CN112301145A - 转基因水稻eb7001s-6的rpa检测引物与探针组合、试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
一种转基因水稻EB7001S‑6的RPA检测引物与探针组合、试剂盒及检测方法，根据外源插入DNA序列与水稻基因组的连接区域设计大量RPA引物，从中筛选出一对可快速有效检测出转基因水稻EB7001S‑6成分的引物及探针组合。以转基因水稻EB7001S‑6基因组DNA为模板，利用该对引物和探针进行RPA扩增及实时荧光检测，具有速度快、特异性好、灵敏度高的特点。
Description
技术领域
本申请涉及分子生物学技术领域，具体而言，涉及一种转基因水稻 EB7001S-6的RPA检测引物与探针组合、试剂盒及检测方法。
背景技术
转基因水稻EB7001S-6是中国科学院亚热带农业生态研究所研发的抗虫且耐草铵膦除草剂的转基因水稻品系，是利用基因工程技术将密码子优化的的epsps基因和来源于土壤细菌的bar基因导入水稻中而获得的耐草甘膦及草铵膦除草剂转基因品系。该品系已进入转基因生物安全评价生产性试验阶段，具有广阔的产业化前景。在已报道的对转基因水稻EB7001S-6检测方法主要是利用PCR仪在实验室中进行常规检测，但基于PCR的转基因检测方法需要PCR仪、凝胶成像系统等专业仪器设备，且扩增和产物检测时间较长(约 3～4h)，难以达到现场快速检测目的，因此，在实际工作中需要一种更加便捷、准确、且适用于现场操作的转基因检测新技术。
重组酶聚合酶等温扩增技术(RPA)，属于核酸等温扩增技术的一种。核酸等温扩增技术(isothermal nucleic acid amplification technology)是一种新型的扩增技术，恒定温度条件下即可进行反应，具有简便、快速、灵敏等优点，并可用于进行现场检验。RPA技术模拟了生物体内DNA的复制过程，重组酶蛋白在ATP参与下与单链DNA(引物)结合，形成DNA核蛋白微丝。该微丝牵扯周围的DNA分子，对模板DNA序列进行比对并搜索出与之匹配的序列，在单链结合蛋白的帮助下，双链模板DNA解链，引物和模板配对形成复制起始所需3’羟基末端，在DNA聚合酶的作用下开始复制延伸，并形成新的DNA。 RPA荧光检测技术极大的缩短了反应时间。目前尚无利用RPA技术对转基因水稻EB7001S-6进行品系特异性的鉴定方法。
发明内容
本发明提供了一种转基因水稻EB7001S-6的RPA检测引物与探针组合, 该引物包括正向引物和反向引物，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明还提供了一种转基因水稻EB7001S-6的RPA检测试剂盒，该试剂盒包括上述的引物和探针组合。
本发明还提供了一种转基因水稻EB7001S-6的RPA检测方法，该检测方法包括如下步骤：
以待测样品的基因组DNA为模板，利用前述的引物和探针组合进行RPA 扩增并进行荧光检测，如果得到明显的扩增曲线，则证明所检样品含有转基因水稻EB7001S-6成分。
进一步的，RPA扩增反应体系为每50μl反应体系中包括正向引物和反向引物各20pmol，探针5pmol，DNA模板50ng。
进一步的，RPA扩增反应体系为每50μl反应体系中还包括，再水化缓冲液29.5μl，280μM醋酸镁溶液2.5μl，余量为水。
进一步的，RPA扩增程序为39℃反应20分钟
本发明还提供一种前述的检测引物与探针组合、检测试剂盒和/或检测方法在检测转基因水稻EB7001S-6的种子资源中的应用。
本发明首次提供了转基因水稻EB7001S-6品系特异性的RPA检测方法。本发明根据外源插入DNA序列与水稻基因组的连接区域设计大量RPA引物，从中筛选出一对可快速有效检测出转基因水稻EB7001S-6成分的引物及探针组合。以转基因水稻EB7001S-6为模板，利用该对引物和探针进行荧光检测，可以得到明显的扩增曲线。本发明的RPA检测引物与探针组合、试剂盒及检测方法具有速度快、特异性好、灵敏度高的特点。
附图说明
图1为EB7001S-6引物筛选Basic电泳图，其中，1：100bp Maker，2：EB7001S-6-F1与EB7001S-6-R1，3：EB7001S-6-F1与EB7001S-6-R2，4：EB7001S-6-F1与EB7001S-6-R3， 5：EB7001S-6-F1与EB7001S-6-R4，6：EB7001S-6-F1与EB7001S-6-R5，7：EB7001S-6-F1 与EB7001S-6-R6，8：EB7001S-6-F1与EB7001S-6-R7，9：EB7001S-6-F1与EB7001S-6-R8；
图2为EB7001S-6引物筛选Basic电泳图，其中，1：100bp Maker，2：EB7001S-6-F3与EB7001S-6-R1，3：EB7001S-6-F3与EB7001S-6-R2，4：EB7001S-6-F3与EB7001S-6-R3， 5：EB7001S-6-F3与EB7001S-6-R4，6：EB7001S-6-F3与EB7001S-6-R5，7：EB7001S-6-F3 与EB7001S-6-R6，8：EB7001S-6-F3与EB7001S-6-R7，9：EB7001S-6-F3与EB7001S-6-R8；
图3为EB7001S-6引物筛选Basic电泳图，其中，1：100bp Maker，2：EB7001S-6-F4与EB7001S-6-R1，3：EB7001S-6-F4与EB7001S-6-R2，4：EB7001S-6-F4与EB7001S-6-R3， 5：EB7001S-6-F4与EB7001S-6-R4，6：EB7001S-6-F4与EB7001S-6-R5，7：EB7001S-6-F4 与EB7001S-6-R6，8：EB7001S-6-F4与EB7001S-6-R7，9：EB7001S-6-F4与EB7001S-6-R8；
图4为EB7001S-6引物筛选Basic电泳图，其中，1：100bp Maker，2：EB7001S-6-F5与EB7001S-6-R1，3：EB7001S-6-F5与EB7001S-6-R2，4：EB7001S-6-F5与EB7001S-6-R3， 5：EB7001S-6-F5与EB7001S-6-R4，6：EB7001S-6-F5与EB7001S-6-R5，7：EB7001S-6-F5 与EB7001S-6-R6，8：EB7001S-6-F5与EB7001S-6-R7，9：EB7001S-6-F5与EB7001S-6-R8；
图5为EB7001S-6引物筛选Basic电泳图，其中，1：100bp Maker，2：EB7001S-6-F6与EB7001S-6-R1，3：EB7001S-6-F6与EB7001S-6-R2，4：EB7001S-6-F6与EB7001S-6-R3， 5：EB7001S-6-F6与EB7001S-6-R4，6：EB7001S-6-F6与EB7001S-6-R5，7：EB7001S-6-F6 与EB7001S-6-R6，8：EB7001S-6-F6与EB7001S-6-R7，9：EB7001S-6-F6与EB7001S-6-R8；
图6为EB7001S-6引物筛选Basic电泳图，其中，1：100bp Maker，2：EB7001S-6-F7与EB7001S-6-R1，3：EB7001S-6-F7与EB7001S-6-R2，4：EB7001S-6-F7与EB7001S-6-R3， 5：EB7001S-6-F7与EB7001S-6-R4，6：EB7001S-6-F7与EB7001S-6-R5，7：EB7001S-6-F7 与EB7001S-6-R6，8：EB7001S-6-F7与EB7001S-6-R7，9：EB7001S-6-F7与EB7001S-6-R8；
图7为EB7001S-6引物筛选Basic电泳图，其中，1：100bp Maker，2：EB7001S-6-F8与EB7001S-6-R1，3：EB7001S-6-F8与EB7001S-6-R2，4：EB7001S-6-F8与EB7001S-6-R3， 5：EB7001S-6-F8与EB7001S-6-R4，6：EB7001S-6-F8与EB7001S-6-R5，7：EB7001S-6-F8 与EB7001S-6-R6，8：EB7001S-6-F8与EB7001S-6-R7，9：EB7001S-6-F8与EB7001S-6-R8；
图8为EB7001S-6引物筛选Basic电泳图，其中，1：100bp Maker，2：EB7001S-6-F10与EB7001S-6-R1，3：EB7001S-6-F10与EB7001S-6-R2，4：EB7001S-6-F10与EB7001S-6-R3，5：EB7001S-6-F10与EB7001S-6-R4，6：EB7001S-6-F10与EB7001S-6-R5，7：EB7001S-6-F10与EB7001S-6-R6，8：EB7001S-6-F10与EB7001S-6-R7，9：EB7001S-6-F10与EB7001S-6-R8；
图9为EB7001S-6引物筛选Basic电泳图，其中，1：100bp Maker，2：EB7001S-6-F1与EB7001S-6-R9，3：EB7001S-6-F2与EB7001S-6-R9，4：EB7001S-6-F3与EB7001S-6-R9，5：EB7001S-6-F4与EB7001S-6-R9，6：EB7001S-6-F5与EB7001S-6-R9，7：EB7001S-6-F6 与EB7001S-6-R9，8：EB7001S-6-F7与EB7001S-6-R9，9：EB7001S-6-F8与EB7001S-6-R9；
图10为EB7001S-6引物筛选Basic电泳图，其中，1：100bp Maker，2：EB7001S-6-F1与EB7001S-6-R10，3：EB7001S-6-F2与EB7001S-6-R10，4：EB7001S-6-F3与 EB7001S-6-R10，5：EB7001S-6-F4与EB7001S-6-R10，6：EB7001S-6-F5与EB7001S-6-R10， 7：EB7001S-6-F6与EB7001S-6-R10，8：EB7001S-6-F7与EB7001S-6-R10，9：EB7001S-6-F8 与EB7001S-6-R10；
图11为EB7001S-6引物筛选实时荧光检测图，其中，1：EB7001S-6-F4与 EB7001S-6-R1，2：EB7001S-6-F4与EB7001S-6-R6，3：EB7001S-6-F5与EB7001S-6-R5， 4：EB7001S-6-F4与EB7001S-6-R3，5：EB7001S-6-F5与EB7001S-6-R3，6：EB7001S-6-F4 与EB7001S-6-R7，7：EB7001S-6-F3与EB7001S-6-R10，8：空白对照；
图12为EB7001S-6引物筛选实时荧光检测图，其中，1：EB7001S-6-F6与 EB7001S-6-R1，2：EB7001S-6-F6与EB7001S-6-R10，3：EB7001S-6-F6与EB7001S-6-R3， 4：EB7001S-6-F6与EB7001S-6-R6，5：EB7001S-6-F1与EB7001S-6-R10，6：EB7001S-6-F6 与EB7001S-6-R5，7：EB7001S-6-F6与EB7001S-6-R9，8：空白对照；
图13为EB7001S-6引物筛选实时荧光检测图，其中，1：EB7001S-6-F3与EB7001S-6-R1，2：EB7001S-6-F3与EB7001S-6-R3，3：EB7001S-6-F10与EB7001S-6-R3， 4：EB7001S-6-F10与EB7001S-6-R6，5：EB7001S-6-F8与EB7001S-6-R6，6：EB7001S-6-F8 与EB7001S-6-R3，7：EB7001S-6-F8与EB7001S-6-R10，8：空白对照；
图14为引物EB7001S-6-F3与EB7001S-6-R1特异性检测图，其中，1：转基因水稻EB7001S-6，2：其他转基因水稻混合样，3：转基因玉米混合样，4：转基因大豆混合样， 5：转基因棉花混合样，6：转基因油菜混合样，7：转基因水稻EB7001S-6受体，8：空白对照；
图15为引物EB7001S-6-F3与EB7001S-6-R1特异性检测图，其中，1：转基因水稻EB7001S-6，2：非转基因水稻混合样，3：非转基因玉米混合样，4：非转基因大豆混合样， 5：非转基因棉花混合样，6：非转基因油菜混合样，7：转基因水稻EB7001S-6受体，8：空白对照；
图16为引物EB7001S-6-F4与EB7001S-6-R1特异性检测图，其中，1：转基因水稻EB7001S-6，2：其他转基因水稻混合样，3：转基因玉米混合样，4：转基因大豆混合样， 5：转基因棉花混合样，6：转基因油菜混合样，7：转基因水稻EB7001S-6受体，8：空白对照；
图17为引物EB7001S-6-F4与EB7001S-6-R1特异性检测图，其中，1：转基因水稻EB7001S-6，2：非转基因水稻混合样，3：非转基因玉米混合样，4：非转基因大豆混合样， 5：非转基因棉花混合样，6：非转基因油菜混合样，7：转基因水稻EB7001S-6受体，8：空白对照；
图18为引物EB7001S-6-F6与EB7001S-6-R1特异性检测图，其中，1：转基因水稻EB7001S-6，2：其他转基因水稻混合样，3：转基因玉米混合样，4：转基因大豆混合样， 5：转基因棉花混合样，6：转基因油菜混合样，7：转基因水稻EB7001S-6受体，8：空白对照；
图19为引物EB7001S-6-F6与EB7001S-6-R1特异性检测图，其中，1：转基因水稻EB7001S-6，2：非转基因水稻混合样，3：非转基因玉米混合样，4：非转基因大豆混合样， 5：非转基因棉花混合样，6：非转基因油菜混合样，7：转基因水稻EB7001S-6受体，8：空白对照；
图20为引物EB7001S-6-F4与EB7001S-6-R1灵敏度检测图，其中，样品1-8的DNA 模板拷贝数依次为100000；5000；1000；10000；500；100；50；0；
图21为引物EB7001S-6-F6与EB7001S-6-R1灵敏度检测图，其中，样品1-8的DNA模板拷贝数依次为100000；5000；10000；1000；500；100；50；0
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例,基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1、引物、探针组合的设计与筛选
根据转基因水稻EB7001S-6转化体特异性区域设计引物及探针。在设计引物时避免前后引物之间形成二级结构及引物间出现重复序列等问题，在探针的中后部选择两个T碱基，各标记一个荧光基团(FAM和BHQ1)，在两个基团之间有一个脱碱基位点(THF)，该位点在反应过程中被核酸外切酶识别并切割，使两个荧光基团分离产生荧光信号，特异性的探针可以实时监测荧光检测的结果。引物长度为35nt左右，RPA实验需要从靶标序列两端设计多对引物进行优化、筛选，个别碱基的增减或替换都会对实验结果产生重要影响。本发明中用于RPA方法扩增的靶标序列为水稻基因组与外源插入DNA 的5’端部分序列。针对这一转化体特异性序列，本申请设计了RPA探针(编号为EB7001S-6-P)并在探针上游与下游分别设计了10条正向引物(编号为EB7001S-6-F1至EB7001S-6-F10)、10条反向引物(编号为EB7001S-6-R1 至EB7001S-6-R10)。筛选过程中，首先使用RPA-Basic试剂盒进行扩增并进行电泳，筛选能够扩增正确条带的引物对，具体电泳结果如图1-10所示。其中有21个引物对扩增条带较好，运用RPA-EXO试剂盒进行特异性实时荧光筛选，结果如图11-13所示，其中其中图11中1号线、图12中1号线及图 13中1号线起飞时间以及扩增效果较好，其引物对与Basic实验图3中2孔道，图5中2孔道及图2中2孔道引物对一致。因此，初步筛选引物对EB7001S-6-F4+EB7001S-6-R1、EB7001S-6-F6+EB7001S-6-R1与 EB7001S-6-F3+EB7001S-6-R1用于转基因水稻EB7001S-6的品系特异性检测。其中EB7001S-6-F6+EB7001S-6-R1引物和探针组合序列见表1。
表1
注:FAM：发光基团；THF：脱碱基位点；BHQ1：淬灭基团；block：封闭基团，本次使用的碳酸化
实施例2、利用实施例1筛选的引物及探针组合对转基因水稻EB7001S-6 检测的特异性、灵敏性分析
1.实验材料
1.1植物材料
转基因水稻EB7001S-6，转基因水稻EB7001S-6受体材料，其他转基因水稻混合样，转基因玉米混合样，转基因大豆混合样，转基因棉花混合样，转基因油菜混合样，非转基因水稻混合样，非转基因玉米混合样，非转基因大豆混合样，非转基因棉花混合样，非转基因油菜混合样。
1.2酶与试剂
分子生物学试剂，TwistAmp DNA amplification Exo Kits购自TwistDX公司，TwistAmp DNA amplification Basic Kits购自TwistDX公司，其他生化试剂均为进口分装或国产分析纯。引物和探针选择实施例1中筛选得到的三组引物和探针，由北京生工生物技术有限公司合成。
1.3实验仪器
DNA处理仪器：低温混合球磨仪ΜM400(Retsch)
荧光检测仪：RPA扩增检测仪(Twista)
其它仪器包括：恒温水浴锅、电子天平、离心机、纯水仪等。
2.实验方法和过程
2.1基因组DNA的提取
依照TianGen Plant Genomic DNA Kit试剂盒的操作手册，进行植物材料DNA的提取。具体步骤如下：
⑴.取充分碾磨的植物材料种子粉末150mg，加入800μl 65℃预热的缓冲液GP1，65℃水浴60min，期间颠倒离心管数次以混合样品。
⑵.加入1：1的酚/氯仿进行抽提，12000rpm离心10min。
⑶.取上清加入800μl氯仿充分混匀，12000rpm离心10min。
⑷.取上清加入800μl缓冲液GP2，充分混匀。
⑸.将混匀的液体转入吸附柱CB3中，12000rpm离心30sec，弃废液
⑹.向吸附柱中加入600μl缓冲液GD，12000rpm离心30sec,弃废液
⑺.向吸附柱中加入800μl漂洗液PW，12000rpm离心30sec,弃废液
⑻.向吸附柱中加入600μl漂洗液PW，12000rpm离心30sec,弃废液
⑼.将吸附柱CB3放入收集管，12000rpm空转3min，弃废液，室温放置 10分钟
⑽.将吸附柱CB3转入干净收集管，滴加50μl水，室温放置10min， 12000rpm收集到离心管中。
2.2 DNA浓度和纯度测定
使用NanoDrop 1000分光光度计(Thermo Scientific)测定DNA的纯度和浓度，并用去离子双蒸水调节DNA浓度至25ng/μl。
2.3 RPA反应体系
经试验得到优化的RPA扩增体系，总体系50μl，再水化缓冲液 (RehydrationBuffer)29.5μl，280μm醋酸镁溶液(Magnesium Actate)2.5μl，引物各2.4μl(10uM)，植物材料DNA 2μl(25ng/μl)，剩余用水补足。
优化的RPA扩增程序：RPA扩增检测仪39℃反应30分钟。
2.4特异性检测
将待检测材料转基因水稻EB7001S-6，转基因水稻EB7001S-6受体材料，其他转基因水稻混合样，转基因玉米混合样，转基因大豆混合样，转基因棉花混合样，转基因油菜混合样，非转基因水稻混合样，非转基因玉米混合样，非转基因大豆混合样，非转基因棉花混合样，非转基因油菜混合样的DNA样品按步骤2.3的反应体系进行RPA-EXO实验，测试特异性。
2.5灵敏度检测
将EB7001S-6基因组DNA分别稀释如下的拷贝数：100000，10000，5000， 1000，500，100，50。按照步骤2.3的反应体系进行RPA-EXO实验测试灵敏度，同时进行阴性对照。
3.实验结果
特异性检测结果如图14-19所示，以转基因水稻EB7001S-6为模板，三组引物对均可以得到明显的扩增曲线。以其他转基因水稻混合样，转基因玉米混合样，转基因大豆混合样，转基因棉花混合样，转基因油菜混合样，非转基因水稻混合样，非转基因玉米混合样，非转基因大豆混合样，非转基因棉花混合样，非转基因油菜混合样的基因组DNA为模板，除引物对EB7001S-6-F3 与EB7001S-6-R1以空白对照为模板产生扩增曲线(图14)外，均没有产生扩增曲线(图16～19)。由于缺少特异性，删除引物对EB7001S-6-F3与 EB7001S-6-R1。
灵敏度检测结果如图20-21所示，如图21所示，采用 EB7001S-6-F6+EB7001S-6-R1时，在阴性材料没有起飞的前提下，模板DNA 拷贝数为100000，10000，5000，1000，500，100，50个拷贝时都有扩增曲线，说明该引物和探针组合以及检测方法鉴定转基因水稻EB7001S-6的灵敏度可以达到50个拷贝。如图20所示，采用EB7001S-6-F4与EB7001S-6-R1时，在阴性材料没有起飞的前提下，模板DNA拷贝数为100000，10000，5000，1000， 500个拷贝时有扩增曲线，模板DNA拷贝数为100、50个拷贝时没有扩增曲线，说明该引物和探针组合以及检测方法鉴定转基因水稻EB7001S-6的灵敏度较差。因此，本发明最终选择EB7001S-6-F6+EB7001S-6-R1用作转基因水稻 EB7001S-6品系特异性的检测引物组合。
如图18-19,21所示，扩增曲线在第10分钟左右即可超过阈值起飞，由此可以得出，采用本发明的引物和方法可以快速鉴定转基因水稻EB7001S-6，鉴定时间仅需10分钟左右。
序列表
<110> 中国农业科学院生物技术研究所
<120> 转基因水稻EB7001S-6的RPA检测引物与探针组合、试剂盒及检测方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tccccatctg ctctgccgat ttttttttta ttttg 35
<210> 2
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agatcccccg aattaattcg gcgttaattc agtac 35
<210> 3
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgtgatatt ggatgtgatc tgggatgtat ttgagttatg atgca 45
Claims (7)
1.一种转基因水稻EB7001S-6的RPA检测引物与探针组合,所述引物包括正向引物和反向引物，其特征在于，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述反向引物R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.一种转基因水稻EB7001S-6的RPA检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物和探针组合。
3.一种转基因水稻EB7001S-6的RPA检测方法，其特征在于，包括如下步骤：以待测样品的基因组DNA为模板，利用权利要求1的引物和探针组合进行RPA扩增并进行荧光检测。
4.根据权利要求3所述的转基因水稻EB7001S-6的RPA检测方法，其特征在于，所述RPA扩增反应体系为每50μl反应体系中包括所述正向引物和反向引物各20pmol，探针5pmol，DNA模板50ng。
5.根据权利要求4所述的转基因水稻EB7001S-6的RPA检测方法，其特征在于，所述RPA扩增体系为总体系50μl，再水化缓冲液29.5μl，280μm M醋酸镁溶液2.5μl，余量为水。
6.根据权利要求3-5任一项所述的转基因水稻EB7001S-6的RPA检测方法，其特征在于，所述RPA扩增程序为39℃反应20分钟。
7.权利要求1所述的检测引物与探针组合、权利要求2所述的检测试剂盒和/或权利要求3-6任一项所述的检测方法在检测转基因水稻EB7001S-6的种子资源中的应用。
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