KR100604195B1

KR100604195B1 - 식물 노화에 특이적으로 발현되는 유전자 및 그 유전자의프로모터

Info

Publication number: KR100604195B1
Application number: KR1020040069765A
Authority: KR
Inventors: 신정섭; 정광욱; 옥승한; 반성철; 유경신; 유민경
Original assignee: 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2004-09-02
Filing date: 2004-09-02
Publication date: 2006-07-25
Also published as: US20060048241A1; KR20060020992A; US7193076B2; WO2006025664A1; CN1763197A; JP4188944B2; JP2006067996A; CN100381571C

Abstract

본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 식물 노화에 특이적으로 발현되는 애기장대에서 분리된 유전자 및 그 유전자의 발현을 유도할 수 있는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 프로모터에 관한 것이다. 상기한 본 발명에 의한 노화 관련 유전자 및 그 유전자의 프로모터는, 분자적 기작에 의해 식물의 노화를 환경친화적으로 조절하는 데 매우 유용하게 이용될 수 있다.

식물, 노화, 유전자, 프로모터, 애기장대

Description

식물 노화에 특이적으로 발현되는 유전자 및 그 유전자의 프로모터{A novel senescence-specific plant gene and its promoter}

도 1은 본 발명에 의한 식물 노화에 특이적으로 발현되는 유전자의 전사발현 양상을 나타내는 도면.

도 2는 본 발명에 의한 식물 노화에 특이적으로 발현되는 유전자의 전체 염기서열을 나타내는 도면.

도 3은 본 발명에 의한 식물 노화에 특이적으로 발현되는 유전자의 발현을 유도하는 프로모터의 전체 염기서열을 나타내는 도면.

도 4는 본 발명에 의한 식물 노화에 특이적으로 발현되는 유전자의 발현을 유도하는 프로모터의 클로닝에 사용되는 pBI101 벡터의 레프트 보드와 라이트 보드 카세트를 나타내는 도면.

도 5는 본 발명에 의한 식물 노화에 특이적으로 발현되는 유전자의 발현을 유도하는 프로모터에 GUS를 융합시켜 발현 양상을 관찰한 결과를 나타내는 도면.

본 발명은 애기장대(Arabidopsis thaliana)에서 유래된 식물 노화에 특이적 으로 발현되는 유전자 및 그 유전자의 프로모터에 관한 것으로, 분자적 기작에 의해 환경친화적으로 식물의 노화를 조절하는 데 유용하게 이용될 수 있는 애기장대에서 분리된 식물 노화에 특이적으로 발현되는 유전자(식물 노화 특이적 발현 유전자) 및 그 유전자의 발현을 유도하는 프로모터에 관한 것이다.

생명체의 생노병사에 관한 연구는 생명공학 연구에서 매우 중요한 분야이다. 이 중에서 노화는 생명체의 발달, 생육과정의 일환이기 때문에 전 세계적으로 노화의 원인과 조절 메카니즘 규명을 통해 최종적으로 생명체의 노화 지연을 이루고자 하는 연구가 활발히 진행 중이나 관련된 연구성과는 매우 미약한 편이다.

동물에서뿐만 아니라 식물 노화 관련 유전자의 조절 기작에 대한 연구도 활발히 진행 중이다. 고등 식물에서의 노화는 일련의 세포사멸(PCD; Programmed Cell Death)의 과정에 포함되어져 있고, 이는 발생의 마지막 단계로 잎과 꽃 등을 포함한 식물 전조직에서 관찰되기도 하지만 외부의 공격으로부터의 방어를 위해 국소적으로도 일어난다. 현재까지 식물에서의 노화는 식물 내의 호르몬들(ethylene, abscisic acid 및 cytokinins)의 작용과 영양분인 당(sugar)의 흐름에 의해 조절받는다고 알려져 있다.

만약 식물에서의 노화 촉진 또는 지연에 관여하는 유전자들의 분자 기작을 규명하고, 노화 관련 유전자를 식물체에 도입하면 고부가치의 산업에 유용하게 이용될 수 있다. 즉, 장미와 카네이션 등의 화훼작물, 벼와 보리 등과 같은 주요 식량작물에 도입하여 환경친화적인 방법으로 노화를 지연시킬 수 있다. 이런 목적으로 모델 식물인 애기장대(Arabidopsis thaliana)를 이용한 노화관련 유전자들 및 그 유전자들의 발현을 조절하는 조절 유전자 부위인 프로모터에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있다.

대한민국 특허공개공보(10-2004-0023252)에는 노화 지연 변이체 ore9-1에 액티베이션 태깅 방법을 적용하여 ore9-1 변이체에 비해 잎의 노화가 촉진되는 형질을 나타내는 돌연변이체를 선별하여 분리한 SOR9 유전자와 관련된 발명이 개시되어 있다.

한편, 노화 관련 유전자들의 특성이 식물체의 생육과 밀접하게 관계하여 작용하기 때문에 연구에 많은 어려움이 있다. 따라서, 식물체 형질전환에 있어 가장 널리 사용하고 있는 CaMV 35S 프로모터(Cauliflower mosaic virus 35S promoter) 등은 노화 연구의 프로모터로서 실험에 이용하기 부적절하다.

최근까지는 많은 노화 관련 유전자들의 형질전환 연구에서는 화학 약품 또는 호르몬 등의 인위적 처리시에 일시적으로 발현한다고 알려져 있는 유전자들의 프로모터를 사용하여 연구에 임하고 있는 실정이다. 하지만, 외부에서 화학 약품 처리를 한다는 것 자체가 식물체에 좋지 않은 영향을 끼칠 수 있고, 노화 관련 유전자들의 기능만 가늠할 정도이며 영구적으로 식물체에 도입하여 실용화할 수 없다는 큰 단점을 가지고 있다.

이와 같은 제약을 극복하고자 노화 특이적으로 반응하는 유전자 프로모터를 확보하여 사용하고자 하는 필요성이 대두되었다. 1995년 사이언스에 보고된 애기장대 SAG12(Senescence-associated gene 12) 유전자의 프로모터가 식물체 내의 분자적 기작에 의해 노화 특이적으로 반응하고 조절을 받는다고 알려져 있고, 현재까 지 이런 성질의 프로모터는 애기장대 내에서 상기 SAG12와 SEN4[(1) Gan S and Amasino RM, 1995. Inhibition of leaf senescence by autoregulated production of cytokinin. Science 270: 1986-1988, (2) Noh YS and Amasino RM, 1999, Indentification of a promoter region responsible for the senescence-specific expression of SAG12. Plant Mol Biol 41: 181-194] 정도가 알려져 있어 관련 연구성과가 매우 미흡한 상태이다.

따라서, 식물체의 발육과 생장에는 전혀 영향을 미치지 않으면서 단시간 내에 효율적으로 노화 관련 유전자들의 기능을 분석할 수 있고, 환경친화적이면서 산업적으로 영구적인 형질전환이 가능하도록, 외부의 어떤 처리 없이 노화에 특이적으로 반응(auto-regulate reaction)하는 프로모터에 대한 요구가 끊임없이 존재하여 왔다.

본 발명은 상기 문제점과 요구를 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 식물 노화에만 특이적으로 발현하는 유전자 및 그 유전자의 발현을 유도하는 프로모터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 노화 특이적 유전자 발현 신규 프로모터를 포함한 재조합 벡터 및 이에 의해 형질전환된 식물체를 제공하는 것이다.

본 발명은 (a) 서열번호 1의 염기서열 또는 (b) 서열번호 1의 염기서열과 실질적 서열 상동성을 갖는 염기서열을 포함하는 식물 노화에 특이적으로 발현되는 분리된 유전자(AtCDCP1)를 제공한다.

또한, 본 발명은 (a) 서열번호 2의 염기서열 또는 (b) 서열번호 2의 염기서열과 실질적 서열 상동성을 갖는 염기서열을 포함하는 식물 노화 특이적 유전자의 발현을 유도할 수 있는 분리된 프로모터를 제공한다.

애기장대의 전체 염기서열은 이미 모두 밝혀져 있다. 이들 염기서열을 바탕으로 각 유전자들의 위치와 중요한 도메인(domain), 엑손(exon), 인트론(intron) 등에 관한 정보도 이미 추정하여 공개되어 있지만, 아직도 특정 도메인이 없고 기능을 추정할 수 없는 유전자가 대다수이다. 본 발명자들은 노화와 관련된 유전자를 찾기 위해 스트레스(stress)와 관련된 중요한 식물 호르몬인 살리실산(salicylic acid)를 애기장대에 처리하여 발현이 증가되는 미지(unknown) 유전자를 발견하고 AtCDCP1이라 명명하였다.

이를 근거로 출원인은 TAIR(The Arabidopsis Information Resource) 싸이트에 개시된 애기장대 서열 데이터베이스를 상기 신규 유전자 염기서열과 비교 조사해 본 결과, 상기 유전자와 상동성을 갖는 유전자를 애기장대에서 찾아낼 수 있었다(TAIR 제at4g34120호)(도 2 참조).

이 유전자의 프로모터가 노화 특이적인 유전자가 발현되도록 조절하고 있을 것이라고 결론을 내리고 이 유전자의 프로모터로 추정되는 염기서열을 분리하고 이를 확인하였다(도 3 참조).

본 발명에 의한 식물 노화 특이적인 유전자 발현을 유도할 수 있는 프로모터에 GUS를 융합시켜 발현 양상을 조사해 본 결과, 노화한 잎에서만 GUS 유전자가 발 현된다는 것을 확인하였다(도 5 참조).

따라서, 상기 애기장대에서 분리된 본 발명에 의한 신규한 프로모터는 정상적인 조직에서는 발현을 거의 하지 않고, 노화에만 특이적으로 유전자 발현을 유도할 수 있어, 친환경적으로 노화를 조절하는 데 매우 유용하게 이용될 수 있다.

상기 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열과 실질적 서열 상동성을 갖는 서열이란 도 2(서열번호 1) 또는 도 3(서열번호 2)에 나타난 염기서열과 비교해 약간의 서열 변이를 갖지만 서열 기능이 동일한 염기서열을 말한다.

또한, 본 발명은 상기 프로모터의 염기서열을 포함하는 재조합 벡터(도 4 참조) 및 상기 재조합 벡터에 의해 형질전환된 식물체(도 5 참조)를 제공한다.

본 발명에 의한 프로모터 염기서열을 포함하는 재조합 벡터를 제조하고 이 재조합 벡터를 식물체 내로 도입시키기 위하여, 본 발명이 속하는 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 알려진 다양한 기술을 사용할 수 있다(참고 문헌: Clough SJ and Bent AF, 1998. Floral dip:a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J 16:735-43). 예를 들어 아그로박테리움-매개 형질전환을 이용할 수 있다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 프로모터의 DNA단편을 증폭하기 위한 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 PCR용 프라이머를 제공한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지 에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

[실시예 1. 신규한 유전자(AtCDCP1)의 발견]

본 발명자들은 노화와 관련된 유전자를 찾기 위해 스트레스(stress)와 관련된 중요한 식물 호르몬인 살리실산(salicylic acid)를 애기장대에 처리하여 발현이 증가되는 미지(unknown) 유전자를 발견하고 AtCDCP1이라 명명하였다.

이를 근거로 출원인은 TAIR(The Arabidopsis Information Resource) 싸이트에 개시된 애기장대 서열 데이터베이스를 상기 신규 유전자 염기서열과 비교 조사해 본 결과, 상기 유전자와 100% 상동성을 갖는 유전자를 애기장대에서 찾아낼 수 있었다(TAIR 제at4g34120호).

[실시예 2. 타겟 유전자(TAIR 제at4g34120호)의 RT-PCR]

TAIR 싸이트에서 추정된 상기 AtCDCP1 유전자의 ORF(open reading frame)가 실제로 애기장대에서 전사되는지 알아보기 위하여 RT-PCR을 수행하였다.

RT-PCR에 이용할 표준 cDNA를 합성하기 위해 뉴클레오스핀 RNA 플랜트 키트(Nucleospin RNA plant kit, Macherey-Nagel)를 이용하여, 애기장대(Arabidopsis thalina ecotype Columbia)의 각 조직, 즉 꽃(flower), 경생엽(cauline leaves), 근생엽(rosette leaves), 줄기(stem), 뿌리(root)의 전체 RNA(total RNA)를 추출하였다.

정량한 전체 RNA(total RNA) 4㎍과 10mM의 각각 dNTP, 100M의 랜덤 데카머(random decamer)와 뉴클레아제가 없는(nuclease-free) 멸균수를 잘 섞은 다음 65 ℃에서 5분간 처리한 후, 그 튜브를 얼음에 옮겨 RT-PCR 버퍼(buffer), RNase 저해제(RNase inhibitor), 0.1 M DTT를 첨가하여 42℃에서 2분간 처리하였다.

다시 얼음으로 옮긴 후 역전사효소(reverse transcriptase) 200 유니트(unit)를 넣고 42℃에서 1시간 동안 처리하였다. 이 생성물을 70℃에서 15분간 불활성화시켜 조직별 cDNA 풀(pool)을 만들었으며, 이 cDNA 풀(pool)을 RT-PCR의 주형(template)으로 사용하였다.

RT-PCR에 이용된 프라이머는 TAIR 싸이트의 염기서열을 바탕으로 유전자의 엑손 연결부위에서 합성하였다. RT-PCR에 이용된 타겟 유전자 특이 프라이머는 표 1에 구체적으로 나타나 있다. 그리고 이때 PCR 반응은 Gene Amp^® PCR System 2700 (Perkin Elmer, USA)을 사용하여, 95℃에서 2분간 초기 변성 후, 터치-다운(touch-down) PCR 방법으로 5회 [95℃ 40초, 62℃ → 57℃ (매 cycle당 1℃씩 감소) 15초, 72℃ 1분] 실시하고, 정상적인 PCR 방법으로 20회 [95℃ 40초, 57℃ 15초, 72℃ 1분]와 72℃에서 5분을 수행하였다.

RT-PCR에 이용된 타겟 유전자 특이 프라이머

5'-CCT-CTA-CGT-CGG-TCG-ATG-ATG-CG(서열번호 3)	23-mer
5'-CCA-TAT-GTC-TTA-CTG-ATC-AGT-TTC-TGT-AGT-TCG(서열번호 4)	33-mer

내적대조군(Internal control)으로는 18S rRNA(Ambion)를 사용하였으며, 조직별 cDNA 풀(pool)에서 동일한 양이 발현되는 것을 확인하였다. 상기 타겟 유전자 특이 프라이머를 이용한 RT-PCR의 결과는 도 1과 같다. 도 1에 나타난 바와 같 이 타겟 유전자가 꽃, 경생엽, 근생엽에서 강하게 발현이 되는 것을 확인할 수 있었다.

[실시예 3. 노화 특이적 발현 유전자(TAIR 제at4g34120호)의 프로모터 염기서열 확인]

상기 AtCDCP1 유전자(at4g34120)의 바로 앞부분에 있는 유전자(at4g34110)의 3'UTR(untranslated region)에서부터 상기 유전자(at4g34120)의 시작부분(ATG)까지 1,094 염기쌍(base pair)을 이 유전자의 프로모터 부위라 추정하였다.

먼저 애기장대의 게놈 DNA(gDNA)를 추출하고, 양 말단에 HindIII(5'말단)와 BamHI(3'말단) 싸이트를 포함하고 있는 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머를 합성하였다(표 2 참조). 상기 gDNA를 주형(template)으로 하여, 합성한 상기 프라이머와 교정(proofreading) 기능을 갖는 DNA 중합효소(pyrobest, TAKARA)를 이용하여 프로모터 부위를 증폭하였다. 그리고 이때 PCR 반응은 Gene Amp^® PCR System 2700 (Perkin Elmer, USA)을 사용하여, 95℃에서 2분간 초기 변성 후, 터치-다운(touch-down) PCR 방법으로 5회 [95℃ 40초, 60℃ → 55℃ (매 cycle당 1℃씩 감소) 15초, 72℃ 1분 30초] 실시하고, 정상적인 PCR 방법으로 30회 [95℃ 40초, 55℃ 15초, 72℃ 1분 30초]와 72℃에서 30초를 수행하였다.

프로모터 클로닝에 이용한 프라이머

5'-CTA-AAG-CTT-GTG-TTC-ACG-GAA-GAT-GAA-TTT-GAT-T(서열번호 5)	34-mer
5'-CAT-GGA-TCC-ATT-CGC-TTA-TCC-TCT-GTT-ACT-CAC-AGA(서열번호 6)	36-mer

PCR로 얻은 산물을 각 제한효소로 말단을 자른 다음 pBI101 벡터(vector)에 클로닝하였다. 이 클론을 시퀀싱(sequencing)한 결과 정확한 염기서열이 클로닝되었음을 확인할 수 있었다(도 3 참조).

[실시예 4. 타겟 프로모터 클로닝 및 프로모터의 노화 특이적 발현 양상 확인]

타겟 프로모터 클로닝에 이용한 pBI101 벡터는 레프트 보드(left board)와 라이트 보드(right board) 사이에 GUS(β-glucuronidase) 리포터 유전자를 가지고 있으며 형질전환시킬 수 있는 복수벡터(binary vector)였다(도 4 참조). 이 벡터를 아그로박테리움(Agrobacterium, GV3101)에 형질변환시킨 후 꽃 침지(flower dipping, Clough et al., Plant J., 16(6): 735 - 743, 1998) 방법으로 애기장대를 형질전환시켰다.

형질전환시킨 애기장대를 세번에 걸친 선발(screening)로 T₃ 계통(line)을 확보할 수 있었다. GUS(β-glucuronidase)는 특정한 기질(X-GlcA)을 분해시켜 푸른색을 나타내게 하므로, GUS 유전자가 도입된 식물체를 X-GlcA 용액에 담가 두면 이 유전자가 발현되는 조직에서만 푸른색을 띄게 된다.

이러한 특징을 갖는 GUS 유전자의 발현 양상을 관찰한 결과, 정상적으로 살아있는 조직에서는 전혀 관찰되지 않았고, 오직 노화된(엽록소가 없는) 잎에서만 특이적으로 강하게 발현하는 것을 관찰할 수 있었다(도 5 참조). 노화한 잎을 확대하여 보면 이 프로모터는 노화 특이적인 프로모터임을 명확하게 확인할 수 있었다.

상술한 바와 같이, 본 발명은 식물 노화에 특이적으로 발현되는 신규한 AtCDCP1 유전자 및 정상조직에서는 발현되지 않고 노화 조직에서만 특이적으로 유전자를 발현시킬 수 있는 신규한 프로모터 등을 제공하여, 식물체의 발육과 생장에는 전혀 영향을 미치지 않으면서 단시간 내에 효율적으로 노화 관련 유전자들의 기능을 분석할 수 있고, 환경친화적이면서 산업적으로 영구적인 형질전환이 가능한 효과를 도모할 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열번호 1의 염기서열을 갖는 식물 노화에 특이적으로 발현되는 분리된 유전자(AtCDCP1).
서열번호 2의 염기서열을 갖는 식물 노화 특이적 유전자의 발현을 유도할 수 있는 분리된 프로모터.
제2항에 따른 프로모터 염기서열을 포함하는 재조합 벡터.
제3항에 따른 재조합벡터에 의해 형질전환된 대장균.
제4항에 따른 대장균에 의해 형질전환된 식물체.
서열번호 2의 염기서열을 갖는 프로모터의 DNA단편을 증폭하기 위한 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 PCR용 프라이머.