CN108866085A - Bsu DNA聚合酶的表达基因、重组表达载体及制备方法 - Google Patents

Bsu DNA聚合酶的表达基因、重组表达载体及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种Bsu DNA聚合酶的制备方法、表达基因及重组表达载体。一种Bsu DNA聚合酶的表达基因，包括如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。上述表达基因编码的Bsu DNA聚合酶基因能够在大肠杆菌中实现大量可溶性表达，且表达的Bsu DNA聚合酶的纯度大于95％。

Description

Bsu DNA聚合酶的表达基因、重组表达载体及制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种Bsu DNA聚合酶的表达基因、重组表达载体及制备方法。
背景技术
DNA扩增在许多分子生物学检测方法中都是非常关键的一步。PCR是在1986年就发展起来的应用最为广泛的DNA扩增技术，常用于检测、鉴定传染性疾病、基因突变以及其他方面。然而，这种经典的技术需要一个温度循环仪器使双链DNA解链，再在等温条件下扩增目的片段。
随着分子生物学的不断发展，重组酶聚合酶扩增(recombinase polymeraseamplification，RPA)技术使不借助精密温度循环系统进行等温核酸扩增逐渐成为可能。重组酶聚合酶扩增技术通过模拟DNA体内扩增，在等温条件下产生目的片段，该技术主要依赖重组酶UvsX、单链结合蛋白Gp32和链置换Bsu DNA聚合酶。重组酶UvsX能够不通过加热就解开双链DNA。重组酶聚合酶扩增反应开始时，重组酶UvsX在ATP的参与下结合引物，形成核酸蛋白复合体，这些复合体能够扫描与引物序列互补的目标双链DNA。接着，核酸蛋白复合体侵入5'端位点形成D状环。单链结合蛋白Gp32与被置换单链结合使其稳定。同时，重组酶UvsX离开寡核苷酸的3'端，降解后被DNA聚合酶利用。然后Bsu DNA聚合酶结合在核酸蛋白复合体的游离3'端，进行链延伸，形成新的互补链。在链延伸的过程中，新合成的单链与原始互补链配对。以上步骤循环进行，实现DNA的指数增长。重组酶聚合酶扩增技术是一项由多种酶和蛋白参与，在恒定温度条件下实现核酸指数扩增的新技术，具有反应灵敏、高效、性价比高的特点。
重组酶聚合酶扩增技术中Bsu DNA聚合酶具有重要作用，但目前获得的Bsu DNA聚合酶的纯度不高，而且Bsu DNA聚合酶基因在基因工程菌中的表达量低，量产化成本高。
发明内容
基于此，有必要针对Bsu DNA聚合酶的纯度低的问题，提供一种能够使Bsu DNA聚合酶纯度高的表达基因。
此外，还提供一种Bsu DNA聚合酶的重组表达载体及制备方法。
一种Bsu DNA聚合酶的表达基因，包括如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
上述表达基因，编码的Bsu DNA聚合酶基因能够在大肠杆菌中实现大量可溶性表达，且表达的Bsu DNA聚合酶的纯度大于95％。
一种重组表达载体，包括pET-28a载体和插入在所述pET-28a载体中的目的基因表达片段，所述目的基因表达片段中含如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
在其中一个实施例中，所述目的基因表达片段的5'端具有BamHI酶切位点黏性末端，所述目的基因表达片段的3'端具有SalI酶切位点黏性末端。
一种Bsu DNA聚合酶的制备方法，包括以下步骤：
将目的基因表达片段导入pET-28a载体中，得到重组表达载体，所述目的基因表达片段含有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，所述目的基因表达片段的5'端具有BamHI酶切位点黏性末端，所述目的基因表达片段的3'端具有SalI酶切位点黏性末端；将所述重组表达载体转入大肠杆菌，得到重组工程菌；以及对所述重组工程菌进行诱导培养，得到所述Bsu DNA聚合酶。
在其中一个实施例中，所述目的基因表达片段的制备包括以下步骤：以如SEQ IDNo.1所示的核苷酸序列为扩增模板，并加入上游引物和下游引物后进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，所述上游引物包括BamHI酶切位点，所述下游引物包括SalI酶切位点；将所述PCR扩增产物插入到pMD19-T Simple载体，并转化至感受态细胞中，得到克隆载体；以及用限制性内切酶BamHI和限制性内切酶SalI对所述克隆载体进行双酶切，得到目的基因表达片段。
在其中一个实施例中，所述上游引物的碱基序列如SEQ ID No.2所示，所述下游引物的碱基序列如SEQ ID No.3所示。
在其中一个实施例中，所述大肠杆菌为BL21(DE3)。
在其中一个实施例中，所述对所述重组工程菌进行诱导培养得到所述Bsu DNA聚合酶的步骤中，包括：在重组工程菌的菌落OD值为为0.4～0.8时，加入终浓度为0.05mM～0.15mM的异丙基硫代半乳糖苷，并在19℃～25℃诱导表达20h～24h，固液分离收集上清，得到粗产物；以及将所述粗产物纯化，得到所述Bsu DNA聚合酶。
在其中一个实施例中，所述将所述粗产物纯化得到所述Bsu DNA聚合酶的步骤中，包括：将所述粗产物采用硫酸铵盐析后进行Ni亲和纯化，得到所述Bsu DNA聚合酶。
一种Bsu DNA聚合酶，其特征在于，通过上述Bsu DNA聚合酶的制备方法获得。
上述Bsu DNA聚合酶能够不通过加热就解开双链DNA，纯度大于95％。
上述Bsu DNA聚合酶作为重组酶聚合酶扩增领域中的一种重要酶，在恒定温度条件下可与其他酶一起实现核酸指数扩增，Bsu DNA聚合酶的应用可以使得DNA的扩增反应灵敏、高效、性价比高。
附图说明
图1为实施例1的克隆载体的部分正向测序图；
图2为实施例1的克隆载体的部分反向测序图；
图3为实施例1的重组工程菌的平板培养物与阴性对照、阳性对照的对比图；
图4为实施例1的重组工程菌的菌落PCR电泳图；
图5为实施例1的重组工程菌诱导后菌体的SDS-PAGE电泳图；
图6为实施例1的重组工程菌诱导前后菌体、诱导且超声破碎后离心上清及诱导且超声破碎后离心沉淀的SDS-PAGE电泳图；
图7为实施例1的重组工程菌诱导后超声破碎的上清在Ni柱纯化前后的SDS-PAGE电泳结果比对图；
图8为实施例1的计算酶活性的标准曲线；
图9为实施例1制备的Bsu DNA聚合酶酶活性验证电泳图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的部分实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使本发明公开内容更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
一实施方式的Bsu DNA聚合酶的制备方法，包括以下步骤：
S110、以如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列为扩增模板，并加入上游引物和下游引物后进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，上游引物包括BamHI酶切位点，下游引物包括SalI酶切位点。
具体地，步骤S110具体包括以下步骤S111～S113：
S111、获得Bsu DNA聚合酶的基因编码序列。具体地，Bsu DNA聚合酶的基因编码序列可以从基因数据中筛选获得。
S112、重新设计编码Bsu DNA聚合酶的核苷酸序列，得到如SEQ ID No.1序列。
S113、将如SEQ ID No.1序列PCR扩增，得到PCR产物。具体地，构建包括如SEQ IDNo.1序列、上游引物及下游引物的PCR体系，然后进行PCR，得到PCR产物。进一步地，上游引物包括BamHI酶切位点，下游引物包括SalI酶切位点，以便于酶切PCR扩增产物从而构建克隆载体。更一步地，上游引物的碱基序列如SEQ ID No.2所示，下游引物的碱基序列如SEQID No.3所示。
S120、将PCR扩增产物插入到pMD19-T Simple载体，并转化至感受态细胞中，得到克隆载体。
具体地，将S110步骤中得到的PCR扩增产物用限制性内切酶BamHI酶及限制性内切酶SalI酶双酶切处理，漏出粘性末端。然后插入同样经过BamHI酶及SalI酶双酶切处理的pMD19-T Simple载体中，并转化至大肠杆菌感受态细胞中，然后扩增提取质粒，并测序验证插入序列的正确性，得到插入序列正确的克隆载体。
本实施方式中的感受态细胞为TOP10。
S130、用限制性内切酶BamHI和限制性内切酶SalI对克隆载体进行双酶切，得到目的基因表达片段。
具体地，将S120步骤中得到的插入序列正确的克隆载体进行BamHI酶及SalI酶双酶切，并将双酶切的片段产物进行纯化回收，得到目的基因表达片段。得到的目的基因表达片段含有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，且其5'端具有BamHI酶切位点黏性末端，3'端具有SalI酶切位点黏性末端，以便于构建重组表达载体。本实施方式采用试剂盒进行纯化回收。
S140、将目的基因表达片段导入pET-28a载体中，得到重组表达载体。
具体地，将目的基因表达片段导入经BamHI酶及SalI酶双酶切处理的pET-28a载体中，得到重组表达载体。pET-28a载体经BamHI酶及SalI酶双酶切处理以便于目的基因片段插入。
具体地，pET-28a载体包括pET-28a载体的基本序列、多克隆位点序列、启动子序列，多克隆位点包括BamHI酶切位点和SalI酶切位点。
S150、将重组表达载体转入大肠杆菌，得到重组工程菌。
具体地，将重组表达载体转入具有抗性标记的大肠杆菌，然后在抗性平板上培养以得到转化子。然后随机挑选一定量的转化子进行菌落PCR以验证转化的正确性，确保重组工程菌转化成功。
进一步地，具有抗性标记的大肠杆菌为BL21(DE3)，抗性平板上为含Kanr平板。进行菌落PCR的引物如SEQ ID No.2及SEQ ID No.3所示。
进一步地，菌落PCR之后采用琼脂糖凝胶电泳，若琼脂糖凝胶电泳的条带与目的基因片段预期的大小一致，则转化成功，反之则未转化成功。
具体地，将重组表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，并涂于含Kanr平板上，培养12h～16h，观察是否有单克隆生长，若有生长，则初步判定转化成功。然后挑取转化子进行菌落PCR进一步验证。
发明人在酶切位点、表达载体以及基因工程菌方面进行了大量的探索研究，从而构建获得上述Bsu DNA聚合酶的表达片段的重组工程菌。该重组工程菌能够高效、可溶性的表达Bsu DNA聚合酶，产率高，能够实现大批量的生产。
S160、对重组工程菌进行诱导培养，得到粗产物。
具体地，将重组工程菌加入含有Kanr的LB液体培养基中培养一段时间，待菌体正常生长后，加入IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)进行诱导培养，得到粗产物。
进一步地，重组工程菌与含有Kanr的LB液体培养基的接种体积比例为10μL：800mL～1200mL。重组工程菌在含有Kanr的LB液体培养基中培养的温度为35℃～38℃，培养时间为10h～16h，以使重组工程菌复苏和扩增，得到OD值为0.4～0.8的生长活力较好的重组工程菌。
进一步地，加入终浓度为0.05mM～0.15mM的IPTG，IPTG的诱导培养温度为19℃～25℃，培养时间为20h～22h，低于扩增培养重组工程菌的温度。研究过程中发现，诱导培养的温度较低，适宜Bsu DNA聚合酶的表达，提高表达效率。
进一步地，诱导培养之后，进行Bsu DNA聚合酶是否表达的验证。具体地，取一定量的诱导培养后的菌液，离心得到菌体，加入loading buffer，煮沸，离心，冷却后取上清进行SDS-PAGE电泳。若上清的SDS-PAGE电泳条带在Bsu DNA聚合酶预期(由SnapGene计算得BsuDNA聚合酶的大小)处，则有表达，反之则无。当然，在其他实施方式中，若也可以用本领域内常见其他确定蛋白是否表达的方法。可以理解的是，在确定Bsu DNA聚合酶在重组工程菌中能够表达时，验证Bsu DNA聚合酶是否表达的步骤可以省略。
进一步地，确定Bsu DNA聚合酶是表达后，进行Bsu DNA聚合酶的表达方式的确认，以确定Bsu DNA聚合酶是可溶性表达还是包涵体表达，还是两者皆是。具体地，取一定量诱导培养后的菌液，进行固液分离，收集菌体，并超声破碎，得上清及沉淀，将上清和沉淀经SDS-PAGE电泳。若在上清及沉淀具有与目的蛋白大小相近的条带，则可溶性表达及包涵体表达均有，若只上清具有与目的蛋白大小相近的条带，则为可溶性表达，若只沉淀具有与目的蛋白大小相近的条带，则为包涵体表达。当然，可以理解的是，在确定表达方式之后，确认Bsu DNA聚合酶的表达方式的步骤可以省略，直接收集所需的含有Bsu DNA聚合酶的溶液。
本实施方式中，Bsu DNA聚合酶均有表达，为进一步简化后续蛋白纯化的工艺，取超声破碎后的上清作为粗产物进行下一步纯化。
S170、将粗产物纯化，得到Bsu DNA聚合酶。
具体地，将粗产物采用硫酸铵盐析后进行Ni亲和纯化，得到聚合酶。
具体地，将粗产物纯化，得到Bsu DNA聚合酶的操作包括以下步骤S171～S172：
S171、将粗产物硫酸铵盐析沉降，得到盐析产物。
具体地，盐析沉降时温度控制在0℃～10℃条件下，避免蛋白沉降后发生变性。
具体地，硫酸铵的终浓度为2mol/L～6mol/L，加入硫酸铵后，硫酸铵的浓度合适，通过硫酸铵盐析沉降目的蛋白，从使得粗产物得到纯化。
具体地，盐析沉降时间为20min～40min。盐析沉降后得到的沉淀中含有大量的目的蛋白。
具体地，盐析沉降后，在10000rpm～15000rpm离心10min～20min，收集沉淀得盐析产物。
S172、将盐析产物通过Ni离子亲和柱纯化，得到Bsu DNA聚合酶。
具体地，利用Ni离子亲和柱纯化盐析产物的操作包括以下步骤S1721～S1722。
S1721、将盐析产物溶解在结合缓冲液中，加入到Ni离子亲和柱中，结合缓冲液中含有终浓度为15mmol/L～25mmol/L的Tris-HCl和终浓度为100mmol/L～300mmol/L的NaCl，结合缓冲液与盐析产物的体积比为2～5：1。
具体地，结合缓冲液的pH值约为8，将盐析产物溶解在结合缓冲液中并加入到Ni离子亲和柱中，粗产物中的目的蛋白结合在Ni离子亲和柱上面。
S1722、用浓度梯度的咪唑溶液洗涤Ni离子亲和柱，收集Bsu DNA聚合酶的洗脱液。
咪唑溶液能够竞争性的与Ni离子结合，从而将目的蛋白洗脱下来。
具体地，结合缓冲液的pH值约为8，将盐析产物加入到Ni离子亲和柱中后，先用8倍～12倍柱床体积结合缓冲液平衡。再用3倍～6倍柱床体积的浓度梯度咪唑溶液依次洗涤。
梯度咪唑溶液中含有终浓度为10mmol/L～30mmol/L的Tris-HCl和终浓度为100mmol/L～300mmol/L的NaCl和不同浓度的咪唑。具体地，浓度梯度的咪唑溶液中咪唑的浓度依次为15mmol/L、40mmol/L和240mmol/L。
先用低浓度的咪唑溶液冲洗Ni离子亲和柱，洗脱杂蛋白。然后用高浓度的咪唑溶液冲洗Ni离子亲和柱，出现目的蛋白峰时，收集含有Bsu DNA聚合酶(目的蛋白)的洗脱液。
具体地，收集含有Bsu DNA聚合酶的洗脱液的操作之后，还包括：用平衡缓冲液对含有Bsu DNA聚合酶的洗脱液进行缓冲液置换，平衡缓冲液中含有终浓度为15mmol/L～25mmol/L的Tris-HCl、终浓度为0.1mmol/L～0.4mmol/L的EDTA(乙二胺四乙酸)和终浓度为0.5mmol/L～2mmol/L的DTT(二硫苏糖醇)，pH为8。
含有Bsu DNA聚合酶的洗脱液中还有部分咪唑，对Bsu DNA聚合酶的纯度以及稳定性产生影响。将Bsu DNA聚合酶置换到平衡缓冲液中，使得Bsu DNA聚合酶比较稳定，保存时间更长。
进一步地，将含有Bsu DNA聚合酶的洗脱液置换成平衡缓冲液后，加入等体积的甘油，置于-80℃条件下待用。
需要说明的是，实际应用中，表达纯化Bsu DNA聚合酶时，不局限于上述步骤S110～S170的顺序。本领域技术人员可以根据需要进行调整。如当预先已经构建并保存了含有Bsu DNA聚合酶表达片段的重组工程菌时，步骤S110～S150可以省略。
一种Bsu DNA聚合酶，通过上述Bsu DNA聚合酶的制备方法获得。具体地，编码上述Bsu DNA聚合酶的基因序列包括如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。上述Bsu DNA聚合酶在大肠杆菌中大量可溶性表达，且Bsu DNA聚合酶的纯度高，能够大批量的生产。
上述Bsu DNA聚合酶的制备方法，通过对含有Bsu DNA聚合酶的表达基因的重组工程菌进行诱导培养，并收集诱导培养后的菌体。然后将菌体裂解，得到含有目的蛋白(BsuDNA聚合酶)的裂解液。然后向裂解液中加入硫酸铵进行盐析，Ni离子亲和柱纯化，除去杂蛋白，提高Bsu DNA聚合酶的纯度。这种制备Bsu DNA聚合酶的方法操作简便、快速、成本低，适应于大批量的生产，获得的Bsu DNA聚合酶纯度高，可达95％以上，能够满足重组酶聚合酶扩增技术对于Bsu DNA聚合酶的纯度要求，应用于DNA扩增领域，尤其是重组酶聚合酶扩增领域。
以下为具体实施例部分。
实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者试剂盒生产厂家推荐的方法实现。
实施例1
(1)构建克隆载体
将如SEQ ID No.1所示的序列通过PCR的方法拼接，然后克隆入PMD19-T SIMPLE载体并转化至感受态细胞TOP10，测序验证克隆载体中插入序列是否与要求相一致，得到插入序列正确的克隆载体。
本实施方式的克隆载体的部分测序结果如图1～图2所示。由图可知，如SEQ IDNo.1所示的部分序列从图1中的38开始至988结束；如SEQ ID No.1所示的序列的互补链的部分序列从图2的21开始至1068结束。如SEQ ID No.1所示的序列正确插入了PMD19-TSIMPLE载体。
(2)构建重组表达载体
酶切：将插入序列正确的克隆载体中的如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列从克隆载体PMD19-T Simple双酶切切下，pET-28a载体也使用BamHI酶及SalI酶酶切，上述两种载体的酶切体系如下表1。
表1
酶切的条件为：先30℃酶切2h，再37℃酶切2h。并且将双酶切后的pET-28a载体进行纯化回收，目的片段进行切胶回收，具体按照试剂盒的说明书进行操作，得到纯化的均带有BamHI酶切位点黏性末端及SalI酶切位点黏性末端的pET-28a载体和目的片段。
连接：将纯化回收的pET-28a载体和目的基因表达片段按照表2的体系连接，得到重组表达载体，其中，连接反应条件为16℃，2h。
表2
(3)构建重组工程菌
将重组表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，并涂于含Kanr平板上，培养12h～16h，观察是否有单克隆生长。
结果如图3所示，由左向右依次是阴性对照组、阳性对照组、实验组，其中阴性对照组为空质粒的大肠杆菌BL21(DE3)，阳性对照组为含有PET-28a质粒的大肠杆菌BL21(DE3)，实验组为将重组表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)的重组工程菌。从图3中可以看出实验组平板长满了克隆，表明含有目的基因表达片段的重组工程菌构建成功。
随机挑取7个转化子编号1～7，分别溶于20μL的生理盐水，取1μL用于菌落PCR验证。其中，菌落PCR引物如表3所示，GGATCC代表BamHI的酶切位点，GTCGAC代表SalI的酶切位点。
表3
菌落PCR的扩增体系如表4，扩增条件为：1)94℃，5min；2)94℃，30s，55℃，30s，72℃，30s，循环30次；3)72℃，4min。然后将PCR扩增结果1％的琼脂糖凝胶电泳。
表4
菌落PCR电泳结果如图4所示。图4的第一泳道为Maker，Maker的分子量从上到下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。第二～第八泳道分别为挑取的7个转化子。图4中，转化子的PCR结果的条带与目的基因片段预期的大小一致(目的基因片段的理论大小为1794bp)。进一步表明了目的基因片段成功地导入了大肠杆菌BL21(DE3)中。
(4)诱导重组工程菌表达及纯化
确认是否表达成功：挑取菌落PCR编号1～7的转化子所在的克隆，分别溶于20μL的生理盐水，取10μL加入1L含有Kanr的LB液体培养基中培养3h，加入IPTG诱导(1:1000)，培养2h，收取菌液，离心，去上清，加入60ul 1Xloading buffer，煮沸10min，离心，冷却，取上清，上样10ul。先恒压100V，电泳30min，再恒压200V，电泳20min。取下胶，用考马斯亮蓝染色5min，高温加热脱色5min。
SDS-PAGE结果如图5所示，图5中，第一泳道为未诱导的大肠杆菌BL21(DE3)处理的菌体；第二泳道为蛋白maker，蛋白marker的分子量从上到下依次为250KD、150KD、100KD、70KD、50KD、40KD、30KD、20KD、15KD；第三泳道～第九泳道编号分别为1-7是转化子诱导后的菌体。
根据各酶序列以及SnapGene软件计算，28a-Bsu(指Bsu DNA聚合酶与载体蛋白的结合)的理论大小是69.5KD。由图5可以看出，除第三泳道外，其他泳道在69.5KD附近的蛋白表达量较多，表明按照上述步骤制备的重组工程菌能够诱导表达Bsu DNA聚合酶。
确认表达方式：将10μL重组工程菌接种到1000mL的LB培养基中，37℃培养6h，使其菌落OD值达到0.5后，加入0.1mM的IPTG，低温20℃，诱导表达22h，10000rpm离心收集菌体，并且对其菌体进行超声破碎，然后SDS-PAGE电泳。
SDS-PAGE结果如图6所示，图6中第一泳道为蛋白Maker，第二泳道为诱导前的菌体；第三泳道为诱导后的菌体；第四泳道为诱导后超声破碎离心的上清；第五泳道为诱导后超声破碎离心的沉淀。由图6可以看出，诱导后超声破碎离心的上清中Bsu DNA聚合酶的含量远远超过沉淀中Bsu DNA聚合酶的含量。Bsu DNA聚合酶在大肠杆菌中存在可溶性表达和包涵体表达。
盐析及Ni离子亲和柱纯化：取诱导表达后的菌体进行超声破碎后，取上清，在4℃加入终浓度为的4mol/L硫酸铵，盐析沉降时间为30min，10000rpm离心10min，收集沉淀得盐析产物。将盐析产物Ni离子亲和柱纯化，收集洗脱液SDS-PAGE电泳，结果如图7所示。泳道编号从左到右依次为第一泳道～第十五泳道。
合并第十泳道～十四泳道的洗脱液，测定蛋白纯度，测定结果显示按照上述制备方法制备的Bsu DNA聚合酶纯度大于95％。
用sephadexG25色谱柱进行进行缓冲液的置换。先用1CV～2CV(1～2倍柱体积)的NaOH(0.2mol/L)清洗sephadexG25色谱柱，填料、系统和管路，用NaOH清洗以确保所有接触蛋白的部位无菌。上样前色谱柱用无菌水平衡至pH中性，随后用storage buffer(20mmol/LTris-HCl，pH 8.0，150mmol/L EDTA，1mmol/L DTT)平衡色谱柱，至UV280洗脱至基线，电导、PH稳定。取收集的含有Bsu DNA聚合酶的洗脱液上样(约1/5柱床体积)，上柱过程中温度维持在4℃。凝胶过滤层析收集的样品补加等体积的甘油，-80℃保存。
(5)Bsu DNA聚合酶活性的测定
原理：在DNA聚合酶催化DNA分子的聚合过程中伴随着焦磷酸(PPi)的生成，利用ATP硫酰化酶将焦磷酸定量转化成ATP，再利用虫荧光素酶系统发光检测ATP的量，从而确定PPi的量，以PCR反应体系中PPi的量来反映DNA聚合酶的活性。
具体地，1)取标准ATP样品，并且浓度为：10-2pmol、10-1pmol、1、10pmol、102pmol、103pmol各10μL于发光管中，然后分别加入80μL的Reaction buffer和10μL的Enzyme Mix，混匀，放入荧光检测仪中，记录发光强度，绘制标准曲线。标准曲线如图8所示。
2)将1mmol的Bsu DNA聚合酶按照1、10倍、100倍稀释，分别加入以合成的M13mpssDNA为模板/引物，10nmol dNTP混合液，37℃反应30min后，10μL的50μmol/L的APS以及0.2U ATP硫酰化酶，混匀，使样品中的PPi转化为ATP。取10μL上述产物然后分别加入80μL的Reaction buffer和10μL的Enzyme Mix，混匀并且测定其荧光值。通过标准曲线，计算出掺入的dNTP，从而计算出Bsu DNA聚合酶酶活。Bsu DNA聚合酶酶活值为2500IU/mL
3)将0.5mmol的NEB的Bsu DNA聚合酶(阳性对照)、0.5mmol的实施例1的Bsu DNA聚合酶与合成的M13mpssDNA为模板/引物、10nmol dNTP混合液混合，37℃反应30min后，用1％脂糖凝胶电泳，在0.5×TBE缓冲液中电泳检测。凝胶电泳结果如图9所示，图9中，第一泳道为DNA Maker，第二泳道为M13mpssDNA，第三泳道为引物(primer)，第四泳道为NEB的BsuDNA聚合酶(阳性对照)，第五泳道为实施例1制得的Bsu DNA聚合酶。
从图9的结果可以看出，结果表明实施例1制得的Bsu DNA聚合酶具有活性，能够催化DNA合成。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 深圳市艾伟迪生物科技有限公司
<120> Bsu DNA聚合酶的表达基因、重组表达载体及制备方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1767
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggatccgatc agagcctgga agatattaat gttaaaaccg ttaccgatgt gaccagcgat 60
attctggtta gcccgagcgc atttgttgtt gagcagattg gtgataacta tcacgaagaa 120
ccgattctgg gttttagcat tgttaatgaa accggtgcct atttcatccc gaaagatatt 180
gcagttgaaa gcgaagtgtt caaagaatgg gttgaaaacg acgagcagaa aaaatgggtg 240
tttgatagca aacgtgcagt tgttgcactg cgttggcagg gtattgaact gaaaggtgca 300
gaatttgata ccctgctggc agcctatatt atcaatccgg gtaatagcta tgatgatgtt 360
gcaagcgttg ccaaagatta tggtctgcat attgttagca gtgatgaaag cgtttatggc 420
aaaggtgcaa aacgtgccgt tccgagcgaa gatgttctga gcgaacatct gggtcgtaaa 480
gcactggcaa ttcagagtct gcgtgaaaaa ctggttcaag aactggaaaa taacgatcag 540
ctggaactgt ttgaagaatt agaaatgccg ctggcactga ttctgggcga aatggaaagc 600
accggtgtta aagttgatgt tgatcgtctg aaacgtatgg gtgaagaact gggtgccaaa 660
ctgaaagaat atgaagaaaa aatccacgag attgccggtg aaccgtttaa tatcaatagc 720
ccgaaacagc tgggtgtgat cctgtttgaa aaaattggtc tgccggttgt gaaaaaaacc 780
aaaaccggtt atagcaccag cgcagatgtg ctggaaaaat tagcagataa acatgacatc 840
gtggactaca ttctgcagta tcgtcagatt ggtaaactgc agagcaccta tattgaaggt 900
ctgctgaaag ttacccgtcc ggatagccat aaagttcata cccgttttaa tcaggcactg 960
acccagaccg gtcgtctgag cagcaccgat ccgaatctgc agaatattcc gattcgtctg 1020
gaagaaggtc gtaaaattcg tcaggcattt gtgccgagcg aaaaagattg gctgattttt 1080
gcagcagatt atagccagat tgaactgcgt gttctggcac atattagcaa agatgaaaat 1140
ctgatcgaag ccttcaccaa cgatatggat attcatacca aaacagccat ggatgtgttt 1200
catgttgcga aagatgaagt taccagcgca atgcgtcgtc aggccaaagc agttaatttt 1260
ggtattgtgt atggcatcag cgattatggc ctgagccaga atctgggtat tacccgtaaa 1320
gaagcaggcg catttattga tcgctatctg gaaagttttc agggcgttaa agcatacatg 1380
gaagatagcg ttcaagaggc aaaacagaaa ggttatgtta ccacactgat gcatcgtcgt 1440
cgttatattc cggaactgac cagccgtaat ttcaatattc gtagctttgc agaacgtacc 1500
gcaatgaata ccccgattca gggtagcgca gcagatatca tcaaaaaagc aatgattgac 1560
atggcagcga agctgaaaga aaaacagctg aaagcacgtc tgctgctgca ggttcatgat 1620
gaactgatct ttgaagcacc gaaagaagaa atcgagatcc tggaaaagct ggttccggaa 1680
gttatggaac atgcactggc actggatgtt ccgctgaaag tggattttgc aagcggtccg 1740
agctggtatg atgcaaaata agtcgac 1767
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgggatccat gagcgatctg aaaag 25
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcgtcgactt attcgttaaa ttct 24

Claims (10)

1.一种Bsu DNA聚合酶的表达基因，其特征在于，包括如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
2.一种重组表达载体，其特征在于，包括pET-28a载体和插入在所述pET-28a载体中的目的基因表达片段，所述目的基因表达片段中含如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于，所述目的基因表达片段的5'端具有BamHI酶切位点黏性末端，所述目的基因表达片段的3'端具有SalI酶切位点黏性末端。
4.一种Bsu DNA聚合酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将目的基因表达片段导入pET-28a载体中，得到重组表达载体，所述目的基因表达片段含有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，所述目的基因表达片段的5'端具有BamHI酶切位点黏性末端，所述目的基因表达片段的3'端具有SalI酶切位点黏性末端；
将所述重组表达载体转入大肠杆菌，得到重组工程菌；以及
对所述重组工程菌进行诱导培养，得到所述Bsu DNA聚合酶。
5.如权利要求4所述的Bsu DNA聚合酶的制备方法，其特征在于，所述目的基因表达片段的制备包括以下步骤：
以如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列为扩增模板，并加入上游引物和下游引物后进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，所述上游引物包括BamHI酶切位点，所述下游引物包括SalI酶切位点；
将所述PCR扩增产物插入到pMD19-T Simple载体，并转化至感受态细胞中，得到克隆载体；以及
用限制性内切酶BamHI和限制性内切酶SalI对所述克隆载体进行双酶切，得到目的基因表达片段。
6.如权利要求5所述的Bsu DNA聚合酶的制备方法，其特征在于，所述上游引物的碱基序列如SEQ ID No.2所示，所述下游引物的碱基序列如SEQ ID No.3所示。
7.如权利要求4所述的Bsu DNA聚合酶的制备方法，其特征在于，所述大肠杆菌为BL21(DE3)。
8.如权利要求4所述的Bsu DNA聚合酶的制备方法，其特征在于，所述对所述重组工程菌进行诱导培养得到所述Bsu DNA聚合酶的步骤中，包括：
在重组工程菌的菌落OD值为0.4～0.8时，加入终浓度为0.05mM～0.15mM的异丙基硫代半乳糖苷，并在19℃～25℃诱导表达20h～24h，固液分离收集上清，得到粗产物；以及
将所述粗产物纯化，得到所述Bsu DNA聚合酶。
9.如权利要求8所述的Bsu DNA聚合酶的制备方法，其特征在于，所述将所述粗产物纯化得到所述Bsu DNA聚合酶的步骤中，包括：
将所述粗产物采用硫酸铵盐析后进行Ni亲和纯化，得到所述Bsu DNA聚合酶。
10.一种Bsu DNA聚合酶，其特征在于，通过如权利要求4～9任一项所述的Bsu DNA聚合酶的制备方法获得。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111662893A (zh) * 2020-07-01 2020-09-15 济南国科医工科技发展有限公司 分子诊断酶制剂的制备方法
CN115747187A (zh) * 2022-12-09 2023-03-07 厦门康基生物科技有限公司 一种重组酶UvsX及其表达基因和应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105039278A (zh) * 2015-06-17 2015-11-11 菲鹏生物股份有限公司 突变型Taq DNA聚合酶及其制备方法和应用
US20180155698A1 (en) * 2016-04-29 2018-06-07 Omniome, Inc. Polymerases engineered to reduce nucleotide-independent dna binding

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105039278A (zh) * 2015-06-17 2015-11-11 菲鹏生物股份有限公司 突变型Taq DNA聚合酶及其制备方法和应用
US20180155698A1 (en) * 2016-04-29 2018-06-07 Omniome, Inc. Polymerases engineered to reduce nucleotide-independent dna binding

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
YI MA 等: "Enhancement of Polymerase Activity of the Large Fragment in DNA Polymerase I from Geobacillus stearothermophilus by Site-Directed Mutagenesis at the Active Site", 《BIOMED RESEARCH INTERNATIONAL》 *
何钢等: "重组TaqDNA聚合酶在大肠杆菌中表达条件的优化 ", 《中南林学院学报》 *
景建洲等: "重组pfu DNA聚合酶的表达及扩增条件优化 ", 《化学试剂》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111662893A (zh) * 2020-07-01 2020-09-15 济南国科医工科技发展有限公司 分子诊断酶制剂的制备方法
CN115747187A (zh) * 2022-12-09 2023-03-07 厦门康基生物科技有限公司 一种重组酶UvsX及其表达基因和应用
CN115747187B (zh) * 2022-12-09 2023-06-20 厦门康基生物科技有限公司 一种重组酶UvsX及其表达基因和应用

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