CN103484455B - 一种转人血清白蛋白水稻品系114-7-2的侧翼序列 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种转人血清白蛋白水稻品系114-7-2的侧翼序列及其鉴定方法。本发明所提供的鉴定方法包括如下步骤：以待测水稻的基因组DNA为模板，利用特异性的引物对进行PCR检测，确定所述待测水稻是否为转人血清白蛋白水稻品系114-7-2；所述引物对的按照如下（1）或（2）的方法设计得到的：（1）分别依据序列1的第1-379位，以及第380-525位设计所述引物对中的正向引物和反向引物；（2）分别依据序列2的第1-533位，以及第534-785位设计所述引物对中的正向引物和反向引物。实验证明，本发明所提供的鉴定待测水稻是否为转人血清白蛋白水稻品系114-7-2的方法准确率高、特异性强、灵敏度高、耗时短，这为转基因安全提供了保证。

Description

一种转人血清白蛋白水稻品系114-7-2的侧翼序列

本申请是申请号为201210313098.7、申请日为2012年8月29日、发明创造名称为“转人血清白蛋白水稻品系114-7-2的侧翼序列及其鉴定方法”的分案申请。

技术领域

本发明涉及一种转hsa基因表达人血清蛋白水稻品系114-7-2的侧翼序列及其鉴定方法，具体涉及用于鉴定或辅助鉴定待测水稻是否为转人血清白蛋白水稻品系114-7-2的引物对的设计方法，转人血清白蛋白水稻品系114-7-2的鉴定方法，以及转人血清白蛋白水稻品系114-7-2外源插入片段的侧翼序列。

背景技术

水稻是我国乃至全世界最重要的粮食作物之一，是世界上食用人口最多、历史最悠久的农作物。随着生物技术的发展，转基因技术正广泛地应用于农作物改性，其中2009年我国已批准了转基因水稻Bt63的安全证书。目前，还有多个转基因品系已进入环境释放和生产性试验阶段。

转人血清白蛋白水稻品系114-7-2是由武汉大学杨代常教授利用水稻胚乳细胞的蛋白体，采用水稻胚乳特异性表达的启动子和信号肽，介导重组人血清白蛋白进入水稻胚乳细胞的内膜系统，并储存到水稻胚乳的蛋白体中，从而使重组人血清白蛋白能在水稻种子内大量积累的转基因水稻品系，所导入外源基因是人血清白蛋白（HSA）。转人血清白蛋白水稻品系114-7-2作为一个高效蛋白质表达技术平台，可以用于表达包括医药、食品添加剂、美容、营养和工业用等各种用途的蛋白质或多肽，使传统的蛋白药物的工业发酵生产方式变为农业生产方式生产，具有极高地推广价值和应用前景，可以产生巨大的经济和社会效应。

在转基因生物安全受到越来越广泛关注的当今社会，以生物技术为基础的转基因检测方法成了监管转基因植物及食品的有效手段。实时荧光PCR（Real time PCR）就是其中一个最常用最有效的方法。实时荧光PCR是在常规PCR基础上加入荧光标记探针，通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测实现对起始模板定量及定性的分析，具有高特异性和高灵敏度的优点。

目前已经有部分专利和文献报道了转基因植物外源插入载体旁侧序列，例如：彭于发等人于2007年利用基因步移和LD-PCR方法分析了水稻品系科丰6号的外源插入片段的旁侧序列，建立了转基因水稻科丰6号的品系特异性检测方法。然而，在对现有的专利和文献的分析中发现，还没有任何关于转hsa基因表达人血清蛋白水稻品系114-7-2的外源插入片段的旁侧序列的文章和专利报道。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测水稻是否为转人血清白蛋白水稻品系114-7-2的PCR引物对的设计方法。

本发明所提供的鉴定或辅助鉴定待测水稻是否为转人血清白蛋白水稻品系114-7-2的PCR引物对的设计方法，为如下（1）或（2）：

（1）依据序列表中序列2的第1-379位设计所述引物对中的正向引物，依据序列表中序列2的第380-525位设计所述引物对中的反向引物；

（2）依据序列表中序列1的第1-533位设计所述引物对中的正向引物，依据序列表中序列1的第534-785位设计所述引物对中的反向引物。

其中，序列1和序列2分别为转人血清白蛋白水稻品系114-7-2的两个侧翼序列。序列1为位于水稻基因组第5染色体上的5'端侧翼序列，全长785bp，前533bp为水稻基因组序列片段（GenBank：NC008398的第2496104-2496636位），后252bp为转化载体上T-DNA RBS序列片段。序列2为位于水稻基因组第4染色体上的5'端侧翼序列，全长525bp，前379bp为水稻基因组序列片段（GenBank：NC008397的第30911165-30911543位），后146bp为转化载体上T-DNA RBS序列片段。

本发明的另一个目的是提供一种检测或辅助检测待测水稻是否为转人血清白蛋白水稻品系114-7-2的方法。

该方法包括如下步骤：以所述待测水稻的基因组DNA为模板，利用根据上述方法（即鉴定或辅助鉴定待测水稻是否为转人血清白蛋白水稻品系114-7-2的PCR引物对的设计方法）设计得到的引物对进行PCR检测，从而确定所述待测水稻是否为转人血清白蛋白水稻品系114-7-2。

在本发明的一个实施例中，所述引物对具体由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA分子组成。

其中，序列3由17个核苷酸组成；序列4由20个核苷酸组成。

为了增加鉴定结果的准确度、灵敏度等，所述PCR可为实时荧光PCR。

所述实时荧光PCR所采用的探针可为TaqMan荧光探针，在本发明中，所述探针的核苷酸序列具体如序列表中序列5所示。

其中，序列5由21个核苷酸组成。

TaqMan荧光探针是一种寡核苷酸探针，报告荧光基团连接在探针的5’末端，淬灭荧光基团连接在探针的3’末端。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

所述报告荧光基团可为Fam（FAM）、Hex(HEX)、Tet(TET)、Joe(JOE)、Vic(VIC)、Fite(FITE)、Cy3(CY3)或Cy5(CY5)。所述淬灭荧光基团可为Tamra（TAMRA）、Rox(ROX)、Dabcy(DABCY)、Bhq1(BHQ1)或Bhq2(BHQ2)。在本发明中，所述探针5’端标记的报告荧光基团具体为FAM荧光基团，3’端标记的淬灭荧光基团具体为TAMRA荧光基团。

所述实时荧光PCR的PCR体系中，所述引物对中的两条引物以及所述探针的摩尔比可为2：2：1。

在本发明的一个实施例中，反应起始时，所述引物对中的两条引物的浓度均为0.2μmol/L，所述探针的浓度为0.1μmol/L。

所述实时荧光PCR的退火温度可为60℃。

在本发明的一个实施例中，所述实时荧光PCR的反应参数具体如下：50℃2min；95℃10min；95℃5s，60℃1min，共40个循环。

本发明的再一个目的是提供转人血清白蛋白水稻品系114-7-2外源插入片段的侧翼序列。

本发明所提供的转人血清白蛋白水稻品系114-7-2外源插入片段的侧翼序列的核苷酸序列具体为序列表中的序列1或序列2。

其中，序列1和序列2分别为转人血清白蛋白水稻品系114-7-2的两个侧翼序列。序列1为位于水稻基因组第5染色体上的5'端侧翼序列，全长785bp，前533bp为水稻基因组序列片段（GenBank：NC008398的第2496104-2496636位），后252bp为转化载体上T-DNA RBS序列片段。序列2为位于水稻基因组第4染色体上的5'端侧翼序列，全长525bp，前379bp为水稻基因组序列片段（GenBank：NC008397的第30911165-30911543位），后146bp为转化载体上T-DNA RBS序列片段。

利用上述方法（鉴定或辅助鉴定待测水稻是否为转人血清白蛋白水稻品系114-7-2的PCR引物对的设计方法）设计得到的鉴定或辅助鉴定待测水稻是否为转人血清白蛋白水稻品系114-7-2的PCR引物对法也属于本发明的保护范围。

实验证明，本发明通过实时荧光PCR的方法，利用根据转hsa基因表达人血清蛋白水稻品系114-7-2的侧翼序列设计得到由序列表中序列3和序列4所示的引物对，以及序列5所示的探针可以检测待测水稻是否为转hsa基因表达人血清蛋白水稻品系114-7-2，且该方法准确率高、特异性强、灵敏度高、耗时短。这为转基因安全提供了保证。

附图说明

图1为HSA基因表达盒图谱。

图2为实时荧光PCR检测品系特异性结果。其中，△Rn是Rn扣除基线后得到的标准化结果（△Rn=Rn–基线）。Rn（Normalized reporter）是荧光报告基团的荧光发射强度与参比染料的荧光发射强度的比值。标记1处所示线条表示转人血清白蛋白水稻品系114-7-2。

图3为实时荧光PCR检测转人血清白蛋白水稻品系114-7-2的灵敏度实验结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

转HSA基因水稻（GMO+），即转人血清白蛋白水稻品系114-7-2：Large-scaleproduction of functional human serum albumin from transgenic rice seeds.Proceedings ofthe National Academy of Sciences10.1073/pnas.1109736108。

非转基因水稻台北309（GMO-）：水稻醇溶蛋白4a基因启动子在转基因水稻中的特异性表达.农业生物技术学报，JOURNAL OF AGRICULTURAL BIOTECHNOLOGY，1999年03期。

转基因番茄“华番1号”：黄文胜陈红运赵文军陈颖徐宝梁朱水芳.转基因延熟番茄"华番一号"的品系特异性检测方法[J].植物检疫，2005，(6):321-324.

转基因水稻“克螟稻”：植酸酶基因定性PCR检测方法及阳性质粒分子的构建.作物学报ACTA AGRONOMICA SINICA2012，38(4):639-647.ISSN0496-3490。

转基因水稻“科丰6号”：植酸酶基因定性PCR检测方法及阳性质粒分子的构建.作物学报ACTA AGRONOMICA SINICA2012，38(4):639-647.ISSN0496-3490。

转基因水稻“华恢1号”：转Bt基因抗虫水稻对稻田生物群落的影响四川农业大学学报2003，21(2):185-186

转基因水稻Bt63：植酸酶基因定性PCR检测方法及阳性质粒分子的构建.作物学报ACTA AGRONOMICA SINICA2012，38(4):639-647.ISSN0496-3490。

转Bt基因抗虫棉：转Bt抗虫棉各器官毒蛋白的含量及表达.农业生物技术学报，2002年第3期。

转基因玉米MON810：植酸酶基因定性PCR检测方法及阳性质粒分子的构建.作物学报ACTA AGRONOMICA SINICA2012，38(4):639-647.ISSN0496-3490。

转基因玉米MON88017：植酸酶基因定性PCR检测方法及阳性质粒分子的构建.作物学报ACTA AGRONOMICA SINICA2012，38(4):639-647.ISSN0496-3490。

转基因玉米NK603：植酸酶基因定性PCR检测方法及阳性质粒分子的构建.作物学报ACTA AGRONOMICA SINICA2012，38(4):639-647.ISSN0496-3490。

实施例1、转人血清白蛋白水稻品系114-7-2的外源插入片段侧翼序列的克隆

一、实验材料

1、植物材料

转基因水稻：转HSA基因水稻（GMO+），即转人血清白蛋白水稻品系114-7-2，该转基因水稻的转化载体含有如图1所示HSA基因表达盒。

常规水稻：非转基因水稻台北309（GMO-）。

2、酶与试剂

荧光定量ABIMIx试剂购自ABI公司，其他分子生物学试剂，如Extaq DNA聚合酶、DL2000Marker购自大连宝生物生物工程有限公司。其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。引物由上海生工生物技术有限公司合成。

3、实验仪器

PCR扩增仪：Veriti^TM96孔梯度PCR仪（ABI公司）

核酸电泳仪：DYY-Ⅲ型核酸电泳仪（北京六一仪器厂）

其它仪器包括：离心机、电子天平、培养箱等。

二、实验方法

1、植物基因组DNA提取和检测

（1）植物DNA的提取方法

a取转基因水稻（或常规水稻）叶片约0.1g于研钵中，加入液氮迅速研磨至粉末状。

b将叶片粉末迅速转入到事先加入700μl CTAB缓冲液（CTAB15g；1M Tris·Cl(pH8.0)75ml；0.5M EDTA30ml；NaCl61.4g；ddH₂O补足到1000ml）的2ml离心管中，轻轻混匀后，65℃水浴保温30分钟。每隔十分钟小心摇晃混匀。

c取出离心管，待冷至室温后（25℃），加入700μl等体积比的酚/氯仿（即酚和氯仿各350μl）。上下颠倒充分混合，抽提5分钟。

d室温下，12000rpm离心10分钟，用剪去头部的1ml枪头将上清转移到另一个新的离心管中，加2μl RNaseA（10mg/ml）。

e加入与上清等体积的氯仿（700μl），上下颠倒充分混合，抽提5分钟。

f室温下，12000rpm离心10分钟，吸取上清到另一新的离心管中。

g加入等体积的异丙醇（700μl），充分混匀，常温放置10分钟后可见沉淀。为沉淀完全，可在-20℃放置1-2小时。

h室温下，12000rpm离心10分钟，沉淀积于管底。弃尽上清液。

I加入700μl70%（体积百分含量）乙醇水溶液清洗30分钟。

j倒去离心管中的乙醇水溶液，使DNA沉淀在管中自然晾干。

k加入适量TE（50μl）溶解，放入-20℃冰箱保存备用。

（2）DNA检测

取5μl步骤（1）提取的DNA溶液，以0.8%的琼脂糖凝胶电泳，根据其亮度和带型来初步判断提取DNA的质量。采用紫外分光光度计测定所提取的DNA的浓度和纯度。

2、转人血清白蛋白水稻品系114-7-2的外源插入载体的侧翼序列的获得

本研究采用Genome walking的方法分离得到了转人血清白蛋白水稻品系114-7-2的两个5'端旁侧序列。Genome walking是一种扩增已知序列旁侧未知区域序列的方法，参照Genome walking试剂盒（TaKaRa Code：D316）说明，主要操作步骤如下：

（1）设计特异性引物

根据已知的T-DNA RBS序列，利用Primer5软件分别设计三条同向且退火温度较高的特异性引物（SP Primer）：SP1、SP2和SP3，SP2的位置在SP1的内侧，SP3位于SP2的内侧，送上海生工生物技术有限公司合成，见表1。

表1特异引物序列相关信息

引物名称	引物序列（5’3’）	引物长度(bp)	退火温度（Tm）
				SP1	CGTTACCCAACTTAATCGCCTTGC	24	66.3
SP2	CTCCTTCAACGTTGCGGTTCTGT	23	65.4
				SP3	AACGTGACTCCCTTAATTCTCCGC	24	65.1

（2）第1轮PCR反应

以试剂盒提供的AP Primer（AP1-AP4四种中的任意一种，以下为AP1为例）作为上游引物，SP1Primer为下游引物，进行1st PCR反应。

反应体系见表2，在PCR反应管中按表2依次加入反应试剂，在台式离心机离心10s。

表2第1轮PCR反应体系

反应程序如下：

反应结束后取出PCR反应管，对PCR反应产物进行电泳检测，或在4℃保存待用。

PCR产物的电泳检测方法如下：将0.8g琼脂糖加入100ml的1×TAE缓冲液中，加热将其溶解，配制成浓度为0.8%的琼脂糖溶液，然后按每100ml琼脂糖溶液中加入5μl SYBR GreenⅠ溶液的比例加入SYBR GreenⅠ溶液，混匀，稍适冷却后，将其倒入电泳板上，插上梳板，室温下凝固成凝胶后，放入1×TAE缓冲液中，轻轻垂直向上拔去梳板。吸取5μl的PCR产物与适量的加样缓冲液混合后加入至凝胶泳道中，在其中一个泳道加入DNA分子量标准，进行电泳。电泳结束后，取出琼脂糖凝胶，轻轻地置于凝胶成像仪上成像。若PCR产物呈弥散状，进行后续的反应。

（3）第2轮PCR反应

将第1轮PCR反应液稀释100倍后，取1μl作为第2轮PCR反应的模板，以与第1轮PCR反应相同的AP Primer（以AP1为例）为上游引物，SP2Primer为下游引物，进行第2轮PCR反应，反应体系见表3。

表3第2轮PCR反应体系

反应程序如下：

反应结束后取出PCR反应管，对PCR反应产物进行电泳检测或在4℃保存待用。

PCR产物的电泳检测方法同步骤（2）所述。若PCR产物呈弥散状条带，进行后续的反应。

（4）第3轮PCR反应

将第2轮PCR反应液稀释100倍后，取1μl作为第3轮PCR反应的模板，以与第1轮PCR反应相同的AP Primer（以AP1为例）为上游引物，SP3Primer为下游引物，进行第3轮PCR反应，反应体系如表4。

表4第3轮PCR反应体系

反应程序如下：

PCR产物的电泳检测方法同步骤（2）所述。结果表明，只有AP1引物的第3轮PCR产物呈清晰电泳条带，切胶回收。

（5）序列测序和分析

采用天根公司的PCR产物回收试剂盒回收第3轮PCR扩增产物，连接到PMD18载体（TaKaRa公司）上，转化大肠杆菌，将得到的阳性克隆送到华大基因公司进行测序。采用DNA Star(ver5.01)和BioXM(ver2.6)比较和分析测定的序列与载体序列相似性，在NCBI数据库（http://www.ncbi.nlm.nib.gov/）中检索相似的水稻基因组序列。

三、实验结果

采用Genome walking扩增获得了转人血清白蛋白水稻品系114-7-2的两个外源插入片段的侧翼序列。

1、位于第5染色体上的5'端侧翼序列

位于第5染色体上的5'端侧翼序列全长785bp，其核苷酸序列如序列表中序列1所示。该5'端侧翼序列由水稻基因组序列片段（533bp）和转化载体上T-DNA RBS序列片段（252bp）两部分组成。具体的，序列1的第1-533位为所述水稻基因组序列片段为的水稻基因组序列（GenBank：NC008398的第2496104-2496636位）；序列1的第534-785位为所述转化载体上T-DNA RBS序列片段。

2、位于第4染色体上的5'端侧翼序列

位于第4染色体上的5'端侧翼序列全长525bp其核苷酸序列如序列表中序列2所示。该5'端侧翼序列由水稻基因组序列片段（379bp）和转化载体上T-DNA RBS序列片段（146bp）两部分组成。具体的，序列2的第1-379位为所述水稻基因组序列片段为的水稻基因组序列（GenBank：NC008397的第30911165-30911543位）；序列2的第380-525位为所述转化载体上T-DNA RBS序列片段。

实施例2、鉴定待测水稻是否为转人血清白蛋白水稻品系114-7-2的引物的设计

本实施例将根据实施例1获得的转人血清白蛋白水稻品系114-7-2的外源插入片段的侧翼序列设计用于鉴定或辅助鉴定待测水稻是否为转人血清白蛋白水稻品系114-7-2的特异性PCR检测引物对，其设计方法可为如下（1）或（2）：

（1）依据序列表中序列1的第1-379位设计所述引物对中的正向引物，依据序列表中序列1的第380-525位设计所述引物对中的反向引物；

（2）依据序列表中序列2的第1-533位设计所述引物对中的正向引物，依据序列表中序列2的第534-785位设计所述引物对中的反向引物。

根据上述（2）所述的设计方法，即针对位于第4染色体上的5'端侧翼序列，序列2进行设计，得到如下用于鉴定或辅助鉴定待测水稻是否为转人血清白蛋白水稻品系114-7-2的特异性PCR检测引物对：

HSA-F（正向）：5’-CCGACGCGGAGGAAGAC-3’（序列3）（序列2的第348-364位的序列）

HSA–R（反向）：5’-CGTTTCCCGCCTTCAGTTTA-3’（序列4）（序列2的第396-415位的反向互补序列）

另外，根据上述设计的引物对（HSA-F和HSA-R）设计得到如下探针（TaqMan探针）：

HSA–P：5’-CGGAGGCGGCGTCAAACACTG-3’（序列5）（序列2的第369-389位）

探针HSA–P的5’端用报告荧光基团FAM标记，3’端用淬灭荧光基团TAMRA标记。

实施例3、实施例2的引物对和探针的特异性检测

用实施例2得到的引物对和探针分别检测转人血清白蛋白水稻品系114-7-2、非转基因水稻台北309（GMO-）、转基因番茄“华番1号”、转基因水稻Bt63、转Bt基因抗虫棉、转基因水稻“克螟稻”、转基因水稻“科丰6号”、转基因水稻“华恢1号”、转基因玉米MON810、转基因玉米MON88017和转基因玉米NK603，以验证引物对和探针的特异性。每个样品采用相同的检测方法，包括样本总DNA的提取和实时荧光PCR两个步骤。

一、样品总DNA的提取

同实施例1二1（1）。

二、实时荧光PCR

分别以步骤一获得的各样品的总DNA为模板进行实时荧光PCR。

实时荧光PCR反应体系：将12.5μl ABI TaqMan Gene Expression Master Mix（ABI公司）、5μl DNA模板、5μl灭菌超纯水、1μl正向引物（HSA-F）、1μl反向引物（HSA-R）和0.5μl探针（HSA–P）混合，得到25μl的反应体系；反应体系中，反应初始时，上下游引物的浓度均为0.2μmol/L，探针的浓度为0.1μmol/L。

实时荧光PCR反应参数：50℃2min；95℃10min；95℃15s，60℃1min，共40个循环。

反应结束后根据扩增曲线判定结果。

结果如图2所示，只有转人血清白蛋白水稻品系114-7-2有荧光信号，而其他样品中均无信号，表明实施例2得到的引物对和探针具有较强的特异性。

实施例4、实施例2的引物对和探针的的灵敏度检测

以转HSA基因水稻（GMO+）和非转基因水稻台北309（GMO-）的种子粉末为试材，将两者混合，制备转HSA基因水稻（GMO+）种子粉末重量百分比依次为5%、1%、0.5%、0.1%和0.01%（W/W）的待测混合样品，分别提取5个待测混合样品的总DNA，以20ng总DNA为模板，用实施例2得到的引物对和探针进行实时荧光PCR反应。每个样品采用相同的检测方法。实时荧光PCR反应体系及反应参数同实施例3步骤二。

结果如图3所示，述方法至少可检测转HSA基因水稻（GMO+）的重量百分比为0.01%的混合样品，表明实施例2得到的引物对和探针具有较高的灵敏度。

Claims (1)

1. 转人血清白蛋白水稻品系114-7-2外源插入片段的侧翼序列，其核苷酸序列为序列表中的序列2。