CN108642204A - 一个抗小麦黄花叶病QTL QYm.nau-5A.1的SNP标记引物组合及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一个抗小麦黄花叶病QTL QYm.nau‑5A.1的SNP标记引物组合及其应用。一个抗小麦黄花叶病QTL QYm.nau‑5A.1紧密连锁的分子标记引物组合，由SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.所示的四条引物组成。在作图群体和自然群体，进行标记分析和抗病性的连锁或关联分析，评价该标记在选育QYm.nau‑5A.1的应用价值，表明SNP分子标记与小麦抗黄花叶病QTL QYm.nau‑5A.1紧密连锁，分子标记辅助选择的效率和准确性高。

Description

一个抗小麦黄花叶病QTL QYm.nau-5A.1的SNP标记引物组合 及其应用

技术领域

本发明属于分子遗传育种领域，公布一个基于位于小麦5AL染色体上功能基因半胱氨酸蛋白酶(Cysteine proteinase，CP)基因的单核苷酸位点多态性(SNP)，而开发的一个SNP分子标记，在生产上可用于选育抗小麦黄花叶病QTL QYm.nau-5A.1。

背景技术

危害小麦的病毒病害有16种以上。小麦病毒的传播介体主要包括昆虫和土壤真菌，其中真菌介体传播(土传)病毒病在世界各地广泛发生，经常造成严重危害。据报道，在我国小麦黄花叶病(Wheat yellow mosaic virus,WYMV)的分布较广，包括四川和陕西南部以及湖北、安徽、江苏、河南等地，为害严重。20世纪90年代以来，由于连年推广感病品种，小麦黄花叶病毒由禾谷多黏菌携带在土壤中借助于灌溉和耕作快速传播，危害有加重趋势。由于禾谷多粘菌休眠孢子囊在土壤中干燥条件下可存活数年以上，并通过农事操作、病土、病根残体、病田流水等传播，或通过带介体土壤混杂在种子里进行远距离传播，因此农艺措施和化学防治的效果不明显(Ruan et al.1991；Chen 2005)；若麦区大面积推广种植感病品种，可造成田间带毒介体大量积累，导致病害蔓延加速引起病害流行，目前小麦黄花叶病的危害面积正在不断扩大。

筛选和鉴定抗病新种质，选育和推广抗病品种是控制小麦黄花叶病的最经济、有效和环境友好的途径。在多年抗性鉴定的基础上，江苏、四川、河南等小麦病理学家和育种家合作，筛选出西风小麦、仪宁小麦、黑麦、簇毛麦等抗病资源。其中簇毛麦上的抗病基因被国际小麦基因命名委员会定名为Wss1(Zhang et al.,2015)。小麦种内的其中一个抗性主效基因被多个研究者定位于多个抗病小麦的2DL上(Liu et al.2005；Nishio etal.2010)，另外一个是被申请人所在实验室定位于西风小麦的5AL上，命名为QYm.nau-5A.1。

病毒病的发生由于涉及寄主-病毒-介体-环境等多种因素，生产上缺乏过硬的抗病品种和有效的化学防治药剂，传统的防病措施往往因为防治适期把握困难，使防治效果大打折扣。加之近年来全球变暖、免耕和机械化收割使小麦播种期提前，农村劳动力大量进城务工使田间管理粗放等众多因素,小麦病毒病发生流行的威胁正在逐步增加，造成严重的小麦产量损失。尽管上述研究都为小麦抗病毒病的分子育种奠定了坚实的基础，但在小麦抗病毒遗传育种研究中，还存在许多不容忽视的问题，限制了小麦抗病毒遗传改良的突破。目前根据国家中长期科技发展规划的要求，特别是针对粮食安全、生态安全中的重大科学和技术问题，迫切需要深入系统地开展小麦病毒病害及其防治的基础和应用基础研究，发掘、研究、利用新的高抗黄花叶病遗传资源，系统鉴定我国主栽及主要后备小麦品种的抗性水平；高效选育和推广抗病小麦新品种；利用分子生物学的研究成果，定位、分离克隆抗病毒新基因；阐明小麦抗黄花叶病的分子机制，为小麦抗病毒分子育种提供基础材料和理论依据。

由于小麦黄花叶病抗性鉴定以田间鉴定为主，抗性鉴定结果受到环境条件、病毒介体和病毒分布不均等多种因素的影响，利用分子标记技术可以高效选育和应用推广抗病小麦新品种，有效解决传统方法费时费力和表型鉴定困难等一系列难题。特别是针对目前新发掘的抗性位点，标记信息公开相对少，开发新的、简易的标记方法显得尤为重要。不断发展新的分子标记开发技术，开发新的分子标记，特别是基于基因表达序列、或基因本身序列的分子标记，对于在小麦这种多倍体物种中进行基因的精细定位尤其重要。随着测序技术的高速发展，大量的DNA序列信息被储存在公共数据库中，为利用生物信息学手段开发分子标记提供了大量的有益信息。

发明内容

本发明目的是开发一个抗小麦黄花叶病QTL QYm.nau-5A.1紧密连锁的分子标记的引物组合，在生产上直接用于选育QYm.nau-5A.1。本发明是根据前期定位的结果，在定位的5AL染色体目的区段预测一个半胱氨酸蛋白酶(Cysteine proteinase,CP)基因，根据该基因单核苷酸位点多态性(SNP)，开发了一个SNP分子标记，该标记与QYm.nau-5A.1紧密连锁。

本发明的另一目的是提供该分子标记的应用。

本发明的又一目的是提供该分子标记引物组合的应用。

为了实现该目的，本发明采用以下技术方案：

一个抗小麦黄花叶病QTL QYm.nau-5A.1紧密连锁的分子标记引物，由SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示的2条引物组成。

抗小麦黄花叶病QTL QYm.nau-5A.1紧密连锁的分子标记在特异追踪位于5AL的抗小麦黄花叶病主效QTL QYm.nau-5A.1中的应用，所述的抗小麦黄花叶病QTL QYm.nau-5A.1紧密连锁的分子标记的引物由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的2条引物组成。

所述的一个抗小麦黄花叶病QTL QYm.nau-5A.1紧密连锁的分子标记引物组合在特异追踪位于5AL的抗小麦黄花叶病主效QTL QYm.nau-5A.1中的应用。

所述的一个抗小麦黄花叶病QTL QYm.nau-5A.1紧密连锁的分子标记引物组合在鉴别由QTL QYm.nau-5A.1控制的小麦黄花叶病抗感病品种中的应用。

所述的应用，优选使用本发明所述的分子标记引物组合对小麦植株基因组DNA进行PCR扩增，在含有QYm.nau-5A.1的抗病小麦植株中能扩增出位于226bp的特征条带，在不含有QYm.nau-5A.1的植株中无法扩增出位于226bp的特征条带。

所述的一个抗小麦黄花叶病QTL QYm.nau-5A.1紧密连锁的分子标记引物组合在分子育种选育抗小麦黄花叶病品种中的应用。

本发明的分子标记通过以下方法获得：

(1)根据QYm.nau-5A.1定位结果，查找抗病位点两侧标记信息，锁定抗病基因所在的目标染色体区段。将与QYm.nau-5A.1紧密连锁的标记5EST-90和5EST-44所对应的EST序列与A基因组和D基因组的序列进行BLAST比对，在目标区域共预测出58个编码基因，结合功能注释发现其中8个可能与抗病相关。其中一个基因在NCBI中进行Blast分析，发现编码一个半胱氨酸蛋白酶(Cysteine proteinase,CP)，属于木瓜蛋白酶亚家族。我们对该基因进行了克隆和功能研究。

(2)利用目前公布的小麦基因组序列信息(IWGSC)，获取目标区段的所有注释基因，筛选一个抗病候选基因半胱氨酸蛋白酶(Cysteine proteinase,CP)基因。在抗感材料中进行克隆和比较分析SNP位点，并开发SNP标记。根据国际小麦测序组织(IWGSC)公布的中国春小麦品种的参考基因组序列，分别获得CP基因在小麦A、B和D亚组的序列，分别命名为TaCP-A，TaCP-B和TaCP-D，三个部分同源基因的结构模式图见图1，A。

设计基因全长引物(TaCP-F:ataacccacccggagaagca；TaCP-R:atcgactccaggagggctgc)。在西风小麦和镇9523的不同感病时期的混合cDNA中进行扩增，然后克隆测序。分别获得来自西风小麦和镇9523的A、B和D染色体上的拷贝，对不同材料来源5A上的等位基因进行比较分析发现了4个SNP位点，其中一个SNP位点在核苷酸355bp的位置上，为T(西风小麦)/A(镇9523)的等位变异，而这个位点在西风小麦和镇9523的B和D上的拷贝都为A(图1，B)。根据TaCP-A的第355位的SNP位点，设计基于PCR扩增两对引物组合(图2)，用于该SNP等位位点的检测(You et al.,2008)。引物组合1能特异性地扩增出来自抗病亲本西风小麦的拷贝TaCP-A(T)，片段大小为226bp(图3)，引物信息如下：5SNP-R-Fgttcctcggcttcgtgcagcggttcggg(SEQ ID NO.1)；55SNP-R-R:catctcccgcaggaacgaccgccgcga(SEQ ID NO.2)(图2)；将该标记命名为5SNP-R。引物组合2能特异性地扩增出来自感病亲本镇9523的拷贝TaCP-A，片段大小为122bp(图3)，引物信息如下：5SNP-S-F:gtccctccagtcgaagtcct(SEQ ID NO.3)；5SNP-S-R:gccggaccttcctgggcctcaagagga(SEQ ID NO.4)；将该标记命名为5SNP-S。但是该标记引物可以同时扩增西风小麦和镇9523的B和D上的拷贝，无论在感病材料还是抗病材料都可以扩增(图4，A)，因此不能用于特异性的标记进行感病材料鉴定。

(3)在作图群体和自然群体，进行标记分析和抗病性的连锁或关联分析，评价该标记在选育QYm.nau-5A.1的应用价值。用5SNP-R在标记5EST157和XWMC327之间的191个重组体中进行扩增(图4，A)。结果发现在抗病重组体中能够特异性地扩增出来自抗病亲本西风的拷贝TaCP-A，说明该SNP标记与5AL主效抗病位点共分离。为了验证此SNP标记在分子标记辅助选择5AL主效位点的有效性，我们将5SNP-R引物和两个与QYm.nau-5A.1共分离的EST标记5EST44、5EST90在42个栽培品种中扩增，结果发现其扩增结果完全一致(图4,B)。进一步将该标记用于211份育种材料的分子标记辅助选择(已经过抗性鉴定)，发现仅在抗病材料中可扩增出目标条带，进一步证明该标记可特异追踪位于5AL的抗小麦黄花叶病主效QTLQYm.nau-5A.1(图4,C)。

有益效果：

1、本发明中公开的能特异追踪小麦抗黄花叶病QTL QYm.nau-5A.1的分子标记引物，是基于功能基因的SNP位点差异设计的，可以建立功能基因与抗病位点的联系。

2、本发明中公开的能特异追踪小麦抗黄花叶病QTL QYm.nau-5A.1的分子标记方法，简单易行、方便快捷、技术稳定。

3、本发明中公开的SNP分子标记与小麦抗黄花叶病QTL QYm.nau-5A.1紧密连锁，分子标记辅助选择的效率和准确性高。

附图说明

图1、小麦半胱氨酸蛋白酶(Cysteine proteinase,CP)的3个部分同源基因的结构模式图(A)以及西风小麦和镇9523在355bp位置处(箭头指向)的单个碱基的等位变异(B)

图2、根据TaCP-A基因的第355位的SNP位点，设计两对SNP的引物组合，开发SNP分子标记过程

图3、SNP标记方法中的5SNP-R引物组合在西风小麦和镇9523中的扩增结果

图4、SNP标记方法中的四引物组合在F₂群体(A)、42个栽培品种(B)和211份育种材料中的部分扩增结果(C)

具体实施方式

实施例1、SNP分子标记引物的设计

在抗、感材料中克隆和比较半胱氨酸蛋白酶(Cysteine proteinase,CP)基因。根据QYm.nau-5A.1定位结果和国际小麦测序组织(IWGSC)公布的中国春小麦品种的参考基因组序列，在定位的5AL染色体目标区段预测了一个抗病候选基因CP基因。在西风小麦和镇9523中扩增和比较发现一个SNP位点，在核苷酸的第355位。针对该SNP位点设计了两对引物组合，各引物信息如下：

5SNP-R-F:gttcctcggcttcgtgcagcggttcggg(SEQ ID NO.1)

5SNP-R-R:catctcccgcaggaacgaccgccgcga(SEQ ID NO.2)

5SNP-S-F:tggtccctccagtcgaagtcctcgggga(SEQ ID NO.3)

5SNP-S-FR:gccggaccttcctgggcctcaagagga(SEQ ID NO.4)

实施例2、SNP分子标记方法的实现

利用引物5SNP-R在西风小麦和镇9523中进行PCR扩增检测。结果表明：在双亲扩增出多态条带，其中西风小麦等位位点为226bp的特异扩增条带。可以作为SNP分子标记。

PCR试剂组成为：含20-100ng DNA的1.0μL DNA模板，1.0μL10×PCR buffer，0.8μLMgCl₂，0.8μLdNTP，四引物各0.2μL，0.15μL Taq DNA polymerase，5.85μL dd H₂O。

PCR程序为：94℃预变性3分钟；94℃变性30秒，55℃退火50秒，72℃延伸1分10秒，28个循环；72℃延伸10分钟；10℃保存，PCR产物在丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺质量比为39:1的非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，再用银染法进行染色。

实施例3、SNP分子标记在F2分离群体、42个栽培品种和211份育种材料中的应用

1.标记引物组合5SNP-R和5SNP-S在F2分离群体中的检测

用“RIL5-6×镇9523”次级F2分离群体中的191个重组体的DNA作为模板，这191个重组体全部为感病单株，用本发明中的标记引物5SNP-R和5SNP-S进行PCR扩增，结果表明标记引物5SNP-R特异性地扩增来自抗病亲本西风的拷贝TaCP-A，而标记引物5SNP-R在这191个感病重组体中均未扩增出相应的特异条带。箭头所示为特异条带。

2.利用抗小麦黄花叶病“西风小麦”的衍生品种和感小麦黄花叶病的42个栽培品种验证标记引物的有效性

国内育种工作者通过常规育种方法直接或间接利用“西风小麦”育成了一些广泛推广的高抗小麦黄花叶病的小麦品种，如“宁麦9号”(公知公用，审定品种)，“宁麦16号”(公知公用，审定品种)，如“扬麦18.号”(公知公用，审定品种)。而“镇9523”(公知公用，审定品种)，如“皖麦36”(公知公用，审定品种)，如“郑麦9094”(公知公用，审定品种)，如“周麦18”(公知公用，审定品种)，如“陕麦139”(公知公用，审定品种)，如“蚂蚱麦”(公知公用，审定品种)

为了检测标记5SNP-R追踪42个栽培品种抗小麦黄花叶病QTL QYm.nau-5A.1的有效性，本研究利用42个栽培品种为测试材料，结果发现标记5SNP-R的引物在所有抗小麦黄花叶病“西风小麦”的衍生品种中分别扩增出约226bp的特异条带(图4-B)，在感黄花叶病品种中未扩增出相应的特异条带。该实验证明了标记5SNP-R的引物可用于分子标记辅助选择育种，特异性的追踪“西风小麦”5AL染色体上的抗小麦黄花叶病QTL QYm.nau-5A.1。

3.标记引物5SNP-R在211份育种材料中的分子检测

用211份育种材料的DNA作为模板，用本发明中的标记引物5SNP-R和5SNP-S进行PCR扩增，结果表明标记引物5SNP-R在抗病亲本、抗池中均扩增出约226bp的特异条带，而在感病的亲本和单株中均未扩增出相应的特异条带。箭头所示为特异条带(图4-C)。

序列表

<110> 南京农业大学

江苏瑞华农业科技有限公司

江苏里下河地区农业科学研究所

<120> 一个抗小麦黄花叶病QTL QYm.nau-5A.1的SNP标记引物组合及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gttcctcggc ttcgtgcagc ggttcggg 28

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

catctcccgc aggaacgacc gccgcga 27

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tggtccctcc agtcgaagtc ctcgggga 28

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gccggacctt cctgggcctc aagagga 27

Claims (6)

1.一个抗小麦黄花叶病QTL QYm.nau-5A.1紧密连锁的分子标记引物，其特征在于由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的两条引物组成。

2.抗小麦黄花叶病QTL QYm.nau-5A.1紧密连锁的分子标记在特异追踪位于5AL的抗小麦黄花叶病主效QTL QYm.nau-5A.1中的应用，所述的抗小麦黄花叶病QTL QYm.nau-5A.1紧密连锁的分子标记的引物由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的两条引物组成。

3.权利要求1所述的一个抗小麦黄花叶病QTL QYm.nau-5A.1紧密连锁的分子标记引物在特异追踪位于5AL的抗小麦黄花叶病主效QTL QYm.nau-5A.1中的应用。

4.权利要求1所述的一个抗小麦黄花叶病QTL QYm.nau-5A.1紧密连锁的分子标记引物在鉴别由QTL QYm.nau-5A.1控制的小麦黄花叶病抗感病品种中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于使用权利要求1所述的分子标记引物对小麦植株基因组DNA进行PCR扩增，在含有QYm.nau-5A.1的抗病小麦植株中能扩增出位于220-230bp的特征条带，在不含有QYm.nau-5A.1的植株中无法扩增出位于220-230bp的特征条带。

6.权利要求1所述的一个抗小麦黄花叶病QTL QYm.nau-5A.1紧密连锁的分子标记引物在分子育种选育抗小麦黄花叶病品种中的应用。