mg/ml孢子组成的悬浮液，其中加入了微量的奶粉和Tween20以获得更好的分散。在100％湿度下，将植物置于黑暗中24h——之后，它们被放回到标准的温室区域。接种锈菌后5天，制备用于qPCR的RNA。选择第二或第三个三叶叶片中的一片小叶，并使用来自Agilent(Waldbronn)的植物RNA分离试剂盒(Plant RNA Isolation Kit)，将100mg叶片材料用于RNA制备。使用荧光测定法(Qubit2.0，Thermo Fisher Scientific，Life Technologies，Waltham)测量RNA浓度。一式两份测量每个样品的qPCR。我们使用的qPCR化学品为SensiFast SYBR no-Rox试剂盒(BiolineGmbH，Luckenwalde)。

针对Pp_RPS14对qPCR结果进行归一化。首先分别评估所有样品，然后使用所有植物的平均值来确定沉默是否成功。通过标准t-检验确定沉默作用的显著性。与qPCR结果相关的所有统计分析使用REST-2009软件(Pfaffl 2001,Nucleic Acids Research,29:e45)来进行。

将剩余的小叶片用于症状评估。

观察到HXT1基因的转录水平降低(图2A)和真菌感染减少。在感染后10天进行的疾病表型症状评估(根据Godoy et al.,2006，Fitopatologia Brasileira 31：63-68中记载的对于豆薯层锈菌评估的图解比例)表明，感染了BPMV空载体的植物显示出的叶症状接近60％，感染含HXT1沉默构建体的BPMV载体的植物仅发展约5％的叶症状。

相比之下，当使用不同的豆薯层锈菌靶基因(SDH1)测定VIGS时，与对照(空BPMV载体)相比，尽管转录水平降低，但未观察到豆薯层锈菌感染的减少(图2B)。

实施例4：HXT1蛋白的锈菌特异性组的鉴定

基于豆薯层锈菌的HXT1蛋白的序列，使用BLAST序列比对工具，在其他物种中已经鉴定出同源序列。

表1中示出这些同源序列之间的序列同一性百分比。

这些同源HXT1蛋白显示出在它们自己之间的序列同一性百分比比和其他类型的己糖转运蛋白(包括由Yin et al.(2011,MPMI 24:554-561)鉴定而提出的“HXT1-同系物”)之间的序列同一性百分比更高，由此表明这些己糖转运蛋白构成了一组同源HXT1蛋白，其与其他类型的己糖转运蛋白具有足够的不同。此外，这些HXT1蛋白在除锈菌之外的其他真菌中没有同源蛋白，从而表明这组同源HXT1蛋白对于锈菌具有特异性。

表1：锈菌中己糖转运蛋白之间的序列同一性百分比

PHAKPA:豆薯层锈菌(Phakopsora pachyrhizi)

UROFA:蚕豆单胞锈菌(Uromyces fabae)

PUCGR:禾丙锈菌(Puccinia graminis)

PUCST:条形柄锈菌(Puccinia striiformis)(备注："PUCST_PSTG_03803"是由Yinet al.(2011,MPMI 24:554-561)鉴定的"HXT1-同系物")

PUCTR:Puccinia triticina

CRYNE:新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)

USTIMA:玉蜀黍黑粉菌(Ustilago maydis)

基于序列比对(还包括来自其他真菌的己糖转运蛋白)，构建了系统发生树(图3)。使用矩阵Blosum，在ClustalW2上进行比对，设定空位延伸为0.05，空位开放罚分为10。用具有默认参数和10个引导程序(bootstrap)的Phyml(Guindon et al.(2010),SystematicBiology,59(3):307-21)产生系统发生树。同源HXT1蛋白被分组在系统发生树的单个分支上，从而证实锈菌物种中的这些HXT1蛋白的特异性。

序列表

<110> 拜耳作物科学股份公司（Bayer CropScience AG）/ 霍恩海姆大学（Universityof Hohenheim）

<120> 通过抑制HXT1基因的表达来防治锈菌真菌的方法和组合物

<130> BCS154007

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1425

<212> DNA

<213> 豆薯层锈菌(Phakopsora pachyrhizi)

<400> 1

atgccggcag tgatggcagg tcccgtaacc tttgcgccac cgaaaggaaa atctagcgcg 60

atggcaattg tggttgctgg ctttgctgca tttggaggct ttttgtatgg atacgacact 120

ggatatatct ctggagtaaa agctatgcct ggttggctaa gaggagtggg ccaggttggg 180

ccagatggga atttttttct gacaactagc caagactcat tagtcaccag tattctttcc 240

ataggtactt ttgttggagc ccttttagca taccctattg gggatagata tggccgaaga 300

atcggtatag tattagcatg tttggtattt tctgctggag ttgccatgca gactatcgcc 360

gtcaagctgc cactcttcgt ggcagggaga atttttgcgg gcctgggagt tggcactgcc 420

tcttgtttgg taccaatgta tcaatcagaa tgcgcaccaa aatggattcg aggaggagtc 480

gtcgcgtgct accaatttgc catcactata ggtctcttat gtgcttctgt cgcggtgaat 540

gctaccaaag atatcgattc tacagcgtgc tatcggattc cgattggaat tcagttcatt 600

tgggctttca tcctatgtgc tggattgata attttacccg aatcgccacg atatttgctt 660

ttaaagggta gagaagatga agcattgaaa tctttgatgc gactatacag tgcaccgatg 720

gatgatccgg atgtacaggc cgaattctct gaaataaatg caaacctaga gaaggagagg 780

tcttttggac gcacaacctt gttagactgt ttcaaaagcg atcatcgaaa aaatctcctc 840

aggactatga ctggtatcgg ctgtcaaggt tggcaacaag cttctggaat aaacttcttt 900

ttttactacg gcactacatt cttcaaaaat tctggaatct ctaacccatt cactgttact 960

gtggccagca acgttgtaaa tgttgtggcg accattccag gaatttgggc agttgataaa 1020

cttgggcgta gatcactctt actaatggga gcatttgcaa tgtttgcgtg tgaacttgtt 1080

gttgcttgca ttggaacgtt tactaagagc gataacatgt cgtcgcagaa agttttagtg 1140

gttttctctt gcctttccat cggagttttt gctgccacgt ggggacccat cccatgggta 1200

gtgactagtg aaatataccc tcttgcaacg cgagggaagc agatggcaat gtcaacagct 1260

tccaattggg ggataaattt ttttataggt ttcataacac cttacttggt tgacgaaggc 1320

gccggaaaag ctggtctagg cgtaaaagtt ttctttttat gggcttgtac ttcatttgga 1380

gggttcctat ttgcgttttt ctttattcct gaaacaaaag ggctc 1425

<210> 2

<211> 475

<212> PRT

<213> 豆薯层锈菌(Phakopsora pachyrhizi)

<400> 2

Met Pro Ala Val Met Ala Gly Pro Val Thr Phe Ala Pro Pro Lys Gly

1 5 10 15

Lys Ser Ser Ala Met Ala Ile Val Val Ala Gly Phe Ala Ala Phe Gly

20 25 30

Gly Phe Leu Tyr Gly Tyr Asp Thr Gly Tyr Ile Ser Gly Val Lys Ala

35 40 45

Met Pro Gly Trp Leu Arg Gly Val Gly Gln Val Gly Pro Asp Gly Asn

50 55 60

Phe Phe Leu Thr Thr Ser Gln Asp Ser Leu Val Thr Ser Ile Leu Ser

65 70 75 80

Ile Gly Thr Phe Val Gly Ala Leu Leu Ala Tyr Pro Ile Gly Asp Arg

85 90 95

Tyr Gly Arg Arg Ile Gly Ile Val Leu Ala Cys Leu Val Phe Ser Ala

100 105 110

Gly Val Ala Met Gln Thr Ile Ala Val Lys Leu Pro Leu Phe Val Ala

115 120 125

Gly Arg Ile Phe Ala Gly Leu Gly Val Gly Thr Ala Ser Cys Leu Val

130 135 140

Pro Met Tyr Gln Ser Glu Cys Ala Pro Lys Trp Ile Arg Gly Gly Val

145 150 155 160

Val Ala Cys Tyr Gln Phe Ala Ile Thr Ile Gly Leu Leu Cys Ala Ser

165 170 175

Val Ala Val Asn Ala Thr Lys Asp Ile Asp Ser Thr Ala Cys Tyr Arg

180 185 190

Ile Pro Ile Gly Ile Gln Phe Ile Trp Ala Phe Ile Leu Cys Ala Gly

195 200 205

Leu Ile Ile Leu Pro Glu Ser Pro Arg Tyr Leu Leu Leu Lys Gly Arg

210 215 220

Glu Asp Glu Ala Leu Lys Ser Leu Met Arg Leu Tyr Ser Ala Pro Met

225 230 235 240

Asp Asp Pro Asp Val Gln Ala Glu Phe Ser Glu Ile Asn Ala Asn Leu

245 250 255

Glu Lys Glu Arg Ser Phe Gly Arg Thr Thr Leu Leu Asp Cys Phe Lys

260 265 270

Ser Asp His Arg Lys Asn Leu Leu Arg Thr Met Thr Gly Ile Gly Cys

275 280 285

Gln Gly Trp Gln Gln Ala Ser Gly Ile Asn Phe Phe Phe Tyr Tyr Gly

290 295 300

Thr Thr Phe Phe Lys Asn Ser Gly Ile Ser Asn Pro Phe Thr Val Thr

305 310 315 320

Val Ala Ser Asn Val Val Asn Val Val Ala Thr Ile Pro Gly Ile Trp

325 330 335

Ala Val Asp Lys Leu Gly Arg Arg Ser Leu Leu Leu Met Gly Ala Phe

340 345 350

Ala Met Phe Ala Cys Glu Leu Val Val Ala Cys Ile Gly Thr Phe Thr

355 360 365

Lys Ser Asp Asn Met Ser Ser Gln Lys Val Leu Val Val Phe Ser Cys

370 375 380

Leu Ser Ile Gly Val Phe Ala Ala Thr Trp Gly Pro Ile Pro Trp Val

385 390 395 400

Val Thr Ser Glu Ile Tyr Pro Leu Ala Thr Arg Gly Lys Gln Met Ala

405 410 415

Met Ser Thr Ala Ser Asn Trp Gly Ile Asn Phe Phe Ile Gly Phe Ile

420 425 430

Thr Pro Tyr Leu Val Asp Glu Gly Ala Gly Lys Ala Gly Leu Gly Val

435 440 445

Lys Val Phe Phe Leu Trp Ala Cys Thr Ser Phe Gly Gly Phe Leu Phe

450 455 460

Ala Phe Phe Phe Ile Pro Glu Thr Lys Gly Leu

465 470 475

<210> 3

<211> 1569

<212> DNA

<213> 蚕豆单胞锈菌(Uromyces fabae)

<400> 3

atgcctgcgg ttatggccgg cccggtctct ttcgccccgc cggagggtaa atctagtaag 60

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cctgatggta aatacatgat cactacaagc caagactcaa tggttactag tattctttca 240

gttgggactt tcgtgggagc tcttttagcc tatcctatcg gtgacaggtt cggacgaaga 300

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tcttgtcttg tgccaatgta tcaatcagaa tgtgcaccaa aatggatacg tggagggatt 480

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<210> 4

<211> 522

<212> PRT

<213> 蚕豆单胞锈菌(Uromyces fabae)

<400> 4

Met Pro Ala Val Met Ala Gly Pro Val Ser Phe Ala Pro Pro Glu Gly

1 5 10 15

Lys Ser Ser Lys Val Ala Ile Val Ile Ala Val Phe Ala Ala Phe Gly

20 25 30

Gly Phe Leu Tyr Gly Tyr Asp Thr Gly Tyr Ile Ala Gly Val Lys Ala

35 40 45

Met Pro Phe Trp Leu Arg Ser Ala Gly Gln Arg Gly Pro Asp Gly Lys

50 55 60

Tyr Met Ile Thr Thr Ser Gln Asp Ser Met Val Thr Ser Ile Leu Ser

65 70 75 80

Val Gly Thr Phe Val Gly Ala Leu Leu Ala Tyr Pro Ile Gly Asp Arg

85 90 95

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Gly Val Ala Leu Gln Thr Ala Ser Thr Lys Ile Pro Met Phe Val Val

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Gly Arg Val Phe Ala Gly Leu Gly Val Gly Val Ala Ser Cys Leu Val

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Val Ala Cys Tyr Gln Trp Ala Ile Thr Ile Gly Leu Leu Val Ala Ser

165 170 175

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180 185 190

Ile Pro Ile Gly Ile Gln Phe Ile Trp Ala Ala Ile Leu Thr Ile Gly

195 200 205

Leu Leu Val Leu Pro Glu Ser Pro Arg Tyr Leu Leu Leu Lys Gly Arg

210 215 220

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Asp Asp Pro Asp Val Gln Ala Glu Phe Ser Glu Ile Met Ala Ser Leu

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Val Ala Thr Asn Val Val Asn Val Val Met Thr Ile Pro Gly Ile Trp

325 330 335

Ala Val Asp Lys Val Gly Arg Arg Thr Met Met Ile Cys Gly Ala Ala

340 345 350

Met Met Phe Thr Cys Glu Leu Ile Leu Ala Cys Val Gly Thr Phe Thr

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Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gln Lys Val Leu Val Ala Phe Ser Cys

370 375 380

Ile Phe Ile Gly Leu Phe Ala Ala Thr Trp Gly Pro Ile Pro Trp Val

385 390 395 400

Val Thr Ser Glu Ile Tyr Pro Leu Ala Thr Arg Gly Lys Gln Met Ala

405 410 415

Met Ser Thr Ala Ser Asn Trp Ala Val Asn Phe Phe Ile Gly Phe Ile

420 425 430

Thr Pro Tyr Leu Val Asp Ser Gly Ala Gly Gln Ala Gly Leu Gly Val

435 440 445

Lys Val Phe Trp Leu Trp Ala Ala Leu Cys Phe Gly Ala Met Val Phe

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Ser Phe Leu Leu Ile Pro Glu Thr Lys Gly Leu Ser Leu Glu Gln Val

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Asp Leu Leu Tyr Thr Asn Ser Thr Val Leu Lys Ser Asn Thr Tyr Arg

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<210> 5

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<212> DNA

<213> 条形柄锈菌(Puccinia striiformis)

<400> 5

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Ala Cys Tyr Gln Trp Ala Ile Thr Ile Gly Leu Leu Val Ala Ser Val

165 170 175

Thr Val Asn Ala Thr Lys Asp Phe Asp Ser Ala Asn Ser Tyr Arg Ile

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Thr Val Leu Pro Glu Ser Pro Arg Tyr Leu Leu Leu Lys Gly Asn Glu

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Asp Pro Asp Val Gln Ala Glu Phe Ser Glu Ile Met Ala Ser Leu Glu

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Asp Lys Arg Lys Asn Leu Gln Arg Thr Leu Thr Gly Leu Gly Val Gln

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Thr Phe Phe Lys Asn Ser Gly Ile Glu Asn Ala Phe Leu Val Thr Val

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Ala Thr Asn Val Val Asn Val Val Ala Thr Ile Pro Gly Ile Trp Ala

325 330 335

Val Asp Lys Val Gly Arg Arg Thr Met Leu Ile Ala Gly Ala Met Met

340 345 350

Met Phe Gly Cys Glu Leu Ile Val Ala Cys Val Gly Thr Phe Thr Thr

355 360 365

Ala Asp Asn Gln Ala Ser Gln Lys Val Leu Val Ala Phe Ser Cys Ile

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Phe Ile Gly Val Phe Ala Ala Thr Trp Gly Pro Ile Pro Trp Val Val

385 390 395 400

Thr Ser Glu Ile Tyr Pro Leu Ala Thr Arg Gly Lys Gln Met Ala Met

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Pro Tyr Leu Val Asp Gly Gly Ala Gly Lys Ala Gly Leu Gly Val Lys

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<212> DNA

<213> 禾柄锈菌(Puccinia graminis)

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Met Pro Phe Trp Leu Arg Ser Ala Gly Gln Leu Gly Pro Asp Gly Lys

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Gly Val Ala Leu Gln Thr Ala Ser Thr Thr Ile Pro Leu Phe Val Val

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Gly Arg Val Phe Ala Gly Leu Gly Val Gly Val Ala Ser Cys Leu Val

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Ile Pro Ile Gly Ile Gln Phe Val Trp Ala Ala Ile Leu Val Ile Gly

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Asp Asp Pro Asp Val Gln Ala Glu Phe Ser Glu Ile Met Ala Asn Leu

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Thr Tyr Arg Tyr Ser Thr Ile Ser Phe Phe Tyr Tyr Gly Thr Thr Phe

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Phe Lys Asn Ser Gly Ile Glu Asn Ala Phe Leu Val Thr Val Leu Thr

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Asn Val Val Asn Val Val Ala Thr Ile Pro Gly Ile Trp Ala Val Asp

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Lys Val Gly Arg Arg Thr Met Leu Ile Ala Gly Ala Ala Met Met Phe

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Gly Ile Phe Ala Ala Thr Trp Gly Pro Val Pro Trp Val Val Thr Ser

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Ala Ser Asn Trp Val Val Asn Phe Phe Ile Gly Phe Ile Thr Pro Tyr

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Leu Val Asp Ala Gly Pro Gly Gln Ala Gly Leu Gly Val Lys Val Phe

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Trp Leu Trp Ala Ala Leu Cys Phe Ala Ala Leu Thr Phe Ser Phe Phe

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Leu Ile Pro Glu Thr Lys Gly Leu Ser Leu Glu Gln Val Asp Leu Leu

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<213> Puccunia triticina

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gcgacgaaag acttcgatag tgccaactcc taccgcattc ctattggtat ccagtttgtt 600

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<212> PRT

<213> Puccunia triticina

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Ile Pro Ile Gly Ile Gln Phe Val Trp Ala Ala Ile Leu Val Ile Gly

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Thr Asp Lys Arg Lys Asn Leu Gln Arg Thr Leu Thr Gly Leu Gly Val

275 280 285

Gln Gly Trp Gln Gln Ala Ser Gly Ile Asn Phe Phe Phe Tyr Tyr Gly

290 295 300

Thr Thr Phe Phe Lys Asn Ser Gly Ile Lys Asp Ala Phe Leu Val Thr

305 310 315 320

Val Ala Thr Asn Val Val Asn Val Val Ala Thr Ile Pro Gly Ile Trp

325 330 335

Ala Val Asp Lys Val Gly Arg Arg Thr Met Leu Ile Ala Gly Ala Ala

340 345 350

Met Met Phe Ala Cys Glu Phe Ile Val Ala Cys Val Gly Thr Phe Thr

355 360 365

Ser Ala Asn Asn Met Ala Ser Gln Lys Val Leu Val Ala Phe Ser Cys

370 375 380

Ile Phe Ile Gly Ile Phe Ala Ala Thr Trp Gly Pro Val Pro Trp Val

385 390 395 400

Val Thr Ser Glu Ile Tyr Pro Leu Ala Thr Arg Gly Lys Gln Met Ala

405 410 415

Met Ser Thr Ala Ser Asn Trp Ala Val Asn Phe Phe Ile Gly Phe Ile

420 425 430

Thr Pro Tyr Leu Val Asp Thr Gly Ala Gly Gln Ala Gly Leu Gly Val

435 440 445

Lys Val Phe Trp Leu Trp Ala Ala Leu Cys Phe Ala Ala Leu Leu Phe

450 455 460

Ser Phe Phe Phe Ile Pro Glu Thr Lys Gly Leu Ser Leu Glu Gln Val

465 470 475 480

Asp Leu Leu Tyr Thr Asn Ser Thr Val Leu Lys Ser Asn Ser Tyr Arg

485 490 495

Leu Gln Leu Ile Ala Asn Asn Leu His Glu Gly Met Thr Pro Ala Glu

500 505 510

Lys Ala Tyr Gln Glu Lys Leu Glu His Ile

515 520

Claims (14)

1.一种dsRNA分子，其包含：

i)第一条RNA链，其包含第一部分，所述第一部分具有的核苷酸序列与真菌HXT1基因转录的mRNA的核苷酸序列中的至少18个连续核苷酸基本相同，和

ii)第二条RNA链，其包含第二部分，所述第二部分具有的核苷酸序列与所述第一条链的第一部分的核苷酸序列基本互补，使得所述第一和第二部分在其具有基本序列互补性的范围内能够配对在一起。

2.权利要求1的dsRNA分子，其中所述真菌HXT1基因选自：

a)包含SEQ ID NO：1、3、5、7和9所示核苷酸序列的多核苷酸；

b)编码具有SEQ ID NO：2、4、6、8和10所示氨基酸序列的多肽的多核苷酸；

c)与具有SEQ ID NO：1、3、5、7和9所示核苷酸序列的多核苷酸有至少70％序列同一性的多核苷酸；

d)编码与具有SEQ ID NO：2、4、6、8和10所示氨基酸序列的多肽有至少70％序列同一性的多肽的多核苷酸；

e)在严格条件下与具有SEQ ID NO：1、3、5、7和9所示核苷酸序列的多核苷酸杂交的多核苷酸。

3.一种组合物，其包含至少有效且非植物毒性量的权利要求1或2的dsRNA分子。

4.一种表达盒或遗传构建体，其至少包含：

-在植物细胞中起作用的启动子调控元件，其可操作地连接到；

-DNA分子，其在转录方向上包含，具有正义方向上的核苷酸序列的第一部分和具有反义方向上的核苷酸序列的第二部分，所述在正义方向上的第一部分的核苷酸序列由与真菌HXT1基因的核苷酸序列中的至少18个连续核苷酸基本相同的核苷酸序列组成，并且所述在反义方向上的第二部分的核苷酸序列由与所述正义方向上的第一部分的核苷酸序列基本互补的核苷酸序列组成，和；

-任选地，终止子调控元件。

5.一种转基因生物，其包含至少一种权利要求4的表达盒或遗传构建体。

6.权利要求5的转基因生物，其中所述生物为植物细胞或植物、或其种子或部分。

7.权利要求6的转基因植物细胞、植物、或其种子或部分，其中所述植物为大豆植物，其种子或部分。

8.一种制备能够表达抑制真菌HXT1基因的dsRNA的转基因植物细胞或植物、或其种子或部分的方法，所述方法包括用权利要求4的表达盒或遗传构建体来转化植物细胞的步骤。

9.一种处理植物的方法，其特征在于将有效且非植物毒性量的权利要求1或2中任一项的dsRNA分子或权利要求3的组合物，施用于植物生长或能够生长的土壤中、叶子和/或植物果实或所述植物的种子上。

10.一种用于保护植物免受植物病原体感染的方法，其特征在于将有效且非植物毒性量的权利要求1或2中任一项的dsRNA分子或权利要求3的组合物，施用于植物生长或能够生长的土壤中、叶子和/或所述植物的果实或所述植物的种子上。

11.权利要求10的方法，其中所述植物病原体为柄锈菌(Pucciniales)目的真菌锈菌。

12.权利要求11的方法，其中所述真菌锈菌选自：豆薯层锈菌(Phakopsorapachyrhizi)、蚕豆单胞锈菌(Uromyces fabae)、条形锈菌(Puccinia striiformis)、Puccinia triticina和禾柄锈菌(Puccinia graminis)。

13.权利要求12的方法，其中所述真菌锈菌为豆薯层锈菌。

14.权利要求9至13中任一项的方法，其中所述植物为大豆植物。