CN103748224A

CN103748224A - 一个棉花蛋白激酶及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN103748224A
Application number: CN201280004530.2A
Authority: CN
Inventors: 崔洪志; 梁丽; 王建胜; 何云蔚
Original assignee: Genesis Seed Industry Co ltd
Current assignee: Genesis Seed Industry Co ltd
Priority date: 2012-08-13
Filing date: 2012-08-13
Publication date: 2014-04-23
Anticipated expiration: 2032-08-13
Also published as: WO2014026311A1; CN103748224B

Abstract

本发明涉及一个来源于棉花的蛋白激酶GPK1及其编码基因，以及其在培育耐旱性提高的转基因植物中的应用。

Description

一个棉花蛋白激酶及其编码基因与应用

技术领域本发明涉及蛋白激酶及其编码基因与应用，特别是涉及一个来源于棉花的棉花蛋白激酶 GPK1及其编码基因，以及其在培育耐旱性提高的转基因植物中的应用。技术背景非生物胁迫，如干旱、盐渍、极端温度、化学污染和氧损伤等能够对植物的生长发育造成严重的危害，对作物产量造成极大损失，其中干旱对作物产量的影响，在诸多自然逆境中占首位，其危害相当于其它灾害之和，是许多地区是农业发展的瓶颈。据统计，世界干早、半干早地区占陆地面积的 34% ; 我国干早、半干旱地区约占国土面积的 52%, 年受早面积达 20〜270万公顷，全国灌溉区每年缺水约 30亿立方米，因缺水而少收粮食 350〜40亿公斤；特别是我国主要产粮区如华北、东北和西北，是我国缺水最严重的地区，春旱频繁达到十年九遇。

由于植物的耐胁迫性大多属于数量性状，现有可利用的种质资源匮乏，采用常规育种技术改良植物胁迫耐性的难度相当大，培育出真正的耐胁迫品种就尤为困难。近年来，随着对植物抗逆分子机理研究的不断深入和分子生物学技术的迅猛发展，抗逆研究已经从生理水平深入到分子水平，促进了植物抗逆基因工程的发展。当植物在受到胁迫时会产生相应的应答反应，来降低或消除给植株带来的危害。植物的这种应答反应是一个涉及多基因、多信号途径、多基因产物的复杂过程。这些基因及其表达产物可以分为 3 类：（1)参与信号级联放大系统和转录控制的基因及产物；（2) 直接对保护生物膜和蛋白质起作用的基因及其表达产物；（3 ) 与水和离子的摄入和转运相关的蛋白质。近年来，通过转基因技术提高植物对胁迫耐受能力的研究，以及对胁迫具有耐受能力的农作物、旱生植物和盐生植物的研究都取得了显著的成果，对胁迫相关基因和信号转导系统也有了更进一步的了解（Liu Q.1998.Two transcrip tion facto rs,DREBl and DREB2,w ith an EREBP/AP2 DNA binding domain, separate two cellular signal transduction pathways in drought- and low temperature -responsive gene exp ression, respectively, in A rabidopsis. Plant Cell, 10: 1391-1406； KAN GJY.2002. A rabid op sis basic leucine zipper p ro teins that mediate stress2responsive abscisic acid signaling。 Plant Cell, 14: 343- 357； ABE H.2003.A rabid op sis AtMYC2 (bHLH) and AtMYB2(MYB) function as transcrip tional activato rs in abscisic acid signaling. Plant Cell, 15: 63-78. ) 。但就目前的研究状况而言，由于其机制十分复杂,许多植物对逆境下的生物化学和生理学上的响应机制仍有待深入研究。在抗逆应答基因的功能及表达调控方面的研究占多数，但抗逆相关的信号传递途径之间的联系以及整个信号传递网络系统的机理还有待进一步研究。发明内容本发明人利用 SSH与 RACE相结合的方法克隆出了棉花的一个蛋白激酶（本文命名为 GPK1 ) 的编码基因的 DNA序列。并发现将其导入转基因植株后，可明显改善转基因植株的耐旱性，而且这些性状可稳定遗传。

本发明第一方面提供棉花的一个蛋白激酶 GPK1的编码基因，其序列为 SEQ ID NO: l o

本发明第二方面提供一种重组表达载体，其含有本发明第一方面所述的基因并且所述基因的核苷酸序列与所述表达载体的表达控制序列可操作地连接；优选地，所述载体为附图 2所示的 rd29A-GhGPKl-2300载体。

本发明第三方面提供一种重组细胞，其含有本发明第一方面所述的核苷酸序列或者本发明第二方面所述的重组表达载体；优选地，所述重组细胞为重组农杆菌细胞。

本发明第四方面提供一种改善植物耐旱性的方法，包括：将本发明第一方面所述的核苷酸序列或者本发明第二方面所述的重组表达载体导入植物或植物组织并使所述基因表达；优选地，所述植物是烟草。

本发明第五方面提供一种制备转基因植物的方法，包括：在有效产生植物的条件下培养含有本发明第一方面所述的基因、本发明第二方面所述的重组表达载体的植物或植物组织；优选地，所述植物是烟草。

本发明第六方面提供本发明第一方面所述的基因、本发明第二方面所述的重组表达载体或者本发明第三方面所述的重组细胞用于改善植物耐旱性以及用于植物育种的用途；优选地，所述植物是烟草。

本发明第七方面提供发明第一方面所述的基因编码的氨基酸序列，如 SEQ ID ΝΟ:1所示。附图说明图 1是 GhGPKl的植物表达载体 (rd29A-GhGPKl-2300)的构建流程。

图 2是 GhGPKl的植物表达载体 (rd29A-GhGPKl-2300)的质粒图。

图 3是 GhGPKl T1代转基因烟草植株（图中， T1R1 ; 右， T1R3 )和作为对照的非转基因烟草植株（图左， CK) 的耐旱模拟实验结果。

图 4是转基因 T1代烟草植株和非转基因对照植株在转录水平上的蛋白表达验证结果。具体实施方式

下面结合非限制性实施例对本发明进行进一步说明。实施例 1、干旱胁迫下棉花 SSH文库构建：

具体方法为：

利用 Clontech公司的 PCR-selectTM cDNA Subtraction Kit 所示的方法通过抑制差减杂交方法构建差减文库。在实验过程中以干旱处理的棉花幼苗的叶子的 mRNA作为样本（tester), 以未处理的棉花幼苗的叶子的 mRNA作为对照（driver)。具体步骤简述如下：

( 1 ) 供试材料：

冀棉 14 (国家棉花中期库，获取单位中国棉花研究所，统一编号： ZM-30270) 播种到灭过菌的蛭石上，在 25°C、光周期 16h/8h条件下培养，每周浇 1/2MS培养基（9· 39 mM KN03, 0. 625 mM KH2P04, 10. 3 mM NH4N03, 0. 75 mM MgS04, 1. 5 mM CaC12, 50 μ Μ KI , 100 μ Μ H3B03, 100 μ Μ MnS04, 30 μ M ZnS04, 1 μ Μ Na2Mo04, 0. Ι μ Μ CoC12, 100 μ M Na2EDTA, 100 μ Μ FeS04) 一次。当苗株高达 25_30cm时用于实验。

( 2 ) 材料处理：

将供试幼苗分为 2组，每组 4盆，每盆 1株。第一组为对照组，在 25°C、光照培养，正常浇灌。第二组为干旱处理组， 25°C、光照培养，停止浇灌，处理 10天，处理完毕后及时剪取两组幼苗顶端 1/3 的叶片，用液氮迅速冷冻后，于 -70°C冰箱中保存。

( 3 ) 总 RNA提取：

分别取对照组和干旱处理组的棉花叶子 0. 5g，用植物 RNA 提取试剂盒 ( invitrogen)提取棉花的总 RNA。用 HITACHI公司的紫外分光光度计 U-2001测定总 RNA在 260 nm和 280 nm的吸光度值， 0D260/0D280比值为 1. 8-2· 0，表明总 RNA 纯度较高，用 1. 0%的琼脂糖凝胶电泳检测总 RNA的完整性， 28S条带的亮度约为 18S 条带的 2倍，表明 RNA的完整性良好。使用 Qiagen 公司的 Ol igotex mRNA 纯化试齐 [^ (purification of polyA+ RNA from total RNA)分离 mRNA。

( 4) 抑制消减杂交：

为了增加获得表达序列标签 ( Expressed sequence tag, EST) (unigene)的有效性，避免基因无酶切位点及所获得序列在非翻译区。本实验室用 Rsal， Hael l l 分别对双链 cDNA (按照消减试剂盒中记载的方案，由 mRNA逆转录获得）进行消化，做两组抑制差减，其他步骤及方法按 Clontech 公司的 PCR-select™ cDNA Subtraction Kit试剂盒所示的方法进行抑制消减杂交，最后合并两组两组正向消减杂交 cDNA片段的第二次 PCR产物。

( 5 ) cDNA消减文库的构建与初步筛选、克隆、鉴定

正向消减杂交 cDNA片段的第二次 PCR产物（QIAquick PCR Purification Kit 纯化，购自 Qiagen) 与 pGEM-T Easy (购自 Promega试剂盒）载体连接，依照 pGEM_T Easy试剂盒的程序，具体步骤如下：用 200 μ 1 PCR管依次加入下列成分：纯化的正向差减杂交 cDNA片段的第二次 PCR产物 3 μ 1， Τ4连接酶缓冲液 5 μ 1， pGEM-T Easy载体 1 μ 1， Τ4 DNA连接酶 1 μ ΐ ，于 4 °C连接过夜。取 10 μ L连接反应产物，加入到 100 μ L感受态大肠杆菌 JMI09 (购自 TAKARA)中，冰浴 30 min, 热休克 60 s、冰浴 2 min,另加 250 μ L LB培养液（1% Tryptone购自 0X0ID, 0. 5% Yeast Extract购自 0X0ID, 1% NaCl购自国药）置 37°C水浴中，以 225 r/min振荡培养 30 min, 取 200 μ L菌液种植于含 50 μ g/mL氨苄青霉素的 LB (同上） /X-gal/IPTG (X-gal/IPTG购自 TAKARA) 培养板上， 37°C培育 18 h。计数培养板中直径〉 1 mm 的清晰白色及蓝色菌落数，随机挑取 360个白色菌落 (编号： Gh-D001至 Gh-D360)。将所有白色克隆挑于含有 50 g/mL氨苄青霉素的 LB 液体培养基的 96 孔细胞培养板 (CORNING)中， 37°C培养过夜后加甘油至终浓度 20%, 于 - 80°C保存备用。以巢式 PCR 引物 Primer 1 和 Primer 2R ( Clontech 公司的 PCR-selectTM cDNA Subtraction Kit试剂盒自带）进行菌液 PCR扩增，得到 292个阳性克隆，对所有阳性克隆在送英潍捷基（上海）贸易有限公司测序

( 6 ) 差异克隆的 cDNA测序分析：

将 DNA 测序结果去除载体和不明确序列及冗余的 cDNA 后，共得到 180 个

EST (unigene)。经 BlastN发现其中 102条 unigene 在 GenBank 中有同源序列（蛋白同源性 50%以上）， 33条 EST功能未知或者为假定蛋白，另有 45条未获得同源匹配，推测可能是处于 3 '、 5 ' 末端非翻译区的较短序列。实施例 2 棉花蛋白激酶类编码基因 GhGPKl的克隆

克隆子 Gh-D193去掉冗余 DNA后，序列为 SEQ ID No : 3，序列分析表明该序列的编码的氨基酸序列属于促分裂原活化蛋白激酶，本文将克隆子 Gh-D193编码的全长基因命名为 GhGPKl , 对应的蛋白命名为 GPK1。

SEQ ID No: 3

1 ACACTAAACA ACTTTTGTTG GGACTGGAAT ATCTTCACAA AAATAGAATC GTGCATAGAG

61 ACATCAAGGG AGCAAACATT CTTGTGGATA ACAAGGGTTG TATCAAACTT GCAGACTTTG

121 GTGCATCCAA AAAAGTTGTC GAGTTGGCTA CAATAAATGG AGCCAAGTCA ATGAAGGGAA 181 CTCCTTATTG GATGGCTCCT GAAGTTATTC TCCAAACTGG GCATAGCTTC TCTGCCGATA 241 TTTGGAGTGT TGGCTGT

GhGPKl全长基因的克隆

根据已经获得的 Gh-D193基因片段，设计两条特异性引物，作为 3 ' RACE的 5 ' 端特异性引物。

GhGPKl GSP1 : SEQ ID NO : 4：

ACTTTTGTTGGGACTGGAAT AT

GhGPKl GSP2: SEQ ID NO : 5：

CAAAAATAGAATCGTGCATAGAG

实验步骤按试剂盒说明书操作（3 ' RACE System for Rapid Ampl ification of cDNA Ends试剂盒购自 invitrogen公司）

用 SEQ ID NO : 4与 3 ' 端引物 AUAP (试剂盒自带），以 mRNA逆转录的 cDNA为模板进行第一轮 PCR扩增。具体步骤如下： Ex Taq 购自 TAKARA, 50 μ 1 PCR反应体系： 5 μ 1 lO X Ex Buffer, 3 μ 1 2. 5 mM的 dNTP， 2. 0 μ 1 mRNA反转录的 cDNA, 1. 0 μ 1 Ex Taq 10 μ M的引物 SEQ ID NO : 4和 AUAP各 2. 0 μ 1，以及 35 μ 1 的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min, 94 °C 变性 30 s， 58°C退火 30 s， 72 °C 延伸 2 min, 33个循环后， 72°C 延伸 10 min。

所得的 PCR产物用双馏水稀释 50倍后取 2. 0 μ 1作为模板，用 SEQ ID NO : 5 与 3 ' 端引物 AUAP进行第二轮 PCR扩增，具体步骤如下： 50 μ 1 PCR反应体系： 5 μ 1 10 X Ex Buffer, 3 μ 1 2. 5 mM的 dNTP， 2. 0 μ 1稀释的第一轮 PCR产物， 1. 0 μ 1 Ex Taq 10 μ Μ的引物 SEQ ID NO : 5和 AUAP各 2. 0 μ 1，以及 35 μ 1的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min, 94 °C 变性 30 s， 58°C退火 30 s， 72 °C 延伸 2min， 33个循环后， 72°C 延伸 10 min。第二次 PCR产物回收片段约为 1600bp 条带 (Gel Extraction Kit购自 OMEGA) 连接于 pGEM- T Easy Vector, 转化到大肠杆菌 JM109 (具体方法同上），随机挑取 10个白色菌落于含有 50 μ g/mL氨苄青霉素的 LB 液体培养基中培养， 37°C培养过夜后加甘油至终浓度 20%， -80°C保存备用。 SEQ ID NO : 5与 3 ' 端引物 AUAP进行菌液 PCR扩增，得到 3个阳性克隆，送英潍捷基（上海）贸易有限公司测序测序，获得该基因的 cDNA的 3 ' 端。

根据已经获得的 GhGPKl基因片段，设计三条特异性引物，作为 5 ' RACE的 3 ' 端特异性引物。

GhGPKl GSP3: SEQ ID NO : 6：

TATCGGCAGAGAAGCTATGC

GhGPKl GSP4: SEQ ID NO : 7：

GAATAACTTCAGGAGCCATCC

GhGPKl GSP5: SEQ ID NO : 8：

TTCCCTTCATTGACTTGGCTCC

实验步骤按试剂盒说明书操作（5 ' RACE System for Rapid Ampl ification of cDNA Ends试剂盒购自 invitrogen公司）。

用 SEQ ID NO: 7与 5 ' 通用引物 AAP (试剂盒自带），以 mRNA逆转录的 cDNA (反转录引物 SEQ ID NO : 6 ) 为模板进行第一轮 PCR扩增，具体步骤如下： Ex Taq 购自 TAKARA, 50 μ 1 PCR反应体系： 5 μ 1 ΙΟ Χ Εχ Buffer, 3 μ 1 2· 5 mM的 dNTP， 2. 0 μ 1 mRNA反转录的 cDNA, 1. 0 μ 1 Ex Taq 10 μ M的引物 SEQ ID NO : 7和 AAP各 2. 0 μ 1，以及 35 μ 1的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min, 94 °C 变性 30 s， 55°C退火 30 s， 72 °C 延伸 2min， 33个循环后， 72°C 延伸 10 min。所得的 PCR产物用双蒸水稀释 50倍后取 2. 0 μ 1作为模板，用 SEQ ID Ν0 : 8与 3 ' 端引物 AUAP进行第二轮 PCR扩增，具体步骤如下：50 μ 1 PCR反应体系：5 μ 1 ΙΟ Χ Εχ Buffer, 3 μ 1 2. 5 mM的 dNTP， 2. 0 μ 1稀释的第一轮 PCR产物， 1. 0 μ 1 Ex Taq 10 μ Μ的引物 SEQ ID NO : 8和 AUAP各 2. 0 μ 1，以及 35 μ 1的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min, 94 °C 变性 30 s， 58°C退火 30 s， 72 °C 延伸 2 min, 33个循环后， 72°C 延伸 10 mino 第二次 PCR产物回收片段约为 800bp条带（Gel Extraction Kit购自 OMEGA) 连接于 pGEM- T Easy Vector, 转化到 JM109 (具体方法同上)，随机挑取 10个白色菌落于含有 50 μ g/mL氨苄青霉素的 LB 液体培养基中培养， 37°C培养过夜后加甘油至终浓度 20%， -80°C保存备用。 SEQ ID N0 : 8与 3 ' 端引物 AUAP进行菌液 PCR扩增（反应体系及反应条件同上），得到 4个阳性克隆，送英潍捷基（上海）贸易有限公司测序测序，获得该基因的 cDNA的 5 ' 端。

所得的 5 ' RACE产物克隆测序后，与 3 ' RACE产物测序结果拼接。获得 GhGPKl 全长 cDNA序列 SEQ ID NO : 19。

SEQ ID NO : 19：

1 ACCTCCAAAT CTTTAAGCAA ACGGATCTGA AGAAAGAAGA TTTTTGTACT CTAAATGCAG

61 GAGCTTGTTG GATCGGTTCG CCGGTCCTTT GTCTTTAGGT CTTCAACCTC CAGCGACGAT

121 GCCGGTGGAG GACTTGGAGG CTTTGTTGAG AAGATCGGCG CCAGCATTCG CAGATCGCGA

181 ATCGGCTTGT TCGCTAAGCC ACCTGCTCCA CCCGCTCTTC CTTCTGTTAA GAAAAGGGAC

241 GCTACGATCC GGTGGCGGAA GGGCGAGTTG ATTGGTTGTG GCGCCTTTGG TCGGGTTTAC

301 ATGGGGATGA ATCTTGACTC CGGCGAGTTA CTAGCTGTTA AACAGGTTTT GATAGCGGCA

361 AATGCTTCAA AGGAGAAAAC ACAGGCTCAT ATTAGAGAGC TCGAAGAAGA AGTGAAGCTT

421 CTACAGAATC TGTCACATCC AAACATTGTT AGATATTTGG GCACCGCAAG AGAGGACGAT

481 TCGTTGAATA TTCTATTGGA GTTTGTACCA GGTGGATCCA TTTCCTCACT TTTGGGGAAG

541 TTTGGATCTT TCCCCGAATC TGTTATAAGA ATGTACACTA AACAACTTTT GTTGGGACTG

601 GAATATCTTC ACAAAAATAG AATCGTGCAT AG AG AC AT C A AGGGAGCAAA CATTCTTGTG

661 GATAACAAGG GTTGTATCAA ACTTGCAGAC TTTGGTGCAT CCAAAAAAGT TGTCGAGTTG

721 GCTACAATAA ATGGAGCCAA GTCAATGAAG GGAACTCCTT ATTGGATGGC TCCTGAAGTT

781 ATTCTCCAAA CTGGGCATAG CTTCTCTGCC GATATTTGGA GTGTTGGCTG TACTGTGATT

841 GAGATGGCTA CTGGAAAGCC CCCTTGGAGC CAACAGTATC AGGAGGTTGC TGCTCTCTTT

901 CATATTGGGA CAACTAAATC TCATCCACCC ATCCCTGAGC ATCTCTCCCC TGAGGCTAAA

961 GACCTTTTGT TAAAATGCCT ACAGAAGGAA CCAGGACTGA GACCTAGTGC ATCAGACTTG

1021 CTTCAGCACC CTTTTGTCAC TGGGGACTAT CAGGAACCTC ATGCGGTGCT TCGTAGATCA

1081 ATTAGGGAAC CTGAAAATCT GGAGATGGCA TCTGGGGTGA ACCTGAGAAG CTCAATAAAT

1141 TCGGAGATCA GGTCAACCTG CACGGGTTTA AAGGACGTTT GTGAAATGGG TAGTGTGAGT

1201 TGCTCTACAG CATTTCTTGG GAAATTCTCA GAACCAGGAG CCTATTGGAG GGGAAGCAAT

1261 TGTGACAATA GCATGTGTGA G AT AG AT G AC AAAGATGATC TAGAATTTAA TTATTCTGTA

1321 AAGTTCTCCT CTGTTTTATC ATCTGCTGAC TTGAATAAAA GTTTCAATCC CATGTGTGAA

1381 CCCACTGAAG ACTGGCCACC CAAATTAGAT CAAAGTTCTG AGCTAAGCCG AAGTGGAGTA

1441 AACTTGTCTT TGGATGAAAC AATGGAAGCT GCTAGCACTC CTGGAATGTC TGGTAAGGAG

1501 GAGAATGGCT TCACTTTTCT CTGCGGACCT CCAACAGGTG AT GAT GAT G A AGAAGTTACA

1561 GAGTCAAAAA TTAGAGCCTT CCTGGATGAA AAGGCTCTGG AACTGAAGAA GCTGCAATCT 1621 CCTCTGTATG AACAGTTCTA CAACACATTG AATGGTAGTC TTCCACCTTC TGTTGGAACT 1681 GCAAATGGTG AAAATATTTT GAGCTTACCT CCTAAAAGTA GGTCACCTAA GTGGCTGCCT 1741 AGCAGAAGAC TCTCAGCAGT TGCTGATGCT GCCAACATGG TTAGCTCAAA GAGTCGTATG 1801 AATCATTTGT CAAATACTGC AGTTGTTCAT GACCGGACTT TACAAGAAAT TCAGCCACCG 1861 TCTGTTGAGG AATGGAAAGG GCAGGATATA ATTAGTCCGA GCATGAGCTT TTCTGAGAGA 1921 CAAAGGAGAT GGAAGGAAGA GCTTGACCAA GAGCTTGAGA GAAAGCGAGA GATGCTGCGG 1981 AAGACATCAT CTCCAAAGGA TAAGTTTCTA TTTGGACAAA GAGAACAAAT ACGGTCTCCA 2041 TTTCCTGGCA AGTAAATGTA GTATCCAACT TTACCTCTTT TGATGTTCCA TTGGGACTGT 2101 TCATTTCTGT ATTCTATTTT TGGTGAGAAT GGTGCCCAAT AATGTTACTC GGGCTTTATT 2161 TATGAGTGTC AGATACGAAT ATGTATTTGA TATGAGTATA TTTAATTTTT TTTCTTTTTT 2221 TTTTTTGCTT GTATAAAGTT CTTTCATATT TGTGGAAGAT ATTTGGGAGA GCCAAAAAAA 2281 AAAAAAAAAA AAA 根据 GhGPKl全长 cDNA序列设计一对引物如下:

GhGPKF: SEQ ID NO : 9：

ATGCAGGAGCTTGTTGGATCGG

GhGPKR: SEQ ID NO : 10：

TTACTTGCCA GGAAATGGAG ACCG

通过 SEQ ID NO : 9和 SEQ ID NO : 10来克隆 GhGPKl全长。

采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶，以棉花的 cDNA为模板进行 PCR反应。 50 μ 1 PCR反应体系： 10 μ 1 5 X PS Buffer, 3 μ 1 2. 5 mM的 dNTP， 2. 0 μ 1 cDNA, 1. 0 μ 1 PrimeSTAR、 10 μ Μ的引物 SEQ ID NO : 9和 SEQ ID NO : 10各 2· 0 μ 1，以及 30 μ ΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min, 94 °C 变性 30 s， 58°C退火 30 s， 72°C 延伸 2min， 33个循环后， 72°C 延伸 10 min。

PCR扩增产物加 A尾： PCR产物加 2. 5倍的无水乙醇， _20°C放置 10分钟，离心，去上清，晾干，用 21 μ ΐ双蒸水溶解。加入 2. 5 μ ΐ 10 X Ex Buffer, 0. 5 μ 1 5 mM的 dATP ， 2. 5 μ ΐ ΙΟ Χ Εχ Taq₀ 反应条件： 70°C反应 30分钟。将得到约 1900 bp的 DNA片段回收（Omega回收试剂盒），连接至 pGEM T-easy载体上，转化 JM109 (方法同上），随机挑取 10个白色菌落于含有 50 g/mL氨苄青霉素的 LB 液体培养基中培养， 37°C培养过夜后加甘油至终浓度 20%, _80°C保存备用。 SEQ ID NO : 9与 SEQ ID NO : 10进行菌液 PCR扩增（反应体系及反应条件同上），得到 4个阳性克隆，送至英潍捷基（上海）贸易有限公司测序，序列为 SEQ ID NO : 2。 GPKl蛋白的氨基酸序列： SEQ ID NO: 1

1 MQELVGSVRR SFVFRSSTSS

21 DDAGGGLGGF VEKIGASIRR

41 SRIGLFAKPP APPALPSVKK

61 RDATIRWRKG ELIGCGAFGR

81 VYMGMNLDSG ELLAVKGVL工

101 AANASKEKTQ AHIRELEEEV

121 KLLQNLSHPN 工 VRYLGTARE

141 DDSLNILLEF VPGGSISSLL

161 GKFGSFPESV 工 RMYTKGLLL

181 GLEYLHKNRI VHRDIKGANI

201 lA/DNKGCIKL ADFGASKKW

221 ELATINGAKS MKGTPYWMAP

241 EVILQTGHSF SADIWSVGCT

261 VIEMATGKPP WSQQYQEVAA

281 LFHIGTTKSH PPIPEHLSPE

301 AKDLLLKCLQ KEPGLRPSAS

321 DLLQHPFVTG DYQEPHAVLR

341 RSIREPENLE MASGVNLRSS

361 工 NSEIRSTCT GLKDVCEMGS

381 VSCSTAFLGK FSEPGAYWRG

401 SNCDNSMCEI DDKDDLEFNY

421 SVKFSSVLSS ADLNKSFNPM

441 CEPTEDWPPK LDQSSELSRS

461 GVNLSLDETM EAASTPGMSG

481 KEENGFTFLC GPPTGDDDEE

501 VTESKIRAFL DEKALELKKL

521 QSPLYEQFYN TLNGSLPPSV

541 GTANGEN工: LS LPPKSRSPKW

561 LPSRRLSAVA DAANMVSSKS

581 RMNHLSNTAV VHDRTLQEIQ

601 PPSVEEWKGQ DIISPSMSFS 621 ERQRRWKEEL DQELERKREM

641 LRKTS SPKDK F LFGQREQIR

661 SPFPGK*

GhGPKl编码基因的核苷酸序列： SEQ ID NO: 2

1 ATGCAGGAGC TTGTTGGATC GGTTCGCCGG TCCTTTGTCT TTAGGTCTTC AACCTCCAGC

61 GACGATGCCG GTGGAGGACT TGGAGGCTTT GTTGAGAAGA TCGGCGCCAG CATTCGCAGA

121 TCGCGAATCG GCTTGTTCGC TAAGCCACCT GCTCCACCCG CTCTTCCTTC TGTTAAGAAA

181 AGGGACGCTA CGATCCGGTG GCGGAAGGGC GAGTTGATTG GTTGTGGCGC CTTTGGTCGG

241 GTTTACATGG GGATGAATCT TGACTCCGGC GAG TT AC TAG CTGTTAAACA GGTTTTGATA

301 GCGGCAAATG CTTCAAAGGA GAAAACACAG GCTCATATTA GAGAGCTCGA AGAAGAAGTG

361 AAGCTTCTAC AGAATCTGTC ACATCCAAAC ATTGTTAGAT ATTTGGGCAC CGCAAGAGAG

421 GACGATTCGT TGAATATTCT ATTGGAGTTT GTACCAGGTG GATCCATTTC CTCACTTTTG

481 GGGAAGTTTG GATCTTTCCC CGAATCTGTT ATAAGAATGT ACACTAAACA ACTTTTGTTG

541 GGACTGGAAT ATCTTCACAA AAATAGAATC GTGCATAGAG ACATCAAGGG AGCAAACATT

601 CTTGTGGATA ACAAGGGTTG TATCAAACTT GCAGACTTTG GTGCATCCAA AAAAGTTGTC

661 GAGTTGGCTA CAATAAATGG AGCCAAGTCA ATGAAGGGAA CTCCTTATTG GATGGCTCCT

721 GAAGTTATTC TCCAAACTGG GCATAGCTTC TCTGCCGATA TTTGGAGTGT TGGCTGTACT

781 GTGATTGAGA TGGCTACTGG AAAGCCCCCT TGGAGCCAAC AGTATCAGGA GGTTGCTGCT

841 CTCTTTCATA TTGGGACAAC TAAATCTCAT CCACCCATCC CTGAGCATCT CTCCCCTGAG

901 GCTAAAGACC TTTTGTTAAA ATGCCTACAG AAGGAACCAG GACTGAGACC TAGTGCATCA

961 GACTTGCTTC AGCACCCTTT TGTCACTGGG GACTATCAGG AACCTCATGC GGTGCTTCGT

1021 AGATCAATTA GGGAACCTGA AAATCTGGAG ATGGCATCTG GGGTGAACCT GAGAAGCTCA

1081 ATAAATTCGG AGATCAGGTC AACCTGCACG GGTTTAAAGG ACGTTTGTGA AATGGGTAGT

1141 GTGAGTTGCT CTACAGCATT TCTTGGGAAA TTCTCAGAAC CAGGAGCCTA TTGGAGGGGA

1201 AGCAATTGTG ACAATAGCAT GTGTGAGATA GATGACAAAG AT GAT C TAG A ATTTAATTAT

1261 TCTGTAAAGT TCTCCTCTGT TTTATCATCT GCTGACTTGA ATAAAAGTTT CAATCCCATG

1321 TGTGAACCCA CTGAAGACTG GCCACCCAAA TTAGATCAAA GTTCTGAGCT AAGCCGAAGT

1381 GGAGTAAACT TGTCTTTGGA TGAAACAATG GAAGCTGCTA GCACTCCTGG AATGTCTGGT

1441 AAGGAGGAGA ATGGCTTCAC TTTTCTCTGC GGACCTCCAA CAGGTGATGA TGATGAAGAA

1501 GTTACAGAGT CAAAAATTAG AGCCTTCCTG GATGAAAAGG CTCTGGAACT GAAGAAGCTG

1561 CAATCTCCTC TGTATGAACA GTTCTACAAC ACATTGAATG GTAGTCTTCC ACCTTCTGTT

1621 GGAACTGCAA ATGGTGAAAA TATTTTGAGC TTACCTCCTA AAAGTAGGTC ACCTAAGTGG 1681 CTGCCTAGCA GAAGACTCTC AGCAGTTGCT GATGCTGCCA ACATGGTTAG CTCAAAGAGT

1741 CGTATGAATC ATTTGTCAAA TACTGCAGTT GTTCATGACC GGACTTTACA AGAAATTCAG

1801 CCACCGTCTG TTGAGGAATG GAAAGGGCAG GATATAATTA GTCCGAGCAT GAGCTTTTCT

1861 GAGAGACAAA GGAGATGGAA GGAAGAGCTT GACCAAGAGC TTGAGAGAAA GCGAGAGATG

1921 CTGCGGAAGA CATCATCTCC AAAGGATAAG TTTCTATTTG GACAAAGAGA ACAAATACGG

1981 TCTCCATTTC CTGGCAAGTA A 实施例 3 GhGPKl基因植物表达载体构建

选择植物双元表达载体 PCAMBIA2300 (购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）作为植物表达载体，用 Pnos启动子替换 ΝΡΤΠ基因含双增强子的 35S启动子，以降低 ΝΡΤΠ蛋白在植物中的表达。选择诱导型启动子 rd29A及 Tnos作为 GhGPKl 基因的启动子和终止子。

用引物 SEQ ID NO: 11和 SEQ ID NO: 12以植物表达载体 PBI 121 (购自北京华夏远洋科技有限公司）为模板扩增 Pnos, 采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶。 50 lPCR反应体系： 10 μ 15XPSBuffer， 3 μ 12· 5 mM的 dNTP， 1· 0 μ 1 PBI121, 1.0 μ 1 PrimeSTAR, 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 11和 SEQ ID NO: 12各 2.0 μ 1，以及 31 μΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min, 94 °C 变性 30 s， 56 °C 退火 30 s， 72 °C 延伸 30s， 33个循环后， 72°C 延伸 10min。通过 EcoRI、 Bglll 酶切连接到 PCAMBIA2300 (promega, T4 连接酶盒）获得 pCAMBIA2300_l。

SEQ ID NO: 11 ：

GCACGAATTCATACAAATGGACGAACGGAT SEQ ID NO: 12：

ATCCAGATCTAGATCCGGTGCAGATTATTTG

SEQ ID NO: 13和 SEQ ID NO: 14以 PBI121为模板扩增 Tnos, 采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶。 50 μ 1 PCR反应体系： 10 μ 15XPS Buffer, 3 μ 12.5 mM的 dNTP， 1.0 μ 1 PBI121, 1.0 μ 1 PrimeSTAR, 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 13 和 SEQ ID NO: 14各 2.0 μ 1，以及 31 μ 1的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min, 94 °C 变性 30 s， 58°C退火 30 s， 72 °C 延伸 30 s， 33个循环后， 72°C 延伸 10 mine 通过 Kpnl、 EcoRI酶切连接到 pCAMBIA2300-l (promega T4 连接酶盒）获得 pCAMBIA2300-2

SEQ ID NO: 13：

AAG ^7¾i76GAATTTCCCCGATCGTTCAAA SEQ ID NO : 14：

TCA GAA mCCAGTGAATTCCCGATCTAGTA

SEQ ID NO : 15 和 SEQ ID NO : 16 以拟南芥（哥伦比亚型，购自 www. arabidopsis. org) DNA为模板扩增拟南芥 rd29A启动子（参考 Zeng J. , et L. 2002, Preparation of total DNA from "recalcit rant plant taxa" , Acta Bot. Sin. , 44 (6)： 694-697 中的方法提取拟南芥 DNA)。采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA 聚合酶。 50 μ 1 PCR反应体系： 10 μ 1 5 X PS Buffer, 3 μ 1 2. 5 mM的 dNTP， 1. 0 μ 1 拟南芥 DNA， 1. 0 μ 1 PrimeSTAR, 10 μ Μ的引物 SEQ ID NO : 15和 SEQ ID NO : 16各 2. 0 μ 1，以及 31 μ ΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min， 94 °C 变性 30 s， 58°C退火 30 s， 72 °C 延伸 30 s， 33个循环后， 72°C 延伸 10 min。通过 HindIII、 Sail酶切连接到（连接方法同上） pCAMBIA2300-2获得 pCAMBIA2300_3

SEQ ID NO : 15：

ACTAAGCTTCCTTCTTGACATCATTCAATTTTA

SEQ ID NO : 16：

TGAi7 O¾CTCCAAAGATTTTTTTCTTTCCAATAG

SEQ ID NO : 17禾口 SEQ ID NO : 18扩增 GhGPKl (模板是实施例 2所获得 GhGPKl )，采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶。50 μ ΐ PCR反应体系：10 μ 1 5 X PS Buffer, 3 μ 1 2. 5 mM的 dNTP， 1. 0 μ 1 GhGPKl -pGEM, 1. 0 μ 1 PrimeSTAR、 10 μ Μ的引物 SEQ ID NO : 17和 SEQ ID NO : 18各 2. 0 μ 1，以及 31 μ 1的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min, 94 °C 变性 30 s， 58°C退火 30 s， 72 °C 延伸 2min， 33 个循环后， 72 °C 延伸 10 min。通过 Kpnl、 Sail 酶切连接到（连接方法同上） PCAMBIA2300-3, 获得植物表达载体 rd29A_ GhGPKl_2300。

SEQ ID NO : 17：

TGA i^nATGCAGGAGCTTGTTGGATCGG

SEQ ID NO : 18：

AAG i O¾CTTACTTGCCAGGAAATGGAGACCG 实施例 4 rd29A- GhGPKl-2300表达载体转化农杆菌

农杆菌 LBA4404 (购自 Biovector Science Lab, Inc) 感受态制备：提前 1-2 天将农杆菌 LBA4404在含 50 μ g/ml利福平和 50 μ g/ml链霉素的 LB固体培养基上划单斑接种， 28°C培养 1至 2天。挑取单菌落接种于 5 ml含 50 μ g/ml利福平和 50 μ g/ml链霉素的 LB液体培养基中，28°C下摇动培养过夜（约 12-16 h)至 0D600 值为 0. 4，形成种子菌液。取 5 ml活化后的菌液（1 : 20的比例）接种于 100 ml同样浓度抗生素的 LB液体培养基中， 28°C摇动培养 2-2. 5 h至 0D₆。。=0. 8。冰浴菌液 10 min, 每隔 3 min摇匀一次，令细菌均匀进入休眠状态。于 4°C下 4000 g离心 10 min, 弃上清液；加入一定量预冷 10%甘油重悬浮菌体， 4°C下 4000 g离心 10 min, 收集沉淀；用 10%甘油重复洗 3-4次；加入适量冰浴预冷的 10%甘油重新悬浮细菌沉淀，以 40 μ ΐ/管将其分装，于 -70°C保存备用。

转化农杆菌：在冰上融化感受态细胞，往 40 μ 1 的感受态细胞中加入 1 μ 1 的质粒，混匀后冰浴约 10 min。将感受态和 DNA的混合物用枪转移到预冷的电击杯中，轻敲使悬浮液到达底部，注意不要有气泡。将电击杯（购自 bio-rad) 放到电击室的滑道上，推动滑道将电击杯放至电击室基座电极处。使用 0. lcm的电击杯的时候， MicroPulser (购自 bio-rad) 的程序设置为 "Agr" ，电击一次。立即取出电击杯，加入 28°C预热的 LB培养基。快速而轻柔的用枪将细胞打匀。将悬浮液转入 1. 5 ml的离心管， 28°C， 225 rpm培养 1 h。取 100〜200 μ 1的菌液涂布与相应的抗性筛选培养基平板上（LB固体培养基，含 50 μ g/ml利福平、 50 μ g/ml链霉素、 50 μ g/ml卡那霉素）， 28°C培养。实施例 5 利用农杆菌介导的转化法获得转基因烟草

用 75%酒精浸泡烟草种子（国家烟草中期库，获取单位：中国农科院烟草所，库编号 I5A00660) 30 s，用灭菌双蒸水洗两次。再用 0. 1%升汞浸泡 8 min, 用灭菌双蒸水洗两次，完成表面灭菌。将表面灭菌的烟草种子置于 MS ( 18. 78 mM KN0₃, 1. 25 mM KH₂P0₄, 20. 6 mM NH₄N0₃, 1. 5 mM MgS0₄, 3. 0 mM CaCl₂, 50 μ M KI , 100 μ M H3BO3 , 100 M MnS0₄ , 30 μ M ZnS0₄, 1 μ M Na₂Mo0₄, 0. 1 μ M CoCl₂， 100 μ M N¾EDTA, 100 μ Μ FeS0₄， 7. 4 g/L琼脂，蔗糖 30 g/L) 上于无菌条件下发芽，制备无菌苗。取无菌苗叶片剪成 5 mmX 5 mm 大小的叶盘，用处于对数生长期的含表达载体 rd29A-GhGPKl-2300的农杆菌浸染叶盘 10 min, 吸干菌液，在黑暗条件下共培养 2 天（MS培养基）。将叶片转到分化培养基（MS+1 mg/L细胞分裂素（BA) +0. 1 mg/L 萘乙酸 (麵 +50 mg/L卡那霉素 +500 mg/L头孢霉素）上，光照条件下培养 45天左右，待芽长大后切下转移到生根培养基（MS+50 mg/L卡那霉素 +500 mg/L头孢霉素）中培养 30天左右，待根系发达后将小苗转入仅加有 500 mg/L头孢霉素的 MS 培养基上进行编号保存。

取获得的转基因烟草叶片，提取 DNA (同实施例 3中拟南芥 DNA提取方法），用 SEQ ID NO : 9：和 SEQ ID NO : 10 ( 50 μ 1 PCR反应体系： 5 μ 1 ΙΟ Χ Εχ Buffer, 3 μ 1 2· 5 mM的 dNTP， 2. 0 μ 1 DNA, 1. 0 μ 1 Ex Taq 10 μ M的引物 SEQ ID NO : 9和 SEQ ID NO : 10各 2. 0 μ 1，以及 35 μ 1的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min, 94 °C 变性 30 s， 58°C退火 30 s， 72 °C 延伸 2 min, 33个循环后， 72 V 延伸 10 min), PCR鉴定，保存阳性植株进行编号 T。R1_T。R20。实施例 6 过表达 GhGPKl转基因烟草 T1的耐旱模拟实验及功能鉴定

灭过菌的蛭石用 1/2MS培养基浸透。 T。R1-T。R20及对照烟草种子分别播种在蛭石上，每盆播种 15颗种子， 25°C、 10小时光培养 /14小时暗培养循环，每 5天浇一次 1/2MS, 培养 25天之后，每盆保留大小较一致的 4-5棵苗，做干旱实验，转基因烟草、对照烟草干旱 14天 (不浇水）， 25°C、 10小时光培养 /14小时暗培养循环。 T1 代转基因植株（TO代转基因植株的种子长成的植株）的抗旱性鉴定表明，对照植株都萎蔫严重，而 1\R1、 1\R3、 1\R5、 1\R8、 1\R11、 1\R13、 TJ 6七个株系共 34 棵烟草中有 22棵能够正常生长，表现出明显的耐旱性（参见图 3，以 1\R1、 1\R3为例， 1 R5、 1 R8、 1 R11、 1 R13、 TJ 6的结果与 1 R1、 1 R3类似，在此未示出）。实施例 7 在转录水平上验证 GPK1蛋白表达

分别取对照烟草、不耐旱转基因烟草 T1代植株、耐旱转基因烟草 T1代植株（生长状况良好）干旱 14天叶子 0. 05g, 用植物 RNA提取试剂盒（invitrogen)提取的总 RNAo 用 HITACHI公司的紫外分光光度计 U- 2001测定总 RNA在 260 nm和 280 nm 的吸光度值，计算各个 RNA浓度。依照 invitrogen反转录试剂盒 Superscript I I I Reverse Transcriptase所示方法进行反转录（2 μ g总 RNA作为模板，反转录引物 SEQ ID NO : 10)。通过 SEQ ID N0 : 9和 SEQ ID NO : 10扩增 GhGPKl , 检测 GPK1蛋白相对表达情况。采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶，以反转录的 cDNA为模板进行 PCR反应。 50 μ 1 PCR反应体系： 10 μ ΐ 5 X PS Buffer, 3 μ 1 2. 5 mM的 dNTP, 2. 0 μ 1 cDNA, 1. 0 μ 1 PrimeSTAR, 10 μ Μ的引物 SEQ ID NO : 9禾卩 SEQ ID NO : 10各 2. 0 μ 1，以及 30 μ ΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min， 94 °C 变性 30 s， 58°C退火 30 s， 72 °C 延伸 lmin， 29个循环后， 72°C 延伸 10 min。产物电泳结果如图 4所示： M为 DNA Ladder Marker (DL2000,购自深圳瑞真生物技术有限公司）， 1-5为对照烟草， 6-18为耐旱转基因烟草 T1代植株， 19-24为不耐旱转基因烟草 T1代植株。图中所示条带大小与 GhGPKl-1基因的大小一致。结果表明对照烟草没有转录 GhGPKl的 mRNA，耐旱转基因烟草 T1代植株对 GhGPKl的转录较强，不耐旱转基因烟草 T1代植株没有转录或转录很弱。

Claims

权利要求书

1. 棉花的一个蛋白激酶编码基因，其序列为 SEQ ID NO: 2。
2. 一种重组表达载体，其含有权利要求 1所述基因的核苷酸序列并且所述核苷酸序列与所述表达载体的表达控制序列可操作地连接。
3. 权利要求 2所述的载体，其为附图 2所示的 rd29A-GhGPKl-2300载体。
4. 一种重组细胞，其含有权利要求 1所述基因的核苷酸序列或者权利要求 2或 3所述的重组表达载体；优选地，所述重组细胞为重组农杆菌细胞。
5. 一种改善植物耐旱性的方法，包括：将权利要求 1所述基因的核苷酸序列或者权利要求 2或 3所述的重组表达载体导入植物或植物组织并使所述基因表达；优选地，所述植物是烟草。
6. 一种制备转基因植物的方法，包括：在有效产生植物的条件下培养含有权利要求 1所述基因的核苷酸序列或者权利要求 2或 3所述的重组表达载体的植物或植物组织。
7. 权利要求 6所述的方法，其中所述植物是烟草。
8. 权利要求 1所述的基因、权利要求 2或 3所述的重组表达载体或者权利要求 4所述的重组细胞用于改善植物耐旱性以及用于植物育种的用途。
9. 权利要求 8所述的用途，其中所述植物是烟草。
10. 权利要求 1所述的基因编码的蛋白，如 SEQ ID NO: 1所示。