CN113604496A - 利用烟草脆裂病毒同时表达两种外源蛋白的载体构建法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种同时非融合表达两个外源蛋白载体pTRV2e3的构建方法：以TRV基因组RNA2的农杆菌侵染性克隆pYL156为材料，采用病毒基因缺失策略构建包含TRV的2b和2c基因启动子载体pTRV2e3。本发明还同时提供了利用pTRV2e3制备能同时表达GFP和RFP的病毒TRVe3‑rfp‑gfp的方法，病毒TRVe3能在寄主植物中持续稳定高含量表达两个非融合的目的蛋白。

Description

利用烟草脆裂病毒同时表达两种外源蛋白的载体构建法
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体包括在整个植物中同时快速、高含量表达2种非融合外源蛋白的植物病毒表达载体构建方法。
背景技术
随着大量植物基因组测序的完成，迫切需要一个好的载体或技术来快速地分析基因组中新基因或预测蛋白的生物学功能。目前，研究功能未知的基因或蛋白是最主要通过转基因技术在植物中表达目的蛋白以证实其功能，但转基因操作繁琐、周期长及物种限制等制约因素，目前利用植物病毒表达载体探究蛋白的生物学功能也日益成为一种趋势。
病毒复制/翻译效率高在植物中产生大量病毒蛋白，并且基因组小易操，大量植物病毒被用作构建外源蛋白表达载体的来源。绝大多数植物病毒载体是表达单个外源蛋白，马铃薯X病毒(potato virus X，PVX)和烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus，TMV)外源蛋白表达是是目前最常用病毒表达载体，其构建策略为在病毒的基因组中插入相同病毒或同一属病毒不同成员的外壳蛋白(coat protein，cp)基因启动子序列来驱动外源基因的mRNA转录，利用病毒亚基因组翻译策略表达目的蛋白，在PVX基因组中cp启动子序列前面插入不同病毒cp基因启动子序列用来驱动表达2个外源蛋白。目前，越来越多的植物病毒用于构建表达多个外源蛋白的载体，其构建的原理是：病毒多聚体蛋白水解策略和肽酶切割病毒融合蛋白原理，将外源蛋白基因序列插入到病毒的2个开放阅读框(open reading frame，ORF)之间，利用病毒多聚体蛋白水解翻或肽酶切割译策略在植物中表达目的蛋白，如，采用大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus,SMV)构建的双基因表达载体及将外源基因插入P1/HC-Pro、HC-Pro/NIb和NIb/CP之间的马铃薯病毒A(Potato virus A,PVA)三基因表达载体。由烟草环斑病毒(Tobacco ringspot virus，TRSV)构建载体pT2C2AGFP表达绿色荧光蛋白(GFP)，在本氏烟中能有效地表达5种含有GFP的蛋白(MP-GFP-2A-CP、MP-GFP-2A、GFP-2A-CP、GFP-2A和GFP)，但4种融合蛋白(MP-GFP-2A-CP、MP-GFP-2A、GFP-2A-CP和GFP-2A)为主要成分，而游离的GFP含量极少。基于病毒多聚体蛋白水解策略和肽酶切割病毒融合蛋白策略所构建的表达载体，在寄主植物中所产生的目的蛋白均含有源于病毒蛋白或肽酶的氨基酸残基。上述两种植物病毒表达载体构建原理均是在病毒的基因组插入外源序列，影响病毒基因组的完整性，造成病毒基因组的不稳定(重组、突变或缺失)使得其外源序列在病毒复制、包被或移动过程中被丢失，目的蛋白不能得到有效表达。
烟草脆裂病毒(tobacco rattle virus,TRV)是烟草脆裂病毒属(Tobravirus)的典型成员，寄主范围泛，能侵染超过50种单子叶和双子叶家族的400多种植物。TRV为正义单链RNA(+single strand RNA，+ssRNA)病毒，基因组由RNA1和RNA2分子组成；RNA1所编码4个蛋白参与病毒的复制、移动及症状产生，RNA2中包含3个ORF，编码外cp、27kDa的2b和18kDa的2c，TRV中2b和2c基因完全缺失，病毒还能在植物中的复制、移动和。传播。TRV寄主范围广泛，引起的症状反应相对温和，目前被应用于构建病毒诱导的基因沉默(Virus inducedgene silencing,VIGS)载体和表达单个外源蛋白载体。
目前国内外利用植物病毒编码多聚蛋白的水解酶特性或肽酶2A自我切割所构建的多个蛋白的表达载体，在植物中所产生的外源蛋白均包含一段来源于非目的蛋白的氨基酸残基，目的蛋白的N端或C端携带其它蛋白的氨基酸残基可能干扰其生物学功能。
发明人所在团队早期申请的发明《同时表达两个外源蛋白载体TRVe2的构建方法与应用》(申请号201810261990.2)告知了：以TRV的基因组RNA2的农杆菌侵染性克隆pYL156为材料，构建含有TRV的2b基因启动子和豌豆早枯病毒cp基因启动子的载体pTRV2e2，通过2个亚基因组启动子驱动外源基因在本氏烟中表达。该方案尚存在的不足之处是：载体pTRV2e2中TRV基因组RNA2包含2个cp基因的启动子，而采用双cp基因亚基因组启动子策略所构建的病毒外源蛋白表达载体，外源引入的cp基因启动子影响病毒基因组结构的完整性，容易在寄主植物中发生重组、突变或丢失，使得病毒外源蛋白表达载体在侵染后期或者病毒汁液摩擦转接过程中目的表达表达量低或不能表达外源蛋白。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种同时快速、高含量表达两个外源蛋白载体TRVe3的构建方法。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种同时非融合表达两个外源蛋白载体pTRV2e3的构建方法：以TRV基因组RNA2的农杆菌侵染性克隆pYL156为材料，采用病毒基因缺失策略构建包含TRV的2b和2c基因启动子载体pTRV2e3。
即，本发明通过TRV基因组RNA2中的2个亚基因组启动子产生表达外源蛋白的mRNA，并利用植物的翻译系统快速、高含量地表达出2个目的蛋白，pTRV2e3中基因组RNA2的序列如SEQ ID NO:3所述。
作为本发明的同时非融合表达两个外源蛋白载体pTRV2e3的构建方法，利用重组质粒pTRV2e1，在pTRV2e1插入TRV的2c基因亚基因组启动子序列和多克隆位点2(MCS2)获得含有多克隆位点MCS1和MCS2的载体pTRV2e3。
本发明还同时提供了利用上述pTRV2e3制备能同时表达GFP和RFP的病毒TRVe3-rfp-gfp的方法，包括以下步骤：
1)、PCR扩增绿色蛋白基因(gfp)并通过双酶切连接至质粒pTRV2e3，获得载体pTRV2e3-gfp-MCS2；
2)、以pTRV2e3-gfp-MCS2为模板，PCR扩增、双酶切克隆至质粒pTRV2e3中，获得载体pTRV2e3-MCS1-gfp；
3)、PCR扩增红色蛋白基因(rfp)并通过双酶切克隆至pTRV2e3-MCS1-gfp，获得到载体pTRV2e3-rfp-gfp；载体pTRVe3-rfp-gfp农杆菌转化后，并与农杆菌pTRV1混和后浸润接种于本氏烟中，病毒TRVe3-rfp-gfp在浸润接种叶片中产生表达GFP和RFP；并系统性扩展至非接种的上部组织。
即，设定了pTRV2相关载体的农杆菌转化，并分别与农杆菌pTRV1混和接种于本氏烟中；记录各个病毒农杆菌接种寄主3d荧光表型。
作为本发明的方法的改进，还包括以下步骤：
提取病毒TRVe3-rfp-gfp侵染植株系统叶中总蛋白用于Western blot分析，蛋白杂交能在TRVe3-rfp-gfp侵染的本氏烟总蛋白能特异性检测到GFP和RFP。
即，提取病毒TRVe3表达载体侵染的植物系统叶的总蛋白用于Western blot，分析GFP和RFP表达情况。
本发明还同时提供了上述方法构建所得外源蛋白表达载体pTRV2e1和pTRV2e3的用途：病毒TRVe1和TRVe3在寄主植物中引起轻微的症状反应，携带2个外源基因的病毒TRVe3-rfp-gfp在整个植株同时表达GFP和RFP；
所述TRVe1由pTRV1和pTRV2e1组成，所述TRVe3由pTRV1和pTRV2e3组成。
载体pYL156中TRV2，大小为2103bp，来源于载体Ppk20中TRV2(3855bp)；两者相比，前者中第1642～3169区域碱基完全缺失，即pYL156载体中TRV基因组RNA2中的2c基因组的启动子和ORF完全缺失。本发明以申请号201810261990.2专利中载体pTRV2e1为材料，构建含有TRV的2b和2c基因启动子序列的载体pTRV2e3，通过pTRV2e3中的2个亚基因组启动子驱动外源基因在寄主植物中表达。
载体pYL156和Ppk20详细信息分别见https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AF406991和https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/Z36974。
基于TRV基因组RNA2所编码cp、2b和2c是由3条病毒RNA分子所翻译而来，且RNA2中缺失2b和2c，病毒还是系统性侵染寄主植物。本发明将pYL156中的2b蛋白的N端92氨基酸完全缺失，同时将2b基因的起始密码子(ATG)改为AGG，并在2b基因的启动子序列后引入多克隆位点1和2c基因的亚基因组启动子序列及多克隆位点2，获得载体pTRV2e3。重组病毒TRVe3侵染植物后由基因组RNA2复制后产生3条RNA分子，即全长的RNA2、由2b基因启动子产生亚基因组RNA和2c基因的启动子亚基因组RNA。本发明通过病毒TRVe3的RNA2中2个亚基因组启动子来驱动表达2个非融合蛋白。
本发明的技术方案具体如下：
1、在pTRV2e1插入2c基因启动子序列和多克隆位点MCS2获得载体；
说明：pTRV2e1制备方法在专利201810261990.2中有明确告知。
2、pTRV2e1和pTRV2e3分别转入到农杆菌GV3101后，并与农杆菌pTRV1共同浸润接种于本氏烟，病毒TRVe1和TRVe3在寄主植物中引起轻微的症状反应，而TRV则引起植株叶片坏死。
3、通过不同酶切位点在载体TRVe3中MCS1、MCS2位点中分别插入gfp获得pTRV2e3-gfp-MCS2和pTRV2e3-MCS1-gfp，在pTRV2e3-MCS1-gfp中插入gfp获得pTRV2e3-rfp-gfp。
4、pTRV2相关表达载体的农杆菌转化，并分别与TRV1混和共同浸润本氏烟；接种24h，在TRVe3-rfp-gfp侵染的寄主细胞中激光共聚焦显微镜下能观察到红色荧光和绿色荧光，接种3d紫外灯下能肉眼观察到TRVe3-rfp-gfp接种植物系统叶表达GFP和RFP。
5、分别提取各个表达外源蛋白的TRVe3载体侵染的本氏烟中总蛋白，蛋白电泳、转膜与GFP/RFP抗体杂交检测，重组TRVe3表达载体在植株中表达外源蛋白情形，GFP抗体杂交显示，pTRV2e3-rfp-gfp在整个寄主植物中能同时表达GFP和RFP。
6、现有的(专利201810261990.2中构建)TRVe2-MCS1-gfp和本发明的TRVe3-MCS1-gfp农杆菌浸润本氏烟3d和15d表达外源蛋白表达情况；2个病毒载体通过汁液摩擦接种转接至健康的本氏烟，摩擦接种3d分析TRVe2-MCS1-gfp和TRVe3-MCS1-gfp本氏烟植株中GFP表达情况。
本发明基于TRV构建在本氏烟整个植株中同时快速、高含量表达2个非融合外源蛋白的载体pTRV2e3。本发明相对于201810261990.2的技术改进点是：将pTRV2e2载体中PEBVcp基因启动子缺失，引入TRV基因组RNA2的2c基因启动子，完全缺失TRV基因组RNA2中2b和2c的ORF，保留2b和2c启动子顺式作用元件，在对应于2b和2c的ORF区域用不同外源蛋白代替。所具有的技术优势是：病毒TRVe3能在寄主植物中持续稳定高含量表达2个非融合的目的蛋白。
综上所述，本发明采用植物病毒表达载体中的缺失替换和病毒亚基因组翻译策略，基于TRV构建在本氏烟整个植株中同时快速、高含量表达2个非融合的外源蛋白的载体。
本发明公开一种利用2个TRV基因组RNA2中的2个亚基因组启动子驱动2外源基因在整个植物中同时表达的载体pTRV2e3构建方法。病毒TRVe3在本氏烟中不产生明显的症状反应，携带2个外源基因的病毒TRVe3-rfp-gfp在整个植株同时表达GFP和RFP。本发明首次利用缺失替换和病毒亚基因组翻译策略构建同时快速、高含量表达2个非融合蛋白的植物病毒载体pTRV2e3。
本发明具有如下有益效果：1)本发明采用植物病毒表达载体的缺失置换构建策略；完全缺失TRV基因组2中的2b和2c基因的ORF，用2个外源蛋白替换，不影响TRV2基因组结构完整性；2)TRVe3在本氏烟不引起明显的症状，携带2个外源基因后能系统性扩展至整个植株，在寄主植物表达外源蛋白具有表达高和表达时间快特点。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为TRV2相关载体中基因组RNA2示意图；
图2为TRV2相关表达外源蛋白示意图；
图3为TRV、TRVe1、TRVe3在本氏烟中5d引起的症状反应对比图；
图4为RNA杂交检测重组TRV、TRVe1、TRVe3在本氏烟中基因组照片图；
图4中rRNA为28s RNA，用于确定植物总RNA的上样量；
图5为接种24h病毒TRVe3-rfp-gfp在细胞中同时表达GFP和RFP照片图；
图6为接种3d病毒TRVe3-rfp-gfp在本氏烟中表达GFP和RFP后的荧光表型图；
图7为接种3d病毒TRVe3-rfp-gfp本氏烟中表达GFP和RFP的图；
图7中Rubisco为核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Ribulose bisphosphatecarboxylase oxygenase，Rubisco)的大亚基，用于确定植物总蛋白的上样量；
图8为农杆菌浸润接种3d病毒TRVe3-MCS1-gfp和TRVe2-MCS1-gfp在本氏烟中表荧光表型；
图9为农杆菌浸润接种3d病毒TRVe3-MCS1-gfp和TRVe2-MCS1-gfp侵染寄主中的GFP抗体Western blot检测；
图10为农杆菌浸润接种15d病毒TRVe3-MCS1-gfp和TRVe2-MCS1-gfp在本氏烟中表荧光表型；
图11为农杆菌浸润接种15d病毒TRVe3-MCS1-gfp和TRVe2-MCS1-gfp侵染寄主中的GFP抗体Western blot检测；
图12为病毒TRVe3-MCS1-gfp和TRVe2-MCS1-gfp汁液摩擦接种寄主3d的荧光表型；
图13为病毒TRVe3-MCS1-gfp和TRVe2-MCS1-gfp汁液摩擦接种3d的寄主中的GFP抗体Western blot检测。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1、TRV表达载体的构建
以载体pTRV2e1实验材料，pTRV2e1是以质粒pYL156为模板制备而得，其制备方法在专利201810261990.2中有明确告知。
TRV的2c基因启动子序列为：
tagaatcggtccaatcgtttacggttggttattgtgattggttgatgaggaaattctgtttgaaggctggttgaaagtaccagggcgggagaagccatattctctatcgttgtaggaagcgattgaaataattcctgtggtcacgtcgcacgtgaggtggttgttaccataaacaataatgtcgttggcagcatttaaaataattccatagttactaagagggtgattgtgaccaaaggagcg，通过人工合成并克隆于载体pUC57中，得到pUC57-2c。以载体pUC57-2c为模板，通过引物对P3/P4进行扩增得到2c的启动子序列，目的片段割胶回收，经MluⅠ/SmaⅠ双酶切清洁回收后，并克隆至pTRV2e1中，获得克隆pTRV2e3。引物P3和P4分别为CGacgcgtTAGAATCGGTCCAATCGTTTACG(acgcgt为MluⅠ)和tccCCCGGGccatggGGTACCATggatccCGCTCCTTTGGTCACAATCACC(CCCGGG为SmaⅠ，GGTACC为KpnⅠ，NcoⅠ为CCATGG，和ggatcc为BamHⅠ)。
PCR扩增的体系为：5×Q5 reaction buffer 8μL，dNTP(2.5mmol/L)3.2μL，P3/P4(10μmol/L)各2μL，模板pUC57-2c 10ng，Q5 polymerase(1U/μL)0.4μL，ddH2O补足至40μL；PCR反应程序为：98℃3min，98℃10s，55℃15s，72℃20s，35个循环，72℃5min。Ppk20、pYL156、pTRV2e1和pTRV2e3载体中的RNA2结构示意图如图1所示。
pTRV2e3载体中MCS1酶切位点为EcoRⅠ、XbaⅠ、Xho I和MluⅠ以及MCS2酶切位点为SmaⅠ、NcoⅠ、KpnⅠ和BamHⅠ。pYL156中基因组RNA2大小为2103bp(SEQ ID NO:1)、pTRV2e1中基因组RNA2的大小为1785bp(SEQ ID NO:2)、pTRV2e3中基因组RNA2的大小为2053bp(SEQ IDNO:3)。
实施例2、表达外源蛋白的pTRV2e3相关载体构建
gfp基因大小为720bp，序列为：
atgagtaaaggagaagaacttttcactggagttgtcccaattcttgttgaattagatggtgatgttaatgggcacaaattttctgtcagtggagagggtgaaggtgatgcaacatacggaaaacttacccttaaatttatttgcactactggaaaactacctgttccatggccaacacttgtcactactttctcttatggtgttcaatgcttttcaagatacccagatcatatgaagcggcacgacttcttcaagagcgccatgcctgagggatacgtgcaggagaggaccatcttcttcaaggacgacgggaactacaagacacgtgctgaagtcaagtttgagggagacaccctcgtcaacaggatcgagcttaagggaatcgatttcaaggaggacggaaacatcctcggccacaagttggaatacaactacaactcccacaacgtatacatcatggccgacaagcaaaagaacggcatcaaagccaacttcaagacccgccacaacatcgaagacggcggcgtgcaactcgctgatcattatcaacaaaatactccaattggcgatggccctgtccttttaccagacaaccattacctgtccacacaatctgccctttcgaaagatcccaacgaaaagagagaccacatggtccttcttgagtttgtaacagctgctgggattacacatggcatggatgaactatacaaatag。
采用引物对P5/P6进行PCR扩增获得gfp基因，割胶回收，经EcoRⅠ/MluⅠ双酶切后清洁回收，并连接至质粒pTRV2e3中，连接产物转化到大肠杆菌中获得载体pTRV2e3-gfp-MCS2。引物P5和P6的序列分别为GgaattcGCACACAAGGTTAAAAACGCTGTAGTA(gaattc为EcoRⅠ)和CGacgcgtCTATTTGTATAGTTCATCCATGCCAT(acgcgt为MluⅠ)；PCR扩增的体系为：5×Q5 reactionbuffer 8μL，dNTP(2.5mmol/L)3.2μL，P5/P6(10μmol/L)各2μL，gfp基因模板10ng，Q5polymerase(1U/μL)0.4μL，ddH2O补足至40μL；PCR反应程序为：98℃3min，98℃10s，57℃15s，72℃30s，35个循环，72℃5min。
以质粒pTRV2e3-gfp-MCS2为模板，通过引物对P7/P8进行PCR扩增，目的产物割胶回收，经BamHⅠ/SmaⅠ双酶切后清洁回收，并克隆至质粒pTRV2e3中获得载体pTRV2e3-MCS1-gfp。引物对P7/P8序列分别为CGggatccGCACACAAGGTTAAAAACGCTGTAGTA(ggatcc为BamHⅠ)和TCCcccgggCTATTTGTATAGTTCATCCATGCCAT(CCCGGG为SmaⅠ)；PCR扩增的体系为：5×Q5reaction buffer 8μL，dNTP(2.5mmol/L)3.2μL，P7/P8(10μmol/L)各2μL，gfp基因模板10ng，Q5 polymerase(1U/μL)0.4μL，ddH2O补足至40μL；PCR反应程序为：98℃3min，98℃10s，57℃15s，72℃30s，35个循环，72℃5min。
rfp基因大小为711bp，序列为：
atggtgagcaagggcgaggaggataacatggccatcatcaaggagttcatgcgcttcaaggtgcacatggagggctccgtgaacggccacgagttcgagatcgagggcgagggcgagggccgcccctacgagggcacccagaccgccaagctgaaggtgaccaagggtggccccctgcccttcgcctgggacatcctgtcccctcagttcatgtacggctccaaggcctacgtgaagcaccccgccgacatccccgactacttgaagctgtccttccccgagggcttcaagtgggagcgcgtgatgaacttcgaggacggcggcgtggtgaccgtgacccaggactcctccctgcaggacggcgagttcatctacaaggtgaagctgcgcggcaccaacttcccctccgacggccccgtaatgcagaagaagaccatgggctgggaggcctcctccgagcggatgtaccccgaggacggcgccctgaagggcgagatcaagcagaggctgaagctgaaggacggcggccactacgacgctgaggtcaagaccacctacaaggccaagaagcccgtgcagctgcccggcgcctacaacgtcaacatcaagttggacatcacctcccacaacgaggactacaccatcgtggaacagtacgaacgcgccgagggccgccactccaccggcggcatggacgagctgtacaagtaa。
通过引物对P9/P10进行rfp基因的PCR扩增，目的产物割胶回收，经EcoRⅠ/MluⅠ双酶切后清洁回收，并克隆至pTRV2e3-MCS1-gfp获得到载体TRV2e3-rfp-gfp。引物对P9/P10序列分别为GgaattcATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG(gaattc为EcoRⅠ)和CGacgcgtTTACTTGTACAGCTCGTCCATGC(acgcgt为MluⅠ)；PCR扩增的体系为：5×Q5reactionbuffer 8μL，dNTP(2.5mmol/L)3.2μL，P9/P10(10μmol/L)各2μL，rfp基因模板10ng，Q5polymerase(1U/μL)0.4μL，ddH2O补足至40μL；PCR反应程序为：98℃3min，98℃10s，57℃15s，72℃30s，35个循环，72℃5min。载体pTRV2e3-gfp-MCS2、pTRV2e3-MCS1-gfp和pTRV2e3-rfp-gfp示意图如图2所示。
pTRV2e3-gfp-MCS2载体通过EcoRⅠ/MluⅠ双酶切将gfp基因克隆pTRV2e3获得，TRV2e3-MCS1-gfp通过BamHⅠ/SmaⅠ双酶切将gfp克隆pTRV2e3获得，载体pTRV2e3-rfp-gfp通过EcoRⅠ/MluⅠ双酶切将rfp连接到TRV2e3-MCS1-gfp获得。
实施例3、TRV2相关载体的农杆菌转化、活化和扩大培养(参照201810261990.2)
取100uL农杆菌GV3101感受态细胞于冰上预冷1.5mL灭菌离心管中，并分别各自加入100ng质粒pTRV2e1、pTRV2e3、pTRV2e3-gfp-MCS2、pTRV2e3-MCS1-gfp和pTRV2e3-rfp-gfp，并轻微吹打混匀，冰上放置30min；42℃水浴1min后置于液氮1min，再冰上放置2min；加入500uL不含抗生素LB液体培养基，在28℃、220r/min摇床中震荡培养3～4h；分别取以上5种菌体培养液100uL均匀涂布于含(30mg/L Rifampicin、50mg/L Gentamycin和50mg/LKanamycin)LB固体平板中，在28℃培养箱中培养12～16h。分别挑取以上pTRV2e1、pTRV2e3、TRVe3-gfp-MCS2和pTRV2e3-MCS1-gfp和pTRV2e3-rfp-gfp单菌落以及零下80℃冰箱保存20uL农杆菌pTRV1和pYL156甘油菌于含(30mg/L Rifampicin，50mg/L Gentamycin和50mg/LKanamycin)2mL的LB液体培养基，28℃摇床震荡培养12～16h。
分别取pTRV1、pYL156、pTRV2e1、pTRV2e3、pTRV2e3-gfp-MCS2、pTRV2e2-MCS1-gfp和pTRV2e3-rfp-gfp农杆菌菌液50uL于5mL含10mmol/L MES、200mmol/L acetosyringone、30mg/L Rifampicin、50mg/L Gentamycin和50mg/L Kanamycin的LB液体培养基中，在28℃、220r/min摇床中震荡培养12～16h；分别取2mL扩大培养均液5000r/min离心5min，弃上清，用5mL浸润接种缓冲液(10mmol/L MgCl2，10mmol/L MES和200mmol/L acetosyringone)悬浮菌体，5000r/min离心5min，弃上清，最后用浸润接种缓冲液将各个菌体浓度调至OD600为0.2。
实施例4、农杆菌浸润接种本氏烟
分别取实施例3中的OD600为0.2的pYL156、pTRV2e1、pTRV2e3、pTRV2e3-gfp-MCS2、pTRV2e3-MCS1-gfp和pTRV2e3-rfp-gfp农杆菌菌液5mL与5mL浓度为0.2OD600的pTRV1农杆菌混和，由此获得6个病毒接种组合；农杆菌混和物在室温黑暗预处理4h，通过无针头1mL灭菌注射器浸润5～7叶期本氏烟叶片背部，所有接种植物置于25℃、光照期16h黑暗8h植物生长室培养。pTRV1与pYL156混和物为TRV、pTRV1与pTRV2e1混和物为TRVe1、pTRV1与pTRV2e3混和物为TRVe3、pTRV1与pTRV2e3-gfp-MCS2混和物为TRVe3-gfp-MCS2，pTRV1与pTRV2e2-MCS1-gfp混和物为TRVe3-MCS1-gfp，农杆菌pTRV1与pTRV2e3-rfp-gfp混和物为TRVe3-rfp-gfp。
实施例5、TRV引起本氏烟症状反应
农杆菌混和液TRV(pTRV1+pYL156)、TRVe1(pTRV1+pTRV2e1)和TRVe3(pTRV1+pTRV2e3)分别浸润接种本氏烟，以浸润缓冲液接种作为对照Mock；5d后寄主植物的症状反应，在TRVe1和TRVe3病毒侵染寄主植物中不产生明显的症状反应，而TRV则引起寄主植物的接种叶和系统叶产生坏死表型(见图3)，本发明所构建的TRV重组病毒TRVe1和TRVe3在植物中的症状反应非常轻，有利于其在植物中高效大量的表达目的蛋白。
实施例6、寄主中TRV基因组RNA的Northern blot
分别取病毒TRV、TRVe1和TRVe3侵染的系统叶0.1g，用Trizol提取植物总RNA，方法参考Trizol产品说明书进行。TRV基因组转膜和杂交方法参考地高辛标记检测试剂盒II(Roche,Switzerland)的产品使用说明书，杂交探针为互补于RNA2的3'端一段核苷酸(5'-CTTCAGACACGGATCTACTTAAAGAACCGTAGTTTAATGTCTTCGGGAC-DIG-3')，由上海生物工程有限公司合成。寄主植物中TRV杂交检测结果表明，对照Mock接种寄主植物中检测不到病毒基因组RNA，TRV、TRVe1和TRVe3的侵染植物系统叶均检测到病毒基因组RNA，表明重组病毒TRVe3具有活性，能系统性侵染本氏烟(见图4)。
实施例7、TRV在植物中表达GFP和RFP后荧光现象观察
TRVe3-gfp-MCS2、TRVe3-MCS1-gfp和TRVe3-rfp-gfp浸润接种24h，取TRVe3-rfp-gfp在浸润接种叶片在激光共聚焦观察植物细胞中GFP和RFP的表达情况，在本氏烟同一个细胞中能同时观察到绿色荧光和红色荧光，GFP和RFP荧光的叠加(Merge)为黄色荧光(见图5)。
浸润接种3d，在暗室中用长波型手提便携式紫外灯(Black Ray model B 100AP/R,Upland,USA)观察到本氏烟系统叶荧光现象，用携带Wratten过滤器15的柯达照相机所拍摄的TRV侵染植物荧光照片。除了TRVe3对照接种植物，TRVe3-gfp-MCS2和TRVe3-MCS1-gfp在系统叶上均产生绿色荧光，TRVe3-rfp-gfp侵染植株的系统叶呈现暗黄色表型(见图6)，表明载体TRVe3-rfp-gfp能同时快速、高含量地表达GFP和RFP。
说明：TRVe3-gfp-MCS2和TRVe3-MCS1-gfp在本氏烟中呈现绿色荧光与TRVe3-rfp-gfp完全一样。
实施例8、Western blot分析本氏烟中TRV表达的GFP和RFP
分别取TRVe3、TRVe3-gfp-MCS2、TRVe3-MCS1-gfp和TRVe3-rfp-gfp病毒侵染的植物的系统叶0.1g，液氮研磨志粉末状，加入含2％的β-巯基乙醇的PBS缓冲液研磨至均一状液体，离心后取上清并加入2×loading buffer，95℃水浴煮10min，10000r/min 5min，取上清备用。蛋白转膜、抗体杂交和底物显色的方法参考精编分子生物学实验指南(第三版)，所用抗体为GPF和RFP。在TRVe3-gfp-MCS2、TRVe3-MCS1-gfp和TRVe3-rfp-gfp侵染寄主植物的系统叶样品中，GFP抗体可特异性检测到目的条带，而对照接种的TRVe3中检测不到GFP信号；在TRVe3-MCS1-gfp样品中GFP目的条带信号强度明显高于TRVe3-gfp-MCS2(见图7)，表明TRVe3-MCS1-gfp样品中GFP表达量高于TRVe3-gfp-MCS2，与观察到的绿色荧光表型一致(见图6)；而TRVe3-rfp-gfp样品中可同时检测到GFP和RFP信号(见图7)。因此病毒TRVe3能在整个寄主植物中同时表达GFP和RFP。
实施例9、在农杆菌浸润不同接种时间病毒TRVe3和TRVe2表达GFP效率比较
将现有的TRVe2-MCS1-gfp和本发明的TRVe3-MCS1-gfp农杆菌浸润接种本氏烟，每个病毒接种5颗植物；3d和15d，记录2个病毒在寄主植物上荧光表型，并分别采集2个病毒3d和15d的系统叶，提取植物总蛋白用于Western blot检测GFP的含量。浸润接种3d，TRVe2-MCS1-gfp侵染寄主植物引起的荧光表型强于TRVe3-MCS1-gfp(见图8)，Western blot结果显示TRVe2-MCS1-gfp样品中GFP表达量高于TRVe3-MCS1-gfp(见图9)；浸润接种15d后，TRVe3-MCS1-gfp侵染寄主植物引起的荧光表型明显强于TRVe2-MCS1-gfp(见图10)，Westernblot结果也显示TRVe3-MCS1-gfp样品中GFP表达量高于TRVe2-MCS1-gfp(见图11)。因此表明在浸润接种早期，TRVe2载体表达GFP效率较高，但不能持续稳定表达，而TRVe3载体较TRVe2而言能够持续稳定高含量表达蛋白。
实施例10、病毒TRVe3-MCS1-gfp和TRVe2-MCS1-gfp转接后表达GFP分析
分别取病毒TRVe2-MCS1-gfp和TRVe3-MCS1-gfp农杆菌浸润接种3d的系统叶0.2g，并加入0.5mL含0.1％β-巯基乙醇的0.01mol/L磷酸缓冲液，研磨成汁液，通过汁液摩擦分别接种到健康本氏烟中，每个病毒各接种5颗植物；摩擦接种3d记录病毒侵染植株的荧光表型，并采集系统叶，提取植物总蛋白、Western blot检测病毒转接后GFP表达情况。摩擦接种3d，TRVe2-MCS1-gfp在5株本氏烟植株中的荧光强度弱于TRVe3-MCS1-gfp(见图12)，蛋白杂交显示，TRVe3-MCS1-gfp在寄主植物中所表达的GFP量高于TRVe2-MCS1-gfp(见图13)，病毒转接结果表明进一步证实TRVe2在寄主植物中表达外源蛋白的稳定性不如TRVe3。
因此，实施例9和10证明本发明的病毒TRVe3相对于TRVe2而言能在寄主植物中持续稳定高含量表达2个非融合的目的蛋白。
需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
序列表
<110> 浙江理工大学
<120> 利用烟草脆裂病毒同时表达两种外源蛋白的载体构建法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2103
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ataaaacatt gcacctatgg tgttgccctg gctggggtat gtcagtgatc gcagtagaat 60
gtactaattg acaagttgga gaatacggta gaacgtcctt atccaacaca gcctttatcc 120
ctctccctga cgaggttttt gtcagtgtaa tatttctttt tgaactatcc agcttagtac 180
cgtacgggaa agtgactggt gtgcttatct ttgaaatgtt actttgggtt tcggttcttt 240
aggttagtaa gaaagcactt gtcttctcat acaaaggaaa acctgagacg tatcgcttac 300
gaaagtagca atgaaagaaa ggtggtggtt ttaatcgcta ccgcaaaaac gatggggtcg 360
ttttaattaa cttctcctac gcaagcgtct aaacggacgt tggggttttg ctagtttctt 420
tagagaaaac tagctaagtc tttaatgtta tcattagaga tggcataaat ataatacttg 480
tgtctgctga taagatcatt ttaatttgga cgattagact tgttgaacta caggttactg 540
aatcacttgc gctaatcaac atgggagata tgtacgatga atcatttgac aagtcgggcg 600
gtcctgctga cttgatggac gattcttggg tggaatcagt ttcgtggaaa gatctgttga 660
agaagttaca cagcataaaa tttgcactac agtctggtag agatgagatc actgggttac 720
tagcggcact gaatagacag tgtccttatt caccatatga gcagtttcca gataagaagg 780
tgtatttcct tttagactca cgggctaaca gtgctcttgg tgtgattcag aacgcttcag 840
cgttcaagag acgagctgat gagaagaatg cagtggcggg tgttacaaat attcctgcga 900
atccaaacac aacggttacg acgaaccaag ggagtactac tactaccaag gcgaacactg 960
gctcgacttt ggaagaagac ttgtacactt attacaaatt cgatgatgcc tctacagctt 1020
tccacaaatc tctaacttcg ttagagaaca tggagttgaa gagttattac cgaaggaact 1080
ttgagaaagt attcgggatt aagtttggtg gagcagctgc tagttcatct gcaccgcctc 1140
cagcgagtgg aggtccgata cgtcctaatc cctagggatt taaggacgtg aactctgttg 1200
agatctctgt gaaattcaga gggtgggtga taccatattc actgatgcca ttagcgacat 1260
ctaaataggg ctaattgtga ctaatttgag ggaatttcct ttaccattga cgtcagtgtc 1320
gttggtagca tttgagtttc gcaatgcacg aattacttag gaagtggctt gacgacacta 1380
atgtgttatt gttagataat ggtttggtgg tcaaggtacg tagtagagtc ccacatattc 1440
gcacgtatga agtaattgga aagttgtcag tttttgataa ttcactggga gatgatacgc 1500
tgtttgaggg aaaagtagag aacgtatttg tttttatgtt caggcggttc ttgtgtgtca 1560
acaaagatgg acattgttac tcaaggaagc acgatgagct ttattattac ggacgagtgg 1620
acttagattc tgtgagtaag gttaccgaat tctctagaag gcctccatgg ggatccggta 1680
ccgagctcac gcgtctcgag gcccgggcat gtcccgaaga cattaaacta cggttcttta 1740
agtagatccg tgtctgaagt tttaggttca atttaaacct acgagattga cattctcgac 1800
tgatcttgat tgatcggtaa gtcttttgta atttaatttt ctttttgatt ttattttaaa 1860
ttgttatctg tttctgtgta tagactgttt gagatcggcg tttggccgac tcattgtctt 1920
accatagggg aacggacttt gtttgtgttg ttattttatt tgtattttat taaaattctc 1980
aacgatctga aaaagcctcg cggctaagag attgttgggg ggtgagtaag tacttttaaa 2040
gtgatgatgg ttacaaaggc aaaaggggta aaacccctcg cctacgtaag cgttattacg 2100
ccc 2103
<210> 2
<211> 1785
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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tagagaaaac tagctaagtc tttaatgtta tcattagaga tggcataaat ataatacttg 480
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<400> 3
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taaaattctc aacgatctga aaaagcctcg cggctaagag attgttgggg ggtgagtaag 1980
tacttttaaa gtgatgatgg ttacaaaggc aaaaggggta aaacccctcg cctacgtaag 2040
cgttattacg ccc 2053

Claims (5)

1.同时非融合表达两个外源蛋白载体pTRV2e3的构建方法，其特征是：以TRV基因组RNA2的农杆菌侵染性克隆pYL156为材料，采用病毒基因缺失策略构建包含TRV的2b和2c基因启动子载体pTRV2e3。
2.根据权利要求1所述的同时非融合表达两个外源蛋白载体pTRV2e3的构建方法，利用重组质粒pTRV2e1，其特征是：
在pTRV2e1插入TRV的2c基因亚基因组启动子序列和多克隆位点2获得含有多克隆位点MCS1和MCS2的载体pTRV2e3。
3.利用如权利要求1或2所述的pTRV2e3制备能同时表达GFP和RFP的病毒TRVe3-rfp-gfp的方法，其特征是包括以下步骤：
1)、PCR扩增绿色蛋白基因(gfp)并通过双酶切连接至质粒pTRV2e3，获得载体pTRV2e3-gfp-MCS2；
2)、以pTRV2e3-gfp-MCS2为模板，PCR扩增、双酶切克隆至质粒pTRV2e3中，获得载体pTRV2e3-MCS1-gfp；
3)、PCR扩增红色蛋白基因(rfp)并通过双酶切克隆至pTRV2e3-MCS1-gfp，获得到载体pTRV2e3-rfp-gfp；载体pTRVe3-rfp-gfp农杆菌转化后，并与农杆菌pTRV1混和后浸润接种于本氏烟中，病毒TRVe3-rfp-gfp在浸润接种叶片中产生表达GFP和RFP。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征是还包括以下步骤：
提取病毒TRVe3-rfp-gfp侵染植株系统叶中总蛋白用于Western blot分析，蛋白杂交能在TRVe3-rfp-gfp侵染的本氏烟总蛋白能特异性检测到GFP和RFP。
5.如权利要求1所述方法构建所得外源蛋白表达载体pTRV2e1和pTRV2e3的用途，其特征是：病毒TRVe1和TRVe3在寄主植物中引起轻微的症状反应，携带2个外源基因的病毒TRVe3-rfp-gfp在整个植株同时表达GFP和RFP；
所述TRVe1由pTRV1和pTRV2e1组成，所述TRVe3由pTRV1和pTRV2e3组成。
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