KR20200063566A

KR20200063566A - Epsps 유전자가 도입된 유전자 변형 옥수수 검출용 프라이머 세트, 조성물, 키트 및 이를 이용한 검출 방법

Info

Publication number: KR20200063566A
Application number: KR1020180149410A
Authority: KR
Inventors: 신공식; 임명호; 조현석
Original assignee: 대한민국(농촌진흥청장)
Priority date: 2018-11-28
Filing date: 2018-11-28
Publication date: 2020-06-05
Also published as: KR102146921B1

Abstract

본 발명은 EPSPS 유전자가 도입된 유전자 변형 옥수수의 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 EPSPS 유전자가 도입된 유전자 변형 옥수수 의 검출 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하면 유전자 변형 옥수수의 내재된 유전자와 도입된 mEPSPS 유전자의 동시 검출이 가능하므로 EPSPS 유전자를 포함하는 유전자 변형 옥수수만을 특이적으로 검출할 수 있다.

Description

EPSPS 유전자가 도입된 유전자 변형 옥수수 검출용 프라이머 세트, 조성물, 키트 및 이를 이용한 검출 방법 {Primer set, composition and kit for detecting genetically modified crops introduced EPSPS gene, and methods using the same}

본 발명은 EPSPS 유전자가 도입된 유전자 변형 옥수수 검출용 프라이머 세트, 검출용 조성물, 키트 및 이를 이용한 상기 유전자 변형 옥수수의 검출 방법에 관한 것이다.

전 세계적으로 증가하고 있는 인구의 식량 수요를 충족시키기 위해서, 생명공학 기술은 지속 가능한 식량생산을 위한 토대를 구축하는데 도움이 되는 특정 작물을 농업에 이용하고 있다. 유전자 변형 생물체(GMOs(genetically modified organisms) 또는 LMOs(living modified organisms))로 알려진 작물은 1996년 처음으로 170만 헥타르의 면적에서 재배되었고, 2016년 기준 1억 8,510만 헥타르에 이르며 26개국이 생산에 종사하고 있다(비특허문헌 1).

유전자 변형 작물은 재배 면적의 57% 가량이 제초제 내성(herbicide tolerant, HT) 작물이며, 그 중에서도 글리포세이트(glyphosate)와 글루포시네이트(gluforsinate) 내성 품종이 대부분을 차지하고 있다. 제초제 내성 작물로는 면화, 캐놀라, 콩, 옥수수, 밀, 사탕무, 감자, 쌀, 아마, 알팔파 등이 있으며, 제초제 내성 작물을 생산하는데 이용된 유전자로는 gox, als, bar, pat 및 EPSPS가 있다. EPSPS(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase)는 아그로박테리움(Agrobacterium)의 CP4 균종에서 유래한 cp4-epsps와 옥수수(Zea mays)에서 유래한 mEPSPS로 구분된다. 이 유전자들 중에서 cp4 - epsps가 많이 사용되는 제초제 내성 유전자이며, 이와 기능 및 단백질 구조가 유사한 mEPSPS를 이용한 제초제 내성 작물이 개발되어 있는 상태이다. 현재 mEPSPS를 포함하는 유전자 변형 작물 품종으로는, 콩(FG72 및 Das44406-6), 옥수수(GA21, HCEM485, MZHGOJG 및 VCO-01981-5), 면화(GHB614), 감자(RBMT22-238 및 RBMT22-262) 및 상기 품종들의 후대 교배종이 있다.

mEPSPS는 옥수수 유래의 유전자이기 때문에, 옥수수의 경우에는 내재된 염기서열에 의해 PCR 분석에서 검출 반응을 나타낸다. 그러나 그 외의 작물에서는 내재 염기에 따른 검출 반응은 나타나지 않고, 식품 또는 사료와 같이 여러 작물이 혼합되어 있는 경우에 외래 도입 mEPSPS의 포함 유무가 옥수수의 내재 염기서열에 의해 구분이 어려울 수 있다. 이러한 이유로 현재까지 mEPSPS 유전자만을 특이적으로 구분 검출할 수 있는 보고가 전무한 실정이다.

유전자 변형 작물(Genetically Modified Crops)은 20년 이상 상업화되어 이용되어 왔고, 수입 허가 및 재배를 각국의 규정에 따라 강하게 규제하고 있으나, 여전히 잠재적인 인체 및 환경 위해성에 대한 대중적인 논란이 지속되고 있다. 국내에서는 유전자 변형 작물을 수입하기 전에 환경 위해성 평가를 완료해야 하고, “유전자 변형 생물체의 국가 간 이동 등에 관한 통합고시”를 통해 환경 및 국민건강에 대한 잠재적인 위해 효과를 사전에 방지하도록 하고 있으며, 농업용 유전자 변형 생물체의 취급관리 기준에는 이의 목적 이행을 위해서 유통 및 이용 중 유전자 변형 작물이 비의도적으로 환경에 방출되지 않도록 규정하여 관리하고 있다(농림축산식품부 고시 제2007-8호).

유전자 변형 작물에 대한 환경 위해성 평가 심사는 사례별(case-by-case)로 다루어지고 있다. 환경 위해성 심사에는 도입 유전자에 대한 분자생물학적 분석, 도입 유전자의 검출 및 발현의 확인, 유전자 변형 산물에 대한 검정 방법 등을 명시하도록 하고 있다. 특히, 검출 또는 검정법은 유전자 변형 작물의 비의도적 환경 방출에 따른 안전성 확보를 위해서 사후 환경모니터링 기술로 적용할 수 있다(비특허문헌 2). 유전자 변형 생물체의 주요 검정 방법으로는 도입 유전자의 DNA를 검출하는 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction: PCR)이 국제 표준 분석법으로 추천되고 있으며, 정성 분석법으로 도입된 T-DNA 상의 유전자를 검출하는 스크리닝(screening), 유전자-특이(gene-specific) 및 구조-특이(construct-specific) 방법과 T-DNA가 삽입된 게놈 내의 인접서열과 운반체의 염기서열을 바탕으로 특이 마커를 작성하여 분석하는 이벤트-특이(event-specific) 또는 계통-특이 방법으로 구분되고 있다(비특허문헌 3).

국내에서도 최근 몇 년 동안 농업 및 식품용 유전자 변형 생물체의 수입이 증가하고 있고, 다양한 용도로 이용되고 있다. 이들 유전자 변형 작물은 하역, 운송, 보관 및 유통 중 비의도적인 방출로 일반 환경에 노출될 가능성을 부인할 수 없을 것이다. 유전자 변형 작물의 안전한 이용과 생태계로의 확산을 방지하기 위해서는 지속적인 환경 모니터링 및 안전관리 대책이 필요할 것이다.

따라서, 본 연구에서는 최근 증가하고 있는 국내외 상업 승인 유전자 변형 작물 중에서 도입 유전자가 옥수수로부터 유래하여 검출 방법이 구축되지 않은 제초제 저항성 유전자인 mEPSPS를 검출하는 방법을 제시하여 mEPSPS를 포함하는 상업화 승인 및 미승인 유전자 변형 작물에 대하여 안전성 관리 및 사후 환경모니터링을 위한 유전자-특이적 검출 방법을 개발하고자 하였다.

James Clive, 2016, Global Status of Commercialized Biotech/GM Crops: 2016, ISAAA Brief No. 52-2016 Jae Kyun Rho et al., Qualitative and Quantitative PCR Methods for Detection of Three Lines of Genetically Modified Potatoes, J Agric Food Chem., 2004, 52(11), pp 3269-3274 Nelson Marmiroli et al., Methods for detection of GMOs in food and feed, Anal Bioanal Chem, 2008, 392:369-384

본 발명의 목적은 EPSPS 유전자가 도입된 유전자 변형 옥수수를 검출하기 위한 프라이머 세트, 조성물 및 상기 프라이머 세트를 이용한 EPSPS 유전자가 도입된 유전자 변형 옥수수 검출 방법을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 EPSPS를 포함하는 유전자 변형 옥수수에 대한 안전성 관리 및 사후 환경 모니터링을 위한 유전자 특이적 검출 방법에 대해 연구하던 중, 옥수수 유래의 EPSPS 유전자의 인트론 부위를 이용하여 프라이머를 제작하면 유전자 변형 옥수수에서 변형된 옥수수의 내재 염기서열과 도입된 mEPSPS의 염기서열을 동시에 검출할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

이하, 본 발명의 구성을 상세하게 설명한다.

본 발명은, SEQ ID NO: 1 및 2의 염기서열로 이루어지는 제1의 프라이머 쌍;

SEQ ID NO: 3 및 4의 염기서열로 이루어지는 제2의 프라이머 쌍;

SEQ ID NO: 1 및 4의 염기서열로 이루어지는 제3의 프라이머 쌍;

SEQ ID NO: 5 및 6의 염기서열로 이루어지는 제4의 프라이머 쌍;

SEQ ID NO: 7 및 8의 염기서열로 이루어지는 제5의 프라이머 쌍;

SEQ ID NO: 7 및 9의 염기서열로 이루어지는 제6의 프라이머 쌍;

SEQ ID NO: 7 및 10의 염기서열로 이루어지는 제7의 프라이머 쌍;

SEQ ID NO: 11 및 12의 염기서열로 이루어지는 제8의 프라이머 쌍;

SEQ ID NO: 13 및 12의 염기서열로 이루어지는 제9의 프라이머 쌍;

SEQ ID NO: 14 및 12의 염기서열로 이루어지는 제10의 프라이머 쌍;

SEQ ID NO: 15 및 16의 염기서열로 이루어지는 제11의 프라이머 쌍;

SEQ ID NO: 17 및 16의 염기서열로 이루어지는 제12의 프라이머 쌍;

SEQ ID NO: 18 및 16의 염기서열로 이루어지는 제13의 프라이머 쌍; 및

SEQ ID NO: 19 및 16의 염기서열로 이루어지는 제14의 프라이머 쌍을 포함하는 EPSPS 유전자가 도입된 유전자 변형 옥수수 검출용 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 19의 염기서열로 이루어지는 프라이머 쌍은 EPSPS 유전자에 특이적인 프라이머 쌍이다.

본 발명에 있어서, 상기 EPSPS(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase) 유전자에 특이적인 프라이머는 EPSPS mRNA(NCBI Accession No. X63374)의 염기서열 중 인트론 부위를 포함한 양쪽의 엑손 부위의 서열을 이용하여 제작된 것일 수 있다. 상기 EPSPS 유전자는 제초제 저항성을 유발하는 유전자로 알려져 있다.

한 구체예에서, 상기 제1의 프라이머 쌍 내지 제3의 프라이머 쌍은 PCR 수행시 98 bp의 증폭 산물을 생성할 수 있으며, 상기 제4의 프라이머 쌍 내지 제7의 프라이머 쌍은 PCR 수행시 283 bp의 증폭 산물을 생성할 수 있고, 상기 제8의 프라이머 쌍 내지 제10의 프라이머은 PCR 수행시 162 bp의 증폭 산물을 생성할 수 있으며, 상기 제11의 프라이머 쌍 내지 제14의 프라이머 쌍은 PCR 수행시 80 bp의 증폭 산물을 생성할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 98bp의 증폭 산물, 283bp의 증폭 산물, 162bp의 증폭 산물 및 80bp의 증폭 산물은 EPSPS 유전자의 인트론 부위를 나타내는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 유전자 변형 옥수수 검출용 프라이머 세트는 상기 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:19의 염기서열로 이루어지는 제1의 프라이머 쌍 내지 제14의 프라이머 쌍으로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 프라이머 세트를 포함함으로써, 유전자 변형 옥수수 및 유전자 변형 옥수수 내 EPSPS 유전자만을 특이적으로 검출할 수 있다.

하기 실시예에서는, EPSPS 유전자의 염기서열 중 인트론 부위를 포함하도록 제작된 프라이머 세트를 이용한 결과, 유전자 변형 옥수수의 내재된 염기서열과 동시에 EPSPS 유전자를 특이적으로 검출함으로써 EPSPS 유전자를 포함하는 유전자 변형 옥수수만을 특이적으로 검출할 수 있음을 확인하였다.

본 발명에서, “프라이머(primer)”란 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity) 뿐만 아니라, 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다. 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오타이드는 또한 뉴클레오타이드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트(alkylphosphorothioate) 또는 펩타이드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 프라이머는 디옥시리보뉴클레오타이드이며, 단일쇄이다. 본 발명에서 사용되는 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMR(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한 프라이머는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다.

본 발명에서 이용되는 프라이머는 타겟 핵산에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 용어 “상보적”은 소정의 어닐링(anealing), 또는 혼성화(hybridization) 조건 하에서 프라이머 또는 프로브가 타겟 핵산 서열에 선택적으로 혼성화할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 실질적으로 상보적(substantially complementary) 및 완전히 상보적(perfectly complementary)인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지고, 바람직하게는 완전히 상보적인 것을 의미한다.

본 발명의 프라이머 세트는 프라이머의 크기, Tm 값, 프라이머의 GC 함량, 프라이머 내의 자가-상보적 서열(self-complementary sequence)에 의한 프라이머의 복합체(dimer) 형성 방지 등을 충분히 고려하고, 유전자 변형 작물 검출의 민감도와 특이도를 최대화할 수 있도록 세심하게 디자인된 것이다.

본 발명에 있어서, “유전자 변형 작물(Genetically modified organism)”이란 유전자 변형 기술에 의해 자연에는 없는 새로운 성질을 부여한, 특히 생산성이 향상되고 상품의 질을 강화한 작물을 의미한다. GMO(genetically modified organism)는 ‘유전자 변형 생물체’의 약자이나, 주로 농작물을 대상으로 하기 때문에 통상적으로 ‘유전자 변형 작물’이라고 명명한다. 1994년 미국 칼젠(Calgene)사가 잘 물러지지 않는 토마토를 처음으로 상업화했고, 1996년에는 몬산토(Monsanto)사가 대두를, 노바티스(Novatis)사가 옥수수를 각각 상품화했다. 유전자 변형 작물은 일반 소비시장에 첫선을 보이기 시작한 이후, 5년만에 미국의 수수, 대두(콩), 면화의 50% 이상을 차지하였다. 상기 유전자 변형 작물은 해충 및 질병에 강하고 소출량이 많아 식량난을 해소할 수 있다는 장점이 있으나, 장기간 섭취할 경우 인간에 무해하다는 점이 분명하게 검증된 바가 없으며, 유전자 변형 작물 품종으로 인한 생태계의 교란 등 환경 재앙이 발생할 수 있다는 위험성을 안고 있다.

본 발명에 있어서, “내재된 염기서열(endogenous sequence)”은 해당 작물이 고유하게 가지고 있는 서열로서 외래 도입 서열에 대한 비교 기준으로 사용되며, 내재적 참조 서열(endogenous reference sequence)이라고도 한다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 EPSPS 유전자가 도입된 유전자 변형 옥수수 검출용 조성물을 제공한다.

한 구체예에서, 상기 조성물은 타겟 핵산을 증폭시키기 위한 조성물일 수 있다. 상기 증폭은 핵산 증폭을 위해 알려진 공지의 방법일 수 있다. 예를 들어, 증폭은 DNA 증폭 또는 RNA 증폭일 수 있다. 증폭 방법은 열순환(thermal cycling)을 필요로 하는 것 또는 등온(isothermal)에서 수행되는 것일 수 있다. 상기 증폭 방법은 폴리머라아제 연쇄 반응(polymerase chain reaction; PCR), 핵산 서열-기초 증폭(nucleic acid sequence-based amplification; NASBA), 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification; RCA) 등을 포함할 수 있다. 증폭 방법은 또한, RNA 증폭 방법을 포함할 수 있다. 예를 들면, 역전사(reverse transcription; RT) 또는 역전사-PCR을 포함할 수 있다. 증폭이란 타겟 핵산 서열 또는 그에 상보적인 서열의 카피 수를 증가시키는 것일 수 있다. “PCR”은 중합효소를 이용하여 타겟 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 타겟 핵산을 증폭하는 방법일 수 있다.

상기 조성물은 타겟 핵산의 증폭에 요구되는 알려진 물질을 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 조성물은 핵산 폴리머라아제, 그의 활성에 필요한 버퍼, 보조인자, 및/또는 기질을 더 포함할 수 있다. 상기 핵산 폴리머라아제는 DNA 폴리머라아제, RNA 폴리머라아제, 역전사 효소(reverse transcriptase) 및 이들의 조합일 수 있다. 역전사(reverse transcription)란 RNA를 주형으로 하여 RNA 서열에 상보적인 DNA 가닥을 합성하는 것일 수 있다.

상기 핵산 폴리머라아제는 가닥 치환 활성을 갖는 것일 수 있다. 예를 들면, 레트로 바이러스, 예를 들면, HIV(human immunodeficiency virus), MMLV(murine leukemia virus) 및 AMV(avian myeoloblastosis virus)로부터 유래된 하나 이상의 역전사 효소일 수 있다. 상기 핵산 폴리머라아제는 3‘→5’엑소뉴클레아제 활성(exonuclease activity)을 갖지 않는 것일 수 있다. 상기 조성물은 역전사 또는 PCR 증폭에 필요한 물질을 포함하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 시료의 게놈 DNA를 상기 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하고 PCR 산물을 분석하는 단계를 포함하는, EPSPS 유전자가 도입된 유전자 변형 옥수수의 검출 방법을 제공한다.

구체적으로, 시료로부터 추출한 게놈 DNA(genomic DNA)를 상기 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하고, PCR 산물을 분석하는 단계를 포함하는 EPSPS 유전자가 도입된 유전자 변형 옥수수의 검출 방법을 제공한다.

보다 구체적으로, 상기 검출 방법은,

1) 시료로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계;

2) 제1의 프라이머 쌍 내지 제14의 프라이머 쌍으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 프라이머 쌍을 포함하는 프라이머 세트를 제작하는 단계;

3) 단계 1)에서 추출한 DNA를 주형으로 하고, 단계 2)의 프라이머 세트를 이용하여 PCR(polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및

4) 단계 3)의 PCR 수행에 의해 생성된 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 시료는 mEPSPS 유전자를 포함하거나, 포함할 것으로 예상되는 유전자 변형 작물, 예컨대 유전자 변형 옥수수로부터 얻은 시료일 수 있다.

상기 검출 방법에 있어서, 시료, SEQ ID NO: 1 내지 19의 염기서열로 이루어지는 프라이머 쌍(세트), PCR 반응에 대한 모든 내용은 위에서 기술한 내용을 모두 적용할 수 있다.

상기 단계 1)에서 시료로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계는 통상적으로 사용되는 게놈 DNA 추출 방법을 사용할 수 있으며, 특별히 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 있어서, 상기 “게놈 DNA”는 염색체로부터 유래하거나 염색체 내 존재하는 DNA를 의미한다.

상기 단계 2)에서, 상기 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:19의 염기서열로 이루어지는 제1의 프라이머 쌍 내지 제14의 프라이머 쌍은 EPSPS 유전자를 특이적으로 검출할 수 있다.

상기 단계 3)에서, PCR은 다중(multiplex) PCR일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 단계 3)의 PCR은 어닐링(anealing) 온도 50 내지 65℃로 수행되는 것일 수 있고, 바람직하게는 어닐링 온도는 60℃로 수행되는 것일 수 있다. 상기 PCR 반응 조건은 통상적인 조건으로 수행될 수 있다. 또한, 상기 PCR과 다중 PCR 반응은 동일한 조건으로 수행될 수 있으며, 예를 들어 초기 변성을 96℃에서 10분간 1회 수행한 후, 변성(denaturation, 95℃에서 30초), 어닐링(anealing, 60℃에서 40초) 및 연장(extention, 72℃에서 60초)를 총 30 사이클 수행한 후, 최종 확장 반응을 72℃에서 5분동안 수행할 수 있다. 예를 들어, 상기 SEQ ID NO: 1 내지 19의 염기서열로 이루어지는 프라이머 쌍은 모두 PCR 수행시 어닐링 온도가 60℃로 동일할 수 있고, 이에 따라 다중 PCR 수행시 검출 효율이 우수할 수 있다.

상기 단계 4)의 증폭 산물은 제1의 프라이머 쌍 내지 제3의 프라이머 쌍 중 하나 이상의 프라이머 쌍을 포함하는 프라이머 세트에 의해 증폭된 98 bp의 PCR 산물; 제4의 프라이머 쌍 내지 제7의 프라이머 쌍 중 하나 이상의 프라이머 쌍을 포함하는 프라이머 세트에 의해 증폭된 283 bp의 PCR 산물; 제8의 프라이머 쌍 내지 제10의 프라이머 쌍 중 하나 이상의 프라이머 쌍을 포함하는 프라이머 세트에 의해 증폭된 162 bp의 PCR 산물; 또는 제11의 프라이머 쌍 내지 제14의 프라이머 쌍 중 하나 이상의 프라이머 쌍을 포함하는 프라이머 세트에 의해 증폭된 80 bp의 PCR 산물일 수 있다.

따라서, 제1의 프라이머 쌍 내지 제3의 프라이머 쌍 중 하나 이상의 프라이머 쌍을 포함하는 프라이머 세트를 이용하여 98 bp의 PCR 산물이 증폭되거나;

제4의 프라이머 쌍 내지 제7의 프라이머 쌍 중 하나 이상의 프라이머 쌍을 포함하는 프라이머 세트를 이용하여 283 bp의 PCR 산물이 증폭되거나;

제8의 프라이머 쌍 내지 제10의 프라이머 쌍 중 하나 이상의 프라이머 쌍을 포함하는 프라이머 세트를 이용하여 162 bp의 PCR 산물이 증폭되거나; 또는

제11의 프라이머 쌍 내지 제14의 프라이머 쌍 중 하나 이상의 프라이머 쌍을 포함하는 프라이머 세트를 이용하여 80 bp의 PCR 산물이 증폭되는 경우, 시료 내 EPSPS 유전자가 도입된 유전자 변형 옥수수가 포함된 것으로 결정할 수 있다.

상기 PCR 산물 분석은 PCR 산물을 전기영동하여 산물의 크기를 비교하거나, PCR 산물이 증폭되는지 증폭되지 않는지를 확인하여 분석할 수 있다.

상기 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아마이드 겔 전기영동을 이용할 수 있으나, 전기영동법이 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 사용된 용어 "증폭 반응"은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(PCR)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR)(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등(EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR)(17, 18), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA)(19) (WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self-sustained sequence replication)(20)(WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences)(미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CPPCR)(미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR)(미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA)(미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification)(21, 22) 및 고리-중재 항온성 증폭(loopmediated isothermal amplification; LAMP)(23)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 사용 가능한 다른 증폭 방법들은 미국특허 제5,242,794, 5,494,810, 4,988,617호 및 미국 특허 제09/854,317호에 기술되어 있다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트와 이의 PCR 반응 혼합물을 포함하는 EPSPS 유전자가 도입된 유전자 변형 옥수수의 검출용 PCR 키트를 제공한다.

상기 PCR 반응 혼합물로는 이 기술분야에서 널리 공지된 것 어느 것이나 포함할 수 있으며, 예를 들어, dNTP, DNA 폴리머라아제(polymerase) 및 버퍼 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하면 유전자 변형 옥수수의 내재된 유전자와 상기 유전자 변형 옥수수 내에 도입된 EPSPS 유전자의 동시 검출이 가능하므로 EPSPS 유전자를 포함하는 유전자 변형 옥수수만을 특이적으로 검출할 수 있다.

도 1은 옥수수(Zea mays)의 EPSP-synthase mRNA 염기서열 및 인트론 부위를 나타낸 것이다(①, ②, ③, ④ 및 ⑤는 인트론 부위를 나타낸다).
도 2는 mEPSPS 유전자를 검출하기 위한 유전자 특이적 프라이머 세트를 이용한 mEPSPS 검출 결과를 나타낸 것이다. (M: 1Kb DNA 마커, lane 1-14: ①, ②, ④ 및 ⑤ 인트론 사이의 염기서열을 이용한 프라이머 조합(표 1의 1-14번), lane 15-17: 엑손 염기서열을 이용한 프라이머)
도 3은 mEPSPS 유전자 검출을 위한 구조 특이적 마커 부위를 나타낸 것이다. 상기 도 3에서 적색 바(bar)는 구조 특이적 검출 부위를 나타낸 것이며, GA21은 mEPSPS를 포함하는 유전자 변형 옥수수의 대표적인 품종이다.
도 4는 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용한 유전자 변형 옥수수의 mEPSPS 검출 결과를 나타낸 것이다. 도 4의 (A)는 mEPSPS 유전자 특이적 프라이머 세트에 대한 결과이고, (B)는 mEPSPS 구조 특이적 프라이머 세트에 대한 결과이다. (M: 1Kb DNA 마커, lane 1: 유전자 변형되지 않은 콩, lane 2: 유전자 변형되지 않은 옥수수, lane 3: 유전자 변형 옥수수(GA21), lane 4: 유전자 변형 콩(FG72), lane 5: 유전자 변형 콩(Das44406-6), lane 6: 유전자 변형 면화(GHB614), N: 무처리(no sample), a-i: 순서대로 표 1의 프라이머 1, 2, 4, 5, 7, 8, 9, 11 및 13번, j-l: 엑손 염기서열 조합의 프라이머 세트, m-o: 순서대로 표 2의 1, 2 및 3번, p: 표 2의 1, 2, 및 3번의 조합 프라이머)
도 5는 유전자 변형 옥수수 내 mEPSPS 검출용 프라이머의 검출 한계를 분석한 결과이다. 도 5의 (A)는 mEPSPS 유전자 특이적 프라이머 세트에 대한 결과이고, (B)는 mEPSPS 구조 특이적 프라이머 세트에 대한 결과이다. (M: 1Kb DNA 마커, lane 1: 100%, lane 2: 5%, lane 3: 1%, lane 4: 0.5%, lane 5: 0.1%, lane 6: 0%, a-i: 순서대로 표 1의 1, 2, 4, 5, 7, 8, 9, 11 및 13번, j-l: 순서대로 표 2의 1, 2, 및 3번)
도 6은 유전자 변형 옥수수 내 mEPSPS 검출용 프라이머를 이용한 사료 내 mEPSPS 포함 유전자 변형 옥수수의 검출 결과를 나타낸 것이다. 도 6의 (A)는 mEPSPS 유전자 특이적 프라이머 세트에 대한 결과이고, (B)는 mEPSPS 구조 특이적 프라이머 세트에 대한 결과이다. (M: 1Kb DNA 마커, lane 1: 유전자 변형되지 않은 옥수수, lane 2: 유전자 변형 옥수수(GA21), lane 3: 유전자 변형 콩(FG72), lane f1-f8: 현재 유통중인 동물 사료 8종, a-i: 순서대로 표 1의 1, 2, 4, 5, 7, 8, 9, 11 및 13번, j-l: 순서대로 표 2의 1, 2, 및 3번)

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

< 실시예 1> 식물 재료 준비 및 DNA 추출

유전자 변형 옥수수를 검정하기 위해, 유전자 변형 작물(옥수수-GA21, 콩-FG72 및 Das44406-6, 면화-GHB614)의 표준물질(Certified Reference Material, CRM)(AOCS, 미국)을 구입하여 사용하였으며, 대조구로 비유전자 변형(non-GM) 작물인 옥수수와 콩의 DNA를 이용하였다.

또한, 실질적인 검출법 적용 실험을 위해서 유통 동물사료를 구입하여 미세 분말화한 후, DNA를 추출하여 분석에 사용하였다. 각 시료의 DNA 농도는 50 ng/㎕ 로 조절하여 PCR을 수행하였다.

각 시료의 게놈 DNA는 각 분말 시료 100mg을 수득하여 DNA 추출 키트(DNeasy Plant Mini Kit, Quiagen, 독일)에 포함된 시약과 키트의 방법에 따라 추출하였다.

<실시예2> 유전자 변형 작물 내 mEPSPS 유전자 특이 프라이머 제작

옥수수 유래의 EPSP-synthase mRNA (NCBI Accession No. X63374)의 염기서열 정보를 이용하여 mEPSPS를 포함하고 있는 유전자 변형 옥수수인 GA21 품종에 대한 PCR을 수행하였다. 상기 PCR을 통해 얻어진 PCR 산물을 서열분석하여 내재되어 있는 mEPSPS 유전자의 염기서열을 분석하였다. 그 결과, 도 1에서 보는 것과 같이, mEPSPS의 전체 염기서열에서 5개의 인트론 부위를 확인하였다. 이때, 인트론 염기 크기는 ① 98bp, ② 283bp, ③ 500bp, ④ 162bp, ⑤ 80bp로 확인되었으며, 이들 염기서열을 바탕으로 옥수수 내재 염기서열과 도입된 mEPSPS 염기서열을 구별할 수 있는 유전자-특이적 마커를 선발하였다(가장 크기가 큰 인트론 부위인 ③은 이하 실험에서 제외하였다). 이때, 비교군으로는 각 인트론 부위를 사이에 두고 양쪽의 엑손 염기서열을 이용하여 옥수수 내재 염기서열과 도입된 mEPSPS 유전자를 구분할 수 있는 특이 마커를 제작하였다.

이에, 옥수수 GA21 품종을 대상으로 PCR 분석을 통해 유전자 특이적 검출 여부를 확인하였다(도 2). 이때, 상기 도 2에서 M은 1Kb DNA 마커를 의미하며, lane 1 내지 14는 ①, ②, ④, 및 ⑤의 인트론 부위를 포함하는 프라이머의 조합을, lane 15 내지 17은 엑손 염기서열 내 프라이머의 조합을 나타낸 것이다.

그 결과(도 2), 인트론 염기서열을 이용한 14개의 프라이머 조합(lane 1 내지 14)의 경우, 모두 옥수수 내재 염기서열(노란색 별 표시)과 도입된 mEPSPS 염기서열(빨간색 별 표시)을 검출하는 두 개의 주요 PCR 산물 밴드가 뚜렷하게 확인되었다. 반면, mEPSPS의 엑손 염기서열을 이용하여 제작된 프라이머(lane 15 내지 17)의 경우에는 mEPSPS 염기서열의 단일 PCR 산물 밴드만을 형성하여 옥수수 내재 염기서열과 도입된 mEPSPS 염기서열에 의한 검출 유무의 확인이 불가하였다.

프라이머 NO.	프라이머 조합	SEQ ID NO.	염기서열(5‘-3’)
1	mEPSPS01#1-1	1	CTGTTACTGCTGCTGGTGGA
1	mEPSPS01#1-2	2	CAGTCAGTGCCAAGGAAACA
2	mEPSPS01#2-1	3	TACTGCTGCTGGTGGAAATG
2	mEPSPS01#2-2	4	TGCCAAGGAAACAATCAACA
3	mEPSPS01#1-1	1	CTGTTACTGCTGCTGGTGGA
3	mEPSPS01#2-2	4	TGCCAAGGAAACAATCAACA
4	mEPSPS12#1-1	5	TGATTGTTTCCTTGGCACTG
4	mEPSPS12#1-2	6	CTGATGGAGCCAGACAGCTT
5	mEPSPS12#2-1	7	TGTTTCCTTGGCACTGACTG
5	mEPSPS12#2-2	8	CAATCTCCACATCCCCAAGA
6	mEPSPS12#2-1	7	TGTTTCCTTGGCACTGACTG
6	mEPSPS12#3-2	9	ACATCCCCAAGAGCCAAAG
7	mEPSPS12#2-1	7	TGTTTCCTTGGCACTGACTG
7	mEPSPS12#4-2	10	GACTGCTGATGGAGCCAGAC
8	mEPSPS34#1-1	11	CTCGGTCCATGTAACCTTCG
8	mEPSPS34#1-2	12	CCTCAAGCGCAAGCTATTTC
9	mEPSPS34#2-1	13	ACGCTAGTCTCGGTCCATGT
9	mEPSPS34#1-2	12	CCTCAAGCGCAAGCTATTTC
10	mEPSPS34#3-1	14	TAACCTTCGCTCCCATCATC
10	mEPSPS34#1-2	12	CCTCAAGCGCAAGCTATTTC
11	mEPSPS45#1-1	15	ATGTCGCCATGACTCTTGCT
11	mEPSPS45#1-2	16	AACCATCCTCTCGGTCTCCT
12	mEPSPS45#2-1	17	ATGACTCTTGCTGTGGTTGC
12	mEPSPS45#1-2	16	AACCATCCTCTCGGTCTCCT
13	mEPSPS45#3-1	18	ACCTCAAGGCGATTGATGTC
13	mEPSPS45#1-2	16	AACCATCCTCTCGGTCTCCT
14	mEPSPS45#4-1	19	TTGGGAGGAAACACCTCAAG
14	mEPSPS45#1-2	16	AACCATCCTCTCGGTCTCCT

한편, 현재 mEPSPS가 포함된 유전자 변형 작물의 경우, 도입된 유전자가 대부분 CTP-otp::mEPSPS 형태로 삽입되어 있기 때문에, 상기 부위를 유전자 검출을 위한 구조-특이적(construct-specific) 마커로 선발하였다(도 3 및 표 2). 이때, 상기 구조-특이적 마커는 본 발명의 유전자-특이적 마커의 비교군으로서 제시된 것이며, 도 3은 GA21(옥수수) 품종의 mEPSPS 검출을 위한 구조-특이적 마커의 부위를 적색 bar로 표시한 것이다.

	프라이머 조합	SEQ ID NO.	염기서열(5‘-3’)
1	tpEPSPS1-1	20	TTCGAGACGCTGTCGTACCT
1	tpEPSPS1-2	21	GCTGCAGCACGATCTCCTC
2	tpEPSPS2-1	22	CGTTCCAGGGGCTCAAGT
2	tpEPSPS2-2	23	GAGTAGGAGGATCCGGTTGG
3	tpEPSPS3-1	24	ACGGCAACAAGAAGTTCGAG
3	tpEPSPS2-2	23	GAGTAGGAGGATCCGGTTGG

앞서 제작한 유전자 특이적인 14개의 프라이머 조합 중 각 인트론의 위치(①, ②, ④, 및 ⑤)에 대해 2개씩 선별한 프라이머 조합과, 상기 표 2의 구조 특이적인 프라이머 조합의 mEPSPS 포함 유전자 변형 옥수수의 검출을 확인한 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에서 보는 것과 같이, 본 발명에 따른 프라이머 세트(a 내지 i 참조)의 경우, 유전자 변형 옥수수의 내재된 염기서열(도 4의 노란색 화살표) 및 도입된 mEPSPS의 염기서열(도 4의 빨간색 화살표)에 대한 두 개의 검출 밴드가 형성되는 것을 확인할 수 있다. 반면, 유전자 변형되지 않은 옥수수에서는 옥수수의 내재된 염기서열 부위에 대한 1개의 검출 밴드만을 나타냈다. 또한, mEPSPS 유전자의 엑손 염기서열만을 이용하여 제작된 프라이머의 경우에서도, j 내지 l에서 보는 것과 같이, 유전자 변형되지 않은 옥수수에서도 옥수수의 내재 염기서열에 대한 1개의 검출 밴드가 검출됨에 따라 mEPSPS 유전자를 포함하는 유전자 변형 옥수수만을 특이적으로 검출하지는 못하는 것을 알 수 있다. 이 외에도 mEPSPS 유전자와 tp 염기서열의 구조 특이적 프라이머의 경우(도 4의 (B), m 내지 p), mEPSPS 유전자를 포함하는 유전자 변형 작물(콩-FG72, Das44406-6 및 면화-GHB614)에 대해서는 도입된 mEPSPS 유전자 부위의 구조 서열에 대한 1개의 검출 밴드만이 형성되는 것을 통해 역시 mEPSPS 유전자만을 특이적으로 검출하지 못하는 것을 확인할 수 있었다.

<실시예 3> EPSPS 유전자-특이적 프라이머를 이용한 PCR 분석

상기 실시예 2에서 선발된 유전자-특이적 프라이머의 조합을 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 분석은 다중 PCR 프리믹스(Multiple PCR Premix; Hotstart Top DNA polymerase, Reaction buffer 및 dNTPs 포함, Bioneer, 한국)를 사용하여 시료를 제조하였다. 시료 당 반응액을 총 20㎕로 하고, 각 10μM의 정방향(forward) 및 역방향(reverse) 프라이머와 상기 실시예 1에서 추출한 50ng/㎕의 주형 DNA를 기본 반응으로 하여 수행하였다. PCR 조건은 초기 95℃에서 10분간 실시한 후, 95℃에서 30초, 60℃에서 40초, 72℃에서 1분간 총 30 사이클 반복하였다. 마지막 단계로, 72℃에서 5분간 유전자 증폭기(TProfessional Thermocycler, Biometra, 독일)에서 DNA 증폭 반응을 수행하였다. 증폭된 PCR 산물은 전기영동 장치를 이용하여 2% 아가로스 겔 상에 전개한 후 자외선(UV) 하에서 확인하였다.

<실시예 4> PCR의 검출 한계(limit of detection, LOD) 측정

유전자 변형 작물 검정에 있어서 비의도적으로 시료 내 DNA가 미량으로 존재할 경우, 검출에 어려움이 발생할 수 있으므로, 실제 검출가능한 농도 범위를 확인하고자 검출 한계(LOD)를 확인하였다. 검출 한계를 위한 반응은 mEPSPS를 포함한 대표적인 유전자 변형 옥수수 품종인 GA21을 이용하였으며, 주형 DNA는 실시예 1에서 추출한 50ng/㎕의 DNA를 이용하였다. 각 검출 품목 표준물질의 DNA 농도는 0%, 0.1%, 0.5%, 1%, 5% 및 100%로 달리하여 분석하였다.

그 결과, 도 5에서 보는 것과 같이, 일부 프라이머 조합에서 0.1%까지 검출 가능한 것으로 나타났으며, 전체적으로 선발된 유전자 특이적 프라이머 및 구조 특이적 프라이머 조합 모두 0.5% 범위까지 뚜렷하게 검출 산물을 확인할 수 있었다. 따라서, 국내 표시제 3%와 유럽의 0.9% 범위를 충분히 만족시킬 수 있음을 알 수 있다.

<실시예 5> 가축 사료 내 유전자 변형 작물 내 mEPSPS 검출 확인

본 발명에 따른 PCR 기술의 실제적인 적용을 위해서, 국내에서 유통되고 있는 동물 사료 8종을 무작위로 선별하여 분석을 수행하였다. 재료로 사용한 동물 사료의 경우, 그 우너료 혼합물이 다양한 작물을 포함하고 있고, 국내 수입 승인된 유전자 변형 작물이 포함되어 있기 때문에, 복합적인 재료에서 본 발명에 따른 프라이머의 mEPSPS의 판별 유무를 확인하는 것은 실질적인 적용 가능성을 확인할 수 있는 좋은 방법이라 할 수 있다. PCR은 실시예 3의 양성 대조구 조건과 동일하게 수행하였으며, 주형 DNA는 실시예 1에서 추출한 50ng/㎕의 DNA를 이용하였다.

그 결과(도 6), 본 발명에 따른 프라이머 세트는 사료 내 도입된 mEPSPS 유전자의 판별 뿐만 아니라, 옥수수 원료의 포함 유무까지 뚜렷하게 확인할 수 있었다. 반면, 유전자 변형되지 않은 옥수수에 대해서는 어떠한 mEPSPS 유전자 반응 산물도 나타내지 않는 것을 확인할 수 있었다(도 6의 빨간색 원 참조). 즉, 혼합 시료에서의 mEPSPS가 포함된 유전자 변형 옥수수 또는 mEPSPS 포함된 유전자 변형 작물의 사용에 대한 구분이 가능하여 본 발명에 따른 프라이머 세트의 효율적인 판별 특성과 다양한 이용성을 확인하였다.

이상으로, 본 발명에 따른 프라이머 세트는 mEPSPS 유전자를 포함하는 유전자 변형 옥수수를 특이적으로 검출할 수 있고, 낮은 농도의 시료에서도 mEPSPS를 포함하는 유전자 변형 옥수수의 확인이 가능함을 확인하였다. 이에, 본 발명에 따른 프라이머 세트는 유전자 변형 옥수수의 비의도적 환경 방출에 따른 환경 내 자생 유전자 변형 작물의 검출, 농업용 유전자 변형 작물 처리 사업장 및 사료 이용 농가의 주변 환경에 대한 확인, 유전자 변형 작물의 이력 추적 등에 효과적으로 이용될 수 있어 환경 모니터링의 안전관리 기술로 적용가능하다.

<110> Republic of Korea <120> Primer set, composition and kit for detecting genetically modified crops introduced EPSPS gene, and methods using the same <130> P18R12C0677 <160> 24 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mEPSPS01#1-1 <400> 1 ctgttactgc tgctggtgga 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mEPSPS01#1-2 <400> 2 cagtcagtgc caaggaaaca 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mEPSPS01#2-1 <400> 3 tactgctgct ggtggaaatg 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mEPSPS01#2-2 <400> 4 tgccaaggaa acaatcaaca 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mEPSPS12#1-1 <400> 5 tgattgtttc cttggcactg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mEPSPS12#1-2 <400> 6 ctgatggagc cagacagctt 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mEPSPS12#2-1 <400> 7 tgtttccttg gcactgactg 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mEPSPS12#2-2 <400> 8 caatctccac atccccaaga 20 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mEPSPS12#3-2 <400> 9 acatccccaa gagccaaag 19 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mEPSPS12#4-2 <400> 10 gactgctgat ggagccagac 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mEPSPS34#1-1 <400> 11 ctcggtccat gtaaccttcg 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mEPSPS34#1-2 <400> 12 cctcaagcgc aagctatttc 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mEPSPS34#2-1 <400> 13 acgctagtct cggtccatgt 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mEPSPS34#3-1 <400> 14 taaccttcgc tcccatcatc 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mEPSPS45#1-1 <400> 15 atgtcgccat gactcttgct 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mEPSPS45#1-2 <400> 16 aaccatcctc tcggtctcct 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mEPSPS45#2-1 <400> 17 atgactcttg ctgtggttgc 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mEPSPS45#3-1 <400> 18 acctcaaggc gattgatgtc 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mEPSPS45#4-1 <400> 19 ttgggaggaa acacctcaag 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tpEPSPS1-1 <400> 20 ttcgagacgc tgtcgtacct 20 <210> 21 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tpEPSPS1-2 <400> 21 gctgcagcac gatctcctc 19 <210> 22 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tpEPSPS2-1 <400> 22 cgttccaggg gctcaagt 18 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tpEPSPS2-2 <400> 23 gagtaggagg atccggttgg 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tpEPSPS3-1 <400> 24 acggcaacaa gaagttcgag 20

Claims

SEQ ID NO: 1 및 2의 염기서열로 이루어지는 제1의 프라이머 쌍;
SEQ ID NO: 3 및 4의 염기서열로 이루어지는 제2의 프라이머 쌍;
SEQ ID NO: 1 및 4의 염기서열로 이루어지는 제3의 프라이머 쌍;
SEQ ID NO: 5 및 6의 염기서열로 이루어지는 제4의 프라이머 쌍;
SEQ ID NO: 7 및 8의 염기서열로 이루어지는 제5의 프라이머 쌍;
SEQ ID NO: 7 및 9의 염기서열로 이루어지는 제6의 프라이머 쌍;
SEQ ID NO: 7 및 10의 염기서열로 이루어지는 제7의 프라이머 쌍;
SEQ ID NO: 11 및 12의 염기서열로 이루어지는 제8의 프라이머 쌍;
SEQ ID NO: 13 및 12의 염기서열로 이루어지는 제9의 프라이머 쌍;
SEQ ID NO: 14 및 12의 염기서열로 이루어지는 제10의 프라이머 쌍;
SEQ ID NO: 15 및 16의 염기서열로 이루어지는 제11의 프라이머 쌍;
SEQ ID NO: 17 및 16의 염기서열로 이루어지는 제12의 프라이머 쌍;
SEQ ID NO: 18 및 16의 염기서열로 이루어지는 제13의 프라이머 쌍; 및
SEQ ID NO: 19 및 16의 염기서열로 이루어지는 제14의 프라이머 쌍;을 포함하는 EPSPS 유전자가 도입된 유전자 변형 옥수수 검출용 프라이머 세트.
제1항의 프라이머 세트를 포함하는 EPSPS 유전자가 도입된 유전자 변형 옥수수 검출용 조성물.
시료의 게놈 DNA를 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하고 PCR 산물을 분석하는 단계를 포함하는, EPSPS 유전자가 도입된 유전자 변형 옥수수의 검출 방법.
제3항에 있어서,
제1의 프라이머 쌍 내지 제3의 프라이머 쌍 중 하나 이상의 프라이머 쌍을 포함하는 프라이머 세트를 이용하여 98 bp의 PCR 산물이 증폭되거나;
제4의 프라이머 쌍 내지 제7의 프라이머 쌍 중 하나 이상의 프라이머 쌍을 포함하는 프라이머 세트를 이용하여 283 bp의 PCR 산물이 증폭되거나;
제8의 프라이머 쌍 내지 제10의 프라이머 쌍 중 하나 이상의 프라이머 쌍을 포함하는 프라이머 세트를 이용하여 162 bp의 PCR 산물이 증폭되거나; 또는
제11의 프라이머 쌍 내지 제14의 프라이머 쌍 중 하나 이상의 프라이머 쌍을 포함하는 프라이머 세트를 이용하여 80 bp의 PCR 산물이 증폭되는 경우, 시료 내 EPSPS 유전자가 포함된 것으로 결정하는 EPSPS 유전자가 도입된 유전자 변형 옥수수의 검출 방법.
제1항에 따른 프라이머 세트와 이의 PCR 반응 혼합물을 포함하는 EPSPS 유전자가 도입된 유전자 변형 옥수수 검출용 PCR 키트.
제5항에 있어서,
PCR 반응 혼합물은 dNTP, DNA 폴리머라아제 및 버퍼를 포함하는 EPSPS 유전자가 도입된 유전자 변형 옥수수 검출용 PCR 키트.