CN107686515A

CN107686515A - 葡萄转运蛋白VvMRP1S、编码基因及其在培育抗重金属植物中的应用

Info

Publication number: CN107686515A
Application number: CN201711024692.3A
Authority: CN
Inventors: 薛永; 宋科; 乔红霞; 秦秦; 孙丽娟; 薛书亚; 杨建军; 郑宪清; 李双喜; 吕卫光; 顾守柏; 孙彦伟; 龙腾
Original assignee: Shanghai Construction Land And Land Consolidation Business Center; Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Shanghai Construction Land And Land Consolidation Business Center; Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2017-10-27
Filing date: 2017-10-27
Publication date: 2018-02-13

Abstract

本发明提供了葡萄转运蛋白VvMRP1S及其编码基因以及在抗重金属中的应用，属于遗传育种领域。本发明将葡萄中的转运蛋白经过人工化学合成得到葡萄转运蛋白VvMRP1S编码基因，其转入植物并使得这种转基因植物增加植物抗重金属的能力。所述转运蛋白VvMRP1S编码基因按植物偏爱密码合成含4893个碱基，编码的氨基酸1626个；其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示。本发明中来源于野生型的葡萄VvMRP1S基因采用人工化学方法合成，转基因植物具备较高的抗重金属性。

Description

葡萄转运蛋白VvMRP1S、编码基因及其在培育抗重金属植物中的应用

技术领域

本发明属于遗传育种领域，具体涉及葡萄转运蛋白VvMRP1S、编码基因及其在培育抗重金属植物的应用。

背景技术

目前，含有重金属或有机污染物的土壤修复方法包括气提技术、土壤淋洗、固定化等，由于这些技术容易造成二次污染、破坏自然生境，并且成本较高，因此利用植物及其相关的微生物修复污染土壤、沉积物、地下水，已经成为一种经济环保的技术，越来越受到关注。植物修复主要是利用积聚、络合、挥发、降解、去除、转化或者固定等机制来处理污染物，相对于常规微生物修复，除了可以通过植物过程固定积聚污染物，阻止污染物随水流和风尘而扩散外，植物本身作为天然自养系统，也能够向根际微生物提供营养，保证微生物生长和一定的微生物群落，从而能够进一步使污染物脱毒。

研究表明大量具有修复能力的植物种类已被鉴定。据报道，一些超富集植物的富集能力是普通植物的50～500倍，高生物富集因子以及高效根、茎传输系统使得重金属耐受力增强，从而使超富集植物具有较高的脱毒能力。但是，许多超富集植物具有生长缓慢、生物量低的特点，严重限制了在污染场地实际修复中的应用。因此，识别超富集植物中的特定基因，通过基因操纵技术以及植物转化技术，获得高效去除环境中污染物的转基因植物，对于污染场地的植物修复应用具有非常大的潜力。过表达与金属螯合物的生物合成有关的基因，通过螯合物的不同和螯合物所处部位的不同，可以提高或降低金属的吸收，提高金属的转运和区室化。依靠基因在植物组织(根、茎叶、维管束)和细胞内(细胞膜、液泡膜)中过表达金属转运体基因可能提高金属的吸收、转运，或者区室化的效率。一般情况下，用于修复目的的转基因植物在特定污染环境下生存能力较强，并表现出很强的生物修复能力，在无污染或低污染的环境下则没有特别的生长优势。当土壤和水体污染水平降低时，这些转基因植物的生长发育速度将接近野生型植物。因此，与同类野生型植物相比，它不会有更大的成为生物入侵的趋势。

目前我国绝大部分土壤重金属污染修复产业化水平还仅仅处于物理修复和化学修复的阶段，个别利用生物修复也仅仅局限在常规生物修复的水平，但是目前常规植物修复的能力有限，例如，植物对于重金属的种类和浓度的抗性均有一定限度，这大大制约了植物修复的应用。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种葡萄转运蛋白VvMRP1S及其编码基因，所述萄转运蛋白VvMRP1S及其编码基因具有提高植物的抗重金属的功能。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种萄转运蛋白VvMRP1S，具有序列表中SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。

本发明提供了一种葡萄转运蛋白VvMRP1S编码基因，具有序列表中SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。

本发明提供了一种植物双元载体，pcAMBIA-1301载体中包含所述的葡萄转运蛋白VvMRP1S编码基因和连接在所述编码基因VvMRP1S两端的烟草的染色质附着SAR序列

本发明还提供了所述的葡萄转运蛋白VvMRP1S编码基因或者所述植物双元载体在培育抗重金属植物中的应用。

优选的，所述植物包括拟南芥。

优选的，所述重金属为离子状态重金属，所述离子状态重金属为镉离子。

优选的，所述培育的方法采用农杆菌介导法将所述葡萄转运蛋白VvMRP1S编码基因转化入宿主植物中。

优选的，所述镉离子的摩尔浓度为50～200μmol/L。

本发明了葡萄转运蛋白VvMRP1S及其编码基因，为了进一步分析所述基因在重金属逆境中的作用与功能，比较转VvMRP1S编码基因的拟南芥植株和野生型拟南芥植株的抗重金属性。结果表明，野生型和转VvMRP1S编码基因拟南芥植株在表型上有很大的差异；同时在200μM浓度的Cd²⁺浓度培养基处理下野生型生长明显受抑制，根系不生长，叶片稀少，而转基因株系抑制较小，这说明VvMRP1S基因明显提高了拟南芥的抗重金属能力。

附图说明

图1为本发明中拟南芥转化的植物表达载体示意图；

图2为实施例5转VvMRP1S编码基因拟南芥的GUS染色图；

图3为实施例6转VvMRP1S编码基因拟南芥与野生型拟南芥的抗重金属表型图。

具体实施方式

本发明提供了一种葡萄转运蛋白VvMRP1S，具有序列表中SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。

本发明中，所述葡萄转运蛋白VvMRP1S的合成方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的合成方法即可。

本发明中，所述葡萄转运蛋白VvMRP1S编码基因的合成方法优选采用人工方法合成。所述人工方法包括以下步骤：

依照PTDS(PCR-based two-step DNA synthesis，PTDS)方法进行源自葡萄转运蛋白VvMRP1S编码基因的化学合成，在保持VvMRP1基因的氨基酸序列不变的基础上，合成基因编码区，根据得到的基因编码区核苷酸序列设计引物扩增了VvMRP1S基因。

本发明中，所述合成基因编码区的设计原则包括以下部分：

(一)优化基因密码子，提高基因翻译效率；

(二)消除基因内部的常用限制性内切酶的识别位点，便于表达盒构建；

(三)消除逆向重复序列、茎环结构和转录终止信号，使基因内部的GC/AT均衡，提高RNA的稳定性；

(四)使基因编码蛋白符合N端原则(Tobias 1991)，以提高翻译蛋白的稳定性；

(五)设计提高基因5'端的自由能，以提高基因翻译起始效率。

本发明还提供了一种植物双元载体，pcAMBIA-1301载体中包含所述的葡萄转运蛋白VvMRP1S编码基因和连接在所述编码基因VvMRP1S两端的烟草的染色质附着SAR序列。

本发明中，所述植物双元载体的构建方法，优选包括以下步骤：

①将pcAMBIA-1301载体在BamHI和Sacl酶的作用下进行酶切，得到酶切后的线性pcAMBIA-1301载体；

②葡萄转运蛋白VvMRP1S编码基因两端添加BamHI和Sacl酶切位点；

③在所述步骤②中得到的具有BamHI和Sacl酶切位点的葡萄转运蛋白VvMRP1S编码基因的两端添加上烟草的染色质附着SAR序列，得到两端附加了烟草的染色质附着SAR序列的外源基因的表达单元；

④将所述步骤①得到的线性pcAMBIA-1301载体和所述步骤③得到表达单元连接，得到植物双元载体。

本发明中，所述通过将扩增葡萄转运蛋白VvMRP1S编码基因的引物中添加BamHI和Sacl酶切位点，使扩增得到的葡萄转运蛋白VvMRP1S编码基因连接上BamHI和Sacl酶切位点。所述引物包括正向引物和反向引物。所述正向引物的核苷酸序列为GGATCCATGGCATTTGAACCACTGGTTTGG(SEQ ID No.3)。所述反向引物的的核苷酸序列为GAGCTCTTAGAATTCCATCTC AGTCAGGTCC(SEQ ID No.4)。本发明对扩增体系没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的扩增体系即可；所述扩增程序为：94℃预热1min；94℃，30s，50℃，50s，72℃，2min，共25个循环。

本发明中，所述植物双元载体中外源基因的表达由双CAMV355启动子和TMV omegaleader序列控制。所述双CAMV355启动子和TMV omega leader序列同SAR序列一同连接到外源基因中。

本发明还提供了所述的葡萄转运蛋白VvMRP1S编码基因或所述的植物双元载体在培育抗重金属植物中的应用。

本发明中，所述植物优选包括拟南芥。

本发明中，所述重金属优选为离子状态重金属，所述离子状态的重金属包括镉离子。所述镉离子的摩尔浓度优选为50～200μM，更优选为100μM。

本发明中，所述培育的方法优选采用农杆菌介导法将所述葡萄转运蛋白基因VvMRP1S或所述植物双元载体转化入宿主植物中。在本发明的实施例中，所述宿主植物可具体为拟南芥。

本发明中，所述农杆菌介导法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的培育方法即可。

本发明中，培育后的抗重金属植物优选进行抗重金属功能验证。所述验证方法为将培育后的抗重金属植物自交纯合3代，获得纯合转化株，收取种子；将所述种子播种后，在22℃条件下生长两周，得到转基因培养皿小苗；将野生型和转基因培养皿小苗进行抗重金属实验。

将转VvMRP1S编码基因的拟南芥植株和野生型拟南芥植株在含有200μM浓度的氯化镉溶液中生长，比较转VvMRP1S编码基因的拟南芥植株和野生型拟南芥植株的抗重金属性。由于重金属首先抑制的根的生长，因此以根长作为比较指标。结果显示在200μM浓度的氯化镉浓度培养基处理下野生型生长明显受抑制，根系几乎不生长，平均根长为0.1cm，叶片稀少，而对转基因株系平均根长达到0.9cm。说明VvMRP1S基因明显提高了拟南芥的抗重金属能力。

本发明中，所述抗重金属实验的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的抗重金属实验即可。

下面结合实施例对本发明提供的葡萄转运蛋白VvMRP1S及其编码基因、植物双元载体和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

本发明所用的试验材料及其来源如下：

野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana)和生态型拟南芥Columbia在23℃人工气候室培养，16h光照培养，光照强度为130μmol/(m²·s)。

克隆载体pMD-18-Simple T、各类限制性内切酶、Taq聚合酶、连接酶、dNTP、10×PCR缓冲液和DNAmarker购自宝生物工程大连有限公司。

所有的化学试剂购买自美国西格玛化学公司和上海国药化学试剂。

测序试剂盒购自美国应用系统公司的ABI PRIAM Big-Dye Terminator DNA测序试剂盒。

本发明所用的试剂若未明确指明，则均购自西格玛－奥德里奇(Sigma－Aldrich)。

实施例1

葡萄转运蛋白VvMRP1S基因的人工合成

根据Genbank登录的葡萄转运蛋白VvMRP1基因序列，用以基因合成方法【NucleicAcids Research,2004,32,e98】，在不改变基因编码的氨基酸序列的前提下，按以下原则进行合成基因编码区的设计：(一)优化基因密码子，提高基因翻译效率。(二)消除基因内部的常用限制性内切酶的识别位点，便于表达盒构建。(三)消除逆向重复序列、茎环结构和转录终止信号，使基因内部的GC/AT均衡，提高RNA的稳定性。(四)使基因编码蛋白符合N端原则(Tobias 1991)，以提高翻译蛋白的稳定性。(五)设计提高基因5’端的自由能，以提高基因翻译起始效率。

所述正向引物的核苷酸序列为GGATCCATGGCATTTGAACCACTGG TTTGG(SEQ IDNo.3)。所述反向引物的的核苷酸序列为GAGCTCTTAG AATTCCATCTCAGTCAGGTCC(SEQ IDNo.4)。由于所述正向引物和反向引物中有Bam HI和Sac I酶的酶切位点，扩增产物为添加上Bam HI和Sac I酶的酶切位点的VvMRP1S编码基因的DNA片段。

扩增条件为：94℃预热1min；94℃，30s，50℃，50s，72℃，2min，使用的Taq DNA聚合酶为KOD FX taq酶(Toyobo公司，日本)，共25个循环。

PCR结束后，1％琼脂糖胶回收，取10μl直接与T/A克隆载体相连(大连宝生物公司)。4℃连接过夜，高效转化DH5α感受态中。经过菌落PCR验证，获得阳性克隆。

实施例2

葡萄转运蛋白VvMRP1S农杆菌双元载体的构建

上述人工合成的VvMRP1S基因的阳性克隆用引物经PCR扩增后头尾分别加入BamHI和Sac I酶切切点，经Bam HI+Sac I双酶切，回收DNA片段与包含烟草的染色质附着SAR序列的外源基因的表达单元的pcAMBIA-1301载体相连，经酶切鉴定和测序后得到正确的双元载体(见图1)。

实施例3

电击法转化农杆菌

1)制备农杆菌GV3101感受态，方法参照MicroPulserTM ElectroporationApparatus Operating Instructions and Application Guide(BIO-RAD公司)((Raineriet al.,Bio.Tech.,1990,8:33-38)。

2)取50μL GV3101感受态细胞，加入1μL DNA，转入0.2cm电击杯转化(400Ω，2.5KV，25μf)。加入1mL含有1％甘露醇的LB培养基恢复培养2小时(28℃，250rpm)。分别取10μL、100μL涂LB平板(利福平50μg/mL，庆大霉素50μg/mL，氯霉素100μg/mL)。

3)挑取若干个克隆，碱法抽提农杆菌质粒，并将农杆菌质粒进行酶切鉴定和PCR检测，最终得到阳性转化子。

实施例4

农杆菌介导转化拟南芥

A拟南芥的培养

1)拟南芥种子在4℃进行2～3天的春化处理，目的是有利于种子的一致萌发和花期的提前。

2)将蛭石、黑土、珍珠岩按9：3：0.5的比例拌匀，经高温灭菌后装于10cm的塑料小盆，以营养液PNS浸湿待用。

3)以牙签将拟南芥种子点播于湿润的基质上，保鲜膜封口。放置于22℃暗培养2～3天，待种子萌发后，揭开保鲜膜，置于22℃培养室中进行16小时光照培养。

4)拟南芥抽苔后及抽苔后两周以及转化后需再以PNS营养液浸湿一次。中途可视情况适当浇水。首次抽苔后需剪去初生苔，利于次生苔的生长，当次生苔长至2～10cm(少数已经开花)可用于转化(参考文献：何玉科，巩振辉，细跑生物学杂志,1991,13(3):97-101)。

B农杆菌的准备

1)挑取农杆菌单菌接种于5mL LB液体培养基(利福平50μg/mL，氯霉素100μg/mL)中，28℃，250rpm培养20小时。(Rashid et al.,1996)

2)取1mL菌液转接入20～30mLLB液体培养基(利福平50μg/mL，氯霉素100μg/mL)中，28℃，250rpm培养约12小时，测OD600≈1.5。

3)8000rpm，4℃，10min离心收集菌体，重悬于农杆菌转化渗透液(5％蔗糖，0.05％SilwetL-77)并稀释至OD600≈0.8。

C拟南芥蘸花法转化

1)将拟南芥的花苔浸入渗透液中，轻轻搅动约3～5秒后取出，全部转化完毕后，托盘中加入PNS营养液，以黑色塑料袋套盆封口，保持湿润环境，置于22℃培养室低光强度下生长24小时，即可正常培养。

2)初次转化四天后，可再进行一次转化，重复两次，总共转化三次，这样可以在花发育的不同时期进行转化，提高转化效率。

3)生长约两个月后，收集种子，4℃冰箱贮存待用。

实施例5

拟南芥转化植株种子的筛选

1)称25～30mg种子放入1.5mL离心管。

2)1mL 75％乙醇消毒1min(不停摇晃振荡)，8000rpm离心5秒，去上清。

3)加入1mL过滤后的漂白粉消毒15min(不停摇晃振荡，充分消毒)，8000rpm离心5秒，去上清。

4)无菌水洗涤3－4次。

5)将种子均匀的播撒到1/2MS平板(Hyg 50μg/mL)上，Parafilm膜封口，4℃冰箱放置两天，22℃，16小时光照培养6天。

6)将抗性植株移栽到盆中培养，苗稍大后，进行GUS活性检测，选出阳性植株(T1)继续培养，并收集种子进行T2代和T3代筛选。

实施例6

转基因阳性植株的检测

按Jefferson(1978)的方法，将待测拟南芥叶片样品与X-Gluc染色反应液(50mmol/L NaH2PO4，pH 7.0；0.5m mol/LK₄[Fe(CN)₆]，0.1％Triton X-100，20％甲醇，0.5mg/mL X-Gluc[X-glucuronide])于37℃保温2～4小时后，用75％乙醇脱色观察。

由图2可以看出，植物叶片部分为蓝色，说明拟南芥叶片样品为转基因阳性植株。

实施例7

葡萄转运蛋白VvMRP1S基因转化植物后的抗重金属分析

将转化植物自交纯合3代，获得纯合转化株，收取种子。播种后，在22℃生长两个星期。然后将转VvMRP1S基因的拟南芥植株和野生型拟南芥植株在含有200μM浓度的氯化镉溶液中生长，比较转VvMRP1S基因的拟南芥植株和野生型拟南芥植株的抗重金属性。由于重金属首先抑制的根的生长，因此以根长作为比较指标。

结果如图3所示，野生型和转VvMRP1S基因拟南芥植株在表型上有很大的差异。结果显示在200μM浓度的氯化镉浓度培养基处理下野生型生长明显受抑制，根系几乎不生长，平均根长为0.1cm，叶片稀少，而对转基因株系平均根长达到0.9cm。说明VvMRP1S基因明显提高了拟南芥的抗重金属能力。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 上海市农业科学院

上海市建设用地和土地整理事务中心

<120> 葡萄转运蛋白VvMRP1S、编码基因及其在培育抗重金属植物中的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 4893

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggatccatgg catttgaacc actggtttgg tactgtcaac ctgttgcaaa tggtgtctgg 60

gcaaaggctg ctgaatctgc attcggtcca tacactccat gtgctgttga ctccattgtt 120

gtctgcatct ctcatctggt tctgttgggt ctgtgctgct accgtatctg gctgatcaag 180

atggacttca aagtccaacg tttctgcctg caatccaact actacaacta catgttggga 240

ctgttggcat gttactgcac tgctgaacca ttgttccgtc tggtcatggg tgtctctatc 300

ttcgatctgg atgaacagac tggtcttgct ccatacgaga tcgtctctct gatcatcgaa 360

gctgctacct ggtgctccat gctggtcatg atcggtgttg agaccaaaat ctacatccgt 420

cagttccgtt ggtacgtccg tttcggtgtc atctacctgt tggttggtga tgctgtcatg 480

ctgaacctga tcctgtctct gaaggactcc tactctcgtt ctgtcctgta cccaccaatc 540

tcttctgtcc tgtgtcaggt tctgttcggt atctgcctgc tggtccatgt ccctaacttg 600

aacccatacg tcggttacac tccaatgcag tctgactctc tggagaacac caagtacgaa 660

gtcctgcctg gtggtgatca aatctgtcct gagaaacatg ccaacatgtt ctctcgtatc 720

tacttcggtt ggatgactcc actgatgcag caaggctaca agaagccaat cactgagaag 780

gacatctgga agctggacac ttgggatcag accgagaccc tttctcgtcg tttccagaag 840

tgttggatcg aagagtccca acgttccaag ccacgtcttc ttcgtgcact gaactgctct 900

cttggtggtc gtttctggcg tggtggtttc ttcaagatcg gtaacgacct gtctcagttc 960

gttggtcctg tcttgctgaa ccatctgttg cagtccatgc aacgtggtga tcctgcatgg 1020

attggttaca tctacgcatt ctccatcttc attggtgtct ccttgggtgt cctgtgtgaa 1080

gcacagtact tccagaacgt catgcgtgtc ggtttccgtc tgcgttccac tctggttgct 1140

gccatcttcc gtaagtccct gcgtctgact catgagggtc gtaagaactt cccatctggt 1200

aagatcacca acatgatgac caccgatgct aacgcactgc aacaaatctg tcaacaactt 1260

catgcattgt ggtctgcacc attccgtatc atcatcgcta tggttcttct gtaccagcaa 1320

ctgggtgttg catctctgct tggttctctg atgctgcttc tgatgctgcc aatccagacc 1380

ttcatcatct ccaagatgcg taaactgtcc aaggaaggtc tgcaacgtac tgacaagcgt 1440

gtctccctga tgaacgagat tctggctgct atggacactg tcaagtgcta cgcatgggag 1500

aagtccttcc agtccaaggt tcaatccatg cgtaacgatg aactgtcttg gttccgtaaa 1560

gcacaactgc tgtctgcttg caactccttc atcctgaact ccatccctgt catcgtcacc 1620

gtcacctcct tcggtgcatt cactctgctt ggtggtgact tgactcctgc acgtgcattc 1680

acctccctgt ctctgttcgc tgttctgcgt ttcccattga acatgctgcc taacttgatc 1740

acccaggttg tcactgcaca tgtctctatc caacgtctgg agcaactgtt cttgactgaa 1800

gaacgtgttc ttgcaccaaa cccaaccctt gaacctggtc ttcctgccat ctccatcaag 1860

gatggttact tctcctggga ttccaaggtc gagaagccaa ctttgtctaa catcaacctg 1920

gacatccctg ttggttcctt ggttgctgtc gttggtggta ctggtgaagg taagacctct 1980

ctgatctctg caatgcttgg tgagctgcct ccattgtccg acgcatctgt cgtcatccgt 2040

ggtactgttg catacgttcc tcaaatctcc tggatcttca acgctactgt tcgtggtaac 2100

atcttgttcg gttccgactt cgaacctgca cgttactgga aggctatcga cgtcactgag 2160

ctgcaacatg acctggactt gctgcctggt catgatctga ccgagattgg tgaacgtggt 2220

gtcaacatct ctggtggtca gaagcaacgt gtctctatgg ctcgtgctgt ctactccaac 2280

tccgatgtct acatcttcga tgatccactg tctgcactgg atgcacatgt cgctcaacag 2340

gtcttctcca actgcatcaa ggaagagttg aagggtaaga cccgtgtcct tgtcaccaac 2400

cagctgcact tccttccaca tgtcgatcgt atcatcctgg tctctgatgg tactgtcaaa 2460

gaagacggta ctttcgatga cctgtccaag aactccaagt tgttccagaa gctgatggag 2520

aacgctggta agatggaaga gcaagtcgaa gagaacgagt gtcgtgagaa cctgtccaac 2580

aacaagtcca agccaaccac caatggtgaa gtcaacgagc tgccaaagaa cgcaatccac 2640

tccaacaaag gtaaggaagg taagtccgtc ctgatcaagc aggaagaacg tgagactggt 2700

atcgtctctt ggaaggttct gatgcgttac aaagacgcac tgggtggtct gtgggtcgtc 2760

accctgctgt ttgcctgcta cgtcttgacc gaagttcttc gtgtcttgtc ttccacctgg 2820

ttgtctgtct ggaccgatca atccatgtcc aaggactatc gtcctggtta ctacaacctg 2880

atctacgcac ttctgtcctt cggtcaggtc atggtcactc tgggtaactc cttctggttg 2940

atcacctcct ctcttcacgc tgccaagatt ctgcacaatg tcatgttgaa ctccattttg 3000

cgtgctccta tggtcttctt ccacaccaac cctatcggtc gtatcatcaa ccgttttgcc 3060

aaggatcttg gtgacatcga tcgtaacgtt gcaccatctg ctaacatgtt cctgggtcaa 3120

gtctggcagc tgctgtccac cttcgtcctg attgccattg tctccaccat ctccctgtgg 3180

gcaatcatgc cacttctgat cttgttctat gctgcctatc tgtactacca gtccacttct 3240

cgtgaagtca aacgtctgga ctccatcact cgttctcctg tctacgcaca gttcggtgaa 3300

gcattgaacg gtttgtccac cattcgtgca tacaaagcat acgatcgtat ggcatccatc 3360

aacggtaagt ctatggacaa caacatccgt ttcacccttg ctaacatctc ctccaatcgt 3420

tggcttacca ttcgtctgga gaccttgggt ggtctgatga tctgtctgac tgcaaccttc 3480

gctgtcatgg agaactctcg tgaagagaac cctgctgcat tcgcatccac tatgggtctg 3540

ctgctgtcct acactctgaa catcacctct ctgttgtctg gtgttcttcg tcaagcatct 3600

cgtgctgaga actctttcaa cgctgttgag cgtgttggta cttacgttga tctgccttct 3660

gaggctccaa ccatcatcga gtccaaccgt cctcctcctg gttggccatc ctctggttcc 3720

attcgtttcg aggatgttgt tctgcgttac cgtcctgaac ttcctcctgt tctgcatggt 3780

atctccttca aaatctctcc atctgagaag ctgggtatcg tcggtcgtac tggtgctggt 3840

aagtcctcca tgatcaatgc actgttccgt atcgtcgaac tggaacgtgg tcgtatctgg 3900

atcgatgagt acgacatcgc aaagttcggt ctgaccgatc tgcgtaaagt cttgtccatc 3960

atcccacaat ctcctgtcct gttctctggt actgttcgtt tcaaccttga tccattcaac 4020

gaacacaacg atgctgacct gtgggaggca ttggaacgtg cacatctgaa ggatgtcatc 4080

cgtcgtaact ccttcggtct ggatgctgag gttgctgagg gtggtgagaa cttctctgtt 4140

ggtcagcgtc aactgttgtc tcttgcacgt gcactgctgc gtcgttccaa gatccttgtt 4200

ctggatgaag caactgctgc tgttgatgtt cgtactgacg ctctgattca gaagaccatc 4260

cgtgaagagt tcaagacctg caccatgctt gtcattgctc atcgtctgaa caccatcatc 4320

gactgcgatc gtattcttgt ccttgatgct ggtcaggttg ttgagtatga cactcctgaa 4380

gaactgcttc aagacgaagg ttcttccttc tctcgtatgg ttcgttctac tggtgctgcc 4440

aatgcacagt acttgcgttc cttggtcttc ggtgaggatg gtcagaagaa gtctggtcgt 4500

gaagaggcta agcaactgga tcgtcagaag cgttggcttg cttcttctcg ttgggctgct 4560

gctacccagt tcgcactgtc catctctctg acctcttccc agaatggtct tcaatttctg 4620

gatgtcgaag acgagatgaa catcctgaag aagaccaacg atgctgtcct gactctgcgt 4680

ggtgttcttg agggtactca tgacgaagtc atcgaagaga tgctgaagga gtaccaggtt 4740

cctcgtgatc gttggtggtc tgctctgtac aagatggttg aaggtcttgc tgtcatgaac 4800

cgtctggctc gtcatcgttt ccaacagtcc gaacatgact tcgaagacac cacccttgac 4860

tgggacctga ctgagatgga attctaagag ctc 4893

<210> 2

<211> 1626

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ala Phe Glu Pro Leu Val Trp Tyr Cys Gln Pro Val Ala Asn Gly

1 5 10 15

Val Trp Ala Lys Ala Ala Glu Ser Ala Phe Gly Pro Tyr Thr Pro Cys

20 25 30

Ala Val Asp Ser Ile Val Val Cys Ile Ser His Leu Val Leu Leu Gly

35 40 45

Leu Cys Cys Tyr Arg Ile Trp Leu Ile Lys Met Asp Phe Lys Val Gln

50 55 60

Arg Phe Cys Leu Gln Ser Asn Tyr Tyr Asn Tyr Met Leu Gly Leu Leu

65 70 75 80

Ala Cys Tyr Cys Thr Ala Glu Pro Leu Phe Arg Leu Val Met Gly Val

85 90 95

Ser Ile Phe Asp Leu Asp Glu Gln Thr Gly Leu Ala Pro Tyr Glu Ile

100 105 110

Val Ser Leu Ile Ile Glu Ala Ala Thr Trp Cys Ser Met Leu Val Met

115 120 125

Ile Gly Val Glu Thr Lys Ile Tyr Ile Arg Gln Phe Arg Trp Tyr Val

130 135 140

Arg Phe Gly Val Ile Tyr Leu Leu Val Gly Asp Ala Val Met Leu Asn

145 150 155 160

Leu Ile Leu Ser Leu Lys Asp Ser Tyr Ser Arg Ser Val Leu Tyr Pro

165 170 175

Pro Ile Ser Ser Val Leu Cys Gln Val Leu Phe Gly Ile Cys Leu Leu

180 185 190

Val His Val Pro Asn Leu Asn Pro Tyr Val Gly Tyr Thr Pro Met Gln

195 200 205

Ser Asp Ser Leu Glu Asn Thr Lys Tyr Glu Val Leu Pro Gly Gly Asp

210 215 220

Gln Ile Cys Pro Glu Lys His Ala Asn Met Phe Ser Arg Ile Tyr Phe

225 230 235 240

Gly Trp Met Thr Pro Leu Met Gln Gln Gly Tyr Lys Lys Pro Ile Thr

245 250 255

Glu Lys Asp Ile Trp Lys Leu Asp Thr Trp Asp Gln Thr Glu Thr Leu

260 265 270

Ser Arg Arg Phe Gln Lys Cys Trp Ile Glu Glu Ser Gln Arg Ser Lys

275 280 285

Pro Arg Leu Leu Arg Ala Leu Asn Cys Ser Leu Gly Gly Arg Phe Trp

290 295 300

Arg Gly Gly Phe Phe Lys Ile Gly Asn Asp Leu Ser Gln Phe Val Gly

305 310 315 320

Pro Val Leu Leu Asn His Leu Leu Gln Ser Met Gln Arg Gly Asp Pro

325 330 335

Ala Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Ala Phe Ser Ile Phe Ile Gly Val Ser

340 345 350

Leu Gly Val Leu Cys Glu Ala Gln Tyr Phe Gln Asn Val Met Arg Val

355 360 365

Gly Phe Arg Leu Arg Ser Thr Leu Val Ala Ala Ile Phe Arg Lys Ser

370 375 380

Leu Arg Leu Thr His Glu Gly Arg Lys Asn Phe Pro Ser Gly Lys Ile

385 390 395 400

Thr Asn Met Met Thr Thr Asp Ala Asn Ala Leu Gln Gln Ile Cys Gln

405 410 415

Gln Leu His Ala Leu Trp Ser Ala Pro Phe Arg Ile Ile Ile Ala Met

420 425 430

Val Leu Leu Tyr Gln Gln Leu Gly Val Ala Ser Leu Leu Gly Ser Leu

435 440 445

Met Leu Leu Leu Met Leu Pro Ile Gln Thr Phe Ile Ile Ser Lys Met

450 455 460

Arg Lys Leu Ser Lys Glu Gly Leu Gln Arg Thr Asp Lys Arg Val Ser

465 470 475 480

Leu Met Asn Glu Ile Leu Ala Ala Met Asp Thr Val Lys Cys Tyr Ala

485 490 495

Trp Glu Lys Ser Phe Gln Ser Lys Val Gln Ser Met Arg Asn Asp Glu

500 505 510

Leu Ser Trp Phe Arg Lys Ala Gln Leu Leu Ser Ala Cys Asn Ser Phe

515 520 525

Ile Leu Asn Ser Ile Pro Val Ile Val Thr Val Thr Ser Phe Gly Ala

530 535 540

Phe Thr Leu Leu Gly Gly Asp Leu Thr Pro Ala Arg Ala Phe Thr Ser

545 550 555 560

Leu Ser Leu Phe Ala Val Leu Arg Phe Pro Leu Asn Met Leu Pro Asn

565 570 575

Leu Ile Thr Gln Val Val Thr Ala His Val Ser Ile Gln Arg Leu Glu

580 585 590

Gln Leu Phe Leu Thr Glu Glu Arg Val Leu Ala Pro Asn Pro Thr Leu

595 600 605

Glu Pro Gly Leu Pro Ala Ile Ser Ile Lys Asp Gly Tyr Phe Ser Trp

610 615 620

Asp Ser Lys Val Glu Lys Pro Thr Leu Ser Asn Ile Asn Leu Asp Ile

625 630 635 640

Pro Val Gly Ser Leu Val Ala Val Val Gly Gly Thr Gly Glu Gly Lys

645 650 655

Thr Ser Leu Ile Ser Ala Met Leu Gly Glu Leu Pro Pro Leu Ser Asp

660 665 670

Ala Ser Val Val Ile Arg Gly Thr Val Ala Tyr Val Pro Gln Ile Ser

675 680 685

Trp Ile Phe Asn Ala Thr Val Arg Gly Asn Ile Leu Phe Gly Ser Asp

690 695 700

Phe Glu Pro Ala Arg Tyr Trp Lys Ala Ile Asp Val Thr Glu Leu Gln

705 710 715 720

His Asp Leu Asp Leu Leu Pro Gly His Asp Leu Thr Glu Ile Gly Glu

725 730 735

Arg Gly Val Asn Ile Ser Gly Gly Gln Lys Gln Arg Val Ser Met Ala

740 745 750

Arg Ala Val Tyr Ser Asn Ser Asp Val Tyr Ile Phe Asp Asp Pro Leu

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Ser Ala Leu Asp Ala His Val Ala Gln Gln Val Phe Ser Asn Cys Ile

770 775 780

Lys Glu Glu Leu Lys Gly Lys Thr Arg Val Leu Val Thr Asn Gln Leu

785 790 795 800

His Phe Leu Pro His Val Asp Arg Ile Ile Leu Val Ser Asp Gly Thr

805 810 815

Val Lys Glu Asp Gly Thr Phe Asp Asp Leu Ser Lys Asn Ser Lys Leu

820 825 830

Phe Gln Lys Leu Met Glu Asn Ala Gly Lys Met Glu Glu Gln Val Glu

835 840 845

Glu Asn Glu Cys Arg Glu Asn Leu Ser Asn Asn Lys Ser Lys Pro Thr

850 855 860

Thr Asn Gly Glu Val Asn Glu Leu Pro Lys Asn Ala Ile His Ser Asn

865 870 875 880

Lys Gly Lys Glu Gly Lys Ser Val Leu Ile Lys Gln Glu Glu Arg Glu

885 890 895

Thr Gly Ile Val Ser Trp Lys Val Leu Met Arg Tyr Lys Asp Ala Leu

900 905 910

Gly Gly Leu Trp Val Val Thr Leu Leu Phe Ala Cys Tyr Val Leu Thr

915 920 925

Glu Val Leu Arg Val Leu Ser Ser Thr Trp Leu Ser Val Trp Thr Asp

930 935 940

Gln Ser Met Ser Lys Asp Tyr Arg Pro Gly Tyr Tyr Asn Leu Ile Tyr

945 950 955 960

Ala Leu Leu Ser Phe Gly Gln Val Met Val Thr Leu Gly Asn Ser Phe

965 970 975

Trp Leu Ile Thr Ser Ser Leu His Ala Ala Lys Ile Leu His Asn Val

980 985 990

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995 1000 1005

Pro Ile Gly Arg Ile Ile Asn Arg Phe Ala Lys Asp Leu Gly Asp Ile

1010 1015 1020

Asp Arg Asn Val Ala Pro Ser Ala Asn Met Phe Leu Gly Gln Val Trp

1025 1030 1035 1040

Gln Leu Leu Ser Thr Phe Val Leu Ile Ala Ile Val Ser Thr Ile Ser

1045 1050 1055

Leu Trp Ala Ile Met Pro Leu Leu Ile Leu Phe Tyr Ala Ala Tyr Leu

1060 1065 1070

Tyr Tyr Gln Ser Thr Ser Arg Glu Val Lys Arg Leu Asp Ser Ile Thr

1075 1080 1085

Arg Ser Pro Val Tyr Ala Gln Phe Gly Glu Ala Leu Asn Gly Leu Ser

1090 1095 1100

Thr Ile Arg Ala Tyr Lys Ala Tyr Asp Arg Met Ala Ser Ile Asn Gly

1105 1110 1115 1120

Lys Ser Met Asp Asn Asn Ile Arg Phe Thr Leu Ala Asn Ile Ser Ser

1125 1130 1135

Asn Arg Trp Leu Thr Ile Arg Leu Glu Thr Leu Gly Gly Leu Met Ile

1140 1145 1150

Cys Leu Thr Ala Thr Phe Ala Val Met Glu Asn Ser Arg Glu Glu Asn

1155 1160 1165

Pro Ala Ala Phe Ala Ser Thr Met Gly Leu Leu Leu Ser Tyr Thr Leu

1170 1175 1180

Asn Ile Thr Ser Leu Leu Ser Gly Val Leu Arg Gln Ala Ser Arg Ala

1185 1190 1195 1200

Glu Asn Ser Phe Asn Ala Val Glu Arg Val Gly Thr Tyr Val Asp Leu

1205 1210 1215

Pro Ser Glu Ala Pro Thr Ile Ile Glu Ser Asn Arg Pro Pro Pro Gly

1220 1225 1230

Trp Pro Ser Ser Gly Ser Ile Arg Phe Glu Asp Val Val Leu Arg Tyr

1235 1240 1245

Arg Pro Glu Leu Pro Pro Val Leu His Gly Ile Ser Phe Lys Ile Ser

1250 1255 1260

Pro Ser Glu Lys Leu Gly Ile Val Gly Arg Thr Gly Ala Gly Lys Ser

1265 1270 1275 1280

Ser Met Ile Asn Ala Leu Phe Arg Ile Val Glu Leu Glu Arg Gly Arg

1285 1290 1295

Ile Trp Ile Asp Glu Tyr Asp Ile Ala Lys Phe Gly Leu Thr Asp Leu

1300 1305 1310

Arg Lys Val Leu Ser Ile Ile Pro Gln Ser Pro Val Leu Phe Ser Gly

1315 1320 1325

Thr Val Arg Phe Asn Leu Asp Pro Phe Asn Glu His Asn Asp Ala Asp

1330 1335 1340

Leu Trp Glu Ala Leu Glu Arg Ala His Leu Lys Asp Val Ile Arg Arg

1345 1350 1355 1360

Asn Ser Phe Gly Leu Asp Ala Glu Val Ala Glu Gly Gly Glu Asn Phe

1365 1370 1375

Ser Val Gly Gln Arg Gln Leu Leu Ser Leu Ala Arg Ala Leu Leu Arg

1380 1385 1390

Arg Ser Lys Ile Leu Val Leu Asp Glu Ala Thr Ala Ala Val Asp Val

1395 1400 1405

Arg Thr Asp Ala Leu Ile Gln Lys Thr Ile Arg Glu Glu Phe Lys Thr

1410 1415 1420

Cys Thr Met Leu Val Ile Ala His Arg Leu Asn Thr Ile Ile Asp Cys

1425 1430 1435 1440

Asp Arg Ile Leu Val Leu Asp Ala Gly Gln Val Val Glu Tyr Asp Thr

1445 1450 1455

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1460 1465 1470

Arg Ser Thr Gly Ala Ala Asn Ala Gln Tyr Leu Arg Ser Leu Val Phe

1475 1480 1485

Gly Glu Asp Gly Gln Lys Lys Ser Gly Arg Glu Glu Ala Lys Gln Leu

1490 1495 1500

Asp Arg Gln Lys Arg Trp Leu Ala Ser Ser Arg Trp Ala Ala Ala Thr

1505 1510 1515 1520

Gln Phe Ala Leu Ser Ile Ser Leu Thr Ser Ser Gln Asn Gly Leu Gln

1525 1530 1535

Phe Leu Asp Val Glu Asp Glu Met Asn Ile Leu Lys Lys Thr Asn Asp

1540 1545 1550

Ala Val Leu Thr Leu Arg Gly Val Leu Glu Gly Thr His Asp Glu Val

1555 1560 1565

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1570 1575 1580

Ser Ala Leu Tyr Lys Met Val Glu Gly Leu Ala Val Met Asn Arg Leu

1585 1590 1595 1600

Ala Arg His Arg Phe Gln Gln Ser Glu His Asp Phe Glu Asp Thr Thr

1605 1610 1615

Leu Asp Trp Asp Leu Thr Glu Met Glu Phe

1620 1625

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggatccatgg catttgaacc actggtttgg 30

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gagctcttag aattccatct cagtcaggtc c 31

Claims

1.一种葡萄的转运蛋白VvMRP1S，具有序列表中如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。

2.一种葡萄的转运蛋白VvMRP1S编码基因，具有序列表中SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。

3.一种植物双元载体，pcAMBIA-1301载体中包含权利要求2所述的葡萄转运蛋白VvMRP1S编码基因和连接在所述转运蛋白VvMRP1S编码基因两端的烟草的染色质附着SAR序列。

4.权利要求2所述的转运蛋白VvMRP1S编码基因或权利要求3所述的植物双元载体在培育抗重金属植物中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述植物包括拟南芥。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述重金属为离子状态重金属，所述离子状态重金属是镉离子。

7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述培育的方法为：采用农杆菌介导法将所述转运蛋白VvMRP1S编码基因或所述植物双元载体转化入宿主植物中。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述镉离子的摩尔浓度为50～200μmol/L。