JP2018523988A - 黄色部分および赤色部分の果実を有するトマト植物 - Google Patents

黄色部分および赤色部分の果実を有するトマト植物 Download PDF

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Abstract

本発明は、果実を横切って内部の種子部位から表皮の最外層まで現れる赤色部分および黄色部分を含む果実を有するトマト植物に関する。本発明は、Ａｒｌｅｃｃｈｉｎｏと命名されたこの表現型がフィトエン合成酵素１（Ｐｓｙ１）遺伝子内の挿入変異に関連づけられていることを開示する。【選択図】なし

Description

本発明は、赤色−黄色二色の果肉と表皮を有し、そのゲノム内のフィトエン合成酵素１（Ｐｓｙ１）遺伝子内に挿入変異を含む、トマト植物に関する。
トマトは、世界的に多くの栽培物の基本的な栄養成分である。トマトは、そのビタミン、ミネラルおよび抗酸化の含有量で知られており、これらの健康に有益な成分を消費者に提供する。多数の品種のトマトは市場で入手可能であり、栄養および味のパラメータに加えて、色および全体的な外観は個人の顧客ならびに料理専門の顧客によるトマト果実の購買に影響を及ぼすことが認識されている。
トマト果実の色は、１１の共役二重結合による直鎖状カロテン分子であるリコペンによって供給される。リコペンは果実の成熟期にクロモプラスト内に高濃度で蓄積される。リコペンの生合成は、主にカロテノイド生合成酵素の遺伝子発現レベルで調節される。果実の成熟時、リコペンの上流の酵素の遺伝子は増加するが、リコペンをα−カロテンおよびβ−カロテンに代謝するリコペンシクラーゼの遺伝子は発現停止する。
作物種の改良は、農業の始まり以来、人間が根本的に追求してきたことであった。時には単一の植物よってでも表される独特の植物表現型が最初の古代の栽培家の目を引いたことは想像することができる。改良プロセスが行われた方法は、深刻な遺伝的ボトルネックで明らかになることが多い創始者効果となった。初期の栽培化および現代の育種の活動時に負わされたこれらの遺伝的ボトルネックの結果、ほとんどの作物種の栽培品種はそれらの野生原種および在来品種に現れた変異のごく一部だけを保有することになる（Ｔａｎｋｓｌｅｙ Ｓ ＤおよびＭｃＣｏｕｃｈ Ｓ Ｒ．１９９７ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７：１０６３−１０６６）。現代の作物における限られた遺伝的変異は、種々の植物病害および害虫に対する遺伝的脆弱性の原因の一つである。さらに、それは、農業の重要性とともに形質を改良するためのより良好な遺伝子および対立遺伝子の組み合わせを取得する機会を低減させ、育種障壁を示す。
遺伝学、分子生物および植物育種の分野において最も強力で効率的な方法の１つは、変異体の変種に基づいている。変異は、既存の多様性のサバイバビリティーを改良するため、および新規の生態型、品種および種の進化のために変種を作出する主要な進化力である。しかし、自然発生突然変異体の出現頻度が非常に低いので、これらの変異体が提供する遺伝子および生物学的現象についての情報は、比較的少ない。したがって、人為的な突然変異誘発方法が開発され、変異を誘発するために適用されている。誘発された変異は、次に、遺伝子機能を発見するためおよび開発プロセスを理解するためにツールとして用いられる。
トマト変異の利用可能な供給源は、トマト同系交配品種Ｍ８２のプロセシングの遺伝的背景における本発明の発明者の１人と共同研究者らによって作成された同質遺伝子トマト「変異ライブラリー」である（Ｍｅｎｄａ Ｎら，２００４．Ｐｌａｎｔ Ｊ．３８：８６１−８７２）。このライブラリーを作成するために、種子のエチルメタンスルホナート（ＥＭＳ）化学処理由来、および高速中性子突然変異誘発由来の計１３，０００Ｍ２ファミリーは、圃場条件下で栽培されたとき、表現型が決定された。これらの表現型に基づいて、ファミリーは、１５の一次カテゴリと４８の二次カテゴリを含む形態的カタログに分類された。３０００を超える変異はこのライブラリーで同定された。一部の突然変異は、そのほとんどがＭ８２における同質遺伝子である、Ｔｏｍａｔｏ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ（ＴＧＲＣ）の単一遺伝子変異体コレクションからの前述の表現型の新しい対立遺伝子を表す。加えて、遺伝子座あたり複対立遺伝子を有する１，０００を超える新規の表現型が同定された。
同様の表現型を共有する変異体間の対立性検定の結果は、この集団が、遺伝子の大部分に的中し（例えば、優性ＬＡＮＣＥＯＬＡＴＥ変異から８の独立した対立遺伝子が同定され；黄色の結実した黄色果肉変異から５の対立遺伝子が観察された）、飽和状態に達しているという仮説を確認した。加えて、ＥＭＳの２つの処理を受けた１，０００のＥＭＳファミリーのスクリーニングでは、結果として新規の表現型を生じなかった。
作物改良をもたらすために遺伝子変異の供給源としての野生種の可能性は２１世紀初期に認識された（Ｚａｍｉｒ Ｄ．２００１．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ．２：９８３−９８９）。初期の種間の交配の試みは、例えば、野生種と栽培作物の間の交配の不適合；一代雑種不稔性；分離世代の不稔性；野生種染色体と栽培作物染色体の間の組換えの減少；および負の影響を有する遺伝子と、関心対象の遺伝形質との間の密な連鎖（ＭｃＣｏｕｃｈ Ｓ． ２００４．ＰＬｏＳ Ｂｉｏｌ．２）の深刻な問題に遭遇した。これらの障壁にもかかわらず、野生遺伝子移入育種は、現代の品種の開発に、主に一遺伝子形質または時には単一遺伝子形質と呼ばれる形質の供給源として大きく貢献し、ならびにより小さい程度では、複合形質、例えば、量的形質遺伝子座によって影響を受ける収量、組成品質および種々のストレスに対する抵抗性に貢献した（ＱＴＬ；Ｆｅｒｎｉｅ Ａ Ｒ ら，２００６．Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ．９：１９６−２０２）。
新しいトマト表現型を作出するための上記のツールにも関わらず、新しい、魅力的な色の果実をつける安定した栽培品質を求める市場の需要が常にある。
本発明は、内部の胎座および／または子室から果皮の外部表皮層まで果実全体にわたり、黄色−赤色部分を有する果実を生産するトマト栽培品種に関する。本明細書でＡｒｌｅｃｃｈｉｎｏと命名したこの黄色−赤色のストライプ表現型は、単一の果実において各色の１つのストライプまたは部分から、果実において各色の複数のストライプまでを含み得る。黄色−赤色交互の果皮表現型を有するこれまで知られている果実と対照的に、Ａｒｌｅｃｃｈｉｎｏ表現型は果実全体にわたり色の部分を示す。
本発明はさらに、本発明の植物の種子と、その種子から生長した植物と、それらの子孫と、該植物によって生産される果実と、それから由来する植物の部分と、同植物を生産する方法とに関する。
本発明は、市販栽培品種と野生種トマトとの人工交雑から始まったトマト戻し交雑自殖系統の集団において予想外の変異の発見に一部基づく。変異、すなわちフィトエン合成酵素１（Ｐｓｙ１）遺伝子内の挿入変異は、上述のＡｒｌｅｃｃｈｉｎｏ表現型に関連づけられている。Ａｒｌｅｃｃｈｉｎｏ表現型の黄色部分は、Ｐｓｙ１遺伝子内のエキソン８とエキソン９の間に存在する遺伝子のイントロン８での挿入に起因する（図８に示す遺伝子構造による、Ｇｉｏｒｉｏ Ｇら，２００８．ＦＥＢＳ Ｊ．２７５：５２７−５３５によって発表された遺伝子構造の最新版）。
Ａｒｌｅｃｃｈｉｎｏ果実の黄色の部分で観察された最初の挿入は、核酸配列ＡＴＣＴＧＧＡＴＡ（配列番号１）を含む９個のヌクレオチドであった。Ｐｓｙ１遺伝子内のこの挿入の位置は、核酸配列ＴＣＴＧＧＡＴＡ（配列番号２）を含み、１個のアデニン（Ａ）ヌクレオチドによって区切られた８個のヌクレオチドの直接反復を示した。高忠実度ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＧＸＬ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ））を用いた挿入のさらなる解析、クローニングおよび増幅したポリヌクレオチドの配列決定により、Ａｒｌｅｃｃｈｉｎｏ表現型と関連して、配列番号２に記載の核酸配列と隣接しているトランスポゾンの挿入が明らかになった。それにもかかわらず、アデニン（Ａ）ヌクレオチドによって区切られた直接反復を含む核酸配列ＴＣＴＧＧＡＴＡＡＴＣＴＧＧＡＴＡ（配列番号７）を含むＰＣＲ産物は、標準ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＲＥＡＤＹ−ＭＩＸキット（Ｓｙｎｔｅｚｚａ）を用いてＡｒｌｅｃｃｈｉｎｏ果実の黄色部分から得られた遺伝子物質から増幅される。
黄色部分の細胞において、挿入はホモ接合型で見つかっている。Ａｒｌｅｃｃｈｉｎｏ表現型の赤色部分は、野生型Ｐｓｙ１対立遺伝子またはイントロン内の直接反復領域の可変配列を含むトランスポゾン除去フットプリントを含むＰｓｙ１対立遺伝子のいずれかを含む。
どのような特定の理論または作用機構にも束縛されることを望むことなく、これまで未知のこの変異は、人工の遺伝的交雑を介して達成された異なるゲノムを統合する結果であり得る。
一態様によれば、本発明は、胎座および／または子室から果実の果皮を横切って表皮に及ぶ黄色−赤色部分のＡｒｌｅｃｃｈｉｎｏ表現型を有する果実を生産するトマト栽培品種を提供し、該表現型がｒａｒｌの少なくとも１つの対立遺伝子に関連づけられ、前記ｒａｒｌ対立遺伝子が該対立遺伝子のイントロン内に挿入を含むフィトエン合成酵素１（Ｐｓｙ１）対立遺伝子であり、該挿入がＰｓｙ１の非機能的スプライスバリアントをもたらす。
いくつかの実施形態によれば、Ａｒｌｅｃｃｈｉｎｏ果実の黄色の部分の細胞は、ｒａｒｌ対立遺伝子に対してホモ接合性である。
いくつかの実施形態によれば、挿入は、トランスポゾン３’末端で核酸配列ＴＣＴＧＧＡＴＡ（配列番号２）と隣接しているトランスポゾンを含む。さらなる実施形態によれば、挿入は、トランスポゾン３’末端で核酸配列ＡＴＣＴＧＧＡＴＡ（配列番号１）と隣接しているトランスポゾンを含む。
いくつかの実施形態によれば、トランスポゾンはｈＡＴファミリーに属する。一部の実施形態によれば、トランスポゾンは、配列番号３に記載の核酸配列と少なくとも９０％または少なくとも９５％以上相同の核酸配列を含む。各可能性は、本発明の別々の実施形態を意味する。いくつかの例示的な実施形態によれば、トランスポゾンは、配列番号３に記載の核酸配列を含む。さらなる例示的な実施形態によれば、トランスポゾンは、配列番号３に記載の核酸配列からなる。
いくつかの実施形態によれば、Ｐｓｙ１遺伝子内の挿入は、配列番号４に記載の核酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％以上相同の核酸配列を含む。いくつかの例示的な実施形態によれば、Ｐｓｙ１遺伝子内の挿入は、配列番号４に記載の核酸配列を含む。さらなる例示的な実施形態によれば、Ｐｓｙ１遺伝子内の挿入は、配列番号４に記載の核酸配列からなる。
いくつかの例示的な実施形態によれば、Ｐｓｙ１のｒａｒｌ対立遺伝子は、配列番号５に記載の核酸配列を含む。
いくつかの実施形態によれば、野生型（ｗｔ）Ｐｓｙ１対立遺伝子は、配列番号６に記載の核酸配列を含む。
一部の実施形態によれば、トマト栽培品種は、ｒａｒｌ対立遺伝子に対してホモ接合性の少なくとも１つの果皮細胞と、少なくとも１つの野生型Ｐｓｙ１対立遺伝子を含む少なくとも１つの果皮細胞またはトランスポゾン除去フットプリントを含む少なくとも１つのＰｓｙ１対立遺伝子とを含む。
いくつかの実施形態によれば、トランスポゾン除去フットプリントは、核酸配列ＴＣＴＧＧＡＴＡＡＴＣＴＧＧＡＴＡ（配列番号７）内に少なくとも１つのヌクレオチド欠失を含む。一部の実施形態によれば、トランスポゾン除去フットプリントは、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つまたは少なくとも８つのヌクレオチド欠失を含む。各可能性は、本発明の別々の実施形態を意味する。
一部の実施形態によれば、果実は催色期およびそれ以降、成熟果実である。一部の例示的な実施形態によれば、果実は完熟した果実である。
トマト果実全体が黄色−赤色のストライプもしくは部分表現型を示すこともあり得、またはストライプ／部分が果実の一部分にのみに現れることもあり得ることを明確に理解すべきである。ストライプの幅も可変的であり得るので、単一果実は、赤色部分が１つと黄色部分が１つ果実全体を覆うものから、複数の狭い赤色ストライプと黄色ストライプが果実すべてまたは一部分を覆うものまで含み得る。すべての外観は、本発明に包含される。
一部の実施形態によれば、トマト栽培品種は、小さい果実（サクランボ様果実）を生産する。いくつかの例示的な実施形態によれば、トマト栽培品種は、ソラヌム・リコペルシクム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）である。
さらなる実施形態によれば、トマト栽培品種は、そのゲノム内に黄色果肉表現型をコードする追加のＰｓｙ１変異対立遺伝子をさらに含む。一部の実施形態によれば、黄色果肉表現型をコードするＰｓｙ１遺伝子は、配列番号８および配列番号９のいずれか１つに記載の核酸配列を含む。これらの実施形態によれば、Ａｒｌｅｃｃｈｉｎｏトマト栽培品種は、少なくとも１つのｒａｒｌ対立遺伝子と、黄色果肉表現型をコードする少なくとも１つのＰｓｙ１変異対立遺伝子と、少なくとも１つの野生型Ｐｓｙ１対立遺伝子、またはトランスポゾン除去フットプリントを含むＰｓｙ１対立遺伝子とを含む。いくつかの例示的な実施形態によれば、Ａｒｌｅｃｃｈｉｎｏ果実の黄色部分は１つのｒａｒｌ対立遺伝子と、黄色果肉表現型をコードする１つのＰｓｙ１変異対立遺伝子とを含み、および赤色部分は野生型Ｐｓｙ１対立遺伝子および／またはトランスポゾン除去フットプリントを含むＰｓｙ１対立遺伝子を含む。
さらなる実施形態によれば、トマト栽培品種は、商業成長のために好適である。
トマト栽培品種は、有利には、当技術分野で周知である有益な農業形質、例えば、高い発芽率、除草剤抵抗性、虫害抵抗性、細菌、真菌またはウイルス性疾患への抵抗性、種々の非生物的ストレスへの抵抗性、雄性不稔、活発な生長およびその任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。これらの形質は、トマト栽培品種の遺伝的背景の一部を形成することもあり、または当業者に周知の任意の方法、育種、単一形質転換および形質転換を含むがこれに限定されない方法によって導入されることができる。
別の態様によれば、本発明は、ｒａｒｌ対立遺伝子に対してホモ接合性のトマト栽培品種を提供し、ｒａｒｌ対立遺伝子はトランスポゾン３’末端に核酸配列ＴＣＴＧＧＡＴＡ（配列番号２）と隣接しているトランスポゾンの挿入を含むフィトエン合成酵素１（Ｐｓｙ１）対立遺伝子であり、トマト栽培品種は完全に黄色の果実を生産する。いくつかの例示的な実施形態によれば、完全に黄色の果実を生産するトマト栽培品種は、配列番号５に記載の核酸配列を含むｒａｒｌ対立遺伝子に対してホモ接合性である。
本発明は、本発明のトマト栽培品種の種子も提供し、種子から生長した植物は胎座および／または子室から果実の果皮を横切って表皮に及ぶ黄色−赤色部分のＡｒｌｅｃｃｈｉｎｏ表現型を有する果実を生産し、該表現型はｒａｒｌ対立遺伝子に関連づけられ、ｒａｒｌ対立遺伝子は該対立遺伝子のイントロン内に挿入を含むフィトエン合成酵素１（Ｐｓｙ１）対立遺伝子であり、該挿入はＰｓｙ１の非機能的スプライスバリアントをもたらす。
本発明のトマト栽培品種からの花粉と胚珠、これらから生産された種子、これらの種子から生長した植物、これらの植物から生産され、Ａｒｌｅｃｃｈｉｎｏ表現型を有する果実も本発明の範囲内に包含される。
本発明のトマト栽培品種の再生可能な細胞またはその部分の組織培養、葉、花粉、胚、根、根端、葯、花、果実および種子からなる群から選択される植物部分から得られる再生可能な細胞、ならびに胎座および／または子室から果実の果皮を横切って表皮に及ぶ黄色−赤色部分のＡｒｌｅｃｃｈｉｎｏ表現型を有する果実を生産する組織培養から再生させた植物も、本発明の範囲内に包含され、該表現型はｒａｒｌ対立遺伝子に関連づけられており、該ｒａｒｌ対立遺伝子は該対立遺伝子のイントロン内に挿入を含むフィトエン合成酵素１（Ｐｓｙ１）対立遺伝子であり、該挿入はＰｓｙ１の非機能的スプライスバリアントをもたらす。
本発明のトマト栽培品種植物は安定した真の育種系統の形で、またはより多様な材料としてあり得、そのすべてはそれらのゲノム内にｒａｒｌ対立遺伝子を含む。
さらなる態様によれば、本発明は、胎座および／または子室から果実の果皮を横切って表皮に及ぶ黄色−赤色部分のＡｒｌｅｃｃｈｉｎｏ表現型を有するトマト果実を提供し、該表現型は果実を生産する栽培トマト植物においてｒａｒｌ対立遺伝子に関連づけられており、該ｒａｒｌ対立遺伝子は該対立遺伝子のイントロン内に挿入を含むフィトエン合成酵素１（Ｐｓｙ１）対立遺伝子であり、該挿入はＰｓｙ１の非機能的スプライスバリアントをもたらす。
いくつかの例示的な実施形態によれば、Ａｒｌｅｃｃｈｉｎｏ表現型を有する果実は、ｒａｒｌ対立遺伝子に対してホモ接合性の少なくとも１つの細胞を含む。さらなる例示的な実施形態によれば、ｒａｒｌ対立遺伝子は、配列番号５に記載の核酸配列を含む。
別の態様によれば、本発明は、胎座および／または子室から果実の果皮を横切って表皮に及ぶ黄色−赤色部分のＡｒｌｅｃｃｈｉｎｏ表現型を有する果実を生産するトマト栽培品種を生産する方法を提供し、該方法はフィトエン合成酵素１のｒａｒｌ対立遺伝子を含む遺伝因子を赤色果実またはその一部を生産するトマト栽培品種に導入することを含み、該ｒａｒｌ対立遺伝子は該対立遺伝子のイントロン内に挿入を含み、該挿入はＰｓｙ１の非機能的スプライスバリアントをもたらす。
いくつかの実施形態によれば、挿入は、トランスポゾン３’末端で核酸配列ＴＣＴＧＧＡＴＡ（配列番号２）と隣接しているトランスポゾンを含む。さらなる実施形態によれば、挿入は、トランスポゾン３’末端で核酸配列ＡＴＣＴＧＧＡＴＡ（配列番号１）と隣接しているトランスポゾンを含む。
これらの実施形態によれば、トランスポゾンは配列番号３と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％相同の核酸配列を含む。各可能性は、本発明の別々の実施形態を意味する。
いくつかの例示的な実施形態によれば、Ｐｓｙ１ ｒａｒｌ対立遺伝子は、配列番号５に記載の核酸配列を含む。
当技術分野で周知の任意の方法を用いて、ｒａｒｌ対立遺伝子を含む遺伝因子を、赤色果実を生産するトマト栽培品種またはその一部に導入することができる。遺伝因子が植物部分、種子、細胞または組織を含むがこれに限定されない部分に導入されるとき、本方法は種子、細胞または組織から栽培品種トマト植物を再生させることをさらに含む。当技術分野で周知のように種子、細胞または組織から植物を再生させる任意の方法を用いることができる。
いくつかの実施形態によれば、遺伝因子は、子孫栽培トマト植物を形成するための遺伝因子を含むドナートマト植物と赤色果実を生産するトマト栽培品種を交雑させることによって導入される。これらの実施形態によれば、本方法は以下のステップをさらに含む：
ａ．ｒａｒｌ対立遺伝子の存在について、各子孫栽培トマト植物またはその部分から採取した核酸試料を調べる；
ｂ．該ｒａｒｌ対立遺伝子を含む子孫栽培トマト植物を選抜する；および
ｃ．ステップ（ｂ）で選抜した植物によって生産される果実を調べて、Ａｒｌｅｃｃｈｉｎｏ表現型を有する果実を生産する栽培トマト植物を選抜する。
別の実施形態によれば、遺伝因子は、前述の遺伝因子により赤色果実を生産するトマト栽培品種の複数の細胞を形質転換することによって導入される。これらの実施形態によれば、本方法は以下をさらに含む：
ａ．ｒａｒｌ対立遺伝子の存在について、各形質転換細胞から採取した核酸試料を調べること；
ｂ．該ｒａｒｌ対立遺伝子を含む複数の細胞を選抜すること、
ｃ．該ｒａｒｌ対立遺伝子を含む複数のトランスジェニック植物を得るために、複数の形質転換細胞を再生させること、および
ｄ．トランスジェニック植物によって生産された果実を調べて、Ａｒｌｅｃｃｈｉｎｏ表現型を有する果実を生産する植物を選抜すること。
いくつかの実施形態によれば、本方法は、後代を作出するために、選抜された栽培トマト植物を少なくとも１回、自殖させること、ｒａｒｌ対立遺伝子を含み、Ａｒｌｅｃｃｈｉｎｏ表現型を有する栽培トマト植物をさらに同定して、選抜することをさらに含む。
ｒａｒｌ対立遺伝子の存在について核酸試料を調べるための当技術分野で周知の任意の方法を本発明の教示に従って用いることができる。
一部の実施形態によれば、本発明は、フィトエン合成酵素１のｒａｒｌ対立遺伝子の存在を特異的に検出する少なくとも１種のプローブまたはプライマー対を提供する。
いくつかの実施形態によれば、プライマー対は、配列番号７（ＴＣＴＧＧＡＴＡＡＴＣＴＧＧＡＴＡ）に記載の核酸配列を含むｒａｒｌ対立遺伝子マーカーを増幅するように設計されている。いくつかの例示的な実施形態によれば、ｒａｒｌ対立遺伝子マーカーは、配列番号１０（ＣＡＧＴＧＣＣＡＧＡＡＧＡＧＧＡＡＧＡ）および配列番号１１（ＴＴＧＣＧＧＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＡＡＧＡ）に記載の核酸配列を含む一対のプライマーによって増幅される。
さらなる実施形態によれば、プライマー対は、完全長トランスポゾン挿入を増幅するように設計されている。いくつかの例示的な実施形態によれば、トランスポゾンは、配列番号１２（ＧＴＧＧＡＴＣＣＴＧＡＡＡＴＧＧＣＴＴＧ）および配列番号１３（ＡＧＴＡＣＴＡＡＴＡＡＡＡＴＧＧＴＴＴＴＧＣＣ）に記載の核酸配列を含む一対のプライマーによって増幅される。
さらなる実施形態によれば、プライマー対は、Ｐｓｙ１対立遺伝子内のトランスポゾン挿入の３’ゲノム接合部を増幅するように設計されている。いくつかの例示的な実施形態によれば、３’トランスポゾン挿入接合部は、配列番号１４（ＧＧＧＣＴＡＧＴＣＧＧＴＧＴＡＴＣＡＴ）および配列番号１１（ＴＴＧＣＧＧＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＡＡＧＡ）に記載の核酸配列を含む一対のプライマーによって増幅される。
さらなる実施形態によれば、プライマー対は、Ｐｓｙ１対立遺伝子内のトランスポゾン挿入の５’ゲノム接合部を増幅するように設計されている。いくつかの例示的な実施形態によれば、５’トランスポゾン挿入接合部は、配列番号１５（ＣＴＧＧＡＡＧＧＧＴＧＡＣＣＧＡＴＡＡＡ）および配列番号１６（ＡＴＧＡＴＡＣＡＣＣＧＡＣＴＡＧＣＣＣ）に記載の核酸配列を含む一対のプライマーによって増幅される。
別の態様によれば、本発明は、胎座および／または子室から果実の果皮を横切って表皮に及ぶ黄色−赤色部分のＡｒｌｅｃｃｈｉｎｏ表現型を有する果実を生産するトマト栽培品種を生産する方法を提供し、本方法は、フィトエン合成酵素１の少なくとも１つの対立遺伝子を挿入変異によって変異導入することを含む。いくつかの実施形態によれば、挿入は、非機能的Ｐｓｙ１対立遺伝子をもたらすイントロン内にある。さらなる例示的な実施形態によれば、挿入は、配列番号６に記載の核酸配列を有するＰｓｙ１遺伝子のエキソン８とエキソン９の間に位置しているイントロン８番内にあり、非機能タンパク質をコードするＰｓｙ１スプライスバリアントをもたらす。
さらなる態様によれば、本発明は、配列番号５に記載の核酸配列を含む変異フィトエン合成酵素１をコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の説明および図面から明白になる。
ソラヌム・ピンピネリフォリウム（種）ＬＡ１５８９戻し交雑自殖系統（ＢＩＬ）集団の構造と、２０１０年にＢＩＬ＃１１２ファミリーの単一植物だけに検出されたＡｒｌｅｃｃｈｉｎｏ変異の作出とを示す。 全果実（Ａ）および横断面（Ｂ）を示す異なる遺伝的背景でのＡｒｌｅｃｃｈｉｎｏ変異表現型を示す。 Ａｒｌｅｃｃｈｉｎｏ表現型および野生型赤色トマト系統を示すＢＩＬ＃１１２交雑から生じた２つの独立したＦ２集団における、果実の色形質の分離を示す。 野生型（Ｍ８２）および黄色果肉変異体ｒ３７５６と比較した、Ａｒｌｅｃｃｈｉｎｏの赤色（ｒ）および黄色（ｙ）部分の果実試料中のカロテノイド濃度（μｇ／ｇ 新鮮重量）を示す。 Ａｒｌｅｃｃｈｉｎｏ果実の赤色部分および黄色部分のＰｓｙ１遺伝子内のトランスポゾン挿入／除去部位のヌクレオチド配列の相違を示す。黄色部分は隣接する反復配列に対してホモ接合性であったが、トランスポゾンが１つの対立遺伝子から除去されたので、赤色部分はこの配列に対してヘテロ接合性であった。 Ａｒｌｅｃｃｈｉｎｏ果実の異なる色部分から得られたＰｓｙ１転写物の増幅セグメントの概略図である。 Ｐｓｙ１遺伝子内（図７Ａ）および増幅Ａｒｌｅｃｃｈｉｎｏマーカー（図７Ｂ）のトランスポゾンおよび隣接する核酸挿入の概略図である。 ｒａｒｌ対立遺伝子（配列番号５）の核酸配列を示す。大文字はトマト野生型Ｐｓｙ１遺伝子の配列を示し、エキソンは太文字で印した。小文字はＡｒｌｅｃｃｈｉｎｏイントロン配列を示し、隣接するヌクレオチド挿入は四角で囲った。 ｒａｒｌ対立遺伝子（配列番号５）の核酸配列を示す。大文字はトマト野生型Ｐｓｙ１遺伝子の配列を示し、エキソンは太文字で印した。小文字はＡｒｌｅｃｃｈｉｎｏイントロン配列を示し、隣接するヌクレオチド挿入は四角で囲った。 ｒａｒｌ対立遺伝子（配列番号５）の核酸配列を示す。大文字はトマト野生型Ｐｓｙ１遺伝子の配列を示し、エキソンは太文字で印した。小文字はＡｒｌｅｃｃｈｉｎｏイントロン配列を示し、隣接するヌクレオチド挿入は四角で囲った。 ｒａｒｌ対立遺伝子（配列番号５）の核酸配列を示す。大文字はトマト野生型Ｐｓｙ１遺伝子の配列を示し、エキソンは太文字で印した。小文字はＡｒｌｅｃｃｈｉｎｏイントロン配列を示し、隣接するヌクレオチド挿入は四角で囲った。
本発明は、果実の可食部すべてにわたり−内部の種子部分から果皮および内果皮を通って最外層の外果皮（果実の皮）まで−赤色と黄色のストライプまたは部分の魅力的な外観を有する果実を生産するトマト栽培品種を提供する。本発明はさらに、本明細書でＡｒｌｅｃｃｈｉｎｏと命名した、この外観に関連づけられている遺伝的構成を最初に開示する。
定義
本明細書において、「植物」という用語は、その最も広い意味で用いる。また該用語は、植物の発育のいずれの段階でも存在する構造にほとんど分化する複数の植物細胞も指す。そのような構造としては、根、果柄、シュート、葉、花、花弁、果実などが挙げられるがこれらに限定されない。本明細書で用いる場合、「植物部分」という用語は、一般的に、トマト植物の一部、例えば、植物中で損なわれていない植物細胞などの単細胞と細胞組織、それからトマト植物を再生させることが可能な細胞塊と組織培養物を指す。植物部分の例としては、花粉、胚珠、葉、胚、根、根端、葯、花、果実、果柄、シュートおよび種子からの単細胞および組織、ならびに花粉、胚珠、葉、胚、根、根端、葯、花、果実、果柄、シュート、若枝、根茎、種子、プロトプラスト、カルスなどが挙げられるが、これらに限定されない。
当技術分野で周知のように「果皮」という用語は、成熟子房の壁を指す。具体的には、トマト果実の果皮とは、種子および胎座を囲む果実壁を指す。「果皮」という用語には、外果皮、中果皮および内果皮ならびに放射状果皮が含まれる。
本明細書で用いる場合、「遺伝子」という用語は、染色体上の特定の位置を占め、および生物における特定の特徴または形質のための遺伝的命令を含有するＤＮＡ配列からなる遺伝単位を指す。したがって「遺伝子」という用語は、ＲＮＡまたはポリペプチドまたはその前駆体の産生のために必要なコード配列を含む核酸（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）配列を指す。機能性ポリペプチドは全長コード配列によって、または、ポリペプチドの所望の活性もしくは機能特性（例えば、酵素活性、リガンド結合、シグナル伝達など）が保持されている限り、そのいずれの部分によってもコードされることができる。遺伝子に関連して用いられるとき、「その部分」という用語は、その遺伝子のフラグメントを指す。フラグメントは、サイズにおいて数ヌクレオチドから、全遺伝子配列−１ヌクレオチドまでの範囲であり得る。したがって、「少なくとも遺伝子の一部を含む核酸配列」とは、遺伝子のフラグメントまたは全遺伝子を含み得る。「遺伝子」という用語は、遺伝子のｃＤＮＡ型およびゲノム型の両方を包含する。
また「遺伝子」という用語は、構造遺伝子のコード領域を包含し、５’および３’の両末端上のコード領域に隣接して位置する配列を、遺伝子が完全長ｍＲＮＡの長さに対応するようにいずれかの末端上で約１ｋｂの距離で含む。５’のコード領域に位置し、ｍＲＮＡ上に存在する配列は５’非翻訳配列と呼ぶ。３’またはコード領域の下流に位置し、ｍＲＮＡ上に存在する配列は３’非翻訳配列と呼ぶ。
本明細書で用いる場合、「対立遺伝子」という用語は、遺伝子またはいずれの種類の同定可能な遺伝因子の代替型または異型を指し、それらは相同染色体中の同じ遺伝子座に位置しているので、遺伝形質における選択肢である。そのような代替型または異型は、一塩基多型、挿入、反転、転座もしくは欠失の結果であり得、または例えば、化学修飾もしくは構造修飾、転写調節もしくは翻訳後修飾／調節によって生じる遺伝子調節の結果であり得る。二倍体細胞または生物において、所定の遺伝子または遺伝因子の２つの対立遺伝子は、一般的に、一対の相同染色体上で対応する遺伝子座を占有する。
本明細書で用いる場合、「ｒａｒｌ対立遺伝子」または「Ｐｓｙ１のｒａｒｌ対立遺伝子」という用語は、同じ意味で用いられ、対立遺伝子のイントロン内に挿入を含み、該挿入によってＰｓｙ１の非機能的スプライスバリアントがもたらされる、フィトエン合成酵素１対立遺伝子を指す。いくつかの例示的な実施形態によれば、この用語は、配列番号５に記載の核酸配列を指す。
本明細書で用いる場合、「遺伝子型」という用語は、細胞または生物の遺伝子構成を指す。当技術分野で周知のように、遺伝子型は、その遺伝子座に関連があるもしくは関連がない、および／または結合しているもしくは結合していないにかかわらず、単一遺伝子座または複数の遺伝子座に関連し得る。一部の実施形態において、個体の遺伝子型は、１または複数の遺伝子が目的の表現型（例えば本明細書に定義されている色形質）の発現に関与しているという点で、関連がある１または複数の遺伝子に関する。したがって、一部の実施形態において、遺伝子型は、個体内で１または複数の遺伝子座に存在する１または複数の対立遺伝子座の概要を含む。
本明細書で用いる場合、「表現型」という用語は、個体、特に個々の植物における外観または他の検出可能な特徴を指す。いくつかの実施形態によれば、表現型は植物遺伝子型から生じる。さらなる実施形態によれば、表現型は、そのゲノム、プロテオームおよび／またはメタボーロムと、環境との相互作用から生じる。
本明細書で、「セグメント」、「部分」およびそれらの複数形は同じ意味で用いられ、黄色または赤色のいずれかであり、Ａｒｌｅｃｃｈｉｎｏの赤色−黄色表現型を形成するトマト果実の部分を指す。
本明細書で用いる場合、「育種」およびその文法上の変形は、子孫個体を生産する任意のプロセスを指す。育種は生殖もしくは無性生殖もしくはその任意の組み合わせであり得る。
例示的で非限定的な種類の育種としては、交雑、自殖、倍加半数体誘導体生成およびその組み合わせを含む。
本明細書で用いる場合、「自殖」という用語は、植物の制御自家受粉、すなわち同じ植物によって生成された花粉を胚珠に接触させることを指す。「交雑」という用語は、制御他家受粉、すなわち異なる植物によってそれぞれ生成された花粉と胚珠を接触させることを指す。
本明細書で用いる場合、「ドナー」という用語は、遺伝形質、遺伝子移入またはゲノムセグメントが由来する植物または植物系統を指し、ドナーにはヘテロ接合性もしくはホモ接合性のいずれかの遺伝形質、遺伝子移入またはゲノムセグメントがあり得る。
本明細書で用いる場合、「レシピエント」という用語は、ドナーから遺伝形質、遺伝子移入またはゲノムセグメントを受け取る植物または植物系統を指し、レシピエントそれ自体には、ヘテロ接合性もしくはホモ接合性のいずれかの遺伝形質、遺伝子移入またはゲノムセグメントがある可能性またはない可能性がある。
本明細書で用いる場合、「子孫」という用語は、１または複数の親植物もしくはその子孫からの栄養生殖または有性生殖による後代として得られるいずれの植物を指す。例えば、子孫植物は、親植物のクローン化もしくは自殖によって、または２つの親植物を交雑させることによって得ることができ、自殖ならびにＦ１もしくはＦ２もしくはさらなる世代を包含することができる。Ｆ１は、少なくとも１つの親が遺伝形質のドナーとして初めて用いられる親から生産された第１世代の子孫であるが、第２世代（Ｆ２）またはそれ以降の世代（Ｆ３、Ｆ４など）の子孫はＦ１、Ｆ２などの自殖から生産される標本である。したがって、Ｆ１は（一部の実施形態において）、２つの真の育種親（真の育種は遺伝形質に対してホモ接合性である）間の交雑から得られる雑種であり得るが、Ｆ２は（一部の実施形態において）は、Ｆ１雑種の自家受粉から得られる子孫であり得る。
本明細書で用いる場合、「雑種」という用語は、２つの近交系間の交雑を含むがこれに限定されない、２つの遺伝的に異なる個体間の交雑のいずれの子孫を指す。
本明細書で用いる場合、「近交系」という用語は、実質的にホモ接合性の個々の植物または植物系統を意味する。
本明細書で用いる場合、「戻し交雑」という用語およびその文法上の変形は、育種家が雑種後代とその一方の親、例えば第１世代雑種Ｆ１とＦ１雑種の親遺伝子型の一方とを交雑させるプロセスを指す。一部の実施形態において、戻し交雑は、それ自体が同じ親遺伝子型に戻し交雑されている、一方の戻し交雑の後代個体と繰り返し行われる。
「栽培トマト植物」または「トマト栽培品種」または「トマト栽培品種植物」は、本発明の範囲内と理解され、もはや自然状態ではないが、ヒトが使用するため、および／または消費するために、ヒトの手によって開発されたナス科クレードリコペルシコン（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ）の植物を指す。「栽培トマト植物」または「トマト栽培品種」または「トマト栽培品種植物」はさらに、自然遺伝形質および／またはそれらの自然遺伝学の一部として本発明の主題である遺伝形質を含む野生型を除外すると理解される。トマトの例としては、ソラヌム・リコペルシクム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）（正式にはリコペルシコン・エスクレンツム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、ソラヌム・セラシフォルメ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｃｅｒａｓｉｆｏｒｍｅ）、ソラヌム・チーズマニイ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｃｈｅｅｓｍａｎｉｉ）、ソラヌム・キレンセ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｃｈｉｌｅｎｓｅ）、ソラヌム・クミエレウスキイ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｃｈｍｉｅｌｅｗｓｋｉｉ）、ソラヌム・ヒルスツム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、ソラヌム・パルビフロルム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｐａｒｖｉｆｌｏｒｕｍ）、ソラヌム・ペンネリイ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｐｅｎｎｅｌｌｉｉ）、ソラヌム・ペルビアヌム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍ）、またはソラヌム・リコペルシコイデス（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｉｄｅｓ）が挙げられる。いくつかの実施形態によれば、トマト栽培品種は、ソラヌム・リコペルシクムである（Ｐｅｒａｌｔａ Ｉら．２００５ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｐｅｒｕ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂｏｔａｎｙ ３０（２）：４２４−４３４による生物分類）。
「ヘテロ接合性」という用語を本明細書で用いて、相同染色体上で１または複数の対応する遺伝子座で異なった対立遺伝子を指す。
「ホモ接合性」という用語を本明細書で用いて、相同染色体上で１または複数の対応する遺伝子座で同じ対立遺伝子を指す。
顧客にとって魅力的なトマト果実の新しい外観は、常に望ましい。洗練された顧客も、果実が、実がしまって、おいしく、適切な貯蔵期間があることを求める。トマト栽培者は、生物ストレスおよび非生物的ストレスに抵抗性があり、かつ生産収率が高い植物を探している。植物の遺伝の法則が理解され、この数十年の間、分子遺伝学ツールが急速に開発されたことにより、一般に優れた農作物、特にトマト植物の生産が促進されている。
人為的に誘発させた突然変異による集団を背景として生産されたトマト戻し交雑自殖系統（ＢＩＬ）の集団において、表現型−遺伝子型の関連性を研究する過程で、本発明者らは予想外に、黄色と赤色部分が交互模様になる果実をつけるトマト植物を生産した。この表現型は、「Ａｒｌｅｃｃｈｉｎｏ」と命名された。同様の外部の果実表現型を示すこれまで知られている果実とは対照的に、Ａｒｌｅｃｃｈｉｎｏの有色部分は、表皮および／または果皮の外層に限らず、果実の内部（胎座および／または子室を含み）から果皮を横切って表皮の最外層まで及んだ（図２）。
本明細書に示す果実の色は、催色期での成熟する果実の色調および完熟または成熟した果実までの色調を指す。催色期に、トマト果実の表面に緑から黄褐色、ピンクまたは赤色へと色調の明確な変化が表れる。本明細書で用いる場合「成熟した」という用語は、２つ以上の種子腔の内容物がゼリー様の粘稠度になり、種子が十分に成長していることを意味する。Ａｒｌｅｃｃｈｉｎｏ表現型は、視覚的に容易に検出される。
トマト果実は、果肉質ベリーとして分類される。真果として、トマト果実は受精後、植物子房から発育する。トマト果実は二房または多房のいずれかであり得る。チェリートマト以外の大部分の栽培品種は、２〜５つの子室を有する。子室は、果皮によって囲まれている。果皮は、内壁、柱状体；放射状壁、隔壁；および外壁（表皮）を含む。果皮および胎座は、トマトの果肉質組織を含む。種子は小房腔の内部に位置し、ゼラチン膜に囲まれている。維管束は果皮の外壁全体に及び、そして果柄からトマトの中心まで進み、中心から各種子まで放射状に広がっている。
Ａｒｌｅｃｃｈｉｎｏ変異表現型が単離されたＢＩＬ集団は、赤い実がなり、自家和合性のソラヌム・ピンピネリフォリウムＬＡ１５８９の野生系統と、Ｓ．リコペルシクム加工トマト、同系交配品種、ｃｖ．Ｆ６２０３（ＴＡ２０９）との間の交雑から構築された。どのような特定の理論または作用機構にでも束縛されることを望むことなく、Ａｒｌｅｃｃｈｉｎｏ突然変異体は、遠縁交雑から生じる「ゲノムショック」の結果であり得る。
突然変異原を特徴づける因子の１つは、ＤＮＡの変化が種々の分子機序によって作られ、したがって得られる変異のレパートリーが異なる突然変異原（移行、塩基転換、欠失または添加）の間で劇的に変化し得ることである。突然変異を誘発する別の既知の力は、進化の多様な種類の交雑により種間で集団が作られることから生じる。多様なゲノムを混合することにより、ＭｃＣｌｉｎｔｏｃｋ（１９８４．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２６：７９２−８０１）によって記述されたプロセスである「ゲノムショック」が生じる可能性がある。集中した研究にもかかわらず、ゲノムショックに影響を及ぼす分子機序の特性は、十分に明らかにされていない。しかし、多様な背景への異質のゲノムセグメントの移入が遺伝子変化および突然変異を引き起こし得ることが報告されている。この現象はこれまで記述されており、一例には小麦で実行された込み入った作業がある（Ｓｈａｋｅｄら，２００１．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １３：１７４９−１７５９）。Ｓｈａｋｅｄらは、遺伝子損失などの新しい小麦異質４倍体イベントの合成時に、遺伝子サイレンシングと活性化がむしろ一般的であることを示した。小麦において、種間の雑種形成後に染色体倍加が続くと、急速な遺伝子変化およびエピジェネティック変化が引き起こされ、レトロトランスポゾンの活性がゲノムショックによって活性化されると、それらは主役になるように見える（Ｓｈａｋｅｄら，２００１，前掲書；Ｏｚｋａｎら，２００１．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １３：１７３５−１７４７；Ｋａｓｈｋｕｓｈら，２００３．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．３３：１０２−１０６）。
単離されたＡｒｌｅｃｃｈｉｎｏ表現型植物のさらなる育種により、本発明のトマト植物がもたらされる。これは商業成長に適した栽培品種トマト植物である。
本発明はさらに、Ａｒｌｅｃｃｈｉｎｏ表現型と、フィトエン合成酵素１（Ｐｓｙ１）遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子内に存在するトランスポゾン挿入との間の結合を開示する。ｒａｒｌ対立遺伝子の存在がＡｒｌｅｃｃｈｉｎｏ表現型には必須であるが、その外観の原因となる唯一の因子でない可能性があることを明確に理解すべきである。
Ｐｓｙ１遺伝子内で最初に観察された９つの塩基対（配列番号１）の挿入部位を配列決定することより、核酸配列ＴＣＴＧＧＡＴＡ（配列番号２）の直接反復の存在を示した。植物ゲノムへのトランスポゾンの挿入は、一般的に挿入位置で、直接配向で形成された配列重複によって特徴づけられる。以下に例示するように、本発明の発明者らは、Ａｒｌｅｃｃｈｉｎｏ表現型が実際に、果実の黄色部分を形成する細胞へのトランスポゾン挿入の結果であることを発見した。この挿入は、Ｐｓｙ１遺伝子のイントロン８内（図８に示すＰｓｙ１配列による）であり、Ｐｓｙ１の最後のエキソン（エキソン９）が欠損したスプライスバリアントをもたらし、その結果機能タンパク質の翻訳が損なわれる。赤色部分は、野生型Ｐｓｙ１対立遺伝子および／または遺伝子転写に悪影響を及ぼすことなく、トランスポゾンが除去された細胞のいずれかを含み、機能性フィトエン合成酵素１の翻訳を可能にする。
したがって、本発明は、胎座および／または子室から果実の果皮を横切って表皮に及ぶ黄色−赤色部分のＡｒｌｅｃｃｈｉｎｏ表現型を有する果実を生産するトマト栽培品種を提供し、該表現型がｒａｒｌの少なくとも１つの対立遺伝子に関連づけられ、前記ｒａｒｌ対立遺伝子が該対立遺伝子のイントロン内に挿入を含むフィトエン合成酵素１（Ｐｓｙ１）対立遺伝子であり、該挿入がＰｓｙ１の非機能的スプライスバリアントをもたらす。
いくつかの実施形態によれば、Ａｒｌｅｃｃｈｉｎｏ果実の黄色部分の細胞は、ｒａｒｌ対立遺伝子に対してホモ接合性である。
いくつかの実施形態によれば、挿入は、トランスポゾン３’末端で核酸配列ＴＣＴＧＧＡＴＡ（配列番号２）と隣接するトランスポゾンを含む。さらなる実施形態によれば、挿入は、トランスポゾン３’末端で核酸配列ＡＴＣＴＧＧＡＴＡ（配列番号１）と隣接するトランスポゾンを含む。
いくつかの実施形態によれば、トランスポゾンはｈＡＴファミリーに属する。一部の実施形態によれば、トランスポゾンは少なくとも核酸配列を含む。これらの実施形態によれば、トランスポゾンは配列番号３と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％相同の核酸配列を含む。各可能性は、本発明の別々の実施形態を意味する。
さらなる例示的な実施形態によれば、トランスポゾンは、配列番号３に記載の核酸配列からなる。
いくつかの例示的な実施形態によれば、Ｐｓｙ１遺伝子内の挿入は、配列番号４に記載の核酸配列と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％少なくとも９８％または少なくとも９９％相同の核酸配列を含む。いくつかの例示的な実施形態によれば、Ｐｓｙ１遺伝子内の挿入は、配列番号４に記載の核酸配列を含む。
いくつかの実施形態によれば、Ｐｓｙ１のｒａｒｌ対立遺伝子は、配列番号５に記載の核酸配列を含む。
本発明はさらに、Ａｒｌｅｃｃｈｉｎｏ表現型、そのように生産された植物およびその部分を有するトマト栽培品種を生産する方法を提供する。
特定の態様によれば、本発明は、胎座および／または子室から果実の果皮を横切って表皮に及ぶ黄色−赤色部分のＡｒｌｅｃｃｈｉｎｏ表現型を有する果実を生産するトマト栽培品種を生産する方法を提供し、該方法はフィトエン合成酵素１のｒａｒｌ対立遺伝子を含む遺伝因子を赤色果実またはその一部を生産するトマト栽培品種に導入することを含み、該ｒａｒｌ対立遺伝子は該対立遺伝子のイントロン内に挿入を含み、該挿入はＰｓｙ１の非機能的スプライスバリアントをもたらす。
選抜されたトマト栽培品種のゲノムへの遺伝因子の導入は、当技術分野で既知の任意の方法を用いて行うことができる。
植物育種家および特に種子会社は、一定した品質の製品を提供するために、一般的に「エリート系統と呼ばれるエリート育種系統を使用する。エリート系統は、集中的な近親交配の結果であり、高収率、果実品質、有害生物と疾患に対する抵抗性、および非生物的ストレスに対する許容性などの複数の優れた特性を組み合わせている。これらのエリート系統の平均収率は全体的に、現代の多くのトマト品種がその子孫である元々の野生系統よりもはるかに高い。エリート系統を作物として直接用いることもできるが、一般的に、２つの（ホモ接合または近交系）エリート系統間の交雑によって生産された、いわゆるＦ１すなわち一代交配雑種を生産するために用いられる。したがって、Ｆ１雑種は、２つの親の遺伝的性質を単一植物に組み合わせている。雑種のさらなる利点は、雑種強勢またはヘテロシス、すなわち雑種植物はいずれかの（近交系）親よりも生長が良好であり、高い収率を示す現象が現れることにある。
戻し交雑または系統選抜は、育種家が所望の農業形質を自身のエリート育種系統に加える一方法である。この方法は、育種系統に所望の形質を発現する系統を交雑させ、続いて該形質を発現する子孫植物を反復親に戻し交雑させることを含む。その結果、育種プログラムにおいて親としての個体の選抜は、その祖先の生産力に基づく。そのような方法は、質的に遺伝される形質、すなわち存在する、または存在しない遺伝形質を育種する際に最も効果的である。
循環選抜は、育種系統を改良するための選択的育種方法であり、系統的検査と所望の後代の選抜に続いて、新規の集団を形成するために選抜個体の組換えを含む。循環選抜は、作物の量的遺伝形質を改良するために効果的であることが判明した。しかし、循環選抜は育種プログラムにおいて種々の遺伝子形質の基礎をなす遺伝学的基礎を広げる速度を低下させ、したがってその可能性は限定される。
本明細書に開示するように、黄色−赤色の二色果実を生産するトマト植物は、フィトエン合成酵素１のｒａｒｌ対立遺伝子を含む遺伝因子をエリート育種系列に導入することによって作出することができる。
ｒａｒｌ対立遺伝子を導入することは、植物育種によって、すなわち、ｒａｒｌ対立遺伝子を含むドナー植物とレシピエント植物、好ましくはｒａｒｌ対立遺伝子を含まないエリート栽培品種トマト植物とを交雑させることによって行なわれ得る。
あるいは、ｒａｒｌ対立遺伝子を含む核酸、好ましくは、ＤＮＡは、当技術分野で既知の任意の方法によって単離され、次いで赤色果実を生産するトマト植物のゲノムに導入されてもよい。
単離核酸配列による植物の形質転換は、一般に、植物細胞内で機能する発現ベクターの構築を含む。本発明の教示によれば、そのようなベクターは、ｒａｒｌ対立遺伝子を含む核酸配列を含む。一般的に、発現ベクターは調節エレメントの制御下でｒａｒｌ対立遺伝子を、または調節エレメントに機能的に結合したｒａｒｌ対立遺伝子を含む。いくつかの実施形態によれば、調節エレメントは、プロモーター、エンハンサーおよび翻訳終結配列からなる群から選択される。発現ベクターは、そのような機能的に結合した遺伝子／対立遺伝子／調節エレメントの組み合わせを１または複数含有することができるが、ただし、組み合わせに含有されている少なくとも１つの対立遺伝子がｒａｒｌ対立遺伝子を含むとの条件で可能である。ベクター（複数可）は、プラスミドの形であってもよく、および核酸配列をトマト（双子葉）植物に形質転換するのに適している当技術分野で既知の形質転換方法を用いて、Ａｒｌｅｃｃｈｉｎｏ表現型によって果実を生産するトランスジェニック植物を生成する方法において、単独で、または他のプラスミドと組み合わせて用いることができる。
発現ベクターは、調節エレメント（プロモーターなど）に機能的に結合した少なくとも１つのマーカー（リポーター）を含むことができ、それにより該マーカーを含有する形質転換細胞が負の選択（選択可能なマーカー遺伝子を含んでない細胞の増殖を阻害することによる）によって、または正の選択（マーカー遺伝子によってコードされた産物を選抜することによる）によってのいずれかで回収されることが可能になる。植物形質転換のために多くの一般的に用いられる選択可能なマーカー遺伝子は、当技術分野で既知であり、例えば、抗生物質または除草剤であり得る選択的化学物質を代謝的に解毒する酵素をコードする遺伝子、または抑制因子に非感受性である変化した標的をコードする遺伝子を包含する。いくつかの正の選択方法は、マンノース選択など当技術分野で知られている。あるいは、当技術分野で知られている技術であるマーカーレス形質転換を用いて、前述のマーカー遺伝子なしで植物を得ることができる。
本発明に従って核酸配列を用いて植物細胞を形質転換する方法は、当技術分野で既知である。本明細書で用いる場合、「形質転換」または「形質転換する」という用語は、ベクターなどの外来核酸配列が侵入して、レシピエント細胞を形質転換細胞、遺伝的に改変された細胞、またはトランスジェニック細胞に変化させるプロセスを言う。形質転換は安定であり得、核酸配列が植物ゲノムに組み込まれ、したがって、安定した遺伝形質を表し、または一過性であり、核酸配列が形質転換細胞によって発現されるが、ゲノムに組み込まれてなく、したがって一過性の形質を表す。一般的な実施形態によれば、本発明の核酸配列は、植物細胞に安定して形質転換される。
外来遺伝子を単子葉植物および双子葉植物の両方に導入する種々の方法がある（例えば、Ｐｏｔｒｙｋｕｓ Ｉ．１９９１．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４２：２０５−２２５；Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ Ｋら，１９８９．Ｎａｔｕｒｅ ３３８：２７４−２７６）。
植物ゲノムＤＮＡへの外来性ＤＮＡの安定した組込みの主要な方法には、主に２つのアプローチが含まれる。
アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）によって媒介される遺伝子移入：アグロバクテリウム媒介系は、植物ゲノムＤＮＡへ組み込まれる、定められたＤＮＡセグメントを含有するプラスミドベクターの使用を含む。植物組織の播種方法は、植物種およびアグロバクテリウム送達系によって変化する。広く使われているアプローチは、全植物分化の開始のための良好な供与原を提供する任意の組織外植片を用いて行われ得るリーフディスク手法である（Ｈｏｒｓｃｈら，１９８８．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ Ａ５，１−９， Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ）。補助アプローチとしては、減圧浸潤と組み合わせたアグロバクテリウム送達系を使用する。トマト植物のためのアグロバクテリウム媒介形質転換プロトコルは、当業者に既知である。
直接核酸移入：植物細胞への直接核酸移入には種々の方法がある。電気穿孔法では、プロトプラストは強い電界に短時間さらされ、ＤＮＡが侵入できるためのミニポアを開ける。微量注入法では、核酸は、マイクロピペットを使用して、細胞に直接機械的に注入される。微小粒子銃法において、核酸はマイクロプロジェクタイル、例えば硫酸マグネシウム結晶またはタングステン粒子上で吸着され、次いでマイクロプロジェクタイルは細胞または植物組織内に物理的に加速される。植物に核酸を導入する別の方法は、標的細胞の音波処理による。あるいは、リポソームまたはスフェロプラスト融合を用いて、植物に発現ベクターを導入されてきた。
トマト標的組織の形質転換の後、上述の選択可能なマーカー遺伝子の発現により、現在、当技術分野で周知の再生および選抜方法を用いて、形質転換細胞、組織および／または植物の優先的選択が可能である。
いくつかの実施形態によれば、本発明は、Ａｒｌｅｃｃｈｉｎｏ表現型によるトマト植物を生産する、以下のステップを含む方法を提供する。
（ａ）遺伝因子を含むドナートマト植物からのｒａｒｌ対立遺伝子を含む遺伝因子をレシピエントトマト栽培品種、好ましくはエリート栽培品種に導入して、子孫栽培トマト植物をもたらす；
（ｂ）各子孫栽培トマト植物から採取した核酸を、ｒａｒｌ対立遺伝子の存在について調べる；および
（ｃ）該ｒａｒｌ対立遺伝子を含む栽培トマト植物を選抜する。
所望のＡｒｌｅｃｃｈｉｎｏ表現型の選抜はＡｒｌｅｃｃｈｉｎｏ遺伝子型に特異的な核酸マーカーを用いて行われるので、この方法は「マーカー支援選抜」として定義されることができる。植物が果実を生産すると、Ａｒｌｅｃｃｈｉｎｏ表現型は、唯一表現型的に、適切に確認することができるので、子孫植物における遺伝因子の適切な移入の確立が遺伝子特異的マーカーを用いてモニターすることができることは特に有利である。
Ｐｓｙ１のｒａｒｌ対立遺伝子を含む遺伝因子をレシピエント植物に導入することは、上に記載のいずれの方法および当技術分野で既知の方法によって行われることが可能である。
当技術分野で既知の子孫トマト栽培品種および任意の適切な分子マーカーから遺伝物質を得る任意の方法を、本発明の教示に従って、Ａｒｌｅｃｃｈｉｎｏ遺伝型を選抜するために用いることができる。
本明細書で用いる場合、「分子マーカー」または「複数の分子マーカー」という用語は、核酸配列の特徴の相違を可視化するための方法で用いられる分子指標を指す。そのような指標の例としては、多様性アレイ技術（ＤＡｒＴ）マーカー、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）マーカー、増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）マーカー、一塩基多型（ＳＮＰ）、配列特性化増幅領域（ＳＣＡＲ）、切断増幅多型配列（ＣＡＰＳ）マーカー、配列特性化雑種形成マーカー、またはこれらの任意の組み合わせがある。いくつかの例示的な実施形態によれば、ｒａｒｌ対立遺伝子の存在について、各子孫栽培トマト植物から採取した核酸試料を調べるステップは、双方向プライマーのセットの使用を含む。双方向とは、核酸の増幅反応において一つが順プライマーとして機能し、一つが逆プライマーとして機能するようなプライマーの方向を意味する。双方向プライマーは、一般的に、Ｐｓｙ１のｒａｒｌ対立遺伝子またはそのマーカーの独特な核酸配列を増幅するが、野生型Ｐｓｙ１対立遺伝子は増幅しないゲノムＤＮＡ上の増幅反応で用いられる。いくつかの実施形態によれば、プライマー対は、配列番号７（ＴＣＴＧＧＡＴＡＡＴＣＴＧＧＡＴＡ）に記載の核酸配列を含むｒａｒｌ対立遺伝子を増幅するように設計されている。いくつかの例示的な実施形態によれば、ｒａｒｌ対立遺伝子マーカーは、配列番号１０（ＣＡＧＴＧＣＣＡＧＡＡＧＡＧＧＡＡＧＡ）および配列番号１１（ＴＴＧＣＧＧＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＡＡＧＡ）に記載の核酸配列を含む一対のプライマーによって増幅される。
さらなる実施形態によれば、プライマー対は、完全長トランスポゾン挿入を増幅するように設計されている。いくつかの例示的な実施形態によれば、トランスポゾンは、配列番号１２（ＧＴＧＧＡＴＣＣＴＧＡＡＡＴＧＧＣＴＴＧ）および配列番号１３（ＡＧＴＡＣＴＡＡＴＡＡＡＡＴＧＧＴＴＴＴＧＣＣ）に記載の核酸配列を含む一対のプライマーによって増幅される。
さらなる実施形態によれば、プライマー対は、Ｐｓｙ１対立遺伝子内のトランスポゾン挿入の３’ゲノム接合部と増幅するように設計されている。いくつかの例示的な実施形態によれば、３’トランスポゾン挿入接合部は、配列番号１４（ＧＧＧＣＴＡＧＴＣＧＧＴＧＴＡＴＣＡＴ）および配列番号１１（ＴＴＧＣＧＧＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＡＡＧＡ）に記載の核酸配列を含む一対のプライマーによって増幅される。
さらなる実施形態によれば、プライマー対は、Ｐｓｙ１対立遺伝子内のトランスポゾン挿入の５’ゲノム接合物を増幅するように設計されている。いくつかの例示的な実施形態によれば、５’トランスポゾン挿入接合部は、配列番号１５（ＣＴＧＧＡＡＧＧＧＴＧＡＣＣＧＡＴＡＡＡ）および配列番号１６（ＡＴＧＡＴＡＣＡＣＣＧＡＣＴＡＧＣＣＣ）に記載の核酸配列を含む一対のプライマーによって増幅される。
さらに、または代替方法として、マーカーは、ストリンジェント条件下でＰｓｙ１のｒａｒｌ対立遺伝子に特異的にハイブリダイズするが、その野生型対立遺伝子にはハイブリダイズすることはなく、その後、当業者に周知の種々の方法によって検出されることができる配列特異的プローブである。
それにもかかわらず、本発明の方法態様が本明細書に特定されているマーカーの使用に限定されることはなく、および本発明の方法が本明細書に明示的に開示されてないマーカー、または同定されることになるマーカーでさえ利用することができ、そのようなマーカーの同定および使用は当技術分野の知識を有する当業者の十分な技能範囲内であることを明確に理解するべきである。
さらなる方法、または選択的方法において、子孫栽培トマト植物は、以下に例示するようにＡｒｌｅｃｃｈｉｎｏ外観について表現型的に検討される。これらの実施形態によれば、子孫植物を生長させて果実を生産し、果実（Ａｒｌｅｃｃｈｉｎｏ表現型）は、果実全体にわたり赤色部分と黄色部分が存在するかについて検討される。
いくつかの実施形態によれば、Ａｒｌｅｃｃｈｉｎｏ表現型による果実を有する栽培品種トマト植物は、近交系植物である。別の実施形態によれば、Ａｒｌｅｃｃｈｉｎｏ表現型による果実を有する栽培品種トマト植物は、雑種植物である。以下の実施例は、本発明の一部の実施形態をより十分に例示するために提示される。しかし、実施例は本発明の幅広い範囲を限定するものとして解釈されてはならない。当業者は、本発明の範囲から逸脱することなく、本明細書に開示される原理について多くの変更および修正を容易に考案することができる。
実施例１：全ゲノム戻し交雑自殖系統（ＢＩＬ）
ソラヌム・ピンピネリフォリウム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｐｉｍｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍ）ＢＩＬを小さい赤い果実をつける自家和合性の野生種系統ソラヌム・ピンピネリフォリウム（ＬＡ１５８９と命名される）と、加工用トマト、同系交配品種、栽培品種（ｃｖ．）Ｅ６２０３（ＴＡ２０９）（ソラヌム・リコペルシクム（Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ））との交雑から構築した（Ｇｒａｎｄｉｌｌｏ ＳおよびＴａｎｋｓｌｅｙ Ｓ Ｄ．１９９６．Ｔｈｅｏｒ． Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔ．９２：９３５−９５１）。両方の種からのＢＩＬの構築中、初期の世代を、戻し交雑後代（ＡＢ）ＱＴＬ調査（Ｇｒａｎｄｉｌｌｏ Ｓら，２００７．Ｔｈｅｏｒ． Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔ．９２：９３５−９５１によって再検討される）の一部として、収量関連形質について、および種々の形態的形質と生化学的特性についても評価した。Ｓ．ピンピネリフォリウムＢＩＬは１７８の系列から構成されており、この供給源の遺伝子地図は、野生種Ｓ．ピンピネリフォリウムと反復親ｃｖ．Ｅ６２０３との間が多形であることが判明した、ゲノムに固定された４００８のＳＮＰマーカーから構築された。これらのマーカーを８７３ビンに分割し、ビンあたり、平均長０．８７Ｍｂｐおよび平均４．５９ＳＮＰの構成とした。各ビンは、独特の分離パターンを示し、隣接したビン対間の地図距離をｃＭで算出することが可能であった。算出した地図は長さ１１７４．１ｃＭであり、野生種ゲノムの１００％をカバーし、最も長い連鎖群は第３染色体（１２９．５ｃＭ）で、最も短い連鎖群は第６染色体（６０．２ｃＭ）を示す。
実施例２：Ａｒｌｅｃｃｈｉｎｏ変異
ソラヌム・ピンピネリフォリウムとソラヌム・リコペルシクムからの種間ＢＩＬ集団の作出により、ＢＩＬ集団内に新たな変異の形成がもたらされた。果色の表現型が不安定な単一植物をＢＩＬ＃１１２で同定した。この植物は２０１０年の間に（ＢＣ２ｓｅｌｆ１０世代内、図１）生産され、および観察された表現型はこれまでに種々の品種コレクションで検出されていない。
この独特の変異体は、黄色と赤色の平行した縞模様によって特徴づけられ、この縞模様は果実の外部表皮上を縦方向に現れる（図２Ａ）が、重要なのは、果肉（果皮）、種子ゼリーおよび胎座に及んでいる（図２Ｂ）ことである。これまで、黄色のトマト果実に多数の変異が生じることが確認されているが、しかし、これらの変異のいずれも果実類を通して黄色−赤色のストライプまたは部分を示すものはなく、本明細書で初めて開示される。この変異体の別の特徴は、未熟な青い段階で果実表皮色に表現効果が観察できないが、ただし成熟すると表現型が現れることである。この変異表現型には、名称「Ａｒｌｅｃｃｈｉｎｏ」が割り当てられている。２０１０年に発見された最初のＡｒｌｅｃｃｈｉｎｏ表現型は、植物および花序とともに不安定であり、特に完全な赤色果実が同じ植物上にＡｒｌｅｃｃｈｉｎｏ果実とともに観察された点で不安定であった。
Ａｒｌｅｃｃｈｉｎｏ表現型の遺伝様式をＢＩＬ＃１１２において同定された植物と、その親ｃｖ．Ｅ６２０３（ＴＡ２０９）および他の野生型ソラヌム・リコペルシクム栽培品種とを交雑させ、自家交雑と比較して検討した。Ｆ１雑種植物は正常の赤色果実をつけたが、ＢＩＬ＃１１２自己子孫は、特徴的なＡｒｌｅｃｃｈｉｎｏ表現型を示した。これらの結果は、新しい変異が劣性であることを示す。Ｆ１雑種自殖由来のＦ２集団において、後代が次のように観察された：赤色果実をつけた２９植物；Ａｒｌｅｃｃｈｉｎｏ表現型による９植物；および完全に黄色い果実をつけた２植物（計４０）。別個のＦ１雑種由来の追加のＦ２集団では、完全に赤色果実をつけた９０植物；Ａｒｌｅｃｃｈｉｎｏ果実をつけた２２植物；および完全に黄色い果実をつけた５植物（計１１７植物）（図３）であった。全集団からのＡｒｌｅｃｃｈｉｎｏ＋黄色の果実の数は、１：３の割合に適合し、単一のメンデル遺伝子が可変浸透度および発現度を有することを示唆している。
形質分離の様式をさらに検討するために、Ｆ３後代を検討した。Ｆ３後代は、赤色（２１植物）、Ａｒｌｅｃｃｈｉｎｏ（８植物）および黄色（２植物）の果実表現型を有する３１の自殖Ｆ２植物から形成された。各Ｆ２交雑のＦ３世代の約４０植物（３１×４０）を検討した。これらの植物の果実の色の表現型を決定し、Ｆ２植物の遺伝子型を検査した後代に基づいて得た。結果は、２１の赤色Ｆ２植物のうち１３植物が果実表現型について２５％Ａｒｌｅｃｃｈｉｎｏ対７５％赤色の比率で分離したことを示す（表１）。他の８の赤色果実Ｆ２植物は、それらのＦ３後代で分離せず、Ｆ３植物のすべてが赤色であることを意味する（植物４８５３−２６のＦ３は単一のＡｒｌｅｃｃｈｉｎｏ表現型だけを示した。したがって混入物が予想され、したがってこの系統はホモ接合体としてスコア化した（表１）。２つの黄色表現型Ｆ２植物は分離せず、Ｆ３後代植物のすべては完全に黄色果実をつけた。８のＡｒｌｅｃｃｈｉｎｏ Ｆ２植物は、一貫した分離比率を示さなかった。系列番号４８５３−２７のＦ３後代のすべてはＡｒｌｅｃｃｈｉｎｏ表現型を示し、この系統が安定したＡｒｌｅｃｃｈｉｎｏ親であることを示した。
Figure 2018523988
Figure 2018523988
実施例３：Ａｒｌｅｃｃｈｉｎｏ表現型の対立遺伝子構成
上述の結果は、Ａｒｌｅｃｃｈｉｎｏ表現型がＢＩＬ＃１１２とＴＡ２０９の交雑に由来するＦ１植物の果実として劣性に遺伝し、他の野生型（ＷＴ）栽培品種は完全に赤色になることが判明したことを示した。ＢＩＬ＃１１２の交雑に由来するＦ１植物において、タンジェリン変異ｅ３４０６ｍ２およびゼータ変異ｅ２０８３ｍ１への表現型相補性も、判明した。Ａｒｌｅｃｃｈｉｎｏ表現型を有する植物の交雑においてのみ、表現型黄色果肉（ｒ／ｒ；フィトエン合成酵素１遺伝子（Ｐｓｙ１）が欠損）を有する２つの独立した変異は相補性の欠如を示し、果実は弱い縞柄の表現型を示した（表２）。これらの結果は、Ａｒｌｅｃｃｈｉｎｏがおそらく黄色果肉に対する対立遺伝子であることを示唆する。
Figure 2018523988
実施例４：Ａｒｌｅｃｃｈｉｎｏ表現型果実のカロテノイド含有量の分析
Ａｒｌｅｃｃｈｉｎｏ表現型を有する成熟した果実の赤色部分および黄色部分のカロテノイド含有量を調べて、野生型トマト（Ｍ８２）の赤色果実および黄色果肉品種ｅ３７５６ｍ２（ｒ／ｒ；Ｍ８２ ＥＭＳ誘導体）の黄色果実と比較した。カロテノイドをＫａｃｈａｎｏｖｓｋｙら．（Ｋａｃｈａｎｏｖｓｋｙ Ｄ Ｅら，２０１２ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． １０９：１９０２１−１９０２６）に記載のように異なる部分から抽出し、Ｗａｔｅｒｓ ９９６フォトダイオードアレイ検出器（Ｒｏｎｅｎ Ｇら，１９９９．Ｐｌａｎｔ Ｊ １７：３４１−３５１）を用いる高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して分離した。Ａｒｌｅｃｃｈｉｎｏ果実内の赤色部分は、野生型果実と類似のプロファイルを有するカロテノイド総含有量の約５倍高かったが、黄色部分カロテノイド含有量は黄色果肉（ｅ３７５６ｍ２）変異体果実と類似のプロファイルを有するよりもかなり低い（図４、表３）。
Figure 2018523988
実施例５：Ａｒｌｅｃｃｈｉｎｏ表現型変異の配列解析
カロテノイドは、すべての植物、藻類とラン藻によって、ならびにいくつかの非光合成細菌および真菌によって合成される炭素数４０のイソプレノイド色素である。カロテノイドのポリエン鎖は３〜１５の共役二重結合によって伸長することができ、カロテノイド特有の吸収スペクトルに関与し、特異的な光化学的性質を付与する。カロテノイド経路における第１の関与段階は、フィトエン、すなわち、酵素フィトエン合成酵素（ＰＳＹ）によって触媒された、最初のＣ４０カロテノイドを生成するために２つのゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）分子の頭−頭縮合である。元のＢＩＬ＃１１２ Ａｒｌｅｃｃｈｉｎｏ表現型植物のフィトエン合成酵素１の初期ＤＮＡ配列決定によって、ヌクレオチド３３３８の後に挿入されたイントロン８（ＡＴＣＴＧＧＡＴＡ、配列番号１）内の９ｂｐ挿入が明らかになった。
Ａｒｌｅｃｃｈｉｎｏ果実の黄色部分および赤色部分内のイントロン８の初期配列解析
Ｐｓｙ１のイントロン８を、Ａｒｌｅｃｃｈｉｎｏ表現型の果実の赤色部分と黄色部分から採取したＤＮＡ試料からＰＣＲによって増幅し、次いでｐＧＥＭプラスミドベクターにクローン化した。ゲノムＤＮＡは、Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｐｌａｎｔ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用して抽出した。イントロンを、下記の表４に収載されるプライマーを使用して増幅した。黄色部分または赤色部分からのＰＣＲ産物を保有するｐＧＥＭプラスミドを用いて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を遺伝子導入した。黄色組織からのｐＧＥＭクローンを含む７つの大腸菌のコロニーおよび赤色組織からのｐＧＥＭクローンを含む２１のコロニーを検査した。黄色組織からのすべてのＤＮＡクローンは、本明細書で「Ａｒｌｅｃｃｈｉｎｏマーカー」と命名した、アデニン（”Ａ）ヌクレオチド（配列番号７）によって分離されたＴＣＴＧＧＡＴＡ（配列番号２）の直接反復の複製と同じ配列パターンを示した。赤色組織からのクローンは、コロニー間で配列変化を示し、コロニーの大半はトランスポゾン除去フットプリントを含有していたが、残りのコロニーは黄色コロニーで観察されたものと同じパターンを示した（図５）。これらの結果は、１コピーからトランスポゾンが除去された可能性、または赤色部分への黄色細胞の混入による可能性を示した。
Figure 2018523988
ｒ ａｒｌ 対立遺伝子の完全配列の決定
初期ＰＣＲ分析によりＡｒｌｅｃｃｈｉｎｏマーカーの存在を確認した。ＲＥＡＤＹＭＩＸキット（Ｓｙｎｔｅｚｚａ）、５０〜１００ｎｇのゲノムＤＮＡ、上記表４に記載の０．４μＭの順方向および逆方向のプライマーを用いてＰＣＲを行った。９５℃で２分間の変性ステップを用いてＰＣＲを開始し、続いて９６℃で４５秒間の変性を３８サイクル、５８〜６０℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で９０秒間の伸長、最終的に７２℃で１０分間の伸長を行った。
Ａｒｌｅｃｃｈｉｎｏ赤色果実部分および黄色果実部分からのＰｓｙ１転写物の完全長を配列決定するために、３’ＲＡＣＥを実行した。Ａｒｌｅｃｃｈｉｎｏ果実の黄色部分と赤色部分からＴｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＧｅｎｅＪＥＴ ｐｌａｎｔ ＲＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ ＃Ｋ０８０１によってＲＮＡを抽出した。ＲＮＡをＤｎａｓｅ Ｉ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ ＃Ｍ０３０３Ｌ）で処理し、次いでＯｌｉｇｏ−ｄＴ−アダプタープライマーを用いてＭ−Ｍｕｌｖ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｔｉｐｔａｓｅ （Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄｓ ＢｉｏＬａｂｓ ＃Ｍ０２５３Ｌ）によって逆転写した。
Ｐｓｙ１転写物を増幅するために、Ｐｓｙ１用の特定のプライマーとアダプタープライマーとを使用して、ＰＣＲ反応を行った（表５）。
Figure 2018523988
増幅したＰｓｙ１転写物をｐＪＥＴライブラリーにクローン化した（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＣｌｏｎｅＪＥＴ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ）。
Ａｒｌｅｃｃｈｉｎｏ果実の黄色部分から得たコロニー中で３つのスプライスバリアントを検出したが、赤色部分から得たコロニーでは変異転写物に加えて、Ｐｓｙ１の野生型転写物を検出した。転写物の２つが最後のイントロンからの短い部分に融合されることが判明し、３番目の転写物は既知のｈＡＴスーパーファミリートランスポゾンの４００ｂｐ配列に融合されることが判明した。３つのすべてのバリアントにおいて、最後のエキソン（エキソン９）は、欠損していた（図６）。
上記の解析に基づいて、いくつかのプライマー対を設計した（表６）。Ａｒｌｅｃｃｈｉｎｏ表現型を有する植物の若葉または黄色果実の部分からＧｅｎｏｍｉｃ Ｐｌａｎｔ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ （Ｔｈｅｒｍｏ）を使用してゲノムＤＮＡを抽出した。ＰＣＲは、５０ｎｇ〜１００ｎｇのゲノムＤＮＡ、ＰＣＲ緩衝液、２．５ｍＭのｄＮＴＰ、０．２μＭ〜０．３μＭの順方向プリマーと逆方向プライマー、および０．５単位のＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＧＸＬ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ）を用いて行った。９８℃で３分間の変性ステップを用いてＰＣＲを開始し、続いて９６℃で１０秒間の変性を３８サイクル、５５〜６０℃で１５秒間のアニーリング、６８℃で１８０秒間の伸長、最終的に６８℃で９０秒間の伸長を行った。図８に記載のように、これらの反応はイントロンに隣接したＰｓｙ１の部位で同様に完全長トランスポゾンの増幅を可能にした。
Figure 2018523988
実施例６：Ａｒｌｅｃｃｈｉｎｏ植物の葉および果実の黄色部分と赤色部分におけるＰｓｙ１転写物の配列解析
Ｐｓｙ１転写物は、３対のプライマーを用いて、Ａｒｌｅｃｃｈｉｎｏ赤色果実部分と黄色果実部分およびＡｒｌｅｃｃｈｉｎｏ葉組織から抽出したＲＮＡから増幅した。エキソン７からエキソン８に広がるセグメントを増幅することを目標とした反応Ｉは、検討した３つのＲＮＡ試料のすべてで成功した。エキソン７からエキソン８に、およびエキソン８からエキソン９に広がるそれぞれのセグメントを増幅することを目標とした反応ＩＩおよびＩＩＩは、Ａｒｌｅｃｃｈｉｎｏ果実赤色部分から抽出したＲＮＡを含有する試料のみで成功した（表７）。これらの結果は、エキソン９が黄色組織および葉組織で損なわれていることを示す。
Figure 2018523988
実施例７：Ａｒｌｅｃｃｈｉｎｏトランスポゾン
Ａｒｌｅｃｃｈｉｎｏトランスポゾン配列をＧＸＬポリメラーゼとプライマーを用いて完成させた。
ＡＲＬ１順方向：ＧＴＧＧＡＴＣＣＴＧＡＡＡＴＧＧＣＴＴＧ(配列番号１２)； ＡＲＬ１逆方向：ＡＧＴＡＣＴＡＡＴＡＡＡＡＴＧＧＴＴＴＴＧＣＣ（配列番号１３）；および
ＡＲＬ３逆方向：ＡＴＧＡＴＡＣＡＣＣＧＡＣＴＡＧＣＣＣ（配列番号１６）。
トランスポゾンは３９０３の核酸(配列番号３)を含み、５’および３’末端で反復が反転され、Ｐｓｙ１へのその挿入のために備えていた(図７)。
Ａｒｌｅｃｃｈｉｎｏトランスポゾンの配列決定は、該トランスポゾンが既知のトランスポゾン（例えばキンギョソン（Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ ｍａｊｕｓ）からのＴａｍ３に）に類似し、二量体形成ドメイン、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを含有し、したがって潜在的に自律因子である（配列番号２４）、オープンリーディングフレームを含有することを示した。Ａｒｌｅｃｃｈｉｎｏ Ｐｓｙ１遺伝子の核酸配列（配列番号５）を図８に示す。
具体的な実施形態についての前述の説明は、本発明の全般的な性質を十分に明らかにしているので、現在の知識を適用することにより、過度の実験を実施することなく、および遺伝的概念から逸脱することなく、そのような具体的な実施形態を種々の適用のために容易に修正および／または適応させることが可能であり、したがってそのような適応および修正は、本開示の実施形態の均等物の意味および範囲内であると理解されるべきであり、理解されることを意図する。本明細書で使用される語法または用語は説明のためであり、限定するためのものではないことを理解すべきである。開示された種々の機能を実施する手段、材料および工程は、本発明から逸脱することなく種々の代替形態をとることができる。

Claims (42)

  1. 胎座および／または子室から果実の果皮を横切って表皮に及ぶ黄色−赤色部分のＡｒｌｅｃｃｈｉｎｏ表現型を有する果実を生産するトマト栽培品種であって、前記表現型がｒａｒｌの少なくとも１つの対立遺伝子に関連づけられ、前記ｒａｒｌ対立遺伝子が前記対立遺伝子のイントロン内に挿入を含むフィトエン合成酵素１（Ｐｓｙ１）対立遺伝子であり、前記挿入がＰｓｙ１の非機能的スプライスバリアントをもたらす、トマト栽培品種。
  2. 前記黄色部分の細胞がｒａｒｌ対立遺伝子に対してホモ接合性である、請求項１に記載のトマト栽培品種。
  3. 前記挿入がトランスポゾン３’末端で配列番号２に記載の核酸配列と隣接している前記トランスポゾンを含む、請求項１〜２のいずれか１項に記載のトマト栽培品種。
  4. 前記挿入がトランスポゾン３’末端で配列番号１に記載の核酸配列と隣接している前記トランスポゾンを含む、請求項１〜２のいずれか１項に記載のトマト栽培品種。
  5. 前記トランスポゾンが配列番号３に記載の核酸配列と少なくとも９０％相同の核酸配列を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のトマト栽培品種。
  6. 前記トランスポゾンが配列番号３に記載の核酸配列を含む、請求項５に記載のトマト栽培品種。
  7. 前記Ｐｓｙ１対立遺伝子内の前記挿入が配列番号４に記載の核酸配列と少なくとも９０％相同の核酸配列を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のトマト栽培品種。
  8. 前記Ｐｓｙ１対立遺伝子内の前記挿入が配列番号４に記載の核酸配列を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のトマト栽培品種。
  9. 前記ｒａｒｌ対立遺伝子が配列番号５に記載の核酸配列を含む、請求項８に記載のトマト栽培品種。
  10. 前記トマト栽培品種が前記ｒａｒｌ対立遺伝子に対して少なくとも１つの果皮細胞ホモ接合体と、少なくとも１つの野生型Ｐｓｙ１対立遺伝子を含む少なくとも１つの果皮細胞またはトランスポゾン除去フットプリントを含む少なくとも１つのＰｓｙ１対立遺伝子とを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載のトマト栽培品種。
  11. 前記トランスポゾン除去フットプリントが配列番号７に記載の核酸配列内に少なくとも１つのヌクレオチド欠失を含む、請求項１０に記載のトマト栽培品種。
  12. 前記果実が催色期およびそれ以降、成熟果実である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のトマト栽培品種。
  13. 前記栽培品種が小さい「チェリー」果実を生産する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のトマト栽培品種。
  14. 前記栽培品種がソラヌム・リコペルシクムである、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のトマト栽培品種。
  15. 前記栽培品種がそのゲノム内に黄色果肉表現型をコードする追加のＰｓｙ１変異対立遺伝子をさらに含む、請求項１に記載のトマト栽培品種。
  16. 前記追加のＰｓｙ１変異対立遺伝子が配列番号８および配列番号９のいずれか１つに記載の核酸配列を含む、請求項１５に記載のトマト栽培品種。
  17. 前記黄色部分の細胞が１つのｒａｒｌ対立遺伝子と、前記黄色果肉表現型をコードする１つのＰｓｙ１変異対立遺伝子とを含み、および前記赤色部分が野生型Ｐｓｙ１対立遺伝子と、トランスポゾン除去フットプリントを含むＰｓｙ１対立遺伝子と、またはその組み合わせを含む、請求項１５〜１６のいずれか１項に記載のトマト栽培品種。
  18. 前記ｒａｒｌ対立遺伝子に対してホモ接合性であり、前記ｒａｒｌ対立遺伝子がトランスポゾン３’末端に配列番号２に記載の核酸配列と隣接しているトランスポゾンの挿入を含むフィトエン合成酵素１（Ｐｓｙ１）対立遺伝子であるトマト栽培品種であって、前記トマト栽培品種が完全に黄色の果実を生産する、トマト栽培品種。
  19. 前記ｒａｒｌ対立遺伝子が配列番号５に記載の核酸配列を含む、請求項１８に記載のトマト栽培品種。
  20. 請求項１７〜１８のいずれか１項に記載のトマト栽培品種の種子であって、前記種子から生長する植物がｒａｒｌ対立遺伝子に対してホモ接合性であり、および完全に黄色の果実を生産する、種子。
  21. 前記種子から生長した植物が胎座および／または子室から果実の果皮を横切って表皮に及ぶ黄色−赤色部分の表現型を有する果実を生産し、前記表現型がｒａｒｌの少なくとも１つの対立遺伝子に関連づけられ、前記ｒａｒｌ対立遺伝子が前記対立遺伝子のイントロン内に挿入を含むフィトエン合成酵素１（Ｐｓｙ１）対立遺伝子であり、前記挿入がＰｓｙ１の非機能的スプライスバリアントをもたらす、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のトマト栽培品種の種子。
  22. 請求項１〜２１のいずれか１項に記載のトマト栽培品種の植物部位であって、葉、花粉、胚、根、根端、葯、花、単離細胞、単離組織およびそのいずれの部分からなる群から選択される、植物部位。
  23. 胎座および／または子室から果実の果皮を横切って表皮に及ぶ黄色−赤色部分の表現型を有するトマト果実であって、前記表現型が果実を生産する栽培トマト植物において少なくとも１つのｒａｒｌの対立遺伝子に関連づけられ、前記ｒａｒｌ対立遺伝子が前記対立遺伝子のイントロン内に挿入を含むフィトエン合成酵素１（Ｐｓｙ１）対立遺伝子であり、前記挿入がＰｓｙ１の非機能的スプライスバリアントをもたらす、トマト果実。
  24. 前記ｒａｒｌ対立遺伝子が配列番号５に記載の核酸配列を含む、請求項２３に記載のトマト果実。
  25. 前記黄色部分の細胞がｒａｒｌ対立遺伝子に対してホモ接合性である、請求項２３〜２４のいずれか１項に記載のトマト果実。
  26. 胎座および／または子室から果実の果皮を横切って表皮に及ぶ黄色−赤色部分のＡｒｌｅｃｃｈｉｎｏ表現型を有する果実を生産するトマト栽培品種を生産する方法であって、フィトエン合成酵素１のｒａｒｌ対立遺伝子を含む遺伝因子を赤色果実またはその一部を生産するトマト栽培品種に導入することを含み、前記ｒａｒｌ対立遺伝子が前記対立遺伝子のイントロン内に挿入を含み、前記挿入がＰｓｙ１の非機能的スプライスバリアントをもたらす、方法。
  27. 前記遺伝因子が、子孫栽培トマト植物を形成するために前記遺伝因子を含むドナートマト植物と赤色果実を生産するトマト栽培品種を交雑させることによって導入される、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記方法が
    ａ．ｒａｒｌ対立遺伝子の存在について、各子孫栽培トマト植物またはその部分から採取した核酸試料を調べるステップ；
    ｂ．前記ｒａｒｌ対立遺伝子を含む子孫栽培トマト植物を選抜するステップ；および
    ｃ．ステップ（ｂ）で選抜した植物によって生産される果実を調べて、Ａｒｌｅｃｃｈｉｎｏ表現型を有する果実を生産する栽培トマト植物を選抜するステップをさらに含む、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記遺伝因子が、赤色果実を生産するトマト栽培品種の複数の細胞を前記遺伝因子で形質転換することによって導入される、請求項２６に記載の方法。
  30. 前記方法が
    ａ．ｒａｒｌ対立遺伝子の存在について、各形質転換細胞から採取した核酸試料を調べること；
    ｂ．前記ｒａｒｌ対立遺伝子を含む複数の細胞を選抜すること、
    ｃ．前記ｒａｒｌ対立遺伝子を含む複数のトランスジェニック植物を得るために、複数の形質転換細胞を再生させること、および
    ｄ．前記トランスジェニック植物によって生産された果実を調べて、Ａｒｌｅｃｃｈｉｎｏ表現型を有する果実を生産する植物を選抜することをさらに含む、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記ｒａｒｌ対立遺伝子の存在について前記核酸試料を調べることが、配列番号７に記載の核酸配列を含むｒａｒｌ対立遺伝子マーカーを増幅することによって行われる、請求項２８および３０のいずれか１項に記載の方法。
  32. 前記ｒａｒｌ対立遺伝子マーカーが配列番号１０および配列番号１１に記載の核酸配列を含む一対のプライマーを用いて増幅される、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記ｒａｒｌ対立遺伝子の存在について前記核酸試料を調べることが、配列番号３に記載の核酸配列を有するトランスポゾン配列を増幅することによって行われる、請求項２８および３０のいずれか１項に記載の方法。
  34. 前記トランスポゾンが配列番号１２および配列番号１３に記載の核酸配列を含む一対のプライマーを用いて増幅される、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記ｒａｒｌ対立遺伝子の存在について前記核酸試料を調べることが、前記Ｐｓｙ１対立遺伝子内のトランスポゾン挿入の３’ゲノム接合部を増幅することによって行われる、請求項２８および３０のいずれか１項に記載の方法。
  36. 前記３’ゲノム接合部が配列番号１４および配列番号１１に記載の核酸配列を含む一対のプライマーを用いて増幅される、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記ｒａｒｌ対立遺伝子の存在について前記核酸試料を調べることが、前記Ｐｓｙ１対立遺伝子内のトランスポゾン挿入の５’ゲノム接合部を増幅することによって行われる、請求項２８および３０のいずれか１項に記載の方法。
  38. 前記５’ゲノム接合部が配列番号１５および配列番号１６に記載の核酸配列を含む一対のプライマーを用いて増幅される、請求項３７に記載の方法。
  39. 胎座および／または子室から果実の果皮を横切って表皮に及ぶ黄色−赤色部分のＡｒｌｅｃｃｈｉｎｏ表現型を有する果実を生産するトマト栽培品種を生産する方法であって、フィトエン合成酵素１の少なくとも１つの対立遺伝子を挿入変異によって変異導入することを含む、方法。
  40. 前記挿入が非機能的Ｐｓｙ１対立遺伝子をもたらすイントロン内にある、請求項３９に記載の方法。
  41. 前記挿入がトランスポゾンである、請求項４０に記載の方法。
  42. 配列番号５に記載の核酸配列を含む変異フィトエン合成酵素１をコードする単離ポリヌクレオチド。
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