CN1312284C - 假单胞菌Na+/H+逆向转运蛋白基因及其克隆方法 - Google Patents

Abstract

假单胞菌Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因及其克隆方法，涉及一种基因克隆。提供一种假单胞菌的Na⁺/H⁺逆向转运蛋白结构基因及一种既快捷又经济的克隆方法，基因长1089bp，编码362个氨基酸。步骤为将极端耐盐假单胞菌接种，培养；提取总DNA；设计引物；PCR反应并将扩增产物凝胶成像系统扫描记录，切下扩增的约1.1kb的条带；在PCR产物末端加上一个腺嘌呤脱氧核糖核苷酸(A)，弃上清液，加入20μL重蒸水溶解DNA；载体与DNA的连接，形成单菌落；挑选白色菌落，碱裂解法提取重组质粒；鉴定所扩增的目的基因；检测转化子的耐盐水平；转化子中的重组质粒经鉴定，对其中的克隆基因进行测序；判断克隆基因。

Description

假单胞菌Na+/H+逆向转运蛋白基因及其克隆方法

技术领域

本发明涉及一种基因克隆，尤其是涉及一种假单胞菌Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因(nha A)克隆。

背景技术

目前从原核生物中克隆一个已知基因的常规做法是通过生物信息查寻，得知其它生物基因的序列后，再循两条技术路线进行克隆基因：

1.合成该基因的寡聚核苷酸DNA探针，以放射性同位素或非放射性化学物质(例如发荧光物质)标记该分子探针，将该探针与事先构建的该生物基因组文库进行Southern杂交，钓出含有目的基因的DNA片段，对该片段测序；构建含该片段的表达重组质粒，转化受体细胞，检测被该DNA片段转录后转化子获得的新蛋白及其新的生物学功能(参见文献：Sambrook J，Fritsch E F，Maniantis T：Molecular Cloning：A Laboratory Mannual(2^nd).Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989.(金冬雁，黎孟枫等译.分子克隆实验指南(第二版).北京：科学出版社，1996))。

2.根据已知基因的两端序列设计并人工合成3′端和5′端寡聚短核苷酸引物，以该生物的总DNA为模板进行PCR扩增，回收扩增产物并构建重组质粒，测序，转化受体细胞，检测该DNA片段转录后转化子获得的新蛋白及其新的生物学功能(参见文献：吴乃虎编著.基因工程原理.北京：科学出版社，1998)。

方法1需要事先构建该生物的基因组文库，然后化学合成放射性或非放射性DNA探针，再进行大量的Southern杂交，费钱、费时，实验周期又长；

方法2比方法1简单，但由于不同生物的基因序列并不完全相同，因此往往需合成多对的引物，然后在PCR反应中设置多套循环参数，尤其是“退火”的温度。这样，方法2一般都要进行多次的反复摸索才可能克隆出目的基因，本发明即借鉴这种方法，并进行必需的修改和补充。

发明内容

本发明的目的在于提供一种假单胞菌的Na⁺/H⁺逆向转运蛋白结构基因(nha A)及一种既快捷又经济的克隆方法。

本发明所说的假单胞菌的Na⁺/H⁺逆向转运蛋白结构基因(nha A)的序列如下：

1     ATGATTATGGCCAACAGCGGCGCAACCAGTGGATGGTATCACGACTTTCTGGAGACGCCG     60

61    TTCACTCGGTTGGTTCACTCGAAATCAAGCAAAAACATGCTGTTATGGATAAATGACGCG    120

121   CTGATGGCGGTATTTTTCCTGTTAGTCGGTCTGGAAGTTAAACGTGAACTGATGCAAGGA    180

181   TCGCTAGCCAGCTTACGCCAGGCCGCATTTCCAGTTATCGCCGCTATTGGTGGGATGATT    240

241   GTGCCGGCATTACTCTATCTGGCTATTAACTATGCCGATCCGATTACCCGCCAAGGGTGG    300

301   GCGATCCCGGCGGCTACTGACATTGCTTTTGCACTTGGTGTACTGGCGCTGTTGGGAAGT    360

361   CGTGTTCCGTTTGCGCTGAAGATCTTTATGATGGCTCTGGCTATTATCGACGATCTTGGG    420

421   GCCATCATTATCATCGCATTGTTCTACACTAATGACTTATCGATGGCCTCTCTTGGCCTC    480

481   GCGGCTGTAGCATTTGCGGTACTCGCGGTATTGAATCTGTGTGGTGCACGCCGCACGGGC    540

541   GTCTATATTCTTGTTGGCGTGGTGTTGTGGACTGCGGTGTTGAAATCGGGGGTTCACGCA    600

601   ACTCTGGCGGGGGTAATTGTCGGCTTCTTTATTCCTTTGAAAGAGAAGCATGGGCCTTCT    660

661   CCAGCGAAGCGACTGGAGCATGTGTTGCACCCGTGGGTGGCGTATCTGATTTTGCCGCTG    720

721   TTTGCATTTGCTAATGCTGGCGTTTCACTGCAAGGCGTCACGCTGGATGGCTTGACCTCC    780

781   ATTCTGCCATTGGGGATCATCGCTGGCTTGCTGATTGGCAAACCGCTGGGGATTAGTCTG    840

841   TTCTGCTGGTTGGCGCTGCGTTTGAAACTGGCGCATCTGCCTGAGGGAACGACTTATCAG    900

901   CAAATTATGGTGGTGGGGATCGTGTGCGGTATCGGTTTTACTATGTCTATCTTTATTGCC    960

961   AGCCTGGCCTTTGGTAGCGTAGATCCAGAACTGATTAACTGGGCGAAACTCGGTATCCTG    1020

1021  GTCGGTTCTATCTCTTCGGCGGTAATTGGATACAGCTGGTTACGCGTTCGTTTGCGTCCA    1080

1081  TCAGTTTGA                                                       1089

该基因长1089bp，编码362个氨基酸。根据原核基因的特征分析，本序列的前3个核苷酸“ATG”(黑体字)为基因的起始密码子；接着，根据三联体密码，可以推算出该基因的编码氨基酸序列；最后的3个核苷酸“TGA”(黑体字)为基因的终止符。因此这是一个完整的结构基因。通过BLAST软件分析，该基因推测的编码氨基酸序列如下：

 MIMANSGATSGWYHDFLETPFTRLVHSKSSKNMLLWINDALMAVFFLLVGLEVKRELMQGSLASLRQAAFPVIAAIGGMIVPALLYLAINYADPITRQGWAIPAATDIAFALGVLALLGSRVPFALKIFMMALAIIDDLGAIIIIALFYTNDLSMASLGLAAVAFAVLAVLNLCGARRTGVYILVGVVLWTAVLKSGVHATLAGVIVGFFIPLKEKHGPSPAKRLEHVLHPWVAYLILPLFAFANAGVSLQGVTLDGLTSILPLGIIAGLLIGKPLGISLFCWLALRLKLAHLPEGTTYQQIMVVGIVCGIGFTMSIFIASLAFGSVDPELINWAKLGILVGSISSAVIGYSWLRVRLRPSV

将上述序列输入美国GenBank数据库分析DNA序列同源性、蛋白序列同源性和蛋白保守区域比较，结果如下：

P：1     atgattatggccaacagcggcgcaaccagtggatggtatcacgactttctggagacgccg    60

         ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

E：2185  atgattatggccaacagcggcgcaaccagtggatggtatcacgactttctggagacgccg    2244

         ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

P：61    -ttca-ctc--ggttggttcactcgaaatcaagcaaaaacatgctgttatggataaatga    116

          |||| |||  |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

E：2245  gttcagctccgggttggttcactcgaaatcaa-caaaaacatgctgttatggataaatga    2303

         ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

P：117   cgcgctgatggcggtatttttcctgttagtcggtctggaagttaaacgtgaactgatgca    176

         ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

E：2304  cgcgctgatggcggtatttttcctgttagtcggtctggaagttaaacgtgaactgatgca    2363

         ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

P：177   aggatcgctagccagcttacgccaggccgcatttccagttatcgccgctattggtgggat    236

         ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

E：2364  aggatcgctagccagcttacgccaggccgcatttccagttatcgccgctattggtgggat    2423

P：237   gattgtgccggcattactctatctggctattaactatgccgatccgattacccgccaagg   296

         ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

E：2424  gattgtgccggcattactctatctggcttttaactatgccgatccgattacccgcgaagg   2483

         ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

P：297   gtgggcgatcccggcggctactgacattgcttttgcacttggtgtactggcgctgttggg   356

         ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

E：2484  gtgggcgatcccggcggctactgacattgcttttgcacttggtgtactggcgctgttggg   2543

         ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

P：357   aagtcgtgttccgtttgcgctgaagatctttatgatggctctggctattatcgacgatct   416

         ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

E：2544  aagtcgtgttccgttagcgctgaagatctttttgatggctctggctattatcgacgatct   2603

         ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

P：417   tggggccatcattatcatcgcattgttctacactaatgacttatcgatggcctctcttgg   476

         ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

E：2604  tggggccatcattatcatcgcattgttctacactaatgacttatcgatggcctctcttgg   2663

         ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

P：477   cctcgcggctgtagcatttgcggtactcgcggtattgaatctgtgtggtgcacgccgcac   536

         ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

E：2664  cgtcgcggctgtagcaattgcggtactcgcggtattgaatctgtgtggtgcacgccgcac   2723

         ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

P：537   gggcgtctatattcttgttggcgtggtgttgtggactgcggtgttgaaatcgggggttca   596

         ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

E：2724  gggcgtctatattcttgttggcgtggtgttgtggactgcggtgttgaaatcgggggttca   2783

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P：597   cgcaactctggcgggggtaattgtcggcttctttattcctttgaaagagaagcatgggcc   656

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E：2784  cgcaactctggcgggggtaattgtcggcttctttattcctttgaaagagaagcatgggcg   2843

         ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

P：657   ttctccagcgaagcgactggagcatgtgttgcacccgtgggtggcgtatctgattttgcc   716

         ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

E：2844  ttctccagcgaagcgactggagcatgtgttgcacccgtgggtggcgtatctgattttgcc   2903

         ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

P：717   gctgtttgcatttgctaatgctggcgtttcactgcaaggcgtcacgctggatggcttgac   776

         ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

E：2904  gctgtttgcatttgctaatgctggcgtttcactgcaaggcgtcacgctggatggcttgac   2963

         ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

P：777   ctccattctgccattggggatcatcgctggcttgctgattggcaaaccgctggggattag   836

         ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

E：2964  ctccattctgccattggggatcatcgctggcttgctgattggcaaaccgctggggattag   3023

         ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

P：837   tctgttctgctggttggcgctgcgtttgaaactggcgcatctgcctgagggaacgactta   896

         ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

E：3024  tctgttctgctggttggcgctgcgtttgaaactggcgcatctgcctgagggaacgactta   3083

         ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

P：897   tcagcaaattatggtggtggggatcgtgtgcggtatcggttttactatgtctatctttat   956

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E：3084  tcagcaaattatggtggtggggatcctgtgcggtatcggttttactatgtctatctttat   3143

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P：957   tgccagcctggcctttggtagcgtagatccagaactgattaactgggcgaaactcggtat   1016

         ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

E：3144  tgccagcctggcctttggtagcgtagatccagaactgattaactgggcgaaactcggtat   3203

         ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

P：1017  cctggtcggttctatctcttcggcggtaattggatacagctggttacgcgttcgtttgcg   1076

         ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

E：3204  cctggtcggttctatctcttcggcggtaattggatacagctggttacgcgttcgtttgcg   3263

         ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

P：1077  tccatcagtttga                                                  1089

         |||||||||||||

E：3264  tccatcagtttga                                                  3276

注：E为大肠杆菌K12的Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因；

P为假单胞菌的Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因；

比较发现，克隆的假单胞菌基因序列与大肠杆菌K12的Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因(nhaA)高度同源，两者之间不同的核苷酸已经用黑色背景表示。因此初步判断所克隆基因为假单胞菌的Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因(nha A)。

本基因已经被美国GenBank数据库收录，收录号为：AF643494。

根据克隆的假单胞菌的Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因，按照通用的三联体遗传密码推测出它所编码的酶蛋白序列，再与大肠杆菌K12的Na⁺/H⁺逆向转运蛋白序列进行同源性比较，它们完全相同的氨基酸数达95.3％。

P：1    MIMANSGATSGWYHDFLETPFTRLVHS-KSSKNMLLWINDALMAVFFLLVGLEVKRELMQ  59

E：26   MIMANSGATSGWYHDFLETPVQLRVGSLEINKNMLLWINDALMAVFFLLVGLEVKRELMQ  85

P：60   GSLASLRQAAFPVIAAIGGMIVPALLYLAINYADPITRQGWAIPAATDIAFALGVLALLG  119

E：86   GSLASLRQAAFPVIAAIGGMIVPALLYLAFNYADPITREGWAIPAATDIAFALGVLALLG  145

P：120  SRVPFALKIFMMALAIIDDLGAIIIIALFYTNDLSMASLGLAAVAFAVLAVLNLCGARRT  179

E：146  SRVPLVLKIFLMALAIIDDLGAIIIIALFYTNDLSMASLGVAAVAIAVLAVLNLCGVRRT  205

P：180  GVYILVGVVLWTAVLKSGVHATLAGVIVGFFIPLKEKHGPSPAKRLEHVLHPWVAYLILP  239

E：206  GVYILVGVVLWTAVLKSGVHATLAGVIVGFFIPLKEKHGRSPAKRLEHVLHPWVAYLILP  265

P：240  LFAFANAGVSLQGVTLDGLTSILPLGIIAGLLIGKPLGISLFCWLALRLKLAHLPEGTTY  299

E：266  LFAFANAGVSLQGVTLDGLTSILPLGIIAGLLIGKPLGISLFCWLALRLKLAHLPEGTTY  325

P：300  QQIMVVGIVCGIGFTMSIFIASLAFGSVDPELINWAKLGILVGSISSAVIGYSWLRVRLR  359

E：326  QQIMVVGILCGIGFTMSIFIASLAFGSVDPELINWAKLGILVGSISSAVIGYSWLRVRLR  385

P：360  PSV 362

E：386  PSV 388

注：E：大肠杆菌k12(E.coli k12)；P：假单胞杆菌(Pseudomonas sp.cn4902)；

不同氨基酸残基之间用暗背景表示

假单胞菌的Na⁺/H⁺逆向转运蛋白与其他5种杆菌的Na⁺/H⁺逆向转运蛋白保守区域比较如下：

A      1-----------------------------MIMANSGATSGWYHDFLETPFT-RLVHSKSS   30

B      1---MKHLHR-FFSSDASGGIILIIAAILAMMMANSGATSGWYHDFLETPVQLRVGSLEIN   56

C      10GVYVIKLIQRFFKLESAGGILLLFSAVVAMLLANS-PLSNQYNDFLNLPVSLQIGSFSIN  68

D      1---MLTPIQNFLKQEAAGGILLFIFATLAIILANT-PLSYLYFDFLQTPVSVQIGAFIIN   56

E      1---MKHLHR-FFSSDASGGIILIIAAALAMLMANMGATSGWYHDFLETPVQLRVGALEIN   56

F      1---MSDMIRDFFKMESAGGILLVIAAAIAMVIANS-AMGEGYQAFLHT----YVFGMSVS   52

A 31   KNMLLWINDALMAVFFLLVGLEVKRELMQGSLASLRQAAFPVIAAIGGMIVPALLYLAIN    90

B 57   KNMLLWINDALMAVFFLLVGLEVKRELMQGSLASLRQAAFPVIAAIGGMIVPALLYLAFN    116

C 69   KTLIHWINDGFMAVFFVLVGMEVKKELFEGALSTYQQAIFPAIAAIGGMVIPAVVYWFIA    128

D 57   KPLLMWVNDGLMAVFFMLVGMEVKRELLEGSLSSYQRAVFPAIAATGGMVVPAIVFLVFN    116

E 57   KNMLLWINDALMAYFFLLIGLEVKRELMQGSLASLRQAAFPVIAAIGGMIVPALLYLAFN    116

F 53   H----WINDGLMAVFFLLIGLEVKRELLEGALKSRETAIFPAIAAVGGMLAPALIYVAFN    108

A 91   YADPITRQGWAIPAATDIAFALGVLALLGSRVPFALKIFMMALAIIDDLGAIIIIALFYT    150

B 117  YADPITREGWAIPAATDIAFALGVLALLGSRVPLALKIFLMALAIIDDLGAIIIIALFYT    176

C 129  KQDPSLANGWAIPMATDIAFALGIMALLSKQVPLPLKIFLLALAIIDDLGAIVVIALFFS    188

D 117  ATHPEFQEGWAIPMATDIAFALGVIALLGKRVPLALKIFLLALAIIDDLGAIVVIALFFS    176

E 117  YSDPVTREGWAIPAATDIAFALGVLALLGSRVPLALKIFLMALAIIDDLGAIVIIALFYT    176

F 109  FNDPAAIQGWAIPAATDIAFALGIMALLGKRVPVSLKVFLLALAIIDDLGVVVIIALFYS    168

A 151 NDLSMASLGLAAVAFAVLAVLNLCGARRTGVYILVGVVLWTAVLKSGVHATLAGVIVGFF  210

B 177 NDLSMASLGVAAVAIAVLAVLNLCGVRRTGVYILVGVVLWTAVLKSGVHATLAGVIVGFF  236

C 189 HGLSVQALIFSAVAIIVLILLNRFRVSALCAYMVVGAILWASVLKSGVHATLAGVIIGFS  248

D 177 HDLSPQAFIFAGIAVAILITMNRLKITALSAYGIVGIILWASVLKSGVHATLAGVIIGFC  236

E 177 SDLSIVSLGVAAFAIAVLALLNLCGVRRTGVYILVGAVLWTAVLKSGVHATLSGVIVGFF  236

F 169 SDLSTIALTIGFIMTGVLFMLNAKHVTKLSIYLVAGLILWIAVLKSGVHATLAGVVIGFA  228

A 211 IPLK-EKHGPSPAKRLEGVLHPWVAYLILPLFAFANAGVSLQGVTLDGLTSILPLGIIAG  269

B 237 IPLK-EKHGRSPAKRLEHVLHPWVAYLILPLFAFANAGVSLQGVTLDGLTSILPLGIIAG  295

C 249 IPLK-GKKGERPLDDFEHILASWSSFVILPLFAFANAGVSFAGIDVNMISSPLLLAIASG  307

D 237 IPLN-GKKGERPLDDFEHTLSPWSAFAILPLFAFCNAGVSLIGMGMDNLTSTLPMGIALG  295

E 237 IPLK-EKHGRSPAKRLEHVLHPWVAYLILPLFAFANAGVSLQGVTIDGLTSMLPLGIIAG  295

F 229 IPLKGNKGEHSPLKHLEHALHPYVAFAILPVFAFANAGISLQGVSLAGLTSMLPLGVALG  288

A 270 LLIGKPLGISLFCWLALRLKLAHLPEGTTYQQIMVVGIVCGIGFTMSIFIASLAFGSVDP  329

B 296 LLIGKPLGISLFCWLALRLKLAHLPEGTTYQQIMAVGILCGIGFTMSIFIASLAFGSVDP  355

C 308 LIIGKPVGIFGFSYISVKLGLAKLPDGINFKQIFAVAVLCGIGFTMSMFLASLAFDANAG  367

D 296 LLLGKPLGIFSFCFVAVKLGIAKLSEGINFKQIFAVSVLCGIGFTMSMFLAGLAFGGESD  355

E 296 LLIGKPLGISLFCWLALRFKLAHLPQGTTYQQIMAVGILCGIGFTMSIFIASLAFGNVDP  355

F 289 LFLGKPLGIFSFSWAAVKLGVAKLPEGINFKHIFAVSVLCGIGFTMSIFISSLAFGQANE  348

A 330 --ELINWAKLGILVGSISSAVIGYSWLRVRLRPS-V  362

B 356 --ELINWAKLGILVGSISSAVIGYSWLRVRLRPS-V  388

C 368 -ESVNTLSRLGILLGSTVSAILGYLFLKQTTKLN--  400

D 356 SENVTALARLGILIGSGFSAVLGY------------  379

E 356 --ELINWAKLGILIGSLLSAVVGYSWLRARLNAP-A  388

F 349 --AYDTYARLGILMGSTTAALLGYSLLRLSLPLKKA  382

注：A：假单胞杆菌(Pseudomonas sp.cn 4902)；B：大肠杆菌(Escherichia coli)；

C：流感嗜血杆菌(Haemophilus influenae)；D：多杀性巴斯德杆菌(Pasteurella multocida)；

E：鼠伤寒沙门氏杆菌(Salmonella typhomurium)；F：霍乱弧菌(Vibrio cholerae)；

6种菌都相同的氨基酸已经用黑色背景表示

以上比较表明，假单胞菌的Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因推测的多肽与其他5种杆菌的NhaA蛋白具有很高的同源性。在362个氨基酸残基中完全相同的氨基酸高达149个，59处(黑背景表示)，占41.6％。其中最大的保守区域由连续13个氨基酸残基组成(No.192～No.205)，连续5个以上氨基酸残基完全一致的保守区域就有7处。

将上述克隆基因与表达载体连接成重组载体，转化受体细胞(大肠杆菌)，提取转化子的总蛋白进行电泳(参见图1)，发现该基因表达的Na⁺/H⁺逆向转运蛋白分子量大约为41kD，和理论推测值相符。

本发明所说的假单胞菌Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因的具体步骤如下：

1、将假单胞菌在含NaCl0.1～0.9mol/L的培养基中，温度为15～32℃，以100～150rpm的速度震荡培养至指数生长中后期；

2、常规碱变性法提取假单胞菌的总DNA，经紫外光谱检测纯度，其OD₂₆₀/OD₂₈₀比值应≥1.8。若OD₂₆₀/OD₂₈₀比值≥1.8，说明所得DNA较纯，可以进入下一步骤；若OD₂₆₀/OD₂₈₀比值＜1.8，说明所得DNA纯度不够，应进一步纯化，直至OD₂₆₀/OD₂₈₀比值≥1.8。用1％琼脂糖凝胶电泳检测所提取DNA的分子量是否≥21kb。；若所提取DNA的分子量≥21kb则可以进入下一步；

3、根据几种生物的Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因的序列设计引物，其中一对可较稳定地获得PCR扩增产物的引物如下：

5’端引物：5’A CCCGGGATGATTATGGCCAACAGC 3’

3’端引物：5’T GGATCCTCAAACTGATGGACGCAA 3’

为了便于构建原核基因表达载体，在5’端引物和3’端引物分别设计添加了Sma I和BamHI的酶切位点(下划线)；

4、PCR扩增体系：在0.5mL无DNA污染的薄壁离心管(Eppendorf)中依次加入：

重蒸水                     9.2μL

10×PCR缓冲液              2.0μL

MgCl₂(25mmol/L)            1.2μL

dNTPs(各2.5mmol/L)         0.4μL

引物1(20mmol/L)            1.0μL

引物2(20mmol/L)            1.0μL

假单胞菌总DNA(5nG/μL)     5.0μL

pfu DNA聚合酶(5u/μL)      0.2μL

总体积                     20.0μL

5、PCR反应参数：95℃预变性，5min；94℃变性，1min；51℃退火，1min；72℃延伸，2min； 35～40个循环，最后72℃延伸，10min，保存于4℃；

6、PCR反应结束后，将扩增产物在含有0.5～1.0g/mL溴乙锭的0.8％～1.0％琼脂糖凝胶中电泳，凝胶成像系统扫描记录，并在紫外灯下用锋利的刀片切下扩增的约1.1kb的条带；

7、参照华舜公司琼脂糖凝胶回收试剂盒说明书，回收胶条中的约1.1kb的PCR扩增产物；

8、为了提高克隆效率，方便与T载体连接，需要在PCR产物末端加上一个腺嘌呤脱氧核糖核苷酸(A)，在0.5mL无DNA污染的薄壁离心管(Eppendorf)中依次加入：

重蒸水                1.2μL

10×PCR缓冲液         2.0μL

MgCl₂(25mmol/L)       1.2μL

DNTPs(各2.5mmol/L)    0.4μL

回收的PCR产物         15.0μL

TaqDNA聚合酶(5u/μL)  0.2μL

总体积                20.0μL

置恒温72℃，10min后，加入2倍体积的冷无水乙醇(-20℃～0℃)，充分混匀，冰箱中静置4～16h沉淀DNA；10000～15000g离心，弃上清液，加入20μL重蒸水溶解DNA，-20℃保存备用；

9、参照大连宝生物工程公司的pMD18-T载体克隆方法进行载体与DNA的连接，在无DNA污染的薄壁离心管(Eppendorf)中加入：

pMD18-T载体            1.0μL

加“A”的PCR产物       4.0μL

连接溶液I              5.0μL

总体积                 10.0μL

恒温16℃连接反应过夜(15～24 h)；

10、全量连接液(优选10μL)用CaCl₂法转化感受态大肠杆菌JM101(优选100～200μL)后，涂抹在含有X-Gal-IPTG-Amp的LB琼脂平板上，37℃倒置培养24～48h，形成单菌落；挑选白色菌落，在液体LB培养基中37℃震荡培养(优选100～150rpm)过夜(优选12～16h)，碱裂解法提取其中的重组质粒；

11、以Sma I和Bam HI双酶切法鉴定所扩增的目的基因是否已经插入重组质粒中，在无DNA污染的薄壁离心管(Eppendorf)中加入下列酶切反应液：

重蒸水        12.0μL

10×缓冲液    2.0μL

待鉴定质粒    5.0μL

Bam HI        0.5μL

Sma I         0.5μL

总体积        20.0μL

37℃水浴1.5～2.0h，65℃20～25min结束反应，0.8％～1.0％琼脂糖凝胶电泳观察，发现一条清晰的分子量大约为1.1kb的DNA条带，即为所需的目的基因；

也可利用上述一对引物对待鉴定质粒进行PCR反应检测；

12、检测转化子的耐盐水平

含重组质粒的转化子分别接种在含NaCl 0.8～1.2mol/L的LB琼脂培养基上，37℃恒温倒置培养48～60h，发现转化子能够在含NaCl 1.1mol/L的LB琼脂培养基上生长，而对照的最高耐盐水平只达到1.0mol/L，可见转入的外源基因与转化子的耐盐性提高密切相关；

13、转化子中的重组质粒经过双酶切或PCR鉴定后，对其中的克隆基因进行测序；

14、根据已测知的克隆基因序列，与美国GenBank等数据库中的资料进行DNA和蛋白质的同源性比较，初步判断克隆基因为假单胞菌的Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因(nha A)；

15、构建原核基因表达重组质粒以检测克隆基因的表达效率及表达产物活性

碱法大量提取上述重组质粒及原核表达pBV220载体，利用Bam HI和SmaI内切酶分别双酶切上述两种质粒，电泳后从凝胶中回收各片段，在16℃用T₄连接酶连接过夜(优选12～18h)；以CaCl₂法转化感受态大肠杆菌JM101，将转化菌涂布在含Amp的LB平板上；挑取长出的重组子，提取其中的重组质粒，用原内切酶酶切并用0.8％～1.0％琼脂糖电泳鉴定哪一株含正确的重组质粒(即由Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因和pBV220载体构成的重组质粒)；

16、提取转化子的总蛋白

将含重组pBV220质粒(其中带有上述Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因)的大肠杆菌JM101在含有60μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养至OD600为0.8～0.9，立即转入到42℃热诱导基因表达4h，取1mL菌液离心收集菌体，加入2×SDS加样缓冲液50μL及0.1体积的β-巯基乙醇，100℃水煮沸5min破裂菌体；10000～12000g离心10～15min后收集上清液，即为转化子的总蛋白粗提取物；

17、SDS-PAGE电泳检测目的基因表达产物

配制浓缩胶浓度为5％，分离胶浓度为12％的SDS-PAGE平板，分别加入转化子和对照各20～30μL总蛋白粗提取物，SDS-PAGE电泳后发现转化子在约41kD处出现的蛋白带吸收峰值比对照高得多，即从原来的占总蛋白4.1％增加到6.3％，提高了53.7％，说明转化子能有效地转录并表达转入的nha A基因；

18、测定转化子的生长曲线

分别将筛选得到的转化子和对照接种至5mL的液体LB培养基中，37℃培养至指数生长期；分别吸取等量转化子和对照至100mL含NaCl 1.0mol/L的液体LB培养基中，37℃100～150rpm震荡培养；每隔4～8h取样测其OD₆₀₀值，连续测48h，记录各组数据；重复本实验3次，求平均值作图。结果发现，转化子和对照的生长都受到抑制，迟滞期延长，菌数到6h后才有较明显的增长。但转化子的生长速度和最终菌浓度远高于对照组。转化子达到生长平衡期时的OD₆₀₀值约为对照组的2.3倍(参见图2)。可见，外源nha A基因使转化子的耐盐性明显提高；

19、测定转化子中的Na⁺浓度

分别将转化子和对照接种至200mL含NaCl 0.95mol/L的液体LB培养基中，37℃震荡(100～150rpm)培养36～48h；以LB培养液稀释转化子培养液的浓度，使OD₆₀₀≌0.4；取500mL菌液在4℃，以3000～4000g，10～15min离心收集菌体；以50mmol/L葡萄糖溶液离心清洗菌体两次除去菌体外可能吸附的Na⁺；用干净滤纸吸干菌泥中可见的水分，加10mL浓HNO₃溶解，电炉上加热30min；冷却后，加10mL HNO₃-HClO₄混合液(HNO₃∶HClO₄为3∶1)；加热至有浓白烟产生，继续加热4～4.5h，蒸去大部分HNO₃和HClO₄；以无离子水将其稀释至100mL；原子吸收光谱测定其中Na⁺浓度，并换算成转化子中的Na⁺浓度；经两次实验后得知，转化子中的Na⁺浓度为14.3ng/10⁶细胞，仅为对照的60.4％(参见图3)，其原因就在于转化子中由外源nha A基因转录、表达的蛋白不断将Na⁺泵出胞外的缘故；

20、转化子中nha A基因转录、表达的蛋白在细胞中的定位

将转化子接种至50～100mL的液体LB培养基中，37℃震荡(100～150rpm)培养过夜(12～16h)；42℃诱导培养4h；用LB培养液调节转化子和对照的菌液浓度，使其基本一致，冰浴中超声破碎(功率为450W，处理5～7s，间隔9～15s，处理时间7～9min)；取样番红染色，在高倍镜下(40×)检查细菌破碎率，应达到70％以上；低速离心(1500～1800g，10min)除去未破碎细胞，然后超速离心(100000～150000g，10min)收集细胞碎片；加重蒸水100μL，沸水浴10min，10000～12000g离心10min；取上清液20～25μL进行SDS-PAGE凝胶电泳；结果发现，nha A基因转录、表达的蛋白主要位于细胞膜上(参见图4)；

21、转化子丢失重组质粒实验

将转化子培养于无抗性筛选(未添加氨苄青霉素)的LB培养基中，高温(42℃)继代培养18次(9天)，将上述多次继代的转化子分别涂布于：①含NaCl 0.8、0.9、1.0、1.1和1.2mol/L，②含氨苄青霉素(Amp)60μg/mL的LB琼脂培养基上(含琼脂1.2～1.5％)，培养48～60h。实验发现，经上述高温处理的转化子都不能在含Amp60μg/mL的LB琼脂培养基上生长，其耐盐性也回落到原初水平(即1.0mol/L)。随机挑取10株经上述高温处理的、在含NaCl 0.9和1.0mol/L的培养基上长出的原转化子，提取其中的质粒。结果发现，它们中的质粒都已全部丢失。本实验从反面证明了外源nha A基因与该菌的耐盐性提高密切相关。

本方法也适用于克隆其它原核生物的Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因(nha A)。

在步骤4以及其它的PCR扩增体系应是无菌及无DNA污染的，所用的离心管应为薄壁型的。

在步骤6和步骤11中将扩增产物在含有0.5～1.0μg/mL溴乙锭的0.8％～1.0％琼脂糖凝胶中电泳后，凝胶成像系统扫描记录，并在紫外灯下用锋利的刀片切下扩增的约1.1kb的条带。这些操作都应戴护目镜和一次性塑料薄膜手套。

在步骤8、9、10中，各种操作都应在超净工作台中进行。

在步骤10中，应在无菌条件下取100μL转化子溶液分别用三角形无菌玻棒均匀涂抹在含Amp-Xgal-IPTG和Amp的LB琼脂培养基上，37℃培养24～48h后，按常规挑选菌落呈白色的转化子。

在步骤11中，以65℃处理20～25min使酶失活，结束反应，应在水浴中进行。利用上述一对引物对待鉴定质粒进行PCR反应检测的条件与步骤4和步骤5相同。

在步骤14中，所说的生物数据库为GenBank或其他数据库。

在步骤17和步骤20中，所说的SDS-PAGE电泳检测目的基因表达的蛋白产物，是一种垂直板凝胶电泳，所用电压为50～100伏，电流强度为50～200毫安。

在步骤18中，所说的每隔4～8h取样测培养液的OD₆₀₀值，连续测48h，记录各组数据；重复本实验3次，求平均值作图，测定转化子的生长曲线，是建立在已经完成了以下预实验的基础上：取出少量菌液，测其OD₆₀₀值；再定量取该液，并按1∶10的比例进行系列稀释，然后各取50μL各种稀释度的菌液分别均匀地涂抹在琼脂LB培养基上，37℃培养24～48h，计数各培养皿上长出的总菌数，再换算成该菌液的菌浓度，就得到某个菌液OD₆₀₀值与总菌数的对应关系。

在步骤19中所说的以原子吸收光谱法测定转化子中的Na⁺浓度时要经过换算，是建立在事先已经按同样方法获得了系列NaCl溶液经原子吸收光谱法绘出的标准曲线基础上。

在步骤21中所说的将转化子在高温(42℃)继代培养18次(9天)，是指在震荡(100～160rpm)条件下。

本发明根据几种生物的Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因的序列设计引物，提取假单胞菌的总DNA，经多次PCR试验，克隆了假单胞菌的Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因(nha A)。实验证明，该基因的表达蛋白位于细胞膜上，具有突出的将细胞内的Na⁺泵出胞外的功能，同时使被该基因转化的生物的耐盐性大大提高。Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因(nha A)可用于培育转基因耐盐作物和动物，有利于充分利用广袤的盐碱地和海水(咸水)进行种植和养殖，达到节约淡水和扩大耕地面积的目的，因此该基因具有良好的应用前景。

附图说明

图1为含外源Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因的大肠杆菌E.coli JM101的SDS-PAGE电泳图谱。在图1中，1为含外源Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因的大肠杆菌E.coli JM101；2为对照；箭头指处为41kD的蛋白带。

图2为转化子在含NaCl 1.0mol/L的培养基中的生长曲线。在图2中，横坐标为时间/小时(Time/h)。

图3为转化子和对照细胞中的Na⁺浓度比较。

图4为转化子细胞膜(壁)的蛋白质SDS-PAGE电泳图谱。在图4中，1为转化子膜蛋白；2为对照的膜蛋白；3为转化子总蛋白；4为对照的总蛋白；M为分子量标记；箭头指处为nha A基因表达的41kD蛋白。

具体实施方式

以下实施例将对本发明作进一步说明。

实施例1：从极端耐盐的假单胞菌中克隆Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因(nha A)，其步骤为：

1、将假单胞菌在含NaCl 0.5mol/L的培养基中，温度为28℃，以100rpm的速度震荡培养至指数生长中后期；

2、常规碱变性法提取假单胞菌的总DNA，经紫外光谱检测纯度，其OD₂₆₀/OD₂₈₀比值应≥1.8。

3、根据根据几种生物的Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因的序列设计引物，其中一对可较稳定地获得PCR扩增产物的引物如下：

5’端引物：5’A CCCGGGATGATTATGGCCAACAGC 3’

3’端引物：5’T GGATCCTCAAACTGATGGACGCAA 3’

为了便于构建原核基因表达载体，在5’端引物和3’端引物分别设计添加了Sma I和BamHI的酶切位点(下划线)。

4、PCR扩增体系：

在0.5mL无菌无DNA污染的薄壁离心管(Eppendorf)中依次加入：

重蒸水                    9.2μL

10×PCR缓冲液             2.0μL

MgCl₂(25mmol/L)           1.2μL

DNTPs(各2.5mmol/L)        0.4μL

引物1(20mmol/L)           1.0μL

引物2(20mmol/L)           1.0μL

假单胞菌总DNA(5ng/μL)    5.0μL

pfu DNA聚合酶(5u/μL)     0.2μL

总体积                    20.0μL

5、PCR反应参数：95℃预变性，5min；94℃变性，1min；51℃退火，1min；72℃延伸，2min；40个循环。最后72℃延伸，10min，保存于4℃；

6、PCR反应结束后，将扩增产物在含有1.0μg/mL溴乙锭的1.0％琼脂糖凝胶中电泳，凝胶成像系统扫描记录，并在紫外灯下用锋利的刀片切下扩增的约1.1kb的条带。

7、参照华舜公司凝胶回收试剂盒说明书回收胶条中的约1.1kb的PCR扩增产物；

8、为了提高克隆效率，方便与T载体连接，需要在PCR产物末端加上一个腺嘌呤脱氧核糖核苷酸(A)。在0.5mL无DNA污染的薄壁离心管(Eppendorf)中依次加入：

重蒸水                 1.2μL

10×PCR缓冲液          2.0μL

MgCl₂(25mmol/L)        1.2μL

dATP(2.5mmol/L)        0.4μL

回收的PCR产物          15.0μL

Taq DNA聚合酶(5u/μL)  0.2μL

总体                   20.0μL

置恒温72℃，10min后，加入2倍体积的冷无水乙醇(-18℃)，充分混匀，冰箱中静置4h沉淀DNA；10000g离心，弃上清液，加入20μL重蒸水溶解DNA，-20℃保存备用。

9、参照大连宝生物工程公司的pMD18-T载体克隆方法进行载体与DNA的连接。在无DNA污染的薄壁离心管(Eppendorf)中加入：

PMD18-T载体          1.0μL

加“A”的PCR产物     4.0μL

连接溶液I            5.0μL

总体积               10.0μL

恒温16℃连接反应过夜(16h)。

10、全量连接液(10μL)用CaCl₂法转化感受态大肠杆菌JM101(100μL)后，涂抹在含有X-Gal-IPTG-Amp的LB琼脂平板上，37℃倒置培养24h，形成单菌落；挑选白色菌落，在液体LB培养基中37℃震荡培养(150rpm)过夜(15h)，碱裂解法提取其中的重组质粒；

11、以Sma I和Bam HI双酶切法鉴定所扩增的目的基因是否已经插入重组质粒中在无DNA污染的薄壁离心管(Eppendorf)中加入下列酶切反应液：

重蒸水            12.0μL

10×缓冲液        2.0μL

待鉴定质粒        5.0μL

Bam H I           0.5μL

Sma I             0.5μL

总体积            20.0μL

37℃水浴2.0h，65℃ 24min结束反应，1.0％琼脂糖凝胶电泳观察，发现一条清晰的分子量大约为1.1kb的DNA条带，即为所需的目的基因。也可利用上述一对引物对待鉴定质粒进行PCR反应检测。

12、检测转化子的耐盐水平含重组质粒的转化子分别接种在含NaCl 0.8～1.2mol/L的LB琼脂培养基上，37℃恒温倒置培养48h，发现转化子能够在含NaCl 1.1mol/L的LB琼脂培养基上生长，而对照的最高耐盐水平只达到1.0mol/L。可见转入的外源基因与转化子的耐盐性提高密切相关。

13、转化子中的重组质粒经过双酶切或PCR鉴定后，对其中的插入基因进行测序。测序结果见前述。

该基因长1089bp，编码362个氨基酸。根据原核基因的特征分析，本序列的前3个核苷酸“ATG”为基因的起始密码子；接着根据三联体密码，可以推算出该基因的编码氨基酸序列；最后的3个核苷酸“TGA”为基因的终止符。因此这是一个完整的结构基因。通过BLAST软件分析，该基因推测的编码氨基酸序列如下：

MIMANSGATSGWYHDFLETPFTRLVHSKSSKNMLLWINDALMAVFFLLVGLEVKRELMQGSLASLRQAAFPVIAAIGGMIVPALLYLAINYADPITRQGWAIPAATDIAFALGVLALLGSRVPFALKIFMMALAIIDDLGAIIIIALFYTNDLSMASLGLAAVAFAVLAVLNLCGARRTGVYILVGVVLWTAVLKSGVHATLAGVIVGFFIPLKEKHGPSPAKRLEHVLHPWVAYLILPLFAFANAGVSLQGVTLDGLTSILPLGIIAGLLIGKPLGISLFCWLALRLKLAHLPEGTTYQQIMVVGIVCGIGFTMSIFIASLAFGSVDPELINWAKLGILVGSISSAVIGYSWLRVRLRPSV

14、将上述测序结果输入美国GenBank数据库分析DNA序列同源性、蛋白序列同源性和蛋白保守区域比较，发现该基因序列与大肠杆菌K12的Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因高度同源，其推测的蛋白序列与大肠杆菌K12的nha A基因推测的蛋白序列同源性达95％。因此初步判断所克隆基因为假单胞菌的Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因(nha A)。

15、构建原核基因表达重组质粒以检测克隆基因的表达效率及表达产物活性碱法大量提取上述重组质粒及pBV220载体，利用Bam HI和Sma I内切酶分别双酶切上述两种质粒，电泳后从凝胶中回收各片段，在16℃用T₄连接酶连接过夜(约14 h)；以CaCl₂法转化感受态大肠杆菌JM101，将转化菌涂布在含Amp的LB平板上；挑取长出的重组子，提取其中的重组质粒，用原内切酶酶切并用0.9％琼脂糖电泳鉴定哪一株含正确的重组质粒(即由Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因和pBV220载体构成的重组质粒)。

16、提取转化子的总蛋白将上述含Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因的重组pBV220质粒的大肠杆菌JM101在含有60μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养至OD600为0.8，立即转入到42℃诱导基因表达4h，取1mL菌液离心收集菌体，加入2×SDS加样缓冲液50μL及0.1体积的β-巯基乙醇，100℃水煮沸5min破裂菌体；10000g离心12min后收集上清液，即为转化子的总蛋白粗提取物。

17、SDS-PAGE电泳检测目的基因表达产物配制浓缩胶浓度为5％，分离胶浓度为12％的SDS-PAGE平板，分别加入转化子和对照的各20μL总蛋白粗提取物。SDS-PAGE电泳后发现转化子在约41kD处出现的蛋白带吸收峰值比对照高得多，即从原来的占总蛋白4.1％增加到6.3％，提高了53.7％，说明转化子能有效地转录并表达转入的nha A基因。

18、测定转化子的生长曲线分别将筛选得到的转化子和对照接种至5mL的液体LB培养基中，37℃培养至指数生长期；分别吸取等量转化子和对照至100mL含NaCI 1.0mol/L的液体LB培养基中，37℃120rpm震荡培养；每隔4h取样测其OD₆₀₀值，连续测48h，记录各组数据；重复本实验3次，求平均值作图。结果发现，转化子和对照的生长都受到的抑制，迟滞期延长，菌数到6h后才有较明显的增长。但转化子的生长速度和最终菌浓度远高于对照组。转化子达到生长平衡期时的OD₆₀₀值约为对照组的2.3倍。可见，外源nha A基因使转化子的耐盐性明显提高。

19、测定转化子中的Na⁺浓度分别将转化子和对照接种至200mL含NaCl 0.95mol/L的液体LB培养基中，37℃震荡(100rpm)培养48h；以LB培养液稀释转化子培养液的浓度，使OD₆₀₀≌0.4；取500mL菌液在4℃，以3000g，15min离心收集菌体；以50mmol/L葡萄糖溶液离心清洗菌体两次除去菌体外可能吸附的Na⁺；用干净滤纸吸干菌泥中可见的水分，加10mL浓HNO₃溶解，电炉上加热30min；冷却后，加10mL HNO₃-HClO₄混合液(HNO₃∶HClO₄为3∶1)；加热至有浓白烟产生，继续加热4h，蒸去大部分HNO₃和HClO₄；以无离子水将其稀释至100mL；原子吸收光谱测定其中Na⁺浓度，并换算成转化子中的Na⁺浓度；经两次实验后得知，转化子中的Na⁺浓度为14.3ng/10⁶细胞，仅为对照的60.4％，其原因就在于转化子中由nha A基因转录、表达的蛋白不断将Na⁺泵出胞外的缘故。

20、检测转化子中nha A基因转录、表达的蛋白在细胞中的定位将转化子接种至50～100mL的液体LB培养基中，37℃震荡(110rpm)培养过夜(13h)；42℃诱导培养4h；用LB培养液调节转化子和对照的菌液浓度，使其基本一致，冰浴中超声破碎(功率为450W，处理7s，间隔9s，处理时间7min)；取样番红染色，在高倍镜下(40×)检查细菌破碎率，应达到70％以上；低速离心(1500g，10min)除去未破碎细胞，然后超速离心(100000g，10min)收集细胞碎片；加重蒸水100μL，沸水浴10min，10000g离心10min；取上清液20μL进行SDS-PAGE凝胶电泳；结果发现，nha A基因转录、表达的蛋白主要位于细胞膜上。

21、转化子丢失重组质粒实验将转化子培养于无抗性筛选的LB培养基中，42℃继代培养18次，将上述多次继代的转化子分别涂布于：①含NaCl 0.8、0.9、1.0、1.1和1.2mol/L，②含氨苄青霉素(Amp)60μg/mL的LB固体培养基上，培养48h。实验发现，经上述高温处理的转化子都不能在含Amp60μg/mL的LB固体培养基上生长，其耐盐性也回落到原初水平(即1.0mol/L)。随机挑取10株经上述高温处理的、在含NaCl 0.9和1.0mol/L的培养基上长出的原转化子，提取其中的质粒。结果发现，它们中的质粒都已全部丢失。本实验从反面证明了nha A基因与该菌的耐盐性密切相关。

实施例2：

与实施例1类似，其区别在于将假单胞菌接种在含NaCl 0.7mol/L的培养基中，恒温24℃，以150rpm的速度震荡培养至指数生长中后期，约为20h。常规碱变性法提取该菌的总DNA，经紫外光谱检测纯度，其OD₂₆₀/OD₂₈₀比值应≥1.8。

根据根据几种生物的Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因的序列设计引物，其中一对可较稳定地获得PCR扩增产物的引物如下：

5’端引物：5’A CCCGGGATGATTATGGCCAACAGC 3’

3’端引物：5’T GGATCCTCAAACTGATGGACGCAA 3’

为了便于构建原核基因表达载体，在5’端引物和3’端引物分别设计添加了Sma I和BamHI的酶切位点(下划线)。

在0.5mL无菌无DNA污染的薄壁离心管(Eppendorf)中依次加入下列试剂进行PCR反应：

重蒸水                 9.2μL

10×PCR缓冲液          2.0μL

MgCl₂(25mmol/L)        1.2μL

dNTPs(各2.5mmol/L)     0.4μL

引物1(20mmol/L)        1.0μL

引物2(20mmol/L)        1.0μL

假单胞菌总DNA(5ng/μL) 5.0μL

pfu DNA聚合酶(5u/μL)  0.2μL

总体积                 20.0μL

PCR反应参数：95℃预变性，5min；94℃变性，1min；51℃退火，1min；72℃延伸，2min；37个循环。最后72℃延伸，10min，保存于4℃；PCR反应结束后，将扩增产物在含有0.6μg/mL溴乙锭的0.8％琼脂糖凝胶中电泳，凝胶成像系统扫描记录，并在紫外灯下用锋利的刀片切下扩增的约1.1kb的条带。参照华舜公司凝胶回收试剂盒说明书回收该条带；

为了提高克隆效率，方便与T载体连接，需要在PCR产物末端加上一个腺嘌呤脱氧核糖核苷酸(A)。在0.5mL无菌无DNA污染的薄壁离心管(Eppendorf)中依次加入：

重蒸水                 1.2μL

10×PCR缓冲液          2.0μL

MgCl₂(25mmol/L)        1.2μL

dATP(2.5mmol/L)        0.4μL

回收的PCR产物          15.0μL

Taq DNA聚合酶(5u/μL)  0.2μL

总体积                 20.0μL

置恒温72℃，10min后，加入2倍体积的冷无水乙醇(-15℃)，充分混匀，冰箱中静置5h沉淀DNA；15000g离心，弃上清液，加入20μL重蒸水溶解DNA，-20℃保存备用。参照大连宝生物工程公司的pMD18-T载体克隆方法进行载体与DNA的连接。在无菌无DNA污染的薄壁离心管(Eppendorf)中加入：

pMD18-T载体            1.0μL

加“A”的PCR产物       4.0μL

连接溶液I              5.0μL

总体积                 10.0μL

恒温16℃连接反应过夜(18h)。

全量连接液(10μL)用CaCl₂法转化感受态大肠杆菌JM101(180μL)后，涂抹在含有X-Gal-IPTG-Amp的LB琼脂平板上，37℃倒置培养28h，形成单菌落；挑选白色菌落，在液体LB培养基中37℃震荡培养(110rpm)过夜(14h)，碱裂解法提取其中的重组质粒；

以Sma I和Bam HI双酶切法鉴定所扩增的目的基因是否已经插入重组质粒中在无菌无DNA污染的薄壁离心管(Eppendorf)中加入下列酶切反应液：

重蒸水            12.0μL

10×缓冲液        2.0μL

待鉴定质粒        5.0μL

Bam H I           0.5μL

Sma I             0.5μL

总体积            20.0μL

37℃水浴1.8h，65℃ 22min结束反应，1.0％琼脂糖凝胶电泳观察，发现一条清晰的分子量大约为1.1kb的DNA条带，即为所需的目的基因。也可利用上述一对引物对待鉴定质粒进行PCR反应检测。

检测转化子的耐盐水平含重组质粒的转化子分别接种在含NaCl 0.8～1.2mol/L的LB琼脂培养基上，37℃恒温倒置培养50h，发现转化子能够在含NaCl 1.1mol/L的LB琼脂培养基上生长，而对照的最高耐盐水平只达到1.0mol/L。可见转入的外源基因与转化子的耐盐性提高密切相关。

转化子中的重组质粒经过双酶切或PCR鉴定后，对其中的插入基因进行测序。发现它是一个完整的结构基因。通过BLAST软件分析，推测出该基因编码的氨基酸序列。将上述序列输入美国GenBank数据库分析DNA序列同源性、蛋白序列同源性和蛋白保守区域比较，发现该基因序列与大肠杆菌K12的Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因(nha A)高度同源，其蛋白序列与大肠杆菌K12的nha A基因推测的蛋白序列同源性达95％。因此初步判断所克隆基因为假单胞菌的Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因(nha A)。

构建原核基因表达重组质粒以检测克隆基因的表达效率及表达产物活性碱法大量提取上述重组质粒及pBV220载体，利用Bam HI和Sma I内切酶分别双酶切上述两种质粒，电泳后从凝胶中回收各片段，在16℃用T₄连接酶连接过夜(约16h)；以CaCl₂法转化感受态大肠杆菌JM101，将转化菌涂布在含Amp的LB平板上；挑取长出的重组子，提取其中的重组质粒，用原内切酶酶切并用1.0％琼脂糖电泳鉴定哪一株含正确的重组质粒(即由Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因和pBV220载体构成的重组质粒)。

提取转化子的总蛋白将上述含Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因的重组pBV220质粒的大肠杆菌JM101在含有60μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养至OD₆₀₀为0.9，立即转入到42℃诱导基因表达4h，取1mL菌液离心收集菌体，加入2×SDS加样缓冲液50μL及0.1体积的β-巯基乙醇，100℃水煮沸5min破裂菌体；11000g离心后收集上清液，即为转化子的总蛋白粗提取物。

SDS-PAGE电泳检测目的基因表达产物配制浓缩胶浓度为5％，分离胶浓度为12％的SDS-PAGE平板，分别加入转化子和对照的各22μL总蛋白粗提取物。SDS-PAGE电泳后发现转化子在约41kD处出现的蛋白带吸收峰值比对照高得多，即从原来的占总蛋白4.1％增加到6.3％，提高了53.7％，说明转化子能有效地转录并表达转入的nha A基因。

测定转化子的生长曲线分别将筛选得到的转化子和对照接种至5mL的液体LB培养基中，37℃培养至指数生长期；分别吸取等量转化子和对照至100mL含NaCl 1.0mol/L的液体LB培养基中，37℃100rpm震荡培养；每隔6h取样测其OD₆₀₀值，连续测48h，记录各组数据；重复本实验3次，求平均值作图。结果发现，转化子和对照的生长都受到的抑制，迟滞期延长，菌数到6h后才有较明显的增长。但转化子的生长速度和最终菌浓度远高于对照组。转化子达到生长平衡期时的OD₆₀₀值约为对照组的2.3倍。可见，外源nha A基因使转化子的耐盐性明显提高。

测定转化子中的NA⁺浓度分别将转化子和对照接种至200mL含NaCl 0.95mol/L的液体LB培养基中，37℃震荡(110rpm)培养40h；以LB培养液稀释转化子培养液的浓度，使OD₆₀₀≌0.4；取500mL菌液在4℃，以3500g，11min离心收集菌体；以50mmol/L葡萄糖溶液离心清洗菌体两次除去菌体外可能吸附的Na⁺；用干净滤纸吸干菌泥中可见的水分，加10mL浓HNO₃溶解，电炉上加热30min；冷却后，加10mL HNO₃-HClO₄混合液(HNO₃∶HClO₄为3∶1)；加热至有浓白烟产生，继续加热4.2h，蒸去大部分HNO₃和HClO₄；以无离子水将其稀释至100mL；原子吸收光谱测定其中Na⁺浓度，并换算成转化子中的Na⁺浓度；经两次实验后得知，转化子中的Na⁺浓度为14.3ng/10⁶细胞，仅为对照的60.4％，其原因就在于转化子中由nha A基因转录、表达的蛋白不断将Na⁺泵出胞外的缘故。

转化子中nha A基因转录、表达的蛋白在细胞中的定位将转化子接种至70mL的液体LB培养基中，37℃震荡(130rpm)培养过夜(14h)；42℃诱导培养4h；用LB培养液调节转化子和对照的菌液浓度，使其基本一致，冰浴中超声破碎(功率为450W，处理6s，间隔10s，处理时间8min)；取样番红染色，在高倍镜下(40×)检查细菌破碎率，应达到70％以上；低速离心(1700g，10min)除去未破碎细胞，然后超速离心(130000g，10min)收集细胞碎片；加重蒸水100μL，沸水浴10min，11000g离心10min；取上清液24μL进行SDS-PAGE凝胶电泳；结果发现，nha A基因转录、表达的蛋白主要位于细胞膜上。

转化子丢失重组质粒实验将转化子培养于无抗性筛选的LB培养基中，42℃继代培养18次，将上述多次继代的转化子分别涂布于：①含NaCl 0.8、0.9、1.0、1.1和1.2mol/L，②含氨苄青霉素(Amp)60μg/mL的LB固体培养基上，培养50h。实验发现，经上述高温处理的转化子都不能在含Amp60μg/mL的LB固体培养基上生长，其耐盐性也回落到原初水平(即1.0mol/L)。随机挑取10株经上述高温处理的、在含NaCl 0.9和1.0mol/L的培养基上长出的原转化子，提取其中的质粒。结果发现，它们中的质粒都已全部丢失。本实验从反面证明了nha A基因与该菌的耐盐性密切相关。

实施例3

与实施例1类似，其区别在于将假单胞菌接种在含NaCl 0.4mol/L的培养基中，温度为30℃，以110rpm的速度震荡培养至指数生长中后期；常规碱变性法提取假单胞菌的总DNA，经紫外光谱检测纯度，其OD₂₆₀/OD₂₈₀比值应≥1.8。

根据根据几种生物的Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因的序列设计引物，其中一对可较稳定地获得PCR扩增产物的引物如下：

5’端引物：5’A CCCGGGATGATTATGGCCAACAGC 3’

3’端引物：5’T GGATCCTCAAACTGATGGACGCAA 3’

为了便于构建原核基因表达载体，在5’端引物和3’端引物分别设计添加了Sma I和BamHI的酶切位点(下划线)。

在0.5mL无菌无DNA污染的薄壁离心管(Eppendorf)中依次加入下列试剂进行PCR扩增：

重蒸水                     9.2μL

10×PCR缓冲液              2.0μL

MgCl₂(25mmol/L)            1.2μL

dNTPs(各2.5mmol/L)         0.4μL

引物1(20mmol/L)            1.0μL

引物2(20mmol/L)            1.0μL

假单胞菌总DNA(5ng/μL)     5.0μL

pfuDNA聚合酶(5u/μL)       0.2μL

总体积                     20.0μL

PCR反应参数：95℃预变性，5min；94℃变性，1min；51℃退火，1min；72℃延伸，2 min；35个循环。最后72℃延伸，10min，保存于4℃；PCR反应结束后，将扩增产物在含有0.5μg/mL溴乙锭的0.9％琼脂糖凝胶中电泳，凝胶成像系统扫描记录，并在紫外灯下用锋利的刀片切下扩增的约1.1kb的条带。按华舜公司凝胶回收试剂盒说明书回收该条带；

为了提高克隆效率，方便与T载体连接，需要在PCR产物末端加上一个腺嘌呤脱氧核糖核苷酸(A)。在0.5mL无菌无DNA污染的薄壁离心管(Eppendorf)中依次加入：

重蒸水                 1.2μL

10×PCR缓冲液          2.0μL

MgCl₂(25mmol/L)        1.2μL

dATP(2.5mmol/L)        0.4μL

回收的PCR产物          15.0μL

Taq DNA聚合酶(5u/μL)  0.2μL

总体积                 20.0μL

置恒温72℃，10min后，加入2倍体积的冷无水乙醇(-4℃)，充分混匀，冰箱中静置12h沉淀DNA；13000g离心，弃上清液，加入20μL重蒸水溶解DNA，-20℃保存备用。参照大连宝生物工程公司的pMD18-T载体克隆方法进行载体与DNA的连接。在无菌无DNA污染的薄壁离心管(Eppendorf)中加入：

pMD18-T载体          1.0μL

加“A"的PCR产物      4.0μL

连接溶液I            5.0μL

总体积               10.0μL

恒温16℃连接反应过夜(22h)。

全量连接液(10μL)用CaCl₂法转化感受态大肠杆菌JM101(150μL)后，涂抹在含有X-Gal-IPTG-Amp的LB琼脂平板上，37℃倒置培养44h，形成单菌落；挑选白色菌落，在液体LB培养基中37℃震荡培养(120rpm)过夜(16h)，碱裂解法提取其中的重组质粒；

以Sma I和Bam HI双酶切法鉴定所扩增的目的基因是否已经插入重组质粒中在无菌无DNA污染的薄壁离心管(Eppendorf)中加入下列酶切反应液：

重蒸水                 12.0μL

10×缓冲液             2.0μL

待鉴定质粒             5.0μL

Bam H I                0.5μL

Sma I                  0.5μL

总体积                 20.0μL

37℃水浴1.6h，65℃20min结束反应，0.8％琼脂糖凝胶电泳观察，发现一条清晰的分子量大约为1.1kb的DNA条带，即为所需的目的基因。也可利用上述一对引物对待鉴定质粒进行PCR反应检测。

检测转化子的耐盐水平含重组质粒的转化子分别接种在含NaCl 0.8～1.2mol/L的LB琼脂培养基上，37℃恒温倒置培养60h，发现转化子能够在含NaCl 1.1mol/L的LB琼脂培养基上生长，而对照的最高耐盐水平只达到1.0mol/L。可见转入的外源基因与转化子的耐盐性提高密切相关。

转化子中的重组质粒经过双酶切或PCR鉴定后，对其中的插入基因进行测序。发现这是一个完整的结构基因。通过BLAST软件推测该基因编码的氨基酸序列。将上述序列输入美国GenBank数据库分析DNA序列同源性、蛋白序列同源性和蛋白保守区域比较，发现该基因序列与大肠杆菌K12的Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因(nha A)高度同源，其蛋白序列与大肠杆菌K12的nha A基因推测的蛋白序列同源性达95％。因此初步判断所克隆基因为假单胞菌的Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因(nha A)。

构建原核基因表达重组质粒以检测克隆基因的表达效率及表达产物活性碱法大量提取上述重组质粒及原核表达载体pBV220，利用Bam HI和Sma I内切酶分别双酶切上述两种质粒，电泳后从凝胶中回收各片段，在16℃用T₄连接酶连接过夜(约14h)；以CaCl₂法转化感受态大肠杆菌JM101，将转化菌涂布在含Amp的LB平板上；挑取长出的重组子，提取其中的重组质粒，用原内切酶酶切并用1.0％琼脂糖电泳鉴定哪一株含正确的重组质粒(即由Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因和pBV220载体构成的重组质粒)。

提取转化子的总蛋白将上述含Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因的重组pBV220质粒的大肠杆菌JM101在含有60μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养至OD600为0.9，立即转入到42℃诱导基因表达4h，取1mL菌液离心收集菌体，加入2×SDS加样缓冲液50μL及0.1体积的β-巯基乙醇，100℃水煮沸5min破裂菌体；12000g离心13min后收集上清液，即为转化子的总蛋白粗提取物。

SDS-PAGE电泳检测目的基因表达产物配制浓缩胶浓度为5％，分离胶浓度为12％的SDS-PAGE平板，分别加入转化子和对照的各25μL总蛋白粗提取物。SDS-PAGE电泳后发现转化子在约41kD处出现的蛋白带吸收峰值比对照高得多，即从原来的占总蛋白4.1％增加到6.3％，提高了53.7％，说明转化子能有效地转录并表达转入的nha A基因。

测定转化子的生长曲线分别将筛选得到的转化子和对照接种至5mL的液体LB培养基中，37℃培养至指数生长期；分别吸取等量转化子和对照至100mL含NaCl 1.0mol/L的液体LB培养基中，37℃150rpm震荡培养；每隔8h取样测其OD₆₀₀值，连续测48h，记录各组数据；重复本实验3次，求平均值作图。结果发现，转化子和对照的生长都受到的抑制，迟滞期延长，菌数到6h后才有较明显的增长。但转化子的生长速度和最终菌浓度远高于对照组。转化子达到生长平衡期时的OD₆₀₀值约为对照组的2.3倍。可见，外源nha A基因使转化子的耐盐性明显提高。

测定转化子中的Na⁺浓度分别将转化子和对照接种至200mL含NaCl 0.95mol/L的液体LB培养基中，37℃震荡(140rpm)培养42h；以LB培养液稀释转化子培养液的浓度，使OD600≌0.4；取500mL菌液在4℃，以3600g，12min离心收集菌体；以50mmol/L葡萄糖溶液离心清洗菌体两次除去菌体外可能吸附的Na⁺；用干净滤纸吸干菌泥中可见的水分，加10mL浓HNO₃溶解，电炉上加热30min；冷却后，加10mL HNO₃-HClO₄混合液(HNO₃∶HClO₄为3∶1)；加热至有浓白烟产生，继续加热4.5h，蒸去大部分HNO₃和HClO₄；以无离子水将其稀释至100mL；原子吸收光谱测定其中Na⁺浓度，并换算成转化子中的Na⁺浓度；经两次实验后得知，转化子中的Na⁺浓度为14.3ng/10⁶细胞，仅为对照的60.4％，其原因就在于转化子中由nha A基因转录、表达的蛋白不断将Na⁺泵出胞外的缘故。

转化子中nha A基因转录、表达的蛋白在细胞中的定位将转化子接种至80mL的液体LB培养基中，37℃震荡(150rpm)培养过夜(16h)；42℃诱导培养4h；用LB培养液调节转化子和对照的菌液浓度，使其基本一致，冰浴中超声破碎(功率为450W，处理5s，间隔15s，处理时间9min)；取样番红染色，在高倍镜下(40×)检查细菌破碎率，应达到70％以上；低速离心(1800g，10min)除去未破碎细胞，然后超速离心(150000g，10min)收集细胞碎片；加重蒸水100μL，沸水浴10min，12000g离心10min；取上清液21μL进行SDS-PAGE凝胶电泳；结果发现，nha A基因转录、表达的蛋白主要位于细胞膜上。

转化子丢失重组质粒实验将转化子培养于无抗性筛选的LB培养基中，42℃继代培养18次，将上述多次继代的转化子分别涂布于：①含NaCl 0.8、0.9、1.0、1.1和1.2mol/L，②含氨苄青霉素(Amp)60μg/mL的LB固体培养基上，培养50h。实验发现，经上述高温处理的转化子都不能在含Amp60μg/mL的LB固体培养基上生长，其耐盐性也回落到原初水平(即1.0mol/L)。随机挑取10株经上述高温处理的、在含NaCl 0.9和1.0mol/L的培养基上长出的原转化子，提取其中的质粒。结果发现，它们中的质粒都已全部丢失。本实验从反面证明了nha A基因与该菌的耐盐性密切相关。

Claims (4)

1、假单胞菌Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因，其特征在于其序列如下：

1      ATGATTATGGCCAACAGCGGCGCAACCAGTGGATGGTATCACGACTTTCTGGAGACGCCG   60

61     TTCACTCGGTTGGTTCACTCGAAATCAAGCAAAAACATGCTGTTATGGATAAATGACGCG  120

121    CTGATGGCGGTATTTTTCCTGTTAGTCGGTCTGGAAGTTAAACGTGAACTGATGCAAGGA  180

181    TCGCTAGCCAGCTTACGCCAGGCCGCATTTCCAGTTATCGCCGCTATTGGTGGGATGATT  240

241    GTGCCGGCATTACTCTATCTGGCTATTAACTATGCCGATCCGATTACCCGCCAAGGGTGG  300

301    GCGATCCCGGCGGCTACTGACATTGCTTTTGCACTTGGTGTACTGGCGCTGTTGGGAAGT  360

361    CGTGTTCCGTTTGCGCTGAAGATCTTTATGATGGCTCTGGCTATTATCGACGATCTTGGG  420

421    GCCATCATTATCATCGCATTGTTCTACACTAATGACTTATCGATGGCCTCTCTTGGCCTC  480

481    GCGGCTGTAGCATTTGCGGTACTCGCGGTATTGAATCTGTGTGGTGCACGCCGCACGGGC  540

541    GTCTATATTCTTGTTGGCGTGGTGTTGTGGACTGCGGTGTTGAAATCGGGGGTTCACGCA  600

601    ACTCTGGCGGGGGTAATTGTCGGCTTCTTTATTCCTTTGAAAGAGAAGCATGGGCCTTCT  660

661    CCAGCGAAGCGACTGGAGCATGTGTTGCACCCGTGGGTGGCGTATCTGATTTTGCCGCTG  720

721    TTTGCATTTGCTAATGCTGGCGTTTCACTGCAAGGCGTCACGCTGGATGGCTTGACCTCC  780

781    ATTCTGCCATTGGGGATCATCGCTGGCTTGCTGATTGGCAAACCGCTGGGGATTAGTCTG  840

841    TTCTGCTGGTTGGCGCTGCGTTTGAAACTGGCGCATCTGCCTGAGGGAACGACTTATCAG  900

901    CAAATTATGGTGGTGGGGATCGTGTGCGGTATCGGTTTTACTATGTCTATCTTTATTGCC  960

961    AGCCTGGCCTTTGGTAGCGTAGATCCAGAACTGATTAACTGGGCGAAACTCGGTATCCTG  1020

1021   GTCGGTTCTATCTCTTCGGCGGTAATTGGATACAGCTGGTTACGCGTTCGTTTGCGTCCA  1080

1081   TCAGTTTGA                                                     1089

本基因长1089bp，编码362个氨基酸；

根据原核基因的特征分析，序列的前3个核苷酸“ATG”为基因的起始密码子；接着，根据三联体密码，推算出该基因的编码氨基酸序列；最后的3个核苷酸“TGA”为基因的终止符；

通过BLAST软件分析，该基因推测的编码氨基酸序列如下：

MIMANSGATSGWYHDFLETPFTRLVHSKSSKNMLLWINDALMAVFFLLVGLEVKRELMQGSLASLRQAAFPVIAAIGGMIVPALLYLAINYADPITRQGWAIPAATDIAFALGVLALLGSRVPFALKIFMMALAIIDDLGAIIIIALFYTNDLSMASLGLAAVAFAVLAVLNLCGARRTGVYILVGVVLWTAVLKSGVHATLAGVIVGFFIPLKEKHGPSPAKRLEHVLHPWVAYLILPLFAFANAGVSLQGVTLDGLTSILPLGIIAGLLIGKPLGISLFCWLALRLKLAHLPEGTTYQQIMVVGIVCGIGFTMSIFIASLAFGSVDPELINWAKLGILVGSISSAVIGYSWLRVRLRPSV。

2、克隆假单胞菌Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因方法，其特征在于其步骤为：

1)将极端耐盐假单胞菌接种在含NaCl 0.1～0.9mol/L的培养基中，温度为15～32℃，以100～150rpm的速度震荡培养至指数生长中后期；

2)常规碱变性法提取极端耐盐假单胞菌的总DNA，经紫外光谱检测纯度OD₂₆₀/OD₂₈₀比值，用1％琼脂糖凝胶电泳检测所提取DNA的分子量是否≥21kb；

若OD₂₆₀/OD₂₈₀比值≥1.8，进入下一步骤；

若OD₂₆₀/OD₂₈₀比值＜1.8，进一步纯化，直至OD₂₆₀/OD₂₈₀比值≥1.8；

3)设计一对PCR扩增产物的引物如下：

5’端引物：5’A CCCGGGATGATTATGGCCAACAGC 3’

3’端引物：5’T GGATCCTCAAACTGATGGACGCAA 3’

为了便于构建原核基因表达载体，在5’端引物和3’端引物分别设计添加了Sma I和BamHI的酶切位点；

4)PCR反应的各项参数为：95℃预变性5min，然后94℃变性1min；51℃退火1min；72℃延伸2min；35～40个循环，最后72℃延伸10min，保存于4℃；

5)PCR反应结束后，将扩增产物在含有0.5～1.0μg/mL溴乙锭的0.8％～1.0％琼脂糖凝胶中电泳，凝胶成像系统扫描记录，并在紫外灯下用锋利的刀片切下扩增的约1.1kb的条带；

6)在PCR产物末端加上一个腺嘌呤脱氧核糖核苷酸，在0.5mL无菌无DNA污染的薄壁离心管中依次加入各所需试剂，置恒温72℃反应10min后，加入2倍体积的冷无水乙醇，温度为-20～0℃，混匀，静置4～16h沉淀DNA；10 000～15 000g离心，弃上清液，加入20μL重蒸水溶解DNA，-20℃保存备用，所述的各所需试剂为重蒸水1.2μL，10×PCR缓冲液2.0μL，浓度为25mmol/L的MgCl₂ 1.2μL，浓度为各2.5mmol/L的DNTPs 0.4μL，回收的PCR产物15.0μL，浓度为5u/μL的Taq DNA聚合酶0.2μL，总体积20.0μL；

7)进行载体与DNA的连接，在无菌无DNA污染的薄壁离心管中加入各所需试剂，恒温16℃连接反应过夜，全量连接液用CaCl₂法转化感受态大肠杆菌JM101后，涂抹在含有X-Gal-IPTG-Amp的LB琼脂平板上，37℃倒置培养形成单菌落，所述的各所需试剂量为pMD18-T载体1.0μL，加腺嘌呤脱氧核糖核苷酸的PCR产物4.0μL，连接溶液I 5.0μL，总体积10.0μL；

8)挑选白色菌落，在液体LB培养基中37℃震荡培养过夜，碱裂解法提取其中的重组质粒；以Sma I和Bam HI双酶切法鉴定所扩增的目的基因是否已经插入重组质粒中，在无菌无DNA污染的薄壁离心管中依次加入酶切反应液，37℃水浴1.5～2.0h，65℃20～25min结束反应，0.8％～1.0％琼脂糖凝胶电泳观察，发现一条清晰的分子量大约为1.1kb的DNA条带，即为所需的目的基因；

9)检测转化子的耐盐水平

含重组质粒的转化子分别接种在含NaCl 0.8～1.2mol/L的LB琼脂培养基上，37℃恒温倒置培养48～60h；

10)转化子中的重组质粒经过双酶切或PCR鉴定后，对其中的克隆基因进行测序；

11)根据已测知的克隆基因序列，与生物数据库中的资料进行DNA和蛋白质的同源性比较，初步判断克隆基因为假单胞菌的Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因；

12)构建原核基因表达重组质粒以检测克隆基因的表达效率及表达产物活性

碱法大量提取上述重组质粒及原核表达pBV220载体，利用Bam HI和Sma I内切酶分别双酶切上述两种质粒，电泳后从凝胶中回收各片段，在16℃用T₄连接酶连接过夜；以CaCl₂法转化感受态大肠杆菌JM101，将转化菌涂布在含Amp的LB平板上；挑取长出的重组子，提取其中的重组质粒，用原内切酶酶切并用0.8％～1.0％琼脂糖电泳鉴定哪一株含正确的重组质粒，即由Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因和pBV220载体构成的重组质粒；

13)提取转化子的总蛋白

将含Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因的重组pBV220质粒的大肠杆菌JM101在含有60μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养至OD₆₀₀为0.8～0.9，立即转入到42℃热诱导基因表达4h，取1mL菌液离心收集菌体，加入2×SDS加样缓冲液50μL及0.1体积的β-巯基乙醇，100℃水煮沸5min破裂菌体；10 000～12 000g离心10～15min后收集上清液，即为转化子的总蛋白粗提取物；

14)SDS-PAGE电泳检测目的基因表达产物

配制浓缩胶浓度为5％，分离胶浓度为12％的SDS-PAGE平板，分别加入转化子和对照各20～30μL总蛋白粗提取物，SDS-PAGE电泳后发现转化子在约41kD处出现的蛋白带吸收峰值比对照高得多，即从原来的占总蛋白4.1％增加到6.3％，提高了53.7％，说明转化子能有效地转录并表达转入的假单胞菌的Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因；

15)测定转化子的生长曲线

分别将筛选得到的转化子和对照培养在含NaCl 1.0mol/L的液体LB培养基中，37℃100～150rpm震荡培养；每隔4～8h取样测其OD₆₀₀值，连续测48h，记录各组数据；重复本实验3次，求平均值作图；

16)测定转化子中的Na⁺浓度

分别将转化子和对照在含NaCl 0.95mol/L的液体LB培养基中，37℃震荡培养36～48h；以LB培养液稀释转化子培养液的浓度，使OD₆₀₀≌0.4；取500mL菌液在4℃，以3000～4000g，10～15min离心收集菌体；以50mmol/L葡萄糖溶液离心清洗菌体两次除去菌体外可能吸附的Na⁺；用干净滤纸吸干菌泥中可见的水分，加10mL浓HNO₃溶解，电炉上加热30min；冷却后，加10mL HNO₃-HClO₄混合液；加热至有浓白烟产生，继续加热4～4.5h，蒸去大部分HNO₃和HClO₄；以无离子水将其稀释至100mL；原子吸收光谱测定其中Na⁺浓度，并换算成转化子中的Na⁺浓度；

17)转化子中假单胞菌的Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因转录、表达的蛋白在细胞中的定位

将转化子接种至液体LB培养基中，37℃震荡培养过夜；42℃诱导培养4h；用LB培养液调节转化子和对照的菌液浓度，冰浴中超声破碎；取样番红染色，检查细菌破碎率至细菌破碎率大于70％，离心除去未破碎细胞，再收集细胞碎片；加重蒸水，沸水浴，离心，取上清液20～25μL进行SDS-PAGE凝胶电泳；结果发现，假单胞菌的Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因转录、表达的蛋白主要位于细胞膜上；

18)转化子丢失重组质粒实验

将转化子培养于无抗性筛选的LB培养基中，继代培养，分别涂布于：①含NaCl 0.8、0.9、1.0、1.1和1.2mol/L，②含氨苄青霉素60μg/mL的LB琼脂培养基上，培养48～60h；随机挑取10株经上述高温处理的、在含NaCl 0.9和1.0mol/L的培养基上长出的原转化子，提取其中的质粒。

3、如权利要求2所述的克隆假单胞菌Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因方法，其特征在于在步骤7)中，在无菌条件下各取100μL转化子溶液分别用三角形无菌玻棒均匀涂抹在高盐和含X-Gal-IPTG-Amp的LB琼脂培养基上，培养48～60h后，按常规挑选既能在高盐琼脂培养基上生长又在含X-Gal-IPTG-Amp培养基上菌落呈白色的转化子。

4、如权利要求2所述的克隆假单胞菌Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因方法，其特征在于在步骤11)中，所说的生物数据库为GenBank。

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