MXPA02003254A - Tolerancia mejorada al estres en maiz via manipulacion de los genes reguladores del ciclo de la celula. - Google Patents

Abstract

Se describe un metodo transgenico para incrementar la division celular en organos reproductores femeninos de plantas. Los genes son expresados temporal y espacialmente para afectar la activacion y/o modulacion de las quinasas dependientes a ciclina en un organo vegetal o tejido. Las construcciones de expresion y metodos para la produccion de plantas de cultivo con fenotipos heredables los cuales son utiles para programas de reproduccion disenados para incrementar el potencial de rendimiento sobre un intervalo de condiciones ambientales estan tambien incluidos.

Description

TOLERANCIA MEJORADA AL ESTRÉS EN MAÍZ VIA MANIPULACIÓN DE LOS GENES REGULADORES DEL CICLO DE LA CÉLULA DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Esta invención se relaciona generalmente al campo 5 de la biología molecular vegetal. Más específicamente, esta invención se relaciona a los métodos y reactivos para la expresión temporal y espacial de genes que incrementan la división celular en plantas, especialmente plantas transgénicas, para incrementar el rendimiento y la salud de 10 plantas de cultivo en general asi como también en periodos de estrés. La división celular juega un papel crucial dura?te • todas las fases del desarrollo de la planta. La continuación de la organogénesis y las respuestas de crecimiento a un 15 ambiente cambiante requiere regulación espacial, temporal y de desarrollo precisa de la actividad de la división celular en los meristemos (y en las células con la capacidad para formar nuevos meristemos, tales como en la formación lateral de raiz) . El control de la división celular es también 20 importante en los mismos órganos (es decir, separados de los meristemos per se) , por ejemplo, en la expansión de hojas, crecimiento secundario y endorreduplicación. Una red compleja controla la división celular en los eucariotes. Varias trayectorias regulatorias comunican 25 las constricciones ambientales tales como la disponibilidad -á fctiii.i. ? *~^ — .*. ^... ^¡jiiid tÉiinjn i, muí i ?? iinirti iiüjjuiuy de nutrientes, señales mitogénicas tales como factores de crecimiento u hormonas, o entradas de desarrollo tales como la transición a partir del crecimiento vegetativo a reproductivo. Por último, estas trayectorias regulatorias 5 controlan la sincronización, proporción, plano y posición de la división celular. La división celular en eucariotes superiores es • controlada por dos puntos de chequeo principales en el ciólo celular lo cual evita que la célula entre tanto a la fase 10 o S prematuramente. La evidencia a partir de sistemas de levaduras y mamíferos ha repetidamente mostrado que la sobre expresión de los genes del ciclo celular claves puede tanto accionar la división celular en células que no se dividen, o estimular la división en células que se dividen previamente 15 (es decir, la duración del ciclo celular es disminuida y se reduce el tamaño celular) . Ejemplos de genes cuya sobre expresión ha sido mostrada para estimular la división celular incluyen las ciclinas (véase por ejemplo, Doerner, P. et al., Nature (1996) 380:520-523; Wang, T.C. et al., 20 Nature (1994) 369:669-671; quelle, D.e. et al., Genes Dev. • (1993) 7:1559-1571); factores de transcripción E2F (véase, por ejemplo, Jonson, D.G. et al., Nature (1993) 365:349-352; Lukas, J. Et al., Mol. Cell. Biol. (1996) 16:1047-1057), cdc25 (véase, por ejemplo, Bell, M.H. et al., Plant Mol. 25 Bio. (1993) 23:445-451; Draetta, D. et al., BBA (1996) t- 1 ?? l tl í w , ^im?Mm m t^m m^ ü ám 1332:53-63), y mdm2 (véase, por ejemplo, EtOH, G. Et al., Blood (1997) 90:1982-1992). Inversamente, se han encontrado otros productos de genes para participar en el control del punto de chequeo, bloquear efectivamente o retardar la 5 progresión a través del ciclo celular (Cebolla et al., EMBO 18 (16) :4476-84 (1999) ) . Se conserva el mecanismo básico del control del • ciclo celular entre los eucariotes. Una proteina catalítica quinasa y una subunidad de ciclina activanete controlan el 10 progreso a través del ciclo celular. La proteina quinasa es generalmente referida como quinasa dependiente a ciclina (CDK) , cuya actividad se modula por los eventos de • fosforilación y desfosforilación y por la asociación con las subunidades regulatorias llamadas ciclinas. Las CpK 15 requieren la asociación con las ciclinas para la activación, y la sincronización de la activación es bastante dependiente de la expresión de la ciclina. Los genomas de eucariotes típicamente codifican los genes de ciclina y CDK múltiples. En los eucariotes 20 superiores, diferentes miembros de la familia CDK actúan en diferentes etapas del ciclo celular. Los genes de ciclina son clasificados de acuerdo a la sincronización de su aparición durante el ciclo celular. Además de las subunidades de ciclina y CDK, las CDK son con frecuencia 25 asociadas físicamente con otras proteínas las cuales alteran ^„.^....t... .............. ^,^M^^..^M»*^^^ la ubicación, especificidad del substrato, o actividad. Unps cuantos ejemplos de tales proteínas de interacción con CDK son los inhibidores de CDK, miembros de la familia de proteínas asociadas a Retinoblastoma (Rb) , y la subunidad de 5 la quinasa constitutiva (CKS) . La actividad de la proteína quinasa del complejo es regulada por el control de retroalimentación en ciertos • puntos de chequeo. En tales puntos de chequeo la actividad de la CDK llega a ser limitante para progreso adicional. 10 Cuando la red de control de retroalimentación sensibiliza la terminación de un punto de chequeo, se activa la CDK y ja célula pasa a través del siguiente punto de chequeo. Los cambios en la actividad de la CDK son regulados en niveles múltiples, los cuales incluyen la fosforilación reversible 15 de los factores del ciclo celular, cambios en la ubicación subcelular del complejo, y las relaciones de síntesis y la destrucción de componentes limitantes. La regulación del ciclo celular por el complejo ciclina/CDK se nota particularmente en la transición Gl/fase S y en Ja 20 transición G2/fase M. P.W. Doerner, Cell Cycle Regulation in • Plants, Plant Physiol. (1994) 106:823-827. Las plantas tienen características de desarrollo únicas que las distinguen de otros eucariotes. Las células vegetales no migran, y de esta forma solamente la división 25 celular, expansión y muerte celular programada determinan la iSSs^S ^ü : morfogénesis. Se forman los órganos a través de la extensión total de vida de la planta a partir de las regiones especializadas llamadas meristemos. Además, muchas células diferenciadas tienen el potencial tanto para desdiferenciar 5 y para reintroducir el ciclo celular. Hay también numerosos ejemplos de los tipos de células vegetales que sufren de la endorreduplicación, un proceso el cual implica la • multiplicación nuclear sin citosinas. Se espera que el estudio de los genes de control del ciclo celular de la 10 planta contribuya al entendimiento de estos fenóme?os únicos. O. Shaul et al., Regulation of Cell División in Arabidopsis, Critical Revie s in Plant Sciences, 15(2): 97- • 112 (1996). Los métodos actuales para el modificado genético 15 en maíz requieren un tipo celular específico como el receptor de ADN nuevo. Se encuentran estas células células de callo que crece rápidamente, indiferenciado o en la superficie escutelar del embrión inmaduro (lo cual da origen al callo) . Hay evidencia para sugerir que las células deben 20 ser divididas para que ocurra la transformación. Por lo tanto, para optimizar la transformación puede ser deseable proporcionar un método para incrementar el número de células que sufren de división. Se ha observado también que las células de 25 división representan solamente una fracción de las células É.tl^l?,?lrm.M.l«?ílliIl?^^ que expresan temporalmente un transgen. Independientemente del método de suministro actualmente usado, se introduce el ADN en literalmente miles de células, aún se recuperan los transformantes en frecuencias de 10"5 con relación a las células que expresan temporalmente. La presencia de ADN dañado en sistemas que no son plantas (similar al ADN introducido por pistola de partículas u otro medio físico) ha sido bien documentada para inducir rápidamente la detención del ciclo celular. Siede, W., Cell cycle arrest in response to DNA damage: lessons from yeast. Mutation Res. 337 (2): 73-84 (1995). Un incremento en el entendimiento y control del ciclo celular puede ayudar también a incrementar además la relación de recuperación de los transformantes. La ántesis es reconocida generalmente como el periodo crítico de desarrollo de la espiga y grano en el maíz. Varios procedimientos experimentales demuestran qµe los tratamientos, los cuales disminuyen la división celular alrededor de la ántesis, disminuyen el rendimiento del grano. Por ejemplo, ocurren grandes pérdidas de rendimiento cuando las plantas de maíz se someten al ácido abscisíco (ABA) (Myers, P.N. et al., 1990; Mambelli and Setter, 1998), estrés térmico (Jones, R.J. et al., 1985; Cheikh and Jone:?, 1994), deficiencias de agua (Artlip, T.S. et al., 1995) o se exponen a densidad alta de planta alrededor de la ántesis. (Véase Zinselmeier, C, and J.E. Habben, Use of mRNA- j^y» ^|^^^ ^f^g Profiling Technology to Determine Gene Expression Patterns in Developing Maize Ears that Differ in Yield, Plant Physiology Abstracts (1998) ; Prine, G.M. A Critical Pepod for Ear Development in Maize, Crop Science 11:782-786 5 (1971)). Inversamente, los tratamientos que incrementan la división celular de la planta alrededor de la ántesis incrementa el rendimiento del grano. Por ejemplo, la • aplicación de las citoquininas (Lejeune, P. et al., 1998). En la mayoría de los casos, la variación en el rendimiento 10 se relaciona al número de granos que se desarrollan. Colectivamente, estos resultados sugieren que el número de grano y el tamaño pueden ser limitados por la división • celular, particularmente durante sequía o estrés de alta densidad en la ántesis. De acuerdo a la invencióp, 15 incrementar la división celular de la espiga inmadura y el grano puede mantener el crecimiento de la espiga y la semilla, y como una consecuencia, amortigua este periodo vulnerable importante de formación de rendimiento. Los tejidos objetivados para los transgenes están 20 en la inflorescencia femenina del maíz, ya que se relaciona a otros órganos, es frecuentemente el más sensible al estrés abiótico. Por ejemplo, el estrés de agua temporal antes a La polinización ha sido mostrado para detener el crecimiento de las espigas, sacos embrionarios, y sedas. Después de la 25 polinización, el estrés de la sequía puede inhibir la - * ****...*. --* .....».. ... *„.,.»-...^^^..Sl.^^A^.^^^ división celular del endospermo, lo cual se agudiza en 8 a 10 días después de la polinización. Como un resultado, ta?to el grupo de grano y el desarrollo del endospermo se inhiben. Este efecto, es más pronunciado en la región apical de la 5 espiga. El desarrollo retardado del endospermo puede resultar en granos apicales abortados, debido a la división celular reducida y la endorreduplicación disminuida. No • sorpresivamente, cualquiera de estos eventos han sido mostrados para ser controlados por las proteínas quinasas 10 dependientes a la ciclina. La infecundidad (la carencia del desarrollo de espiga) es una de las manifestaciones más comunes de plantas de maíz crecidas en altas densidades. Otro rasgo prevalente en plantas estresadas en densidad es un incremento en ßl 15 intervalo de ántesis/seda, lo cual ha sido mostrado para ser el resultado de crecimiento retardado de la espiga. En base a esta y otra información, una clave para producir una espiga viable bajo estrés de población de planta es mantener su relación de crecimiento. Ya que la divisipn 20 celular es un componente clave del crecimiento de órganos, • el mecanismo regulatorio del ciclo celular en la inflorescencia femenina es el objetivo para la expresión de los transgenes. Los métodos tradicionales para mejorar la 25 formación de rendimiento se han centrado alrededor de las técnicas de reproducción. Como con cualesquier especies vegetales valiosas, los sembradores han usado por mucho tiempo las técnicas convencionales de reproducción para mejorar el rendimiento. Mientras que se han logrado las 5 mejoras, las ' técnicas de reproducción son laboriosas y lentas debido al tiempo requerido para reproducir y hacer crecer las generaciones vegetales sucesivas. Adicionalmente, • ciertos fenotipos pueden ser imposibles para obtener por las técnicas convencionales. De esta forma, puede ser deseable 10 utilizar la tecnología de ADN recombinante para producir nuevas variedades vegetales y cultivos en una forma controlada y predecible. Puede ser especialmente deseable producir cultivos y plantas ornamentales con un conjunto mejorado de semillas sobre un intervalo de condiciones 15 ambientales para incrementar el potencial del rendimiento. Puede observarse a partir de lo mencionado aquí anteriormente que existe una necesidad en la técnica para un método transgénico para incrementar el potencial de rendimiento en las plantas. 20 Es un objeto de la presente invención proporcionar • las construcciones de expresión las cuales cuando se expresan en una forma temporal y espacial en una planta transgénica incrementan el potencial del rendimiento, así como también la resistencia al estrés a través de ja 25 regulación de la división celular.

?Jtti?¿M.htj?t.ii¿a aiJu^a^^ Es otro objeto de esta invención proporcionar líneas vegetales transgénicas con fenotipos heredables jos cuales son útiles en programas de reproducción diseñados para incrementar el potencial en plantas de cultivo sobre un 5 intervalo de condiciones ambientales. Es aún otro objeto de la esta invención producir semillas las cuales producirán plantas con potencial de • rendimiento incrementado. Es un objeto adicional de esta invención 10 proporcionar plantas, células vegetales, y tejidos vegetales que contienen las construcciones de expresión de la invención. • Otros objetos de la invención llegarán a ger aparentes a partir de la descripción de la invención la cual 15 sigue. La presente invención comprende la expresión espacial y temporal de una secuencia de nucleótidos la cual incrementará la tolerancia al estrés (amortiguar la inflorescencia femenina) , particularmente estrés de sequía y 20 alta densidad, en plantas en tiempos en el desarrollo de la • planta tal como el tiempo vulnerable de la ántesis. En particular, esta invención se relaciona a los polinucleótidos los cuales codifican las proteínas implicadas en la regulación del ciclo celular. Más 25 particularmente, los polinucleótidos codifican proteínas lo cual incrementará la división celular en espigas de maíz; y granos por incrementar directamente las actividades de jas proteínas quinasas dependientes a ciclina o indirectamente por aumentar la actividad de las enzimas que controlan la actividad de CDK. Se controla la división celular en eucariotes superiores por un mecanismo bien conservado. El factor de control principal de este mecanismos es un complejo de proteína treonina/serina quinasa que está compuesto de ciclina (la subunidad regulatoria) y CDK (la subunidad catalítica). Este complejo controla la división celular por la fosforilación de las proteínas objetivo. Los eucariotes han desarrollado una red regulatoria elaborada para salvaguardar la fluctuación de las actividades de la CDK en el ciclo celular. Las ciclinas oscilan en abundancia como un resultado de tanto la regulación transcripcional y post- transcripcional . Esto proporciona un control on/off para la CDK, ya que la asociación de la ciclina es absolutamente requerida para la actividad de la quinasa. Ocurre la fosforilación y la desfosforilación de la CDK. Tres sitios de fosforilación importantes están implicados para modular las actividades de la CDK. La fosforilación de Tyrldl por la quinasa que la activa la CDK (CAK) activa CDK, mientras que la fosforilación de Thrl4 y Tyrl5 por Mytl y Weel, respectivamente, inactiva CDK (Mueller, P.R. et al., Mol.

Biol. Cel 6, 119 (1995); Mueller, P.R. et al., Science 2"0, 86 (1995)). CDC25, una proteína tirosina fosfatasa desfosforila Tyrl5 y activa CDK (Kumagai, A. and Dunphy, W.G., Cell 70, 139 (1992). Tanto Weel y CDC25 son a su vez 5 reguladas por la fosforilación. Niml, una proteína quinasa identificada en S . pombe es capaz de fosforilar Weel (esto inhibe la actividad de la Weel), mientras que Plxl es capaz • de usar CDC25 como un substrato e incrementar la actividad de CDC25, un circuito de retroalimentación positivo para la 10 regulación de CDK. El complejo CDK interactúa con los inhibidores de CDK (CKIs) . Un número de proteínas puede físicamente enlazar a CDK e inhibir la actividad de CDK.

• Los inhibidores caracterizados en los sistemas humanos incluyen p21, p27, p57, pl6 y pl9. 15 La identificación de las trayectorias limitantes en proporción influenciadas por el estrés abiótico es importante para determinar cuales se objetivan. Las trayectorias metabólicas de carbohidrato y de nitrógeno, así como también las trayectorias hormonales, han sido 20 encontradas para ser moduladas por el estrés. Un estudio reciente del trigo (Schuppler, U. Et al., "Effect of Water Stress on Cell División and Cell-Division-Cycle 2-Like Cell- Cycle Kinase Activity in Wheat Leaves, " Plant Physiol. 117:667-678 (1998)) muestra evidencia convincente que las 25 proteínas codificadas por los genes del ciclo celular pueden ser objetivos de estrés de agua. Cuando se impone una sequía temporal en las plantas de semillero, se detienen jas células mesófilas de las hojas en la fase Gl . Los ensayos con enzimas revelan que hay una disminución del 50% en la 5 actividad CDK en las células, la cual es provocada por un nivel incrementado de fosforilación de Tyrl5. El aborto de grano apical es una característica • común de maíz sometido a estrés de sequía. La investigación ha mostrado que la hormona vegeta citoquinina, es capaz de 10 reducir el aborto de grano apical. Concurrentemente, se ha mostrado que la citoquinina puede incrementar las actividades de CDK por reducir el grado de la fosforilación • de CDK en Tyrl5. Otra investigación ha mostrado que el mecanismo 15 regulatorio del ciclo celular está altamente conservado entre todos los eucariotes. Los genes del ciclo celular el maíz, Arabidopsis, y la alfalfa son capaces de rescatar mutantes de levadura que son defectuosos en los genes ojel ciclo celular. Similarmente, los genes del ciclo celular de 20 levadura, tales como CDC25, son capaces de promover la • división celular en plantas superiores. De esta forma, los genes heterólogos trabajarán en los eventos de maíz transgénico. En una modalidad, la invención comprende una 25 construcción genética la cual ante la expresión en las -jKf^-^..,<M..^Ai...«..t^..^<,,t..»^^ células vegetales proporciona una secuencia de ADN que codifica un producto de gen útil para dirigir la fosforilación o estado de activación de CDK de una planta o tejido vegetal. Particularmente, las ciclinas del tipo B y 5 tipo D, CDC25, Niml, y Plxl serán sobre expresadas con el fin de promover la división celular bajo el estrés. En otra modalidad, la invención comprende una construcción genética la cual proporciona una secuencia de ADN que codifica un producto de gen útil para cosuprimir Weel con el fin de 10 promover la división celular de una planta o tejido vegetal. El aborto de grano se incrementa cuando ocurren los ambientes desfavorables alrededor de la floración, por lo mismo disminuye el potencial de rendimiento genético en plantas. Típicamente, los flósculos femeninos en desarrollo 15 tienen más tendencia al estrés abiótico comparado con los flósculos masculinos. Las CDK son enzimas críticas que determinan la división celular floral del maíz. La modificación de la división celular femenina puede incrementar la probabilidad de desarrollo floral femenino 20 vigoroso y también mejorar la consistencia de un grupo de semillas bajo condiciones desfavorables. De esta forma la invención contempla la expresión de las secuencias de nucleótidos que incrementa la división celular durante periodos vulnerables, principalmente 5 aquellos implicados con el desarrollo de ántesis, donde el rendimiento se afecta más significativamente por el estrés. Definiciones : Como se usa en la presente el término "desarrollo de ántesis" puede incluir cualquier periodo en el 5 desarrollo de plantas donde el rendimiento puede ser impactado más significativamente por el estrés. Esto puede incluir la fase de crecimiento exponencial de la espiga durante la cual la biomasa y la fase lag del desarrollo de grano se acumula como se describe más totalmente en la 10 presente y en la siguientes referencias. ("Set and Flower Synchrony within the Ear of Maize II. Plant Population Effects", Crop Science, 37:448-455 (Marzo-Abril de 1997); y • Shaw, Robert "Climate Requirement", Corn Improvement, 3rd ed., Capítulo 10, pág. 609-638). Como se muestra en la 15 Figura 1, la reimpresión de Corn an dCron Improvement, los rendimientos de plantas son más vulnerables al estrés de humedad en un periodo de tiempo centrado alrededor de la floración (0-10 DAP) . Típicamente, este periodo será aproximadamente 14 dias antes a la floración a través de 20 aproximadamente 14 días después de la floración. • Los ejemplos y la discusión de la presente pueden específicamente hacer referencia al maíz, sin embargo las enseñanzas de la presente son igualmente aplicables a cualquier otro grano o cultivo de floración. 25 Como se usa en la presente el término "espiga" no tiH^frlttTffrfttl debe ser limitado a maíz y debe incluir cualquier inflorescencia femenina en desarrollo a partir de una planta . Como se usa en la presente el término "grano" 5 también no debe ser limitado a maíz sino debe incluir grano, o semilla dentro de una fruta. Como se usa en la presente el término "secuencia de nucleótidos que incrementa la división celular" debe significar cualquier secuencia de nucleótidos, (ADN, ARN, 10 codificación y/o antisentido) la expresión de la cual incrementa la relación de la división celular del tejido vegetal particular como se compara con la relación sin la • expresión de la secuencia. De acuerdo a la invención, se describe una 15 construcción genética la cual provoca la expresión de la secuencia de nucleótidos que incrementa división celular en un tiempo y ubicación para maximizar la división celular típicamente durante periodos muy vulnerables principalmente, alrededor de la antesis. La expresión espacial y temporal de jj . 20 genes que afectan la división celular de tejidos puede ser alcanzada usando diferentes tipos de promotores. Los promotores útiles para la invención son promotores jos cuales pueden provocar la expresión temporal y espacial de un producto de gen durante la ántesis como se define en la 25 presente y pueden ser constitutivos, inducibles o •"Tr ri -t- *JE"-^JL"- .^ b^»^-^ JIUI*-**»»^. aß~á**.****.?*áUk. üüíká „« específicos a tejido. Por ejemplo, los promotores específicos a semilla pueden ser usados para incrementar la división celular durante el desarrollo de la semilla, los promotores pro polinización pueden ser usados también o los promotores inducibles por estrés pueden ser usados para incrementar la división celular durante periodos de estrés. La optimización de promotores para lograr los objetivos de la invención es considerada rutina y fácilmente determinable por aquellos con experiencia en la técnica y se propone para estar dentro del alcance de la invención. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 es un diagrama esquemático (reproducido de Shaw, Robert "Climate Requirement", Corn Improvement, 3rd ed. , Capítulo 10, pág. 609-638). Como se muestra en la Figura 1, la reimpresión de Corn and Corn Improvement a partir de la página 614) de la relación entre la edad del cultivo y el porcentaje de rendimiento disminuido debido a 1 día de estrés con humedad. Las líneas superiores e inferiores representan las reducciones de rendimiento más altas y más bajas obtenidas en experimentos de estrés, la línea media la reducción promedio. La Figura 2 es una gráfica que representa la sincronización de expresión de varios promotores útiles para la presente invención. ^¡tej^^| La presente invención se basa en el aislamiento y caracterización de genes que afectan las CDK o enzimas qµe controlan las CDK las cuales controlan la división celular en plantas. Cualquier secuencia de nucleótido que codifica una enzima en las trayectorias de activación/modulación de CDK (fosforilación/desfosforilación) puede ser usada de acuerdo con la presente invención. Las secuencias de nucleótidos que codifican estas enzimas son fácilmente determinables por aquellos en la técnica a través de Genbank o las referencias descritas en la presente. Otras reacciones y trayectorias pueden ser utilizadas por diferentes órganos en una planta o por especies de plantas diferentes. Por cambiar los niveles o actividad de un componente en la trayectoria de activación/desactivación/modulación, es posible afectar los niveles de división celular en la planta, órgano de planta, o tejido de planta. Se han identificado muchos tipos diferentes de CDK en las plantas. Varios ADNc que codifican homólogos funcionales de cdc2 quinasa han sido aislados por hibridización rigurosa reducida o transcripción inversa acoplada por la reacción de cadena polimerasa a partir de un número de especies de plantas, las cuales incluyen chícharos (Feiler and Jacobs, 1990), alfalfa (Hirt et al., 1991, 1993), Arabidopsis (Ferreira et al., 1991; Hirayama et al., 1991), fríjol de soya (Miao et al., 1993), Antirrhinum (Fobert et al-, 1994), y maíz (Colaanti et al., 1991). Soni, R. Et al., "A Family of Cyclin D Homólogos from Plants Differentially Controlled by Growth Regulators and Containing the Conserved Retinoblastoma Protein Interactjon 5 Motif", The Plant Cell, 7:86 (1995). Varias otras CDK han sido clonadas y son fácilmente accesibles para aquellos con experiencia en la técnica. • Por lo menos se han identificado tres tipos diferentes de ciclinas en las plantas: los homólogos tipo A, 10 homólogos tipo B, y homólogos tipo D (Renaudin, J-P et al., "Plant cyclins: a unified nomenclature for plant A-, B- y D- type cyclins based on seqúense organization", Plant Mql.

• Biol., 32:1003-1018 (1996)). Las ciclinas del tipo a se descomponen en tres grupos estructurales (Al, A2 y A3). La 15 ciclina Al se ha aislado a partir del maiz. (Renaudin et al., Tabla 1). Las ciclinas del tipo B se descomponen en dos grupos estructurales (Bl y B2) . Las ciclinas Bl y B2 se han aislado del maíz. (Renaudin et al., Tabla 1). Las ciclinas del tipo D contienen tres grupos estructurales (DI, D2, y 20 D3) . Un número de secuencias de ADNc que codifican las • ciclinas mitóticas vegetales con las características del tipo A- o B- que tienen características mezcladas del tipo A y B se han aislado a partir de varias especies, las cuales incluyen zanahoria (Hata et al., 1991), fríjol de soya (Hata 25 et al., 1991), Arabidopsis (Hermerly et al., 1992; Day and Tli—nHi ni ipipi itn ilnlÜH ffltf T 1 1 ntT ' itn '1 1 ^^-»^. ..,.-..^.¿_.=.^* ^-afa^ Reddy, 1994), alfalfa (Hirt et al., 1992), Antirrhinum (Fobert et al., 1994) y maíz (Redaudin et al., 1994; Sun, Y. Et al., 1997, CycZmln a partir de endospermo de aiz (GenBank #U66607), CycZme 1, GenBank #U66608). Soni, R. Et al., "A Family of Cyclin D Homologs from Plarits Differentially Controlled by Growth Regulators and Containing the Conserved Retinoblastoma Protein Interaction Motif", The Plant Cell. 7:86 (1995). Varias otras ciclinas han sido clonadas y son fácilmente accesibles para aquellos expertos en la técnica. En su forma más simple, la invención comprende una construcción de nucleótidos que comprende una secuencia de nucleótidos que incrementa la división celular, un promotor regulatorio para regular el tejido temporal y la expresión espacial durante el desarrollo de la ántesis y las secuencias de terminación operablemente enlazadas a la secuencia que incrementa la división celular. Una lista no exclusiva de enzimas que pueden ^er candidatas para tal intervención incluyen Mytl, Weel, Niml, CDC25, Plxl, CKI, CAK y ciclinas. La identificación de otros polinucleótidos los cuales pueden ser útiles en la invención típicamente se basarán en la tamización para organismos procarióticos o eucarióticos con niveles alterados de división celular usando ensayos estándar en la técnica y descritos en la «i. presente. Por ejemplo, y no limitado a, hormonas vegetales tales como las citoquininas, ABA (Myers, P.N. et al. 199p) , y auxina (Trehin et al., planta (1998) 206 (2) : 215-224 ) . Los polinucleótidos útiles en la invención pueden 5 ser formados a partir de una variedad de polinucleótidos diferentes (por ejemplo, ADNc o genómico, ARN, oligonucleótidos, y polinucleótidos sintéticos) , así como también por una variedad de técnicas diferentes. Como se usa en la presente, un polinucleótido es una secuencia de tanto 0 invención sintética eucariótica o procariótica . En una modalidad preferida, la invención comprende el uso de una o más secuencias de nucleótidos las cuales, cuando se expresan juntas incrementan la división celular reproductiva. Esto puede permitir la producción de plantas o 5 semillas híbridas, una vez que se han establecido las líneas parentales endogámicas transgénicas. Para esta modalidad, la invención comprende una secuencia de ADN que codifica las ciclinas tipo B y D, CDC25, Niml, y/o Plxl capaces de promover la división celular por activar o modular la 0 actividad de las CDK en periodos críticos, sensibles al estrés del desarrollo de plantas. En una segunda modalidad, la secuencia de ADN que codifica la supresión de Weel capaz de promover la división celular por modular la actividad de CDK, es proporcionada por rendimiento incremento, desarrollo 5 de semillas, floración o resistencia al estrés. ^^^ ^ »-* . u^^t^^. -L'^»^*-"*-»'** -»-»**i« fa La invención no se limita a cualquier tipo de planta y puede ser usada para cualquier especies de planta ornamental o cultivo para los cuales es deseable incrementar el rendimiento. Los métodos de la invención pueden ser 5 aplicables a cualesquiera especies de plantas que portan semillas para incrementar el potencial de rendimiento por afectar la división celular en tejido de semilla. • Las construcciones de nucleótidos de la presente invención compartirán elementos similares, los cuales g,on 10 bien conocidos en la técnica de biología molecular vegetal. Por ejemplo, en cada construcción las secuencias de ADN de interés preferentemente serán enlazadas operablemente (es # decir, colocadas para asegurar funcionamiento de) a un promotor el cual permite que el ADN sea transcrito (en una 15 transcripción de ARN) y comprenderá un vector el cual incluye un sistema de replicación. En modalidades preferidas, la secuencia de ADN de interés será de origen exógeno en un esfuerzo para evitar la cosupresión de los genes endógenos. 20 Los promotores (y otros elementos regulatorios) • pueden ser heterólogos (es decir, no naturalmente enlazados operablemente a una secuencia de ADN a partir del mismo organismo) . Los promotores útiles para expresión en plantas son conocidos en la técnica y pueden ser inducibles, 25 constitutivos, específicos a tejido, derivados de ^^^ ^^^iubi üri^^fe^ltt^ eucariotes, procariotes, o virus, o tener varias combinaciones de estas características. Al elegir un promotor para usar en los métodos de la invención, puede ser deseable usar un promotor regulado desarrollamente o específico a tejido. Un promotor regulado desarrolladamente o especifico a tejido es una secuencia de ADN la cual regula la expresión de una secuencia de ADN selectivamente en las células/tejidos de una planta crítica para grupo de semilla y/o función y/o limita la expresión de tal secuencia de ADN para el periodo de maduración de semilla en la planta. Cualquier promotor identificable puede ser usado en los métodos de la presente invención lo cµal provoca la expresión durante el desarrollo de ántesis cpmo se define en la presente. Puede también ser ventajoso usar un promotor inducible a estrés para proporcionar la expresión de la construcción durante periodos de estrés. Pueden ser usadas las técnicas de tamizado diferencial para aislar los promotores expresados en órganos reproductores femeninos en desarrollo (granos y/o espigas inmaduras) a partir de alrededor de 14 días antes de la polinización a aproximadamente 12 días después de la polinización. Los promotores predichos para operar de esta forma incluyen LTP2, gamma-zein y ZAG2. Los promotores preferidos para la invención pueden ser aceptablemente sincronizados a 14 días antes y 12 días MiM^^^^Í^ifiß^M|ÍÍMÉÉ|gÍ^Íi^^| después de la ántesis cuando tanto la espiga inmadura y el grano mitóticamente activo son más susceptibles al estrés. Los promotores predichos para operar durante estas etapas de desarrollo incluyen LTP2, MZE40, nucí y ZAG2. Por ejemplo, 5 el promotor LTP2 de cebada (Kalla et al., 1994, Plant J.6 ( 6) : 849-860) confiere la especificidad de expresión de aleurona. Los investigadores de Pioneer han mostrado que este promotor es también funcional en el maíz. Cuando se fusionan con un gen reportador GUS, el promotor LTP2 dirjge 10 la expresión específica a aleurona de actividad GUS en granos de maíz (Niu and Tome, no publicado) . La aleurona es una capa más externa, de una sola célula de endospermo que • retiene la actividad mitótica cuando la región central del endospermo cesa la división y compromete a la 15 endorreduplicación. Por lo tanto, el promotor LTP2 permitjra manipular la división celular del endospermo cuando se fusiona con los genes regulatorios de división celular. B22E: 69 NAL Cali No. 442.8 Z34 "Primary Structure of a Novel Barley Gene Differentially Expressed in Inmmature 20 Alleurone Layers", Klemsdae, S.S. et al., Springer Intl 1991 Aug., Molecular and General Genetics, Vol. 228 (1/2) pág. 9- 16, 1991. La expresión de B22E es específica al pedicelo en granos de maíz en desarrollo, Zag2: 134 NAL Cali. NO.: QK725.P532 identificación y caracterización molecular de 25 ZAG1, el homólogo de maíz del gen homeótico floral de Arabidopsis AGAMOUS. Schmidt, R.J., Veit, B.; Mandel, M.A.; Mena, M. ; Hake, S.; Yanofsky, M.F. Rockville, MD: American Society of Plant Physiologists, cl989: 1993 Jul. The Pla,nt Cell v. 5(7): pág. 729-737; 1993 Jul incluye las 5 referencias. Las transcripciones de Zag2 pueden ser detectacjas 5 días antes a la polinización para 7 a 8 DAP, y dirige la expresión en el carpelo de inflorescencias femeninas en desarrollo y Ciml la cual es específica a los núcleos de 10 granos de maíz en desarrollo. La transcripción Ciml es detectada 4 a 5 dias antes de la polinización para 6 a 8 DAP. Otros promotores útiles incluyen cualquier promotor el • cual puede ser derivado a partir de un gen cuya expresión está asociada maternalmente con los flósculos femeninos en 15 desarrollo. La Tabla 1 muestra una lista de promotores preferidos los cuales incluyen su sincronización de expresión (DAP=días después de la polinización) . Sumario de expresión del promotor 20 • 4 ?f- +** •*-* fff*»*--'"'-rtmwi 'V"< p"^-^"-¿..^«-^f*^.^.^.^ • • La Figura 2 también representa la sincronización de varios promotores preferidos y desarrollo de grano. Por ejemplo una construcción útil para la presente invención puede incluir el gen B-ciclina de maíz enlazado operablemente al promotor ZAG2 para expresión de B-cicljna <0 a 22 días después de la polinización. Otros promotores los cuales son específicos a semilla o embrión y pueden ser útiles en la invención incluyen patatina (tubérculos de papa) (Rocha-Sosa, M. et al. w (1989) EMBO J. 8:23-29), convicilina, vicilina y legumina (cotiledones de chícharo) (Rerie, W.G., et al. (1991) Mol.

Gen. Genet. 259:149-157; Newbigin, E.J., et al. (1990) Planta 180:461-470; Higgins, T.J.V., et al. (1988) Plant. 5 Mol. Biol. 11:683-695), zein (endospermo de maíz) (Schemthaner, J.P., et al. (1988) EMBO J. 7:1249-1255), faseolina (cotiledón de frijol) (Serupta-Gopalan, C. Et al. (1985) Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 82:3320-3324), fitohemaglutinina (cotiledón de frijol) (Voelker, T. et al. 10 (1987) EMBO J. 6:3571-3577), B-conglicinina y glicinjna (cotiledón de fríjol de soya) (Chen, Z-L et al. (1988) EMBO J. 7:297-302), glutelina (endospermo de arroz), hordein (endospermo de cebada) (Marris, C. Et al. (1988) Plant Mol.

Biol.. 10:359-366), glutenina y esporamina (raíz de 15 tubérculo de papa dulce) (Hattori, T. Et al. (1990) Plant Mol. Biol.. 14:595-604). Los promotores de genes específicos a semillas enlazados operablemente a regiones de codificación heteróloga en construcciones de genes mantienen su patrón de expresión temporal y espacial en 20 plantas transgénicas. Tales ejemplos incluyen el promotor de gen de proteína de almacenamiento de semilla de Arabidopsis thaliana 2S para expresar los péptidos de enkefalina en semillas de Arabidopsis y Brassica napus (Vanderkerckhove et al., bio/Technology 7:L929-932 (1989)), promotores de 25 lectina de fríjol y ß-faseolina de fríjol para expresar la * , .. llMM r ., .^te.^,.,..^, ^^.J^.^*. ^.^M^.^ luciferaza (Riggs et al., Plant Sci. 63:47-57 (1989)), y promotores de glutenina de trigo para expresar la cloramfenicol acetil transferasa (Colot et al., EMBO J 6:3559-3564 (1987) ) . Puede ser usado cualquier promotor inducible en la presente invención para expresar temporalmente una construcción particular durante el desarrollo reproductivo. Véase Ward et al. Plant Mol. Biol. 22:361-366 (1993). Los promotores inducibles de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, aquellos del sistema ACEI el cual respondes a cobre (Mett et al. PNAS 90:4567-4571 (1993)); el gen In2 a partir del maíz el cual responde a aseguradores de herbicida de bencensulfonamida (Hershey et al., Mol. Gen. Genetics 227:229-237 (1991) y Gatz et al., Mol. Gen. Genetics 243:32- 38 (1994)) o represor Tet de TnlO (Gatz et al., Mol. Gen. Genet. 227:229-237 (1991). Un promotor inducible particularmente preferido es un promotor que responde a un agente inductor al cual no responden normalmente las plantas. Un promotor inducible de ejemplo es el promotor inducible a partir de un gen de hormonas esferoides, la actividad transcripcional de la cual se induce por una hormona glucocorticosteroide. Schena et al., Proc. Najl. Acad. Sci. U.S. A. 88:0421 (1991). Muchos promotores constitutivos diferentes pueden también ser utilizados potencialmente en la presente invención. Los promotores constitutivos de ejemplos incluyen, pero no se limitan a, los promotores a partir de virus vegetales tales como el promotor 35S de CaMV (Odell et al., Nature 313:810-812 (1985) y los promotores de tales genes como la actina de arroz (McElroy et al., Plant Cell 2:163-171 (1990)); ubiquitina (Christensen et al., Plant Mol. Biol. 12:619-632 (1989) y Christensen et al., Plant Mol. Biol. 18: 675-689 (1992)); pEMU (Last et al., Theqr. Appl. Genet. 81:581-588 (1991)); MAS (Velten et al., EMBO J. 3:2723-2730 (1984) e histona H3 de maíz (Lepetit et al., Mol. Gen. Genet. 231:276-285 (1992) y Atanassova et al., Plant Journal 2(3): 291-300 (1992)). El promotor ALS, un fragmento Xbal/Ncol 5' para el gen estructural Als3 de Brassica napus (o una secuencia de nucleótidos que tiene similitud de secuencia substancial para el fragmento Xbal/Nco2), representa un promotor constitutivo particularmente útil. Véase la solicitud del PCT WO96/30530. El transporte de proteína producida por los transgenes a un compartimiento subcelular tal como el núcleo, cloroplasto, vacuola, peroxisoma, glioxisoma, pared celular o mitocondria, o para la secreción en el apoplasto, se realiza por medio de enlazar operablemente la secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de señal a la región 5' y/o 3' de un gen que codifica la proteína d interés. Las secuencias de objetivación en el extremo 5' y/o 3' del gen estructural pueden determinar, durante la síntesis y procesamiento de la proteína donde la proteína codifica es puesta en compartimiento por último. La presencia de una secuencia de señal dirige un polipéptido a tanto un organelo intracelular o compartimiento subcelular o para la secreción al apoplasto. Muchas secuencias de serbal son conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Sulliv^n, T., "Análisis of Maize Brittle-1 Alíeles and a Detective Supresor-Mutator-Induced Mutable Alíele", The Plant Cell, 3:1337-1348 (1991), Becker et al., Plant Mol. Biol.20:49 (1992), Cióse, P.S., Master's thesis, Iowa State University (1993), Knox, C, et al., "Structure and Organization of Two Divergent Alpha-Amylase Genes From Barley", Plant Mol. Biql. 9:3-17 (1987), Lerner et al., Plant Physiol 91:124-129 (1989), Fontes et al., Plant Cell 3:483-496 (1991), Matsuqka et al., Proc. Nati. Acad. Sci. 88:834 (1991), Gould et al., J. Cell Biol 108:1657 (1989), Creissen et al., Plant J. 2:129 (1991), Kalderon, D., Robers, B., Richardson, W., and Smith A., "A short amino acid sequence able to specify nuclear location", Cell 39:499-509 (1984), Stiefel, V., Ruiz-Avila, L., Raz r., Valles M., Gómez J. , Pages M,. , Martinez-Izquierdo J., Ludevid M., Landale J., Nelson T., and Puigdomenech P., "Expression of a maize cell wall hydroxiproline-rich glycoprotein gene in early leaf and root ?t? Íum?í t? ?i tm?táÉ Émt , vascular differentiation", Plant Cell 2:785-793 (1990). La selección de un vector apropiado es relativamente simple, ya que las constricciones son mínimas. Los rasgos mínimos del vector son que la secuencia de ácidos 5 nucleicos deseados es introducida en un estado relativamepte intacto. De esta forma, cualquier vector el cual producirá una planta que porta la secuencia de ADN introducida debe • ser suficiente. Típicamente, un vector de expresión contiene (1) elementos de ADN procarióticos que codifican un origen 10 de replicación bacteriano y un marcador de resistencia a antibiótico para proporcionar el crecimiento y selección del vector de expresión en un huésped bacteriano; (2) elementos de ADN que controlan la iniciación de transcripción, tales como un promotor; (3) elementos de ADN que controlan el 15 procesamiento de transcripciones tales como las secuencias de terminación/poliadenilación de transcripción; y (4) un gen reportador. Los genes reportadores útiles incluyen la ß- glucuronidasa, ß-galactosidasa, cloranfenicol acetiltransferasa, luciferaza, kanamicina o los genes de 20 resistencia a herbicida PAT y BAR. Preferentemente, el gen • marcador seleccionable es kanamicina o los genes de resistencia a herbicida PAT y BAR. Se usa el gen BAR o PAT con el agente de selección Bialaphos, y se usa como un gen marcador de selección preferido para la transformación de 25 plantas (Spencer, et al. (1990) J. Theo. Appl'd Genetjes 79:625-631). (5) El gen objetivo o structural de interés. Un gen marcador seleccionalbe comúnmente usado para la transformación de plantas es el gen de la neomicjna fosfotransferasa II (nptll), aislado del Transposon Tn5, el cual cuando se coloca bajo el control de señales regulatorias vegetales confiere resistencia a la kanamicina. Fraley et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A., 80:4803 (1983). Otro gen marcador seleccionable comúnmente usado es el gen de la higromicina fosfotransferasa el cual confiere resistencia al antibiótico higromicina. Vanden Elzen et al., Plant Mol. Biol.., 5:299 (1985). Los genes marcadores seleccionables adicionales de origen bacteriano que confieren resistencia a los antibióticos incluyen la gentamicina acetil transíeras,a, estreptomicina fosfotransferasa, aminolgicósido-3 ' -ade?il transferasa, el determinante a resistencia de bleomicira. Hayford et al., Plant Physiol. 86:1216 (1988), Jones et al., Mol. Gen. Genet., 210: 86 (1987), Svab et al., Plant Mql. Biol. 14:197 (1990), Hille et al., Plant Mol. Biol. 7:171 (1986). Otros genes marcadores seleccionalbes confieren resistencia a los herbicidas tales como el glifosato, fluosinato o broxinil. Comai et al., Nature 317:741-744 (1985), Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2:603-618 (1990) y Stalker et al., Science 242:419-423 (1988). Otros genes marcadores seleccionables para la tarnsformación de plantas no son de origen bacteriano. Estos genes incluyen, por ejemplo, la dihidrofolato reductasa de ratón, 5-enolpiruvilsiquimato-3-fosfato sintasa vegetal y la acetolactato sintasa vegetal. Eichholtz et al., Somatic Cell Mol. Genet. 13:67 (1987), Shah et al., Science 233:4,78 (1986). Charest et al., Plant Cell Rep. 8: 643 (1990). Otra clase de genes marcadores para la transformación vegetal requiere tamizado de células vegetales transformadas presumiblemente más que la selección genética directa de células transformadas para resistencia a una substancia tóxica tal como un antibiótico. Estos genes son particularmente útiles para cuantificar o visualizar el patrón espacial de expresión de un gen en tejidos específicos y son referidos frecuentemente como genes reportadores ya que pueden ser fusionados a un gen o secuencia regulatoria de gen para la investigación de expresión de genes. Los genes comúnmente usados para tamizar presumiblemente células transformadas incluyen la ß-glucuronidasa (GUS) , ß-galactosidasa, luciferaza y cloranfenicol acetiltransferasa . Jefferson, R.A., Plant Mol. Biol. Rep. 5:387 (1987)., Teeri et al., EMBO J. 8:343 (1989), Koncz et al., Proc. Nati. Acad. Ci . U.S. A. 84:131 (1987), De Block et al., EMBO J. 3: 1681 (1984). Otro procedimiento para la identificación de eventos de transformación relativamente raros ha sido el uso ¡?^^ttimtám í itíi de un gen que codifica un regulador constitutivo dominante de la trayectoria de pigmentación de antocianinas de Zea mays . Ludwig et al., Science 247:449 (1990). Recientemente, los métodos in vivo para visualizar la actividad GUS que no requiere destrucción de tejjdo vegetal han sido hechos disponibles. Molecular Probes Publication 2908, Imagene Green, pág. 1-4 (1993) y Naleway et al., J. Cell Biol.. 115:151a (1991). Sin embargo, estos métodos in vivo para visualizar la actividad GUS no han probado ser útiles para recuperar las células transformadas debido la baja sensibilidad, altos antecedentes fluorescentes, y limitaciones asociadas con el uso de genes de lucíferasa como marcadores seleccionables. Más recientemente, se ha utilizado un gen que codifica la Proteína Fluorescente Verde (GFP) como un marcador para expresión de genes en células procarióticas y eucarióticas. Chalfie et al., Science 263:802 (1994). GFP y mutantes de GFP pueden ser usados como marcadores tamizables . Los genes incluidos en vectores de expresión deben ser accionados por una secuencia de nucleótidos que comprenden un elemento regulatorio, por ejemplo, un promotor. Varios tipos de promotores son ahora bien conocidos en la técnica de transformación, como lo son otros elementos regulatorios que pueden ser usados solos o en i&J ^^m combinación con promotores. Una descripción general de vectores de expresión vegetal y genes reportadores puede ser encontrada en Gruber, et al. (Gruber et al. (1993) Vectors for Plant Transformation. In: Methods in Plant Molecular Biology .and Biotechnology. Glich et al., eds. (CRC Press), pág. 89-119). Los vectores de expresión que contienen fragmentos genómicos o sintéticos pueden ser introducidos en protoplasto o en tejidos intactos o células aisladas. Preferentemente se introducen los vectores de expresión en tejido intacto. Se proporcionan los métodos generales de cultivo de tejidos vegetales, por ejemplo, por Maki, et al. (Maki, et al. (1993) Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants: In: Methods in Plant Molecular Biology & Biotechnology: Glich et al. eds (CRC Press), pág. 67-88; Philips, et al. (1988) Cell-Tissue Culture and In Vitro Manipulation. In Corn & Corn Improvement, 3rd ed. Sprague, et al. eds. (American Society of Agronomy Inc.). pág. 345-387). Los métodos para introducir los vectores de expresión en tejido vegetal incluyen la transfección direqta o cocultivación de célula vegetal con Agrobacterí um tumefaciens (Horsh et al. (1985) Science, 227:1229). Se proporcionan descripciones de sistema vector de Agrobacteri um y métodos para la transferencia de ge?¡es mediada por Agrobacteri um por Gruber et al. (supra) . .ÉÉÉIÉiiHa. i N ittlTUtM --^r^"^ — <rml<lr.~- ^»i»**«i *MJ**m«*i~»? Se han desarrollado numerosos métodos para la transformación de plantas, los cuales incluyen protocolos biológicos y físicos, de transformación de plantas. Véase, por ejemplo, Miki et al., "Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants" in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B.R. and Thompson, J.E. Eds. (CRC Press, Inc., Boca Ratón, 1993) páginas 67-88. Además, están disponibles vectores de expresión y métodos de cultivo in vitro para transformación y regeneración de células o tejidos vegetales de plantas. Véase, por ejempjo, Gruber et al., "Vectors for Plant Transformation" in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, BeR. and Thompson, J.E., Eds. (CRC Press, Inc., Boca Ratón, 1993) páginas 89-119. A. Transformación mediada por Agrobacterium Un método para introducir un vector de expresjón en plantas se basa en el sistema de transformación natural de Agrobacteri um . Véase, por ejemplo, Horsch et al, Science 227:1229 (1985). A . tumefaciens y A. rhizogenes son bacterias de la tierra patogénicas vegetales las cuajes transforman genéticamente las células vegetales. Los plásmidos Ti y Ri de A . tumefaciens y A . rhizogenes, respectivamente, portan genes responsables para la transformación genética de la planta. Véase, por ejemplo, Kado, C.I., Crit. Rev. Plant. Sci. 10:1 (1991). Las ».*-J^^M|ttft^ll.M.M^|ll<^^ descripciones de sistemas de vectores de Agrobacteri upi y métodos para la transferencia de genes mediada por Agrobacteri um se proporcionan por Gruber et al., supra, Miki et al., supra, y Moloney et al., Plant Cell Reports 8:238 (1989) . Véase también, la Patente de los Estados Unidos No. 5,591,616, concedida el 7 de enero de 1997. B. Transferencia directa de genes A pesar del hecho de que el intervalo de huésped para la transformación mediada por Agrobacteri um es amplia, algunas especies de cultivo de cereales principales y gimnospermas han sido generalmente recalcitrantes para este modo de transferencia de genes, a pesar de que algún éxjto ha sido recientemente alcanzado en arroz y maíz. Hiei et al., The Plant Journal 6:271-281 (1994); Patente de jos Estados Unidos No. 5,591,616, concedida el 7 de Enero de 1997. Varios métodos de transformación de plantas, colectivamente referidos como transferencia directa de genes, han sido desarrollados como una alternativa para la transformación mediada por Agroba cteri um . Un método generalmente aplicable de transformación de plantas es la transformación mediada por microproyect.il en donde el ADN es portado en la superficie de microproyectiles que miden 1 a 4 mm. El vector de expresión se introduce en tejidos vegetales con un dispositivo biolístico que acelera los microproyectiles a velocidades de k^ ,j?,Á k¿ ÍíA?L, 300 a 600 m/s lo cual es suficiente para penetrar las paredes y membranas de la célula vegetal. Sanford et al., Part. Sci. Technol. 5:27 (1987), Sanford, J.C., Trends Biotech. 6: 299 (1988), Klein et al., Bio/Technology 6:559- 5 563 (1988), Sanford, J.C., Physiol Plant 79:206 (1990), Klein et al., Biotechnology 10:268 (1992). En el maíz, varios tejidos objetivos pueden ser bombardeados con • microproyectiles recubiertos con ADN con el fin de producir plantas transgénicas, lo cual incluye, por ejemplo, callo 10 (Tipo I o Tipo II), embriones inmaduros, y tejido meristemático . Otro método para suministro físico de ADN a ^^ plantas es la sonicación de células objetivo. Zhang et al., Bio/Technology 9:996 (1991). Alternativamente, se ha usado 15 la fusión de liposoma o esferoplasto para introducir los vectores de expresión en plantas. Deshayes et al., EMBO J. , 4:2731 (1985), Christou et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 84:3962 (1987). También ha sido reportada la captación directa de ADN en protoplastos que usan 20 precipitación de CaCl2, alcohol polivinílico, o poli-L- ornitina. Hain et al., Mol. Gen. Genet. 199:161 (1985) y Draper et al., Plant Cell Physiol. 23:451 (1982). Se ha descrito también la electroporación de protoplastos y células enteras y tejidos. Donn et al., In Abstracts of BIT 25 International Congress on Plant Cell and Tissue Culture A?aáaÉiaa<gg¡ft it'ii iTiti ?i??? i«i'iri?«?i.?rtii'¡i IAPTC, A2-38, pág. 53 (1990); D'Halluin et al., Plant Cell 4: 1495-1505 (1992) y Spencer et al., Plant Mol. Biol. 24:51-61 (1994). Después de la transformación de tejidos objetivo de maíz, la expresión de los genes marcadores seleccionables descritos anteriormente permite la selección preferencial de células transformadas, tejidos y/o plantas, usando métodos de regeneración y selección ahora bien conocidos en la técnica. Después de la transformación de una célula vegetal o planta, las células vegetales o plantas transformadas con las secuencias deseadas de ADN integradas en el genoma pueden ser seleccionadas por marcadores fenotípipos apropiados. Los marcadores fenotípicos son conocidos en la técnica y pueden ser usados en esta invención. La confirmación de plantas transgénicas típicamente se basará en un ensayo o ensayos o por medir simplemente la relación de crecimiento. Las plantas transformadas pueden ser tamizadas por ensayos bioquímicos, biológicos moleculares y otros ensayos. Varios ensayos pueden ser usados para determinar si una planta particular, parte de planta, o una célula transformada muestra un incremento en la actividad enzimática. Típicamente, el cambio en la expresión o actividad de una planta transformada será comparada a niveles encontrados en plantas del tipo silvestre (por ejemplo, no transformada) del mismo tipo. Preferentemente, el efecto de la construcción introducida en el nivel de expresión o actividad del gen endógeno será establecido a partir de una comparación de plantas hermanas con y sin la construcción. Pueden ser medidos los niveles de transcripción de ciclina, CDC25, Niml y Plxl, por ejemplo, por Nothern blotting, extensión de cebador, PCR cuantitativa o semicuantitativa (reacción de la cadena polimerasa), y otros métodos b en conocidos en la técnica (Véase, por ejemplo, Sambrook, et al. (1989). Molecular Cloning A. Laboratory Manual, segunda edición (Cold Spring Harbor Laboratory Press), Vol. 1-3). La proteína puede ser medida en un número de formas las cuales incluyen los métodos inmunológicos (por ejemplo, por Elisa o Western Blotting) . La actividad de la CDK puede ser medida en varios ensayos como se describe en Sun et al., Prqc. Nati. Acad. Sci. USA 96 (7) : 4180-85 (1999). La división celular de una célula o tejido vegetal puede ser medida en una variedad de formar las cuales incluyen aquellas descritas en Myers et al., Plant Physiol. 94:1330-36 (1990) y Artlip, et al., Plant Cell and Environ 18:1034-40 (1995). Normalmente, la regeneración implicará obtener una planta entera a partir de un proceso de transformación. El término "regeneración", como se usa en la presente, significa hacer crecer una planta entera a partir de upa T ff^-»*-«^* MBMft * célula vegetal, un grupo de células vegetales, una parte de planta, o una pieza de planta (por ejemplo, a partir de protoplastos, callo o una parte de tejido). Los métodos mencionados en la presente anteriormente para la transformación típicamente serán usados para producir líneas endogámicas transgénicas. Las líneas endogámicas transgénicas pueden entonces ser cruzadas, con otra línea endogámica (no transformada o transformada) , con el fin de producir una planta de maíz híbrida transgénica. Alternativamente, un rasgo genético el cual ha sido modificado en la línea de maíz particular usando las técnicas de transformación mencionadas anteriormente puede ser movido en otra línea usando técnicas de retrocruzamiento tradicional que son bien conocidas en las técnicas de reproducción de plantas. Por ejemplo, puede ser usado un procedimiento de retrocruzamiento para mover un rasgo modificado a partir de una línea pública, no élite en una línea élite, o a partir de una planta de maíz híbrida que contiene un gen extraño en su genoma en una línea o líneas las cuales no contienen ese gen. Como se usa en la presente, "cruzamiento" puede referirse a una cruz X por Y simple, o el proceso de retrocruzamiento dependiendo del contexto. Varias plantas serán objetivos adecuados para incrementar la división celular en órganos reproductores femeninos con los genes identificados. En particular, Los métodos de la invención descritos en la presente pueden ser aplicables a cualquier especie de cultivo que incluye pero no se limita a cebada, sorgo, trigo, maíz, fríjol de soya y 5 arroz. En una modalidad más preferida, la transíormacjón se realiza en plantas de maíz de acuerdo al método de • Agrobacterium. Las partes obtenidas a partir de la planta 10 regenerada, tales como flores, vainas, semillas, hojas, ramas, fruta y similares, están cubiertas por la invención, con la condición de que estas partes comprendan células jas • cuales se han así transformado. Están también incluidas la progenie y variantes, y mutantes de las plantas regeneradas 15 dentro del alcance de esta invención, con la condición de que estas partes comprendan la secuencia de ADN introducida. Los niveles de ciclina, CDC25, Niml, y Plxl y la actividad de CDK son preferentemente determinados como se indica en los ejemplos. 20 Una vez que se produce una planta transgénica que • tiene una característica deseada, será útil propagar la planta y, en algunos casos, cruzar las líneas endogámiaas para producir híbridos útiles. En cultivos propagados de semillas, las plantas 25 transgénicas maduras pueden ser autocruzadas para producir una planta endogámica homocigota. La planta endogámica produce semillas que contienen los genes para el rasgo recientemente introducido. Estas semillas pueden ser crecidas para producir plantas que producirán el fenotipo seleccionado. Todos los artículos citados en la presente y en la siguiente lista son incorporados expresamente en la presente en su totalidad por referencia. CITAS Artlip, T.S. et al., "Water déficit in developing endosperm of maize: cell división and nuclear DNA endoreduplication", Plant, Cell. And Environ. 18:1034-1Q40 (1995) . Cheikh and Jones, "Disruption of Maize Kernel Growth and Development by Heat Stress", Plant Physiql. 106:45-51 (1994) . Doerner, P. et al., "Control of root growth a,nd development by ciclin expresión", Nature 380:520-523 (1996). Doonan et al., "Conserved and novel regulators of the plant cell cycle", Curr. Opin. In Cell Biol. 9:824-830 (1997). Hoffman, I. Et al., "Phosphorylation and activation of human cdc25-Cby cdc2-cyclin B and its involvement in the self-amplification of MPF at mitosis", EMBO J. 12 (1) :53-63 (1993) . Jinno, S. et al., "Cdc25A is a novel phosphatasa functioning early in the cell cycle", EMBO J. 13(7): 154,9- 1556 (1994). Jones, R.J. et al., "termal Environment During Endosperm Cell División in Maize: Effects on Number of endosperm Cells and Starch Granules", Crop Science 25:830- 834 (1985) . Kalla et al., 1994, Plant J. 6 ( 6) : 8 9-860. Kumagai, A. and Dunphy, W.G., "Purification and Molecular Cloning of Plxl, a Cdc25-Regulatory Kinase from Xenopus Egg Extracts", Science 273:1377-1380 (1996). Lammer, C. et al., "The cdc25B phosphatase is essential for the G2/Me phase transition in human cells", J. Cell Sci. 111:2445-2453 (1998). Lee, K.S. et al., "Plk is a Functional Homolog of Saccharomyces cerevisiae Cdc5, and Elevated Plk Activity Induces Múltiple Septation Structures", Mol. Cell. Biol. 17 (6) :3408-3417 (1997). Lejeune, P. et al., "Hormonal Control of ear abortion in a stress-sensitive maize (Zea mays) inbred", Austr. J. Plant Physiol., 25:481-488 (1998). Mambelli and Setter, "Inhibition of maize endosperm cell división and endoreduplication by exogenously applied abiscisic acid", Physiologia Plant. 104:266-272 (1998) . McKibbin, R.S. et al., "Expresión of fisión yeast cdc25 alters the frequeney of lateral root formation in transgenic tobáceo", Plant Mol. Biol. 36:601-612 (1998). Morgan, D., "Cyclin-Dependent Kinases: Engines, Clocks and Microprocessors", Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 5 13:261-91 (1997). Myers, P.N. et al., "Abscisic Acid Inhibition of Endosperm Cell División in Cultured Maize Kernels", Plant • Physiol. 94, 1330-1336 (1990). Prine, G.M. 1971, A Critical for Ear Development 10 in Maize. Crop Science. 11:782-786. Renaudin, J-P et al., "Plant cyclins: a unified nomenclature for plant A-, B-, y D- type cyclins based pn sequence organization", Plant Mol. Biol., 32:1003-1018 (1996) . 15 Schuppler, U. et al., "Effect of Water Stress pn Cell División and Cell División Cycle 2-Like Cell-Cycje Kinase Activity in Wheat Leaves", Plant Physiol. 117:667-678 (1998) . Soni, R. et al., "A Family of Cyclin D. Homologs 20 form Plants Differentially Controlled by Growth Regulators • and Containing the Conserved Retinoblastoma . Protein Interaction Motif", The Plant Cell, 7:86 (1995). Sun, Y. et al., "Alternative splicing of cycljn transcripts in maize endosperm", Gene 195:167-175 (1997). 25 Sun, Y. et al., "Identification of Weel in Maize (Zea mays L. ) and Its Involvement in Endoreduplicatiop", Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A., 1999, 96 (7) : 4180-4185. Zhang et al., "Cytokinin controls the cell cycle at mitosis by stimulating the tyrosine dephosphorilation and activation of p34cdc2-like Hl histona kinase ! , Planta 200:2- 12 (1996). Trehin et al., Planta (1998) 206 (2) : 215-224 ) . Zinselmeier, C. and J. E. Habben. 1998. Use of mRNA-Profiling Technology to Determine Gene Expressjon 10 Patterns in Developing Maize Ears that Differ in Yiejd. Plant Physiology Abstracts. Todas las referencias citadas en la presente son • incorporadas expresamente en la presente en su totalidad para referencia. 15 •

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES 1. Una construcción de expresión recombinante para la producción de plantas que tienen potencial de rendimiento incrementado caracterizada porque comprende: una 5 secuencia de nucleótidos que incrementa la división celujar recombinante, y elementos regulatorios que proporcionarán la • expresión de la secuencia en una célula vegetal. 2. La construcción de expresión de conformidad 10 con la reivindicación 1, caracterizada porque además comprende un promotor enlazado operablemente a la secuencia, el promotor que es uno el cual proporciona expresión • temporal y espacial durante el desarrollo de ántesis. 3. La construcción de expresión de conformicfad 15 con la reivindicación 1, caracterizada porque el promotor proporciona la expresión durante la fase de crecimiento exponencial de la espiga. 4. La construcción de expresión de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el promotor 20 proporciona expresión durante la fase lag del desarrollo del • grano. 5. La construcción de expresión de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el promotor proporciona expresión de aproximadamente 14 días antes a 25 aproximadamente 12 días después de la polinización. r^.. ^ ., ......^a ^,..,..^,^^ JAI 6. Una construcción de expresión para la producción de plantas transgénicas que incrementará el potencial de rendimiento caracterizada porque comprende: una secuencia de nucleótido que incrementa la división celular y 5 un promotor enlazado operablemente a la secuencia, el promotor que es uno el cual da expresión temporal y espacjal de la construcción durante el desarrollo de ántesis, la • secuencia de nucleótidos que incrementa la división celular que es una la cual codifica ante expresión una proteína que 10 activa o modula las quinasas dependientes a ciclina en órganos reproductores femeninos. 7. La construcción de expresión de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque el promotor proporciona expresión durante la fase de crecimiento 15 exponencial de la espiga. 8. La construcción de expresión de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque el promotor proporciona expresión durante la fase lag del desarrollo del grano . 20 9. La construcción de expresión de conformidad • con la reivindicación 6, caracterizada porque el promotor proporciona expresión de aproximadamente 14 días antes a aproximadamente 12 días después de la polinización. 10. La construcción de expresión de conformidad 25 con la reivindicación 6, caracterizada porque la secuencia TtiÉii 1í fit **** ~* *?*a*? ?*¡t**mm*l?^ de nucleótidos comprende una secuencia de ADN que codifica un producto de gen útil para afectar la expresión de una proteína seleccionada del grupo que consiste de ciclinas del tipo B, ciclinas del tipo D, CDC25, Niml, Plxl y Weel en una planta o tejido vegetal. 11. La construcción de expresión de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque la secuencia de nucleótidos incluye variantes naturales de genes que incrementan la división celular reproductora. 12. La construcción de expresión de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque el promotor es un promotor de tejido maternal. 13. La construcción de expresión de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque el promotor se selecciona de un grupo que consiste de zag2, ltp2, gamrr}a-zein, ciml, mze40-2, b223, endl y betll. 14. La construcción de expresión de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque el promotor es un promotor inducible. 15. Una construcción de expresión útil para la producción de una planta transgénica con potencial de rendimiento mejorado, la construcción caracterizada porque comprende: un gen recombinante o combinación de genes lps cuales codifican ante expresión de una proteína lo cual incrementa la división celular en órganos reproductores (t|, ... ^^.^? ?U^?»» femeninos; y un promotor enlazado operablemente al gen o genes, el promotor que es uno el cual da expresión temporal y espacial de los productos de gen durante la ántesis. 16. La construcción de expresión de conformidad 5 con la reivindicación 15, caracterizada porque el promotor proporciona expresión durante la fase de crecimiepto exponencial de la espiga. 17. La construcción de expresión de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque el promotor 10 proporciona expresión durante la fase lag de desarrollo del grano . 18. La construcción de expresión de conformidad • con la reivindicación 15, caracterizada porque el promotor proporciona expresión de aproximadamente 14 días antes a 15 aproximadamente 12 días después de la polinización. 19. La construcción de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque el gen o combinación de genes comprende: una secuencia de ADN que codifica un producto de gen útil para afectar la expresión 20 de una proteína seleccionada del grupo que consiste de las • ciclinas del tipo B, ciclinas del tipo D, CDC25, Niml, Plx2, y Weel en una planta o tejido de planta. 20. La construcción de expresión de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque los genes 25 incluyen variantes naturales de genes que incrementan la ^^ ...^.^ftf división celular. 21. La construcción de expresión de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque la construcción de gen incluye un promotor de tejido maternal. 22. La construcción de expresión de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque el promotor se selecciona del grupo que consiste de zag2, ltp2, gamma-zein, ciml, mze40-2, b22e, endl y betll. 23. La construcción de expresión de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque el promotor es un promotor inducible. 24. La construcción de expresión de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque la planta se selecciona del grupo que consiste de maíz, cebada, sorgo, fríjoles de soya, trigo, arroz y Arabidopsis. 25. Una planta transgénica caracterizada porque comprende una célula vegetal o ancestro de la misma la cual ha sido transformada con la construcción de expresión de conformidad con la reivindicación 1. 26. Un método para incrementar el potencial de rendimiento en una planta caracterizado porque comprende: introducir a la célula vegetal una construcción genética, la construcción genética que comprende una secuencia de nucleótidos recombinante la cual codifica ante expresión una proteína la cual está asociada con activar o modular l s t^¿|^^*!j. quinasas dependientes a ciclina en el órgano reproductor femenino de la planta, y un promotor enlazado operablemente a la secuencia de nucleótidos, el promotor que es uno el cual da expresión temporal y espacial de la secuencia 5 durante el desarrollo de ántesis; y, la construccjón genética está integrada en la célula vegetal. 27. La construcción de expresión de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada porque el promotor proporciona expresión durante la fase de crecimiento 10 exponencial de la espiga. 28. La construcción de expresión de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada porque el promotor proporciona expresión durante la fase lag de desarrollo del grano. 15 29. La construcción de expresión de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada porque el promotor proporciona expresión de aproximadamente 14 días antes a aproximadamente 12 días después de la polinización. 30. La construcción de conformidad con la 20 reivindicación 26, caracterizada porque la secuencia de nucleótidos además comprende: una secuencia de ADN que codifica un producto de gen útil para afectar la expresión de una proteína seleccionada del grupo que consiste de las ciclinas del tipo B, ciclinas del tipo D, CDC25, Niml, Plx2, 25 y Weel en una planta o tejido de planta. J Jfí» * ?*?* t*ái??H 31. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque los genes incluyen variantes naturales de genes que incrementan la división celular. 32. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque la construcción de gen incluye un promotor de tejido maternal. • 33. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque el promotor se 10 selecciona del grupo que consiste de zag2, ltp2, gamma-zejn, ciml, mze40-2, b22e, endl y betll. 34. El método de conformidad con la • reivindicación 26, caracterizado porque el promotor es un promotor inducible. 15 35. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque la planta se selecciona del grupo que consiste de maíz, cebada, sorgo, fríjoles de soya, trigo, arroz y Arabidopsis. • ..... u.^,^Éia.m ata .^?^ ?í?i^?^í¡iáií