CN112920260B

CN112920260B - 葡萄耐热相关VvWRKY4蛋白及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN112920260B
Application number: CN202011414381.XA
Authority: CN
Inventors: 王利军; 梁振昌; 陈海洋; 范培格; 段伟
Original assignee: Institute of Botany of CAS
Current assignee: Institute of Botany of CAS
Priority date: 2020-12-04
Filing date: 2020-12-04
Publication date: 2022-04-19
Anticipated expiration: 2040-12-04
Also published as: CN112920260A

Abstract

本发明公开了葡萄耐热相关VvWRKY4蛋白及其编码基因与应用。VvWRKY4蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。向葡萄41B悬浮细胞中导入VvWRKY4基因，得到转VvWRKY4基因葡萄悬浮细胞。实验证明，在葡萄41B悬浮细胞中过表达VvWRKY4基因可以提高葡萄41B细胞的耐热性；耐热性提高表现在受到高温胁迫恢复后再生能力增加和/或细胞颜色转变为褐色的比例减少。由此可见，VvWRKY4蛋白可以调控葡萄的耐热性，本发明具有重要的应用价值。

Description

葡萄耐热相关VvWRKY4蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及葡萄耐热相关VvWRKY4蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

葡萄是世界上广泛栽培的具有重要经济价值的果树。我国是世界上葡萄生产与消费的第一大国，全国各地几乎都有分布。其中，鲜食葡萄占有很大比例。高温是影响葡萄生长发育的重要环境因素，往往抑制光合作用等生理活动，导致浆果产量和品质的下降。近年来，全球气候变化导致高温天气频率和高温程度增加。许多产区中午温度常常达到40℃，有的甚至超过45℃，由此造成巨大的经济损失。因此，通过对葡萄耐热性机制的深入研究，提高葡萄耐热性，对于葡萄的产量和品质具有重要意义。

近些年来，通过GWAS和QTL定位的方法在农作物(如水稻、玉米)中克隆出了许多控制重要农艺性状的基因，这对提高农作物产量和抗逆性具有重要的意义。因此，采用GWAS和QTL定位的方法挖掘葡萄种质资源和杂交群体中的耐热性关键基因将是一种可行途径。

发明内容

本发明的目的是提高葡萄的耐热性。

本发明首先保护来源于葡萄的VvWRKY4蛋白，可为a1)或a2)或a3)或a4)：

a1)氨基酸序列是SEQ ID NO:2所示的蛋白质；

a2)在SEQ ID NO:2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

a3)将a1)或a2)所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的、来源于葡萄且与耐热相关的蛋白质；

a4)与SEQ ID NO:2限定的氨基酸序列具有80％或80％以上同源性，来源于葡萄且与耐热相关的蛋白质。

其中，SEQ ID NO:2由502个氨基酸残基组成。

为了使a1)中的蛋白质便于纯化，可在SEQ ID NO:2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1.标签的序列

上述a3)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述a3)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述a3)中的蛋白质的编码基因可通过将SEQ ID NO:1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

本发明还保护编码所述VvWRKY4蛋白的核酸分子。

所述编码VvWRKY4蛋白的核酸分子可为b1)或b2)或b3)或b4)所示的DNA分子：

b1)编码区是SEQ ID NO:1所示的DNA分子；

b2)核苷酸序列是SEQ ID NO:1所示的DNA分子；

b3)与b1)或(b2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，来源于葡萄且编码所述VvWRKY4蛋白的DNA分子；

b4)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，来源于葡萄且编码所述VvWRKY4蛋白的DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

其中，SEQ ID NO:1由1509个核苷酸组成，SEQ ID NO:1的核苷酸编码SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码所述VvWRKY4蛋白的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的所述VvWRKY4蛋白的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码所述VvWRKY4蛋白，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的VvWRKY4蛋白的核苷酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

本发明还保护含有上述任一所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物。

所述含有上述任一所述核酸分子的重组载体可为在表达载体的多克隆位点插入SEQ ID NO：1所示的DNA分子得到的重组质粒。

所述重组载体具体可为重组质粒VvWRKY4-2300。重组质粒VvWRKY4-2300可为将pCAMBIA-2300载体的限制性内切酶KpnI和BamHI的识别序列之间的DNA小片段替换为SEQID NO:1所示的DNA分子，得到的重组质粒。

所述含有上述任一所述核酸分子的重组微生物可为将含有上述任一所述核酸分子的重组载体导入出发微生物得到的重组菌。

所述出发微生物可为农杆菌或大肠杆菌。所述农杆菌具体可为根癌农杆菌。所述根癌农杆菌具体可为根癌农杆菌EHA105。

所述含有上述任一所述核酸分子的重组微生物具体可为EHA105/VvWRKY4-2300。所述EHA105/VvWRKY4-2300可为将重组质粒VvWRKY4-2300导入农杆菌EHA105，得到的重组农杆菌。

本发明还保护上述任一所述VvWRKY4蛋白、上述任一所述核酸分子或含有上述任一所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物在调控植物耐热性中的应用。

本发明还保护上述任一所述VvWRKY4蛋白、上述任一所述核酸分子或含有上述任一所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物在培育耐热性改变的转基因植物或转基因植物细胞中的应用。

上述任一所述的应用中，所述调控植物耐热性可为提高植物耐热性。

上述任一所述的应用中，所述培育耐热性改变的转基因植物可为培育耐热性增加的转基因植物。

上述任一所述的应用中，所述培育耐热性改变的转基因植物细胞可为培育耐热性增加的转基因植物细胞。

本发明还保护一种培育转基因植物的方法，可包括如下步骤：提高受体植物中上述任一所述VvWRKY4蛋白表达量和/或活性，得到转基因植物；与受体植物相比，转基因植物的耐热性提高。

上述方法中，所述“提高受体植物中上述任一所述VvWRKY4蛋白表达量和/或活性”可通过转基因、多拷贝、改变启动子、调控因子等本领域熟知的方法，达到提高受体植物中上述任一所述VvWRKY4蛋白的表达量和/或活性的效果。

上述方法中，所述“提高受体植物中上述任一所述VvWRKY4蛋白表达量和/或活性”具体可通过向受体植物中导入编码所述VvWRKY4蛋白的核酸分子实现。

本发明还保护一种培育转基因植物细胞的方法，可包括如下步骤：提高受体植物细胞中上述任一所述VvWRKY4蛋白的表达量和/或活性，得到转基因植物细胞；与受体植物细胞相比，转基因植物细胞的耐热性提高。

上述方法中，所述“提高受体植物细胞中上述任一所述VvWRKY4蛋白的表达量和/或活性”可通过转基因、多拷贝、改变启动子、调控因子等本领域熟知的方法，达到提高受体植物细胞中上述任一所述VvWRKY4蛋白的表达量和/或活性的效果。

上述方法中，所述“提高受体植物细胞中上述任一所述VvWRKY4蛋白的表达量和/或活性”具体可通过向受体植物细胞中导入编码所述VvWRKY4蛋白的核酸分子实现。

上述任一所述的方法中，所述编码VvWRKY4蛋白的核酸分子可为b1)或b2)或b3)或b4)所示的DNA分子：

b1)编码区是SEQ ID NO:1所示的DNA分子；

b2)核苷酸序列是SEQ ID NO:1所示的DNA分子；

所述向受体植物中导入编码所述VvWRKY4蛋白的核酸分子具体可通过向受体植物导入含有上述任一所述核酸分子的重组载体实现。

所述向受体植物细胞中导入编码所述VvWRKY4蛋白的核酸分子具体可通过向受体植物细胞导入含有上述任一所述核酸分子的重组载体实现。

所述含有上述任一所述核酸分子的重组载体具体可为重组质粒VvWRKY4-2300。重组质粒VvWRKY4-2300可为将pCAMBIA-2300载体的限制性内切酶KpnI和BamHI的识别序列之间的DNA小片段替换为SEQ ID NO:1所示的DNA分子，得到的重组质粒。

所述转基因植物细胞具体可为实施例2提及的转VvWRKY4基因葡萄悬浮细胞。此时受体植物细胞具体可为葡萄41B。

本发明还保护一种植物育种方法，包括如下步骤：增加植物中上述任一所述VvWRKY4蛋白的表达量和/或活性，从而提高植物的耐热性。

上述任一所述耐热性的增加可表现为培养的葡萄细胞高温胁迫后重量增加(或再生能力增加)。

上述任一所述耐热性的增加可表现为培养的葡萄细胞高温胁迫后细胞颜色转变为褐色的比例减少。

上述任一所述耐热性的增加可表现为培养的葡萄细胞受到高温胁迫恢复后重量相比于对照增加(或再生能力增加)。

上述任一所述耐热性的增加可表现为培养的葡萄细胞受到高温胁迫恢复后，细胞颜色转变为褐色的比例相比于对照减少。

所述对照可为葡萄41B。

所述高温胁迫可为40-50℃(如40-45℃、45-50℃、40℃、45℃或50℃)处理60-120min(如60-90min、90-120min、60min、90min或120min)。

上述任一所述植物可为c1)至c4)中的任一种：c1)单子叶植物；c2)双子叶植物；c3)葡萄科植物；c4)葡萄。

所述葡萄可为葡萄品种京秀(欧亚种)、葡萄品种塘尾(刺葡萄)或葡萄41B。

向葡萄41B细胞中导入VvWRKY4基因，得到转VvWRKY4基因葡萄悬浮细胞。实验证明，在葡萄41B细胞中过表达VvWRKY4基因可以提高葡萄41B细胞的耐热性；耐热性提高表现在受到高温胁迫恢复后再生能力增加和/或细胞颜色转变为褐色的比例减少。由此可见，VvWRKY4蛋白可以调控葡萄的耐热性，本发明具有重要的应用价值。

附图说明

图1为京秀和塘尾叶片总RNA的琼脂糖凝胶电泳检测结果。

图2为VvWRKY4基因在高温胁迫条件下的表达模式分析。

图3为转VvWRKY4基因葡萄悬浮细胞的鉴定结果。

图4为转VvWRKY4基因葡萄悬浮细胞的耐热性鉴定。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

葡萄品种京秀(欧亚种)和葡萄品种塘尾(刺葡萄)均为市售。在下文中，葡萄品种京秀(欧亚种)简称京秀或Jingxiu，葡萄品种塘尾(刺葡萄)简称塘尾或Tangwei。

实施例1、VvWRKY4基因的获得和在高温胁迫条件下的表达模式分析

一、VvWRKY4基因的获得

1、提取葡萄(京秀或塘尾)叶片的总RNA，进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。

检测结果见图1。结果表明，京秀叶片的总RNA和塘尾叶片的总RNA的电泳条带明显(从上到下依次为28S RNA和18S RNA)。说明，京秀叶片的总RNA和塘尾叶片的总RNA纯度较高且较完整。

2、以步骤1提取的葡萄叶片的总RNA(京秀叶片的总RNA或塘尾叶片的总RNA)为模板，采用诺维赞公司的HiScript Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)试剂盒进行反转录，得到葡萄第一链cDNA。具体步骤如下：

(1)genome DNA去除

取规格为0.2ml的离心管，加入4μl 4×gDNA wiper Mix和1μg葡萄第一链cDNA，用RNase free H₂O补至总体积16μl。之后，用移液枪吹打混匀，42℃温育2min。

(2)反转录

完成步骤(1)后，向所述离心管中加入4μl 5×qRT SuperMixⅡ，混匀后置于PCR仪，反应，得到葡萄第一链cDNA。

反应程序为：25℃10min，50℃30min，85℃5min。

4×gDNA wiper Mix和5×qRT SuperMixⅡ均为HiScript Q RT SuperMixforqPCR(+gDNA wiper)试剂盒中的组件。

3、以葡萄第一链cDNA为模板，采用引物VvWRKY4-CDS-F：5’-ATGTCTCAGCACAAGGAGCCTAT-3’和引物VvWRKY4-CDS-R：5’-GTGATATATTGTTGATGATGAAC-3’组成引物对进行PCR扩增，得到约1500bp的PCR扩增产物。

4、将PCR扩增产物进行测序。

测序结果表明，京秀和塘尾的PCR扩增产物的核苷酸序列均如SEQ ID NO:1所示。

将SEQ ID NO:1所示的基因命名为VvWRKY4基因。VvWRKY4基因编码VvWRKY4蛋白，VvWRKY4蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

二、VvWRKY4基因在高温胁迫条件下的表达模式分析

1、取一年生的葡萄(京秀或塘尾)，25℃、40℃或45℃处理2h。

2、完成步骤1后，提取葡萄叶片的RNA，之后反转录，得到葡萄叶片的cDNA。

3、完成步骤2后，以葡萄叶片的cDNA为模板，实时荧光定量PCR检测VvWRKY4基因的相对表达水平(以编码肌动蛋白的actin基因为内参基因)。

用于检测VvWRKY4基因的引物为5’-GGGGCTACTCAAGGAAGCAT-3’和5’-CACGTACAGTCCTGGATGCC-3’。

用于检测actin基因的引物为5’-CTTGCATCCCTCAGCACCTT-3’和5’-TCCTGTGGACAATGGATGGA-3’。

检测结果见图2。结果表明，25℃、40℃或45℃处理2h时，VvWRKY4基因在塘尾中的相对表达量显著高于京秀。

实施例2、转VvWRKY4基因葡萄悬浮细胞的耐热性分析

一、重组质粒VvWRKY4-2300的获得

1、以实施例1步骤一中3得到的PCR扩增产物为模板，采用引物VvWRKY4-2300-F：5’-TCATTTGGAGAGAACACGGGGGACGAGCTCGGTACCATGTCTCAGCACAAGGAGCCTAT-3’(下划线为限制性内酶切KpnI的识别位点)和引物VvWRKY4-2300-R：5’-GCCCTTGCTCACCATGGTGTCGACTCTAGAGGATCCGTGATATATTGTTGATGATGAA-3’(下划线为限制性内酶切BamHI的识别位点)组成的引物对进行PCR扩增，得到约1500bp的PCR扩增产物。

2、用限制性内切酶KpnI和BamHI双酶切PCR扩增产物，回收约1500bp的酶切产物。

3、用限制性内切酶KpnI和BamHI双酶切pCAMBIA-2300载体，回收约10000bp的载体骨架。

4、将酶切产物和载体骨架进行连接，得到重组质粒VvWRKY4-2300。

将重组质粒VvWRKY4-2300进行测序。测序结果表明，重组质粒VvWRKY4-2300为将pCAMBIA-2300载体的限制性内切酶KpnI和BamHI的识别序列之间的DNA小片段替换为SEQID NO:1所示的DNA分子，得到的重组质粒。

二、重组农杆菌的获得

将重组质粒VvWRKY4-2300导入农杆菌EHA105，得到重组农杆菌，命名为EHA105/VvWRKY4-2300。

将pCAMBIA-2300载体导入农杆菌EHA105，得到重组农杆菌，命名为EHA105/2300。

三、转VvWRKY4基因葡萄悬浮细胞的获得

1、采用农杆菌侵染法(记载于如下文献中：Knockout of VvCCD8 gene ingrapevine affects shoot branching，BMC plant biology，2020-01)，将EHA105/VvWRKY4-2300转至41B细胞，获得若干转VvWRKY4基因葡萄悬浮细胞。

2、采用农杆菌侵染法将EHA105/2300转至41B细胞，获得转空载体葡萄悬浮细胞。

3、分子鉴定

分别提取转VvWRKY4基因葡萄悬浮细胞的基因组DNA并以其作为模板，采用2300-F：5′-ACTATCCTTCGCAAGACCCT-3′和2300-R：5′-CAGGGTCAGCTTGCCGTAG-3′组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。进行如下判断：如果某PCR扩增产物中含有约1650bp的DNA片段，则该PCR扩增产物对应的转VvWRKY4基因葡萄悬浮细胞为转VvWRKY4基因葡萄悬浮阳性细胞。

按照上述步骤，将转VvWRKY4基因葡萄悬浮细胞替换为转空载体葡萄悬浮细胞，其它步骤均不变。作为对照。

按照上述步骤，将模板替换为重组质粒VvWRKY4-2300，其它步骤均不变。作为阳性对照。

部分检测结果见图3中左图(Marker为trans plus 5000Marker，OE-EV为转空载体葡萄悬浮细胞，OE-VvWRKY4为转VvWRKY4基因葡萄悬浮细胞，Positive为重组质粒VvWRKY4-2300)。结果表明，所有转VvWRKY4基因葡萄悬浮细胞的PCR扩增产物中均含有约1650bp的DNA片段，重组质粒VvWRKY4-2300的PCR扩增产物中也含有约1650bp的DNA片段，转空载体葡萄悬浮细胞的PCR扩增产物中仅含有150bp的DNA片段。

上述结果表明，获得的转VvWRKY4基因葡萄悬浮细胞均为转VvWRKY4基因葡萄悬浮阳性细胞。

4、实时定量RT-PCR检测

(1)提取细胞(转VvWRKY4基因葡萄悬浮细胞或转空载体葡萄悬浮细胞)的RNA，之后反转录，得到细胞的cDNA。

(2)完成步骤(1)后，以细胞的cDNA为模板，实时荧光定量PCR检测VvWRKY4基因的相对表达水平(以编码肌动蛋白的actin基因为内参基因)。

将转空载体葡萄悬浮细胞中VvWRKY4基因的相对表达水平作为1，计算转VvWRKY4基因葡萄悬浮细胞中VvWRKY4基因的相对表达水平。检测结果见图3中右图(OE-EV为转空载体葡萄悬浮细胞，OE-VvWRKY4为转VvWRKY4基因葡萄悬浮细胞)。结果表明，VvWRKY4基因在转VvWRKY4基因葡萄悬浮细胞中的表达量大约是转空载体葡萄悬浮细胞的5倍。

上述结果表明，转VvWRKY4基因葡萄悬浮细胞为转VvWRKY4基因葡萄悬浮阳性细胞。

四、转VvWRKY4基因葡萄悬浮细胞的耐热性鉴定

待测细胞为转VvWRKY4基因葡萄悬浮阳性细胞或转空载体葡萄悬浮细胞。

1、分别取1ml正常继代培养的12瓶待测细胞，共同接种至50mlGM培养基，25℃、120rpm暗培养7天，得到悬浮细胞。

2、完成步骤1后，取所述悬浮细胞，45℃、120rpm处理90min。

3、完成步骤2后，取1ml所述悬浮细胞，接种至50mlGM培养基，25℃、120rpm暗培养7天，用移液枪吸取上清，并用滤纸将水分吸干并称重。

将步骤2中的45℃、120rpm处理90min替换为25℃、120rpm处理90min，其它步骤均不变，作为对照。

检测结果见图4(OE-EV为转空载体葡萄悬浮细胞，OE-VvWRKY4为转VvWRKY4基因葡萄悬浮细胞)。结果表明，25℃处理的转空载体葡萄悬浮细胞和转VvWRKY4基因葡萄悬浮细胞均为黄色，且重量没有显著差异(即再生能力没有显著差异)；45℃处理的转空载体葡萄悬浮细胞和转VvWRKY4基因葡萄悬浮细胞均变为褐色，但转空载体葡萄悬浮细胞的变褐程度明显高于转VvWRKY4基因葡萄悬浮细胞；45℃处理时，转VvWRKY4基因葡萄悬浮细胞的重量显著高于转空载体葡萄悬浮细胞。

上述结果表明，在41B细胞中过表达VvWRKY4基因可以提高葡萄41B细胞的耐热性。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

<110>中国科学院植物研究所

<120>葡萄耐热相关VvWRKY4蛋白及其编码基因与应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1509

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

atgtctcagc acaaggagcc tatccacagt gagaatgtag ggatgcatca cattccagaa 60

gaacagaaag gcacataccc ttccatggga atgggaagaa cttcagaaga tggatacaat 120

tggagaaaat atgggcaaaa aagtatgaaa ggtagtgaac atacaaggag ctattataaa 180

tgtactcatc tagattgtcc gatgagaaaa aaggtacaac aatcacatga tggtcaaata 240

acagaaatta tctataaggg tggtcataac cacccaaaac cactgcctag tcgtcgatca 300

gctcttggat ccacacttcc atttaatgag atgtcaggtt tgggggaagg tggcggatct 360

agtgtcagag ttgaaggtgg ctcaatttgg agaaacgttc aaccaggatc taagaatgat 420

agagctggtt ctgattggag ggccaatggt ttggagagga catcctcaac atctgctgta 480

agtgcgctct ccaactcctt atcaaacaca ggaggaatat ccatgggtat atttgaatca 540

gcaggaaccc cagatctttc cttaacagtt gctagtcaag atgatggtga agatggggct 600

actcaaggaa gcatatcact tggagatgat gttgatgatg aaggttctca gtcaaaaaaa 660

aggaagaaag agaattgtat gactgaaaaa aatttggcat ccaggactgt acgtgaacca 720

agggttgttg tccaagtaga gtgtgaatcg gacgtccttg atgatggata tcgctggcga 780

aagtatggac aaaaagtcgt caaaggcaat ctgaatccta ggaattacta caagtgcaca 840

agcactggat gctcagtgag gaggcatgtg gaaagagctt ccaacaatca gaaatccata 900

attgcgacat atgaaggaaa acacaatcat gaagtgcctg cagccagaaa caggagtcat 960

gtgaattcaa gtggtggaaa tttgccttca gctgctcctg gtgctcaatc agcactggct 1020

ttgcacagga atgccaatgt cccaaggcca gaagcactac ttcaagatct tgtcccccac 1080

tttgacataa aacctgaatt cagcaatcag tatataaggc acagtatgct tgggaacttt 1140

gctaatgata tgaaatttgg tccttcctcc ctttattcaa tgcagttccc tcccctgcaa 1200

aataccatgc tttatgctcc ttttggactg gattctaata atgctgatcc ccaccaacct 1260

ggttcagttg ctccagtagc cccagatttc ccaatttcat tgccattgag tctcccccca 1320

cctgcaaatc tgggtctgcc tggctttgac ttcaacagtc atggaaaccc gattggtcaa 1380

gttcagccat atttcgtggg gcagcagctt caggagaacg atatgaggtt cctccatcct 1440

aaagaggaga agaaggatga cattggtgat gcaactacat catgttcatc atcaacaata 1500

tatcactag 1509

<210> 2

<211> 502

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 2

Met Ser Gln His Lys Glu Pro Ile His Ser Glu Asn Val Gly Met His

1 5 10 15

His Ile Pro Glu Glu Gln Lys Gly Thr Tyr Pro Ser Met Gly Met Gly

20 25 30

Arg Thr Ser Glu Asp Gly Tyr Asn Trp Arg Lys Tyr Gly Gln Lys Ser

35 40 45

Met Lys Gly Ser Glu His Thr Arg Ser Tyr Tyr Lys Cys Thr His Leu

50 55 60

Asp Cys Pro Met Arg Lys Lys Val Gln Gln Ser His Asp Gly Gln Ile

65 70 75 80

Thr Glu Ile Ile Tyr Lys Gly Gly His Asn His Pro Lys Pro Leu Pro

85 90 95

Ser Arg Arg Ser Ala Leu Gly Ser Thr Leu Pro Phe Asn Glu Met Ser

100 105 110

Gly Leu Gly Glu Gly Gly Gly Ser Ser Val Arg Val Glu Gly Gly Ser

115 120 125

Ile Trp Arg Asn Val Gln Pro Gly Ser Lys Asn Asp Arg Ala Gly Ser

130 135 140

Asp Trp Arg Ala Asn Gly Leu Glu Arg Thr Ser Ser Thr Ser Ala Val

145 150 155 160

Ser Ala Leu Ser Asn Ser Leu Ser Asn Thr Gly Gly Ile Ser Met Gly

165 170 175

Ile Phe Glu Ser Ala Gly Thr Pro Asp Leu Ser Leu Thr Val Ala Ser

180 185 190

Gln Asp Asp Gly Glu Asp Gly Ala Thr Gln Gly Ser Ile Ser Leu Gly

195 200 205

Asp Asp Val Asp Asp Glu Gly Ser Gln Ser Lys Lys Arg Lys Lys Glu

210 215 220

Asn Cys Met Thr Glu Lys Asn Leu Ala Ser Arg Thr Val Arg Glu Pro

225 230 235 240

Arg Val Val Val Gln Val Glu Cys Glu Ser Asp Val Leu Asp Asp Gly

245 250 255

Tyr Arg Trp Arg Lys Tyr Gly Gln Lys Val Val Lys Gly Asn Leu Asn

260 265 270

Pro Arg Asn Tyr Tyr Lys Cys Thr Ser Thr Gly Cys Ser Val Arg Arg

275 280 285

His Val Glu Arg Ala Ser Asn Asn Gln Lys Ser Ile Ile Ala Thr Tyr

290 295 300

Glu Gly Lys His Asn His Glu Val Pro Ala Ala Arg Asn Arg Ser His

305 310 315 320

Val Asn Ser Ser Gly Gly Asn Leu Pro Ser Ala Ala Pro Gly Ala Gln

325 330 335

Ser Ala Leu Ala Leu His Arg Asn Ala Asn Val Pro Arg Pro Glu Ala

340 345 350

Leu Leu Gln Asp Leu Val Pro His Phe Asp Ile Lys Pro Glu Phe Ser

355 360 365

Asn Gln Tyr Ile Arg His Ser Met Leu Gly Asn Phe Ala Asn Asp Met

370 375 380

Lys Phe Gly Pro Ser Ser Leu Tyr Ser Met Gln Phe Pro Pro Leu Gln

385 390 395 400

Asn Thr Met Leu Tyr Ala Pro Phe Gly Leu Asp Ser Asn Asn Ala Asp

405 410 415

Pro His Gln Pro Gly Ser Val Ala Pro Val Ala Pro Asp Phe Pro Ile

420 425 430

Ser Leu Pro Leu Ser Leu Pro Pro Pro Ala Asn Leu Gly Leu Pro Gly

435 440 445

Phe Asp Phe Asn Ser His Gly Asn Pro Ile Gly Gln Val Gln Pro Tyr

450 455 460

Phe Val Gly Gln Gln Leu Gln Glu Asn Asp Met Arg Phe Leu His Pro

465 470 475 480

Lys Glu Glu Lys Lys Asp Asp Ile Gly Asp Ala Thr Thr Ser Cys Ser

485 490 495

Ser Ser Thr Ile Tyr His

500

Claims

1.VvWRKY4蛋白在提高葡萄耐热性中的应用；

所述VvWRKY4蛋白为a1)或a2)：

a1)氨基酸序列是SEQ ID NO:2所示的蛋白质；

a2)在SEQ ID NO:2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

2.编码权利要求1中所述VvWRKY4蛋白的核酸分子在提高葡萄耐热性中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述编码权利要求1中所述VvWRKY4蛋白的核酸分子为b1)或b2)所示的DNA分子：

b1)编码区是SEQ ID NO:1所示的DNA分子；

b2)核苷酸序列是SEQ ID NO:1所示的DNA分子。

4.权利要求1中所述VvWRKY4蛋白在培育耐热性提高的转基因葡萄或转基因葡萄细胞中的应用。

5.权利要求2或3中所述编码权利要求1中所述VvWRKY4蛋白的核酸分子在培育耐热性提高的转基因葡萄或转基因葡萄细胞中的应用。

6.一种培育转基因葡萄的方法，包括如下步骤：提高受体葡萄中权利要求1中所述VvWRKY4蛋白的表达量，得到转基因葡萄；与受体葡萄相比，转基因葡萄的耐热性提高。

7.一种培育转基因葡萄细胞的方法，包括如下步骤：提高受体葡萄细胞中权利要求1中所述VvWRKY4蛋白的表达量，得到转基因葡萄细胞；与受体葡萄细胞相比，转基因葡萄细胞的耐热性提高。

8.一种葡萄育种方法，包括如下步骤：增加葡萄中权利要求1中所述VvWRKY4蛋白的表达量，从而提高葡萄的耐热性。