ES2532609T3 - Sistemas y métodos para expresión clonales en plantas - Google Patents

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Abstract

Un linaje de raíz clonal, linaje de células de raíz clonal, linaje de células de plantas clonales, o plantas clonales derivado(a) de una planta o porción de la misma, en donde una célula del linaje de raíz clonal, linaje de células de raíz clonal, linaje de células de plantas clonales, o plantas clonales comprende de manera estable: (i) un vector de RNA viral autorreplicante, episómico y extracromosómico que comprende un polinucleótido de interés que no está asociado normalmente con las secuencias del vector viral; y (ii) un DNA de Ri o porción del mismo suficiente para generar raíces pilosas; en donde las células del linaje de raíz clonal, linaje de células de raíz clonal, linaje de células de plantas clonales, o plantas clonales se originan a partir de una célula que se infectó con el vector de RNA viral antes de la introducción del T-DNA de Ri o porción del mismo, y en donde el linaje de raíz clonal, el linaje de células de raíz clonal, el linaje de células de plantas clonales, o la plantas clonales expresa el polinucleótido de interés.

Description

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50% del genoma), de un virus, o una molécula de ácido nucleico complementaria en secuencia de bases a dicha molécula de ácido nucleico. En el caso de virus segmentados, el vector viral puede ser un segmento de genoma, o una mayor parte del mismo. El vector viral puede encontrarse en forma de RNA o DNA.
Preferiblemente, el vector viral comprende una porción suficiente para soportar la replicación del vector viral en presencia de las proteínas replicasa virales apropiadas, es decir, constituye un replicón viral. La aptitud de cualquier porción particular de un genoma viral para soportar la replicación de un ácido nucleico que incluye la porción, en presencia de proteínas virales replicasa, puede ensayarse fácilmente utilizando métodos conocidos en la técnica, v.g., por fabricación de mutantes de deleción, por transferencia de la porción a un ácido nucleico que no soporta la replicación y determinación de si ocurre replicación, etc. Las proteínas replicasa pueden estar codificadas por el vector, por otro vector, o por una planta en la cual se introduce el vector. En ciertas realizaciones preferidas de la invención, el vector es capaz de autorreplicación, es decir, codifica las proteínas virales necesarias para replicación del virus en un hospedador de planta apropiado. En ciertas realizaciones de la invención, el vector comprende un gen MP. En ciertas realizaciones de la invención, el vector comprende un gen CP. No obstante, en ciertas realizaciones de la invención no está presente en el vector un gen MP ni un gen CP. Dado que los linajes de raíz clonales, linajes de plantas clonales, y plantas clonales se derivan de células ancestrales simples en las cuales se ha introducido el vector, no es necesario que el vector viral tenga capacidad de movimiento célula-a-célula o a larga distancia. En particular, las plantas clonales pueden expresar el polinucleótido de interés en toda la planta aun cuando el transcrito viral no se mueve, dado que cada célula se deriva de una célula ancestral simple que contiene el vector viral.
En general, un polinucleótido de interés se inserta en un vector viral bajo control de (es decir, enlazado operativamente a), un promotor que dirige la transcripción del polinucleótido en una célula de planta de interés. En ciertas realizaciones preferidas de la invención, se utiliza un promotor viral de plantas, v.g., un promotor para la proteína de la cubierta, la proteína de movimiento, etc. El polinucleótido de interés puede insertarse en lugar de la secuencia codificante endógena MP o CP. Por ejemplo, como se describe con mayor detalle en los Ejemplos, puede utilizarse un vector basado en TMV en el cual la secuencia codificante CP de TMV ha sido reemplazada por un polinucleótido de interés, bajo control del promotor CP de TMV. Alternativamente, el polipéptido insertado puede incluir su propio promotor, que puede ser idéntico o similar a uno de los promotores virales existentes naturalmente, puede ser de un virus diferente (v.g., el virus del mosaico de la coliflor), puede ser un promotor no viral tal como un promotor de un gen de planta, o un promotor sintético. En ciertas realizaciones de la invención se utiliza un promotor inducible. Se conocen una diversidad de promotores inducibles que funcionan en plantas. Véase, v.g., Zuo, J. y Chua, N-H., "Chemical-Inducible Systems for Regulated Expression of Plant Genes", Curr. Op. en Biotechnol., 11: 146-51, 2000. Por ejemplo, puede utilizarse promotores inducibles por metales tales como cobre, o sensibles a hormonas tales como estrógeno, o sistemas sensibles a otras moléculas pequeñas tales como tetraciclina. Pueden utilizarse otros estímulos tales como calor, luz, etc. Véase U.S.S.N. 10/294314.
En ciertas realizaciones de la invención en alguno de sus aspectos, se utiliza trans-activación para inducir o aumentar la expresión de un polinucleótido de interés. Por ejemplo, la casete de expresión que comprende el polinucleótido puede ser una casete de expresión inactiva que comprende una secuencia de ácido nucleico extraña inactiva o silenciada, que es capaz de dirigir la expresión de un polinucleótido de interés después de su activación. En ciertas realizaciones de la invención, la transactivación se realiza por introducción de un factor de activación o que facilita la expresión de una secuencia polinucleotídica inactiva o silenciada en las células de la entidad clonales. Un promotor que puede activarse en trans de dicha manera se conoce como "trans-activable". Véase U.S.S.N. 10/832603, titulado "Expression of Foreign Sequences in Plants Using Trans-Activation System", que se incorpora en esta memoria por referencia, para detalles adicionales de ciertos métodos adecuados. Tales métodos incluyen técnicas basadas en recombinación (v.g., utilizando un sistema de recombinasa Lox/Cre o Flp/Frt) y técnicas basadas en proteínas que comprenden un dominio de fijación de DNA tal como GAL4 y un dominio de activación transcripcional tal como VP16. Una diversidad de otros métodos pueden utilizarse para conseguir la transactivación.
En ciertas realizaciones de la invención, el polinucleótido se inserta para crear un marco de lectura abierto independiente, mientras que en otras realizaciones de la invención el polinucleótido se inserta para crear un marco de lectura abierto en el cual un polinucleótido que carece de un codón de parada está insertado en marco con secuencias codificantes de parte o la totalidad de una proteína viral tal como CP, de tal modo que se produce una proteína de fusión después de la traducción. Pueden insertarse polinucleótidos múltiples. En ciertas realizaciones preferidas de la invención, el vector TMV retiene parte o la totalidad de su UTR 3' y/o parte o la totalidad de la secuencia codificante CP. En ciertas realizaciones de la invención, el polinucleótido de interés o un vector viral en el cual está insertado el polinucleótido de interés comprende una porción que codifica una secuencia de direccionamiento, v.g., una secuencia que direcciona un polipéptido codificado a un orgánulo o compartimiento intracelular particular. Por ejemplo, puede ser deseable direccionar un polipéptido de interés al retículo endoplásmico, lo que puede dar como resultado finalmente la secreción del polipéptido. El polipéptido secretado puede cosecharse luego del medio de cultivo o del fluido intersticial de un tejido de planta.
Las Figuras 1-5 muestran ejemplos de la manipulación genética de diversos vectores de virus de plantas adecuados para uso en la presente invención. La Figura 1 muestra un constructo de virus basado en TMV, D4, y el mismo
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presencia o ausencia de tal o tales compuestos o condiciones ambientales se conoce como una "condición selectiva" o "condiciones selectivas". Por "ventaja de crecimiento" se entiende o bien viabilidad incrementada (v.g., las células u organismos con la ventaja de crecimiento tienen una duración de vida incrementada, por término medio, con relación a otras células idénticas por lo demás), tasa de proliferación incrementada (a la que se hace referencia también en esta memoria como "tasa de crecimiento") con relación a células u organismos idénticos por lo demás, o ambas cosas. En general, una población de células que tienen ventaja de crecimiento exhibirá un número menor de células muertas o no viables y/o una tasa de proliferación celular mayor que una población de células idénticas por lo demás que carecen de la ventaja de crecimiento. Aunque un marcador seleccionable conferirá típicamente una ventaja de crecimiento a una célula, ciertos marcadores seleccionables confieren una desventaja de crecimiento a una célula, v.g., hacen que la célula sea más sensible a los efectos deletéreos de ciertos compuestos
o condiciones ambientes que células idénticas por lo demás que no expresan el marcador.
Los marcadores de resistencia a los antibióticos son un ejemplo no limitante de una clase de marcador seleccionable que puede utilizarse para seleccionar células que expresan el marcador. En presencia de una concentración apropiada de antibiótico (condiciones selectivas), un marcador de este tipo confiere una ventaja de crecimiento a una célula que expresa el marcador. Así, las células que expresan el marcador de resistencia a los antibióticos son capaces de sobrevivir y/o proliferar en presencia del antibiótico, en tanto que las células que no expresan el marcador de resistencia a los antibióticos no son capaces de sobrevivir y/o son incapaces de proliferar en presencia del antibiótico. Por ejemplo, un marcador seleccionable de este tipo que se utiliza comúnmente en células de plantas es la proteína NPTII, que codifica una proteína que proporciona resistencia contra el antibiótico kanamicina. Marcadores seleccionables adicionales incluyen proteínas que confieren resistencia contra la carbenicilina (v.g., βlactamasas), proteínas que confieren resistencia contra la gentamicina (higromicina, etc.).
Una segunda clase no limitante de marcadores seleccionables son los marcadores nutricionales. Tales marcadores son generalmente enzimas que funcionan en un camino de biosíntesis para producir un compuesto que es necesario para el crecimiento o la supervivencia de la célula. En general, en condiciones no selectivas el compuesto requerido está presente en el ambiente o se produce en la célula por un camino alternativo. En condiciones selectivas, es necesario el funcionamiento del camino de biosíntesis en el cual está involucrado el marcador para producir el compuesto.
En general, un marcador seleccionable es un marcador cuya presencia en el interior de una célula puede detectarse por medios distintos del sometimiento de la célula a una condición selectiva o la medida directa del nivel del marcador propiamente dicho. Así, en general, la expresión de un marcador detectable dentro de una célula da como resultado la producción de una señal que puede ser detectada y/o medida. El proceso de detección o medida puede implicar el uso de reactivos adicionales y puede implicar el procesamiento de la célula. Por ejemplo, en el caso en que el marcador detectable es una enzima, la detección o medida del marcador implicará típicamente proporcionar un sustrato para la enzima. Preferiblemente, la señal es una señal fácilmente detectable tal como luz, fluorescencia, luminiscencia, bioluminiscencia, quimioluminiscencia, productos de reacción enzimática, productos susceptibles de tinción, o color. Así, marcadores detectables preferidos para uso en la presente invención incluyen proteínas fluorescentes tales como la proteína fluorescente verde (GFP) y variantes de la misma. Otros marcadores adecuados incluyen luciferasa, proteína fluorescente amarilla (YFP), liquenasa, β-galactosidasa, fosfatasa alcalina, etc. Preferiblemente, el marcador detectable es uno que puede ser detectado en células vivas intactas de raíz y/o plantas.
Otro ejemplo de un vector viral preferido para uso en la presente invención es un vector AlMV en el cual está insertado un polinucleótido de interés, como se muestra en la Figura 5. Por ejemplo, el polinucleótido de interés puede reemplazar el componente codificante CP de AlMV en RNA3 de AlMV. La transcripción del polinucleótido de interés puede ponerse bajo control del promotor de CP de AlMV. Alternativamente, el polinucleótido puede reemplazar al componente codificante MP de AlMV, y su transcripción puede ponerse bajo control del promotor MP de AlMV. En otras realizaciones, el polinucleótido insertado no reemplaza secuencias virales endógenas. El polinucleótido de interés puede insertarse en marco con secuencias codificantes de CP (completas o parciales), de tal modo que se produce una proteína de fusión. En ciertas realizaciones de la invención, la proteína de fusión comprende un sitio de escisión entre la porción de CP y el resto, de tal modo que la proteína de fusión puede escindirse para proporcionar una proteína de interés exenta de secuencias CP (o que contiene solamente un pequeño número de tales secuencias). En ciertas realizaciones de la invención, la proteína de fusión se ensambla en partículas, lo que puede facilitar la purificación y/o presentación del antígeno (v.g., véanse las patentes U.S. Nos.
6.042.832 y 6.448.070).
Otro ejemplo adicional de un vector útil en la práctica de la presente invención es un vector viral del virus del mosaico de la coliflor (CMV) en el cual un polinucleótido de interés está insertado bajo control del promotor CP de CMV, reemplazando el componente codificante CP de CMV encontrado en el genoma del CMV existente naturalmente.
En ciertas realizaciones de la invención, es deseable insertar una porción de secuencia codificante o no codificante de un vector viral de un tipo de virus en un vector viral de otro tipo. Por ejemplo, ciertas secuencias pueden
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aumentar la replicación o expresión, etc. Tales secuencias pueden comprender, por ejemplo, parte o la totalidad de una UTR 5' o 3' de un transcrito viral.
Generalmente, con objeto de preservar la función viral y también simplemente para facilitar la manipulación genética, los vectores virales se prepararán por alteración de un genoma de virus de planta existente, por ejemplo por eliminación de genes particulares y/o por disrupción o sustitución de secuencias particulares a fin de desactivar o reemplazar las mismas. En tales circunstancias, los vectores exhibirán identidad de secuencia muy alta con los genomas virales naturales. Por supuesto, pueden prepararse también vectores completamente nuevos, por ejemplo, por aislamiento separado de elementos genéticos deseados individuales y unión entre sí de los mismos, opcionalmente con la inclusión de elementos adicionales. Debe indicarse que cuando se dice que un vector de virus de planta expresa afirmativamente una proteína o actividad particular necesaria para la replicación viral, el movimiento, o cualquier otra función viral, no es necesario que el gen relevante sea idéntico al gen correspondiente que se encuentra en la naturaleza. Con tal que la proteína sea funcional, aquél puede utilizarse de acuerdo con la presente invención. Sin embargo, generalmente se prefiere una identidad de secuencia muy alta con la proteína natural. Por ejemplo, deberían evitarse por lo general deleciones largas (v.g., mayores que aproximadamente 25 aminoácidos), conforme a ciertas realizaciones de la invención. Típicamente, las proteínas virales expresadas de acuerdo con la presente invención exhibirán al menos 50%, preferiblemente 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad de secuencia con la proteína viral natural correspondiente. Más particularmente, la proteína viral de inventiva debería exhibir típicamente 100% de identidad con porciones funcionales críticas (típicamente de al menos varios aminoácidos, a menudo de al menos 10, 20, 30, 40, 50 o más aminoácidos) de la proteína viral natural relevante.
Se indicará que en el caso de muchas proteínas, pueden hacerse varios cambios de aminoácidos sin afectar significativamente a la actividad funcional y/o diversas otras propiedades de la proteína tales como estabilidad, etc. En particular, muchas proteínas toleran cambios de aminoácidos conservadores, es decir, la sustitución de un aminoácido con un aminoácido diferente que tiene propiedades similares (sustitución conservadora) en muchas posiciones sin reducción significativa de la actividad. La sustitución conservadora de aminoácidos es bien conocida en la técnica y representa un enfoque para obtener un polipéptido que tenga propiedades similares o sustancialmente similares a las de un polipéptido dado en tanto que se altera la secuencia de aminoácidos. En general, los aminoácidos se han clasificado y dividido en grupos de acuerdo con (1) carga (positiva, negativa, o nula); (2) volumen y polaridad; (3) distancia físico-química de Grantham; y combinaciones de éstos. Véase, v.g., Zhang, J., J. Mol. Evol., 50: 56-68, 2000; Grantham R., Science, 85: 862-864, 1974; Dagan, T., et al., Mol. Biol. Evol., 19(7), 1022-1025, 2002; Biochemistry, 4ª Ed., Stryer, L., et al., W. Freeman and Co., 1995; y la Patente U.S. No.
6.015.692. Por ejemplo, los aminoácidos pueden dividirse en las 6 categorías siguientes basadas en volumen y polaridad: especiales (C), neutros y pequeños (A, G, P, S, T); polares y relativamente pequeños (N, D, Q, E); polares y relativamente grandes (R, H, K), no polares y relativamente pequeños (I, L. M, V), y no polares y relativamente grandes (F, W, Y). Una sustitución de aminoácido conservadora puede definirse como una que reemplaza un aminoácido con un aminoácido del mismo grupo. Así pues, pueden derivarse una diversidad de proteínas funcionalmente equivalentes por realización de una o más sustituciones de aminoácidos, v.g. sustituciones conservadoras de aminoácidos, en una proteína viral dada.
C. Linajes de Raíz Clonales
La presente invención proporciona métodos para generar un linaje de raíces clonales en el cual se utiliza un vector viral de planta para dirigir la expresión de un polinucleótido de interés. Las figuras 6A-6E muestran los pasos del método conforme a ciertas realizaciones de la invención. Como se muestra en la Figura 6, uno o más vectores de expresión viral que incluye(n) un polinucleótido de interés enlazado operativamente a un promotor se introducen en una planta o una porción de la misma conforme a cualquiera de una diversidad de métodos conocidos. Por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 2, pueden inocularse hojas de plantas con transcritos virales. Los vectores propiamente dichos pueden aplicarse directamente a las plantas (v.g., por inoculaciones abrasivas, inoculaciones de pulverización mecanizada, infiltración a vacío, bombardeo con partículas, o electroporación). Alternativamente, se pueden preparar viriones (v.g., a partir de plantas ya infectadas), y pueden aplicarse a otras plantas conforme a técnicas conocidas.
En el caso de que la infección deba realizarse por aplicación directa de un genoma viral a una planta, puede utilizarse cualquier técnica disponible para preparar el genoma. Por ejemplo, muchos virus que se emplean útilmente conforme a la presente invención tienen genomas de ssRNA. El ssRNA se puede preparar por transcripción de una copia de DNA del genoma, o por replicación de una copia de RNA, sea in vivo o in vitro. Dada la fácil disponibilidad de sistemas de transcripción in vitro fáciles de utilizar (v.g., SP6, T7, lisado de reticulocitos, etc.), así como la conveniencia del mantenimiento de una copia de DNA de un vector de RNA, es de esperar que se preparen a menudo vectores de ssRNA de inventiva por transcripción in vitro, particularmente con polimerasa T7 o SP6. Pueden utilizarse también clones infecciosos de cDNA. También se puede utilizar transferencia génica mediada por agrobacterias para transferir ácidos nucleicos virales tales como vectores virales (sea genomas virales enteros o porciones de los mismos) a células de plantas utilizando, v.g., agroinfiltración, de acuerdo con métodos conocidos en la técnica.
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polinucleótido expresado pueda ser ingerido indeseablemente. No obstante, en otras realizaciones será deseable emplear plantas comestibles.
A menudo, ciertas características deseables de la planta estarán determinadas por el polinucleótido particular a expresar. Para ofrecer solamente unos pocos ejemplos, cuando el polinucleótido codifica una proteína que debe producirse con rendimiento elevado (como será el caso a menudo, por ejemplo cuando deben expresarse proteínas terapéuticas), será deseable a menudo seleccionar plantas con biomasa relativamente alta (v.g., tabaco, que tiene las ventajas adicionales de que es altamente susceptible de infección viral, tiene un periodo de crecimiento corto, y no se encuentra en la cadena alimentaria humana). En el caso en que el polinucleótido codifica una proteína cuya actividad plena requiere (o es inhibida por) una modificación particular posterior a la traducción, la capacidad (o incapacidad) de ciertas especies de plantas para realizar la modificación relevante (v.g., una glicosilación particular) puede dirigir la selección.
En ciertas realizaciones preferidas de la invención, se utilizan plantas de cosecha, o plantas relacionadas con cosechas. En algunas realizaciones particularmente preferidas, se utilizan plantas comestibles.
Plantas preferidas para uso de acuerdo con la presente invención incluyen Angiospermas, Briofitas (v.g., Hepáticas, Musgos, etc.), Pteridofitas (v.g., helechos, equisetos, licopodios), Gimnospermas (v.g., Coníferas, Cicasa, Ginko, Gnetales), y Algas (v.g., Clorofíceas, Feofíceas, Rodofíceas, Mixofíceas, Xantofíceas, y Euglenofíceas). Se prefieren particularmente miembros de la familia Leguminosas (Fabáceas; v.g., guisante, alfalfa, soja); Gramíneas (Poáceas; v.g., maíz, trigo, arroz); Solanáceas, particularmente del género Lycopersicon (v.g., tomate), Solanum (v.g., patata, berenjena), Capsium (v.g. pimiento), o Nicotiana (v.g. tabaco); Umbelíferas, particularmente del género Daucus (v.g., zanahoria), Apium (v.g., apio), o Rutáceas (v.g., naranjas); Compuestas, particularmente del género Lactuca (v.g., lechuga); Brasicáceas (Crucíferas), particularmente de los géneros Brassica o Sinapis. Miembros particularmente preferidos de la familia Brasicáceas incluyen Brassica campestris, B. carinata, B. juncea, B. napus, B. nigra, B. oleraceae, B. tournifortii, Sinapis alba, y Raphanus sativus.
III. Polinucleótidos y Polipéptidos de Interés
La doctrina de la presente invención puede emplearse para suministrar a y/o expresar en células de plantas cualquier polinucleótido de interés. Por ejemplo, polinucleótidos codificantes de proteínas pueden expresar enzimas, anticuerpos, hormonas, citocinas, factores de regulación, proteínas estructurales, o cualquier otra proteína o polipéptido de interés. Las proteínas codificadas pueden ser proteínas existentes naturalmente, o pueden ser proteínas diseñadas o manipuladas genéticamente, incluyendo por ejemplo proteínas de fusión (v.g., proteínas de fusión que incorporan parte o la totalidad de una proteína de virus de planta tal como MP o CP). Véanse, v.g., los documentos U.S. Pat. Nos. 6.448.070 y 6.660.500. Pueden codificarse numerosos tipos de proteínas de fusión. Una secuencia heteróloga puede fusionarse al extremo 5' o 3' de una proteína de virus de plantas o localizada internamente. Numerosas secuencias de origen diverso pueden incluirse dentro de una sola proteína de fusión. La proteína codificada puede comprender un sitio de escisión, que puede estar codificado por el polinucleótido insertado o por el vector viral. Véase, v.g., U.S. Pat. No. 6.740.740. Por ejemplo, el vector puede comprender una porción que codifica un sitio de escisión aguas arriba de una porción que codifica CP de tal modo que cuando un polinucleótido de interés se inserta entre el promotor CP y la porción que codifica un sitio de escisión, el marco de lectura abierto resultante codifica una proteína de fusión que contiene una porción codificada por el polinucleótido de interés, un sitio de escisión, y parte o la totalidad de la CP. La escisión de la proteína de fusión en el sitio de escisión libera el polipéptido de interés codificado. El sitio de escisión puede ser un sitio para escisión por medios químicos (v.g., bromuro de cianógeno) o por medios enzimáticos (v.g., por una proteasa tal como tripsina, quimotripsina, trombina, pepsina, la proteasa V8 de Staphylococcus aureus, y la proteasa del Factor Xa).
En ciertas realizaciones de la invención, el polinucleótido de interés comprende una porción que codifica una etiqueta, v.g., una etiqueta 6X-His, etiqueta HA, etiqueta Myc, etiqueta FLAG, etc. Tales etiquetas pueden simplificar la detección, el aislamiento y/o la purificación de la proteína. En ciertas realizaciones de la invención, la etiqueta es una etiqueta escindible, v.g., una etiqueta escindible por medios químicos o por medios enzimáticos como se ha descrito arriba. La inclusión de un sitio de escisión permite que la etiqueta se separe fácilmente del polipéptido traducido, v.g., después de la purificación, dando como resultado una proteína con secuencia de tipo salvaje. Debe entenderse que la etiqueta y/o el sitio de escisión pueden estar presentes dentro de un vector viral en el cual debe insertarse un polinucleótido particular de interés y no precisa estar presente dentro del polinucleótido insertado propiamente dicho. Una vez que se inserta el polinucleótido, la porción entera que comprende la o las regiones que codifica(n) la etiqueta, el sitio de escisión, y el polinucleótido recién insertado se considera un polinucleótido de interés.
En algunos casos, puede ser deseable utilizar el sistema de inventiva para expresar más de una cadena polipeptídica en la misma raíz clonal o linaje de células de plantas o plantas clonales (v.g., utilizando dos vectores virales diferentes cada uno de los cuales dirige la expresión de un polinucleótido, insertando dos polinucleótidos diferentes en un solo vector viral, utilizando una planta transgénica que expresa uno o más polinucleótidos para generar una raíz clonal o linaje de células de plantas o plantas clonales), por ejemplo a fin de producir una proteína
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se comprenderá que el uso total diario de las composiciones de la presente invención será decidido preferiblemente por un médico encargado del caso dentro del alcance de un criterio médico sólido. El nivel de dosis terapéuticamente eficaz específico para cualquier paciente u organismo particular puede depender de diversos factores que incluyen el trastorno de que se trate y la gravedad del trastorno; la actividad del compuesto específico empleado; la composición específica empleada; la edad, peso corporal, estado general de salud, sexo del paciente, dieta del paciente, condición farmacocinética del paciente, tiempo de administración, ruta de administración, y tasa de excreción del compuesto respectivo empleado; la duración del tratamiento, los fármacos utilizados en combinación o coincidentes con el compuesto específico empleado; y factores análogos bien conocidos en las técnicas médicas.
Se apreciará también que las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden emplearse en terapias de combinación, es decir, las composiciones farmacéuticas se pueden administrar simultáneamente con, antes de, o subsiguientemente a, uno o más otros agentes terapéuticos o procedimientos médicos deseados. La combinación particular de terapias (terapéuticas o procedimientos) a emplear en un régimen de combinación tendrá en cuenta la compatibilidad de los agentes terapéuticos y/o procedimientos deseados y el efecto terapéutico deseado a alcanzar. Se apreciará también que las terapias empleadas pueden alcanzar un efecto deseado para el mismo trastorno (por ejemplo, un compuesto de inventiva puede administrarse simultáneamente con otro agente anti-cáncer), o pueden alcanzar efectos diferentes.
Ejemplos
Ejemplo 1: Construcción de Vectores Recombinantes de Virus de Plantas
Se emplearon vectores basados en el Virus del Mosaico del Tabaco que están adaptados para inserción de un polinucleótido de interés a fin de crear un vector para uso en la generación de linajes de raíz clonal, linajes de células de raíz clonal, linaje de células de plantas clonales, y/o plantas clonales que expresan un polinucleótido de interés conforme a la presente invención. La Figura 1 muestra un diagrama esquemático de un vector basado en TMV, D4, que se manipuló genéticamente para aceptar la inserción de un polinucleótido de interés (Shivprasad et al., Virology, 255 (2): 312-23, 1999), e ilustra la inserción de diversos polinucleótidos de interés en el vector. D4 contiene una deleción de las secuencias codificantes de la proteína de la cubierta (CP) de TMV, pero retiene el promotor subgenómico de CP de TMV y la región no traducida (UTR) 3' de TMV, como se indica en la figura. Las proteínas de 126 y 183 kD son necesarias para la replicación de TMV. La proteína de 30 kD es la proteína de movimiento (MP), utilizada para el movimiento célula-a-célula. D4 contiene sitios PacI y XhoI aguas abajo del promotor subgenómico de CP, proporcionando un sitio para inserción conveniente de un polinucleótido de interés. Vectores particulares creados por inserción de diversos polinucleótidos de interés en D4 se describen más adelante.
D4C3GFP es un vector de expresión basado en TMV que es deficiente en producción de CP (Shivprasad et al., 1999: TTT-GFP) como resultado de la deleción de la región codificante de CP de TMV y su reemplazamiento con el gen C3GFP, que está bajo control del promotor subgenómico de CP de TMV. El gen C3GFP se clonó de nuevo en D4 por solapamiento PCR para eliminar los sitios NcoI y XhoI en la secuencia de nucleótidos de GFP C3 a fin de facilitar pasos de clonación ulteriores. Se introdujo un polienlazador PstI-NotI-XhoI en el extremo 3' del gen C3GFP. El producto PCR digerido con PacI-XhoI se clonó en D4 dando como resultado D4C3GFP. Los cebadores utilizados por los inventores para modificar el gen C3GFP y eliminar los sitios NcoI y XhoI son:
1) C3GFP.PacI.Dir(N)
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GGGAG.ATCTT.AATTA.ATGGC.TAGCA.AAGGA.GAAGA.A
36nt
2) C3GFP.XhoI.Inv(N)
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CCCCT.CGAGC.GGCCG.CTGCA.GTTAT.TTGTA.GAGCT.CATCC.ATGCC
45nt
3) C3GFP.Nco1.Dir
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GTTCC.CTGGC.CAACA.CTTGT.CAC
23nt
4) C3GFP.Ncol.Inv
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TAGTG.ACAAG.TGTTG.GCCAG.GG
22nt
5) C3GFP.XhoI.Dir
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GGACA.CAAAC.TGGAG.TACAA.CTATA
25nt
6) C3GFP.XhoI.Inv
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AGTTA.TAGTT.GTACT.CCAGT.TTGTG
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7) (BglII)-PacI
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