CN105543238B - 转基因玉米ie034外源插入片段3’端旁侧序列及检测方法 - Google Patents

转基因玉米ie034外源插入片段3’端旁侧序列及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供转基因玉米事件IE034插入位点的外源插入片段的3'端旁侧序列及其应用。本发明还提供了用于检测该旁侧序列的引物、探针和试剂盒。本发明所提供的旁侧序列和引物适用于快速检测样品是否含有转基因玉米品系IE034，为转基因安全提供保障。

Description

转基因玉米IE034外源插入片段3’端旁侧序列及检测方法
技术领域
本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一种转基因玉米IE034 外源插入片段3'端旁侧序列及定性PCR检测方法，以及用于检测该序列的PCR引物、探针和试剂盒。
背景技术
玉米作为我国三大粮食作物之一，播种面积和总产量均居第二位，在我国粮食安全中发挥着重要的作用。近年来，国内玉米种植面积保持在5亿亩以上，同时，每年还要进口300万-500万吨的转基因玉米弥补消费缺口。而随着饲用玉米需求的刚性增长和近年来玉米深加工业的快速发展，国内玉米消费还将持续增长。但是病虫害、杂草、干旱、盐碱等生物或非生物胁迫严重影响了玉米生产。培育具有抗虫、抗除草剂、抗病等性状的转基因玉米品种并应用到实际生产中，能够减少玉米产量损失，减少农药化肥使用量。其中Bt蛋白的发现揭开了利用基因工程培育抗虫植物的序幕。Bt杀虫蛋白基因来源于苏云金杆菌(Bacillusthuringiensis即Bt杆菌)，是天然存在于土壤中的格兰氏阳性菌，在其芽孢形成过程中产生许多以结晶方式存在的蛋白质，这些蛋白质具有杀虫活性，通常也被称为Bt杀虫蛋白。Bt杀虫蛋白按氨基酸序列的同源性可分为45大类313种，Cry1Ie抗虫基因属于BT杀虫蛋白家族，是中国农业科学院植物保护研究所首次分离克隆出来的一种新的Cry基因，随后中国农业科学院作物科学研究所将Cry1Ie基因通过农杆菌介导法转入到了中国玉米优良自交系综31基因组中，获得了一个抗虫转基因玉米事件IE034，现已在进行环境释放阶段的安全评价，对于未来国内日益高涨的玉米需求，该抗虫玉米有可能进入商业化种植并推广。
转基因玉米IE034已申请“农业转基因生物安全评价证书”，因而其分子特征，包括插入序列、插入位点及其相应的检测方法都需要非常清晰，其中中国专利201210065919.X提供了转基因玉米事件 IE034插入位点的外源5'端旁侧DNA序列，该序列全长312bp。但目前尚不清楚转基因玉米事件IE034插入位点的外源3'端旁侧DNA 序列，关键原因是3'端旁侧序列结构更为复杂，受体基因组序列和载体序列间或出现，需要更精准的实验进行鉴定。因此3'端旁侧DNA 序列及鉴定方法是转基因玉米IE034安全管理不可或缺的部分。
发明内容
本发明的目的是提供转基因玉米事件IE034插入位点的外源插入片段的3'端旁侧DNA序列及其应用，以及用于检测该序列的PCR引物、探针和试剂盒。
为达到以上目的，本发明提供了转基因玉米IE034外源插入片段 3'端旁侧DNA序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，或者为SEQ ID NO.1所示序列的特异性片段。
本发明还提供了所述DNA序列在检测转基因玉米中的应用。
本发明还提供了用于检测权利要求1所述的DNA的特异性PCR 检测引物及探针，所述引物的核苷酸序列为：
上游引物：5'-CACTCCGCATACAGCTCGATAATCT-3'，
下游引物：5'-TATGGTCTTCTTGCTTCGTGCTTTT-3'；
探针为：5'-F-TACTCTTCCGAGCAAAGGACGCC-Q-3'。
可选的，在所述探针中，F为FAM、Hex、Tet、Joe、Vic、Fite、 Cy3或Cy5；Q为Tamra、Rox、Dabcy、Bhq1或Bhq2。
本发明还提供了一种转基因玉米IE034的检测试剂盒，所述试剂盒含有特异性PCR检测引物及探针，所述引物的核苷酸序列为：
上游引物：5'-CACTCCGCATACAGCTCGATAATCT-3'，
下游引物：5'-TATGGTCTTCTTGCTTCGTGCTTTT-3'；
探针为：5'-F-TACTCTTCCGAGCAAAGGACGCC-Q-3'。
可选的，在所述探针中，F为FAM、Hex、Tet、Joe、Vic、Fite、 Cy3或Cy5；Q为Tamra、Rox、Dabcy、Bhq1或Bhq2。
本发明还提供了一种转基因玉米事件IE034的检测方法，所述方法包括：以样品总DNA为模板利用本发明所提供的引物及探针进行实时荧光PCR扩增反应，检测扩增反应产物中是否具有SEQ ID NO.1 所示的核苷酸序列。
可选的，所述实时荧光PCR扩增的反应程序为：95℃10min；95℃ 15sec，60℃60sec40个循环。
可选的，实时荧光PCR扩增的反应体系为：
Figure BDA0000902284200000031
加入灭菌蒸馏水至总体系为20μl。
本发明还提供了上述引物及探针在检测转基因玉米中的应用。
本发明还提供了上述试剂盒在检测转基因玉米中的应用。
本发明通过TAIL-PCR扩增得到了抗虫转基因玉米事件IE034的 3'旁侧序列，并根据该序列设计获得特异性引物和探针，用于检测转基因玉米IE034。利用该方法，在实时荧光PCR结束后即能判断所检测样品中是否含有转基因玉米IE034。本发明所提供的旁侧序列和引物适用于对转基因玉米IE034(包括亲本、杂种F1和后代)及其制品 (包括植株、组织、种子及其制品)的检测。
附图说明
图1为实施例1中三轮反应的PCR产物电泳图：
其中，图1A为第一轮PCR扩增产物，图1B为第二轮PCR扩增产物，图1C为第三轮PCR扩增产物；
图2为转基因玉米IE034实时荧光PCR检测结果；
图3为灵敏度检测扩增曲线。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecμlar cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1
本实施例用于说明转基因玉米IE034的外源插入片段3’端侧翼序列的获得。
1.提取玉米种子基因组DNA。
1.1样品处理：
取适量玉米种子(由中国农业科学院作物所王国英研究员提供转基因玉米“IE034”以及对照玉米“综31”)在液氮速冻下经莱驰MM400 冷冻研磨仪磨成粉末状
1.2玉米种子DNA提取：
采用天根DP305-02植物基因组DNA提取试剂盒提取玉米种子基因组DNA，操作按产品说明书进行。
1.3 DNA检测：
取5μl提取的DNA溶液，以1％的琼脂糖凝胶电泳，根据其亮度和带型来初步判断提取DNA的质量。最终采用ND-2000超微量核酸蛋白测定仪测定所提取的DNA的浓度和纯度。
2.通过TAIL-PCR方法获得转基因玉米外源基因整合位点3’端侧翼序列。
2.1引物设计：
根据中国农业科学院作物所王国英研究员提供目的基因表达载体p3301UbiIe及元件的结构，采用TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)技术，获得转基因玉米外源基因整合位点3’端侧翼序列并设计如下表1所示的引物序列：
表1每轮TAIL-PCR扩增的引物序列
引物名称 引物序列'
SP F1-1 CCATCAACCAGGGCAACTTCAG
SP F2-1-140 ACGATGGACTCCAGTCCGGCCCGAGCAGCGGCAACGAGGTGTA
SP F2-2-140 AGCAGCGGCAACGAGGTGTA
SP F3-189 CTGAGCGACGAGTTCTACCTGGAC
LAD1-1 ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCNNNNCCAC
LAD1-2 ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCNNNNCCAA
AC ACGATGGACTCCAGAG
2-SP F1 CCGAACTGAGATACCTACAGCGTGA
2-SP F2 GGCAGGGTCGGAACAGGAGAG
2-SP F3 ATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCT
3-SPF1 CTTCCCCGATATCCTCCCTGATC
3-SPF2 GTTGCTGTCTCCCAGGTCGC
3-SPF3 TCCCAGTTTTCGCAATCCACAT
2.2 TAIL-PCRPCR扩增：
每轮TAIL-PCR包含三轮PCR扩增，具体如下：
第一轮PCR扩增，以转基因玉米种子DNA为模板，用特异性引物SP F1-1和LAD1-1及LAD1-2分别进行扩增；
第二轮PCR扩增，将上述PCR产物稀释40倍，取2μl为模板，分别用SPF2-1+AC和SPF2-2+AC进行扩增；
第三轮PCR，将上述PCR产物稀释10倍，取2μl为模板，用SP F3+AC进行扩增。扩增程序如下表2所示：
表2每轮TAIL-PCR扩增程序
Figure BDA0000902284200000061
2.3电泳检测：
将2.2中PCR产物取5μl进行电泳，电泳结果如图1A-C所示。
图1A为第一轮PCR扩增产物电泳，lane 1-2为SP F1-1+LAD1-1 扩增产物，lane 3-4为SP F1-1+LAD1-2，lane 1-4均以转基因玉米DNA 为模板。
图1B为第二轮PCR扩增产物电泳，lane 1-3为SPF2-1+AC扩增产物，lane 4-6为SPF2-2+AC扩增产物.其中lane1、4均以1A中的 lane 2为模板，lane 2、5均以图1A中的lane3为模板，lane 3、6均以图1A中的lane 4为模板。
图1C为第三轮PCR扩增产物电泳，lane1-6均为SPF3+AC扩增产物，lane1以图1B中的lane1为模板，lane2以图1B中的lane2为模板，lane3以图1B中的lane3为模板，lane4以图1B中的lane4为模板，lane5以图1B中的lane5为模板，lane6以图1B中的lane6为模板。
2.4序列测序和分析
将图1C中(第3轮PCR扩增产物)的lane1-6号亮带0.8％的琼脂糖凝胶进行电泳，采用TAKARA公司的PCR产物回收试剂盒回收扩增片段，连接到PMD18载体(Takara)，转化大肠杆菌，将得到的阳性克隆送到Invitrogen公司进行测序。采用DNA Star(ver 5.01)和BioXM(ver 2.6)比较和分析测定的序列与载体序列相似性，在NCBI 数据库(http://www.ncbi.nlm.nib.gov/)中检索相似的玉米基因组序列。 2.5结果分析
提取转基因玉米IE034种子基因组DNA，利用特异性引物和随机引物进行TAIL-PCR扩增，获得了外源插入片段在玉米基因组整合位点的右边界281bp长的序列，包括第1-40共40bp的玉米基因组序列和41-281共241bp的载体序列。如SEQ ID NO.1所示。其中，玉米基因组序列位于玉米5号染色体(GenBank登录号：AC203153.4) 的86287-86326。
实施例2
实施例2用于说明针对转基因玉米IE034实时荧光PCR检测方法的建立。
1.引物设计
1.1通过分析外源插入片段在玉米基因组整合位点的右边界281bp长的序列，根据其中包含的玉米基因组序列以及载体序列，设计如下引物和探针，引物和探针均在invitrogen公司合成。
上游引物：5'-CACTCCGCATACAGCTCGATAATCT-3'
下游引物：5'-TATGGTCTTCTTGCTTCGTGCTTTT-3'
荧光探针为：
5'-FAM-TACTCTTCCGAGCAAAGGACGCC-3'TAMRA
预计扩增产物为140bp。
2.实时荧光PCR反应体系
2.1反应体系：用GoldStar TaqMan Mixture(With ROX) (CWbio.Co.Ltd，Cat#CW0953)进行扩增，实验操作按产品说明书进行。扩增程序为：95℃10min，(95℃15sec，60℃60sec)×40个循环，报告通道为FAM，淬灭通道为TAMRA。RealTime反应体系为：
Figure BDA0000902284200000081
加入灭菌蒸馏水至20μl。
3实时荧光PCR检测方法特异性检测
以转基因玉米IE034(GMO+)、非转基因玉米综3112(GMO-)、转基因番茄(华番1号)、转基因水稻Bt63、转基因棉花(转Bt抗虫基因)及转基因玉米Mon810、Mon88017、nk603、油菜RT73、 T45的总DNA为模板，进行实时荧光PCR反应，检测引物探针的特异性。
4.实时荧光PCR检测方法灵敏度检测
取转基因玉米IE034DNA进行10倍梯度稀释，做5个稀释度 (如表3所示)，稀释后样品各取2μl作模板。
表3灵敏度RealTime PCR检测试验设计
Figure BDA0000902284200000082
5、结果分析
5.1.特异性检测
结果如图2所示。检测转基因玉米IE034的引物探针只在品系 IE034有信号，在其它材料中均无信号。
图2转基因玉米IE034实时荧光PCR检测结果(基线以下为阴性对照：Bt63、KF6号、华番1号、Mon810、Mon88017、nk603、油菜RT73、T45)
5.2.灵敏度检测
图3中灵敏度检测扩增曲线对应的ct值如下表4所示：
表4
浓度(ng/μl) 33.3 3.33 0.33 0.033 0.0033
Ct值 26.87512 30.37431 34.09298 37.08225 未检到
结果显示，在Ct值35以内，设计的引物及探针可以检测DNA 浓度最低限为0.33ng/μl的转基因玉米IE034样品。
6.结论
本发明根据转基因玉米IE034右边界侧翼序列设计引物探针，用于检测转基因玉米IE034。利用该方法，在实时荧光PCR结束后即能判断所检测转基因玉米样品是否为转基因玉米IE034。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Figure IDA0000902284280000011
Figure IDA0000902284280000021
Figure IDA0000902284280000031
Figure IDA0000902284280000041
Figure IDA0000902284280000051
Figure IDA0000902284280000061

Claims (8)

1.用于检测转基因玉米IE034外源插入片段3'端旁侧DNA序列的特异性PCR检测引物及探针，其特征在于，所述3'端旁侧DNA序列如SEQ ID NO.1所示，所述引物的核苷酸序列为：
上游引物：5'-CACTCCGCATACAGCTCGATAATCT-3'，
下游引物：5'-TATGGTCTTCTTGCTTCGTGCTTTT-3'；
探针为：5'-F-TACTCTTCCGAGCAAAGGACGCC-Q-3'。
2.根据权利要求1所述的引物及探针，其中，F为FAM、HEX、TET、JOE、VIC、FITE、CY3或CY5；Q为TAMRA、ROX、DABCY、BHQ1或BHQ2。
3.一种转基因玉米IE034的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1或2所述引物及探针。
4.一种转基因玉米IE034的检测方法，其特征在于，所述方法包括：以样品总DNA为模板利用权利要求1或2所述的引物及探针进行实时荧光PCR扩增反应，检测扩增反应产物中是否具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述实时荧光PCR扩增的反应程序为：95℃10min；95℃15sec，60℃60sec40个循环。
6.根据权利要求4或5所述的检测方法，其特征在于，实时荧光PCR扩增的反应体系为：2×GoldStar TaqMan Mixture10μl，10μM上游引物0.4μl，10μM下游引物0.4μl，10μM探针0.4μl，DNA模板2μl，加入灭菌蒸馏水至总体系为20μl。
7.权利要求1或2所述的引物及探针在检测转基因玉米IE034中的应用。
8.权利要求3所述的试剂盒在检测转基因玉米IE034中的应用。
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