CN111647621A

CN111647621A - 适用于表达异源蛋白的病毒载体的构建及其使用方法

Info

Publication number: CN111647621A
Application number: CN202010352990.0A
Authority: CN
Inventors: 谷红仓; 许佩松; 王云飞; 车仙荣
Original assignee: Hangzhou Shengting Medical Technology Co ltd
Current assignee: Hangzhou Shengting Medical Technology Co ltd
Priority date: 2020-04-23
Filing date: 2020-04-23
Publication date: 2020-09-11

Abstract

本发明提供了一种适用于表达异源蛋白的病毒载体的构建及其使用方法，其特征在于：菜豆荚斑驳病毒(BPMV)载体，其包含编码RNA2多蛋白开放阅读框(ORF)的核酸序列。本发明通过对质粒载体和病毒序列进行一系列修改，发明了一种BPMV全长的cDNA重组质粒载体pGG7R2。同时，在该质粒载体上引入荧光报告集团GFP蛋白，用于追踪和分析外源蛋白的表达水平。BPMV载体也可用于病毒诱导的基因沉默和异源多肽的表达方法。本发明还提供了病毒诱导的基因沉默方法，适用于确定目的基因的功能。

Description

适用于表达异源蛋白的病毒载体的构建及其使用方法

技术领域

本发明一般涉及植物分子生物学领域，更具体地说，涉及到一种植物病毒载体(Plant virus-based vectors)表达异源基因的构建方法。

背景技术

植物病毒载体在植物中表达外源蛋白，为补充常规育种和转基因技术提供了非常有前途的生物技术工具。考虑到病毒感染在整个植物中的形成速度和积累于植物中的病毒编码蛋白的高产量，使用病毒载体为在植物中过量生产有价值的蛋白和快速评估新性状提供了一种有吸引力的、经济效率的手段。

目前已开发出几种不同类型的正链RNA植物病毒作为生产重组蛋白和多肽的载体((Pogue et al.，Annu.Rev.Phytopathol.40：45-74(2002))。根据所涉及的病毒结构、基因组复制以及其表达方法，目前已经使用了许多的病毒载体方法，包括基因替换、基因插入、表位呈递和互补。植物病毒载体目前可利用于许多宿主植物中的重组蛋白表达，包括烟草、南瓜、黄瓜、小麦、大麦、豇豆、烟草、藜麦和拟南芥等。虽然在这些植物中有了很好的发展和利用，但适合在大豆等主要作物中系统表达外源蛋白的植物病毒载体还是非常有限的。大豆是世界范围内油脂和优质蛋白质的主要来源，因此迫切需要一些能够快速评估涉及到有价值的、赋予疾病/害虫抗性和/或增强大豆的商业价值的蛋白质表达新特性的工具。

植物病毒载体为外源蛋白在植物中的表达和基因功能研究提供了有价值的工具。以前的病毒载体都不适合在大豆上使用，因此，需要一种能够有效用于植物如大豆中表达异源蛋白质并确定植物基因功能的方法。虽然 CPMV-RNA2载体有可能作为大豆的表达载体，但它并不稳定，而且CPMV 侵染大豆会引起严重的症状。此外，大豆不是CPMV的自然宿主，因此，基于CPMV的载体不能在CPMV不流行于实际应用的国家的田间释放。

本发明满足了这些需求并且还提供了相关的优点，包括在诸如大豆植物中表达异源蛋白的豆荚斑驳病毒(BPMV)载体的构建；BPMV载体也可用于病毒诱导的基因沉默；在诸如大豆的植物中表达异源多肽的方法。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供了一种在诸如大豆的植物中有用的菜豆荚斑驳病毒(BPMV)载体。本发明的BPMV载体可用于在大豆等植物中高效表达异源蛋白。BPMV载体也可用于病毒诱导的基因沉默。本发明还提供了在诸如大豆的植物中表达异源多肽的方法。本发明提供了第一个适合在大豆中表达外源蛋白的植物病毒载体。本发明还提供了病毒诱导的基因沉默的方法，特别是在大豆植株中，该方法可用于确定目的基因的功能。本发明的 BPMV载体有利地允许在大豆中高效系统地表达外源多肽和核酸。

为实现上述目的以及其他相关目的，本发明技术方案如下：

1.本发明提供了一种载体构建和体外转录的方法，具体涉及一种BPMV 全长cDNA重组质粒的构建，具体方案如下：

1)BPMV菌株KY-Hopkins 1(K-Hol)、KY-Hancock 1(K-Hal)和 KY-Graves 7(K-G7)RNA提取；

2)病毒RNA使用Superscript II逆转录酶试剂盒(Invitrogen)进行第一链cDNA合成；

3)使用RT-PCR方法构建来自菌株K-G7(I组)和K-Hal(II组)的基因组RNA的全长cDNA克隆；构建菌株K-Hol缺失5′-端21和14个核苷酸的RNA 1和2的近全长cDNA；

4)设计PCR引物对cDNA进行扩增，三种菌株5’端特异性序列相同，设计引物添加启动子序列用于转录表达；

进一步地，由于所有3个菌株的两个基因组RNA的5′末端46个核苷酸都是相同的，因此在所有情况下都使用相同的正向(有义)引物(F1)进行 cDNA扩增。

进一步地，F1引物包含修饰的T7启动子序列，额外的G碱基和基因组 RNA的5′端39个核苷酸。反向(反义)引物(R1)包含18个(dT)残基 (与病毒RNA的poly(A)尾部互补)，限制性内切酶SaII位点和21个额外核苷酸，用于有效的限制性内切酶消化。

5)将纯化的PCR产物(菌株K-Hol的RNA1 cDNA和所有三个菌株的 RNA2 cDNA)克隆到pGEM-T easy载体中，分别产生质粒pGHoR1，pGHoR2， pGG7R2和pGHaR2；

进一步地，将菌株K-G7和K-Hal的RNA1 cDNA的PCR产物克隆到pCR2.1-TOPO载体(Invitro gen)中，分别产生质粒pCRG7R1和 PCRHaR1。

6)体外转录后，通过在1％琼脂糖凝胶上进行电泳分析转录反应混合物的结果，评估产量和质量；

进一步地，除非另有说明，否则在所有接种中，均使用来源于全长感染性RNA1cDNA(I，RNA1型)的质粒的pGHoR1转录本以及来自全长pGG7R2 或pGHoR2的重组质粒的转录本。

2.本发明提供了一种重组质粒的构建方法，具体涉及到一种绿色荧光蛋白GFP重组质粒的构建，方案如下：

1)利用引物对F1和SWAL-REV R2，从质粒pGG7R2或pGHoR2中扩增出BPMV RNA2cDNA的5‘-半片段，并将PCR产物克隆到pGEM-T Easy 载体中；

2)对步骤1)中所得的克隆进行Swal和NcoI消化，并通过限制性内切酶消化和核苷酸测序验证后，选择两个克隆pGG7R2-1和pGHoR2-1；

3)用Aat II消化克隆pGG7R2-1和pGHoR2-1，将其平端化并自连接以去除载体中的Aat限制性位点并产生新的重组体pGG7R2-2和pGHoR2-2；

4)以质粒pZGFP(Soldevila and Ghabrial，J.Virol.74：997-1003(2000))为模板，引物GFP-For和GFP-Rev扩增出GFP5基因；

5)将步骤4)中的PCR产物克隆到pGEM-T Easy载体中，经测序证实为克隆pGGFP-1；

6)对重组体pGG7R2-2和pGHoR2-2进行Swal和SalI双酶切，并连接到同样酶切的pCGFP-1中，分别产生构建体pCG7R2-3和pGHoR2-3；

7)利用引物对Aati I-for-R2和R1，从质粒pGG7R2或pGHoR2中扩增出BPMV RNA2cDNA的3‘-半片段，并将PCR产物克隆到pGEM-T Easy 载体上，得到克隆pGG7R2-4和pGHoR2-4；

8)克隆pGG7R2-4和pGHoR2-4分别用SacI和PstI酶切、钝端和自连，去除载体SaII位点，得到克隆pGG7R2-5和pGHoR2-5

9)最后，将克隆pGG7R2-5和pGHoR2-5分别用AatII和SalI酶切，分离出较小的片段，分别连接到AatII/SalI酶切的pCG7R2-3和pGHoR2-3中，构建成感染性重组质粒pCG7R2-GFP和pGHoR2-GFP。

3.本发明提供了一种重组质粒的构建方法，具体涉及到一种DsRed重组质粒的构建，方案如下：

1)以质粒pDsRed2-C1(Clontech)为模板，使用引物RFP-For和RFP-Rev 通过PCR扩增出DsRed目的基因；

2)将PCR产物克隆到pGEM-T Easy载体中，获得克隆pGdsRed-1，测序证实克隆pGdsRed-1；

3)双酶切从pGdsRed-1中释放出DSRed基因，并将其连接到经 SwaI/AatII酶切后的质粒pGG7R2-GFP和pGHoR2-GFP中，取代GFP基因，构建成感染性重组质粒pGG7R2-DsRed和pGHoR2-DsRed。

4.本发明提供了一种载体修饰的方法，具体涉及一种重组质粒 pCG7R2-GFP的修饰，方案如下：

1)为了产生合适的BPMV RNA2载体用于克隆和表达外源基因，对GFP 结构的pGG7R2-GFP(图1)进行了修改，以去除大部分GFP序列并插入两个新的内切酶限制位点；

2)使用相互部分退火的引物VecModi-for1和VecModi-Rev1进行PCR 扩增，将产物克隆到pGEM-T Easy载体上，引入BamHI酶切位点，并测序证实为pVecModi-1；

3)使用彼此部分退火的引物VecModi-For2和VecModi-Rev2进行PCR 扩增，将产物克隆到pGEM-T Easy载体，引入MscI酶切位点，并经测序证实为pVecModi-2；

4)质粒pGG7R2 GFP用SwaI和MscI双酶切，分离出较大片段，连接到同样酶切的pVecModi-1上，得到质粒pGG7R2-6；

5)质粒pGG7R2-6用ClaI和AatII消化，并分离得到大的片段，并连接到同样酶切的pVecModi-2中，以产生BPMV-RNA2载体，命名为pGG7R2-V；

5.本发明提供了一种重组质粒的构建方法，具体涉及到一种bar基因的重组质粒构建，方案如下：

1)质粒pBG-GD(Straubinger et al.，Fungal Genet.Newsl.39：82-83(1992)) 经BglII酶切、Klenow大片段DNA聚合酶补平、BamHI酶切后，释放编码膦丝菌素乙酰转移酶的bar基因；

2)将含有bar基因的DNA片段凝胶纯化后连接到已MscI和BamHI酶切处理的的pGG7R2-V中，获得pGG7R2-Bar。

6.本发明提供了一种重组质粒的构建方法，具体涉及到RNA沉默抑制子的重组质粒构建，方案如下：

1)a.用引物对TBSV-P19-For和TBSV-P19-Rev从质粒PZPTBSvp 19 (Quet al.，J.Virol.77：511-522(2003))中扩增出TBSV P19基因；b.将PCR 产物克隆到pGEM-T Easy载体中，选择正确插入方向的克隆，进行BamHI和 MscI双酶切；c.将酶切释放的P19基因克隆到BamHI/MscI酶切的 pGG7R2-V中，获得pGG7R2-P19重组质粒。

2)a.用引物对TCV-CP-For和TCV-CP Rev从质粒PZP-TCVCP (Quet al.，supra，2003)中扩增出芜菁皱缩病毒外壳蛋白(CP)基因；b.将PCR 产物克隆到pGEM-T Easy载体中，选择正确插入方向的克隆，进行BamHI 和EcoRV双酶切。c.将酶切释放的CP基因克隆到BamHI/MscI酶切的 pGG7R2-V中，获得pGG7R2-TCP重组质粒。

3)a.用引物对TEV-P2-For和TEV-P2-Rev从含有烟草蚀刻病毒 (TEV-RNA)全长cDNA的质粒pTEV7D(Dolja et al.，Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.89：10208-10212(1992))中扩增出烟草蚀刻病毒(TEV)HC-Pro的编码区；b.将PCR产物克隆到pGEM-T Easy载体中，用BamHI和EcoRV对方向正确的克隆进行酶切；c.将酶切释放的HC-Pro基因克隆到BamHI/MscI酶切的pGG7R2-V中，获得pGG7R2-HCPro(T)重组质粒。

4)用RT-PCR方法克隆SMV HC-Pro编码区：a.使用反向引物 (SMVBr)在SMV菌株G6或G7感染的大豆叶片的总RNA中进行第一链 cDNA合成；b.以第一链cDNA为模板和两对扩增引物(SMV-Ar和SMV-Af、 SMV-Br和SMV-Bf)分别进行PCR扩增，扩增出包含整个HC-Pro序列的两个重叠cDNA片段(片段A和B分别覆盖5‘和3’半部分)；c.用等摩尔量的片段A和B、引物SMV-Br和SMV-Af.进行第二步PCR扩增；d.将PCR产物克隆到pGEM-T Easy载体中，测序验证克隆方向的正确；e.将来源于G6 株和G7株HCPro基因分别用BamHI和EcoRV酶切，连接到BamHI/MscI 酶切的pCG7R2-V中，分别获得pGG7R2-HCPro(S6)和pGG7R2-HCPro(S7) 重组质粒。

7.本发明提供了一种重组质粒的构建方法，具体涉及到一种八氢番茄红素脱饱和酶的重组质粒构建，方案如下：

1)从大豆品种‘Essex’的叶片中提取基因组DNA((Srinivasa et al.，Phytopathology 91：831-838(2001))；

2)用引物对PDS-sen5-For和PDS-sen5-Rev进行PCR扩增，产生318bp 的PDS片段；

3)PCR产物用BamHI和EcoRV双酶切，连接到BamHI/MscI酶切的 pGG7R2-V上，构建pGG7R2 PDS重组质粒。

附图说明

图1 表示BPMV RNA2载体构建的示意图。

图2 显示了来自感染GFP载体的大豆植株的总蛋白的免疫印迹分析。图2a显示了使用抗GFP抗血清进行的Western blot分析。从大豆植株中提取总蛋白样品(15ug)，分别为模拟接种(通道1)、野生型BPMV K-G7感染(通道2)、pGG7R2 GFP感染(3和4通道)和pGHoR2-GFP感染(5和6通道)。纯化的His6标记的GFP蛋白(50ng)包含在泳道7中。泳道M含有低分子量的蛋白质Marker。在图2b中。通过SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色分析图2a 中测试的蛋白质上样量。

图3 显示了从BPMV载体表达的GFP和Dsked基因的稳定性。图3a 和3b显示了用于评估外源基因插入稳定性的Northern blot杂交分析。使用从先前接种了以下病毒分离物或转录本的大豆植株的纯化病毒粒子中提取的RNA：1.野生型株K-HO 1；2，野生型株K-G7：3，pGHoR1+pGG7R2-GFP 转录本；4，pGHoR+pGG7R2 DsRed转录本；5，p.GHoR1+pGHoR2-GFP转录本：和6，p.GHoR1+pGHoR2-DsRed转录本。在图3a中，使用了K-HO 1RNA2(类型II)特有的探针。在图3b中，使用K-G7RNA2(I型)特异性探针。注意，含有GFP或DsRed的重组RNA2载体(通道3-6)比野生型RNA2(通道 1和2)的尺寸大。在图4中，通过病毒RNA的溴化乙锭染色来评估RNA负载水平。

图4 显示感染携带已知RNA沉默病毒抑制子的BPMV载体在大豆植株中的症状严重程度。这些照片是在接种后2周拍摄的。图中用于感染的叶片提取物来自pGHoR1转录本，加上来自：模拟接种(图4-1)；pCG7R2(图 4-2)；pGG7R2-P19(图4-3)；pGG7R2-TCVCP(图4-4)：pGG7R2-HCPro(S7)(图 4-5)；pGG7R2-HCPro(T)(图4-6)的转录本。

图5 显示了接种大豆植株叶片上的绿色荧光。大豆幼苗经4代连续传代后，用BPMV-GFP感染植株的叶片提取液接种到大豆幼苗的初生叶上。另一种方法是用野生型K-HO-1分离物接种初生叶或仅用缓冲液模拟接种。先前接种BPMV GFP载体的大豆植株的第一叶(图5a)和第二三叶(图5b)在紫外光下显示出强烈的绿色荧光。在模拟接种的初生叶(图5c)或感染K-HO-1 的植株的第二三小叶(图5d)上没有检测到荧光。图5a、5b和5d中的叶片表现出感染提取物K-Hol的典型症状，接种叶片上有花叶和坏死，系统叶片上有斑驳。接种11天后，在紫外光下拍摄所有叶片。

具体实施方式

本发明首次证明基于BPMV的载体适用于大豆外源蛋白的高效表达。为了使相关领域的科研人员能够更好的理解本发明方案，下面结合实施方式和附图予以详细说明。但本发明并不局限于以下实施方式。

实施例1 BPMV RNA2载体的构建

BPMV是Comoviridae科冠状病毒属的成员。BPMV基因组由RNA1(约 6.0kb)和RNA2(约3.6kb)两条正链RNA组成，RNA1和RNA2分别包裹在直径为28nm的等距颗粒中。BPMV毒株有两个不同的亚群，亚群I和II。BPMV 基因组是通过多蛋白前体的合成和随后的蛋白水解处理来表达的。BPMV RNA-1编码复制所需的5种成熟蛋白，而RNA-2编码假定的细胞间运动蛋白(MP)和两种外壳蛋白(L-CP和SCP)。如本文所公开的，通过将目的基因插入到RNA2编码的多蛋白开放阅读框MP和L-CP编码区之间，通过复制 MP-LCP切割位点，并构建额外的蛋白酶裂解位点于外源蛋白的侧翼，可以产生稳定的BPMV的载体。为了最大限度地减少同源重组的机会，从而减少外源基因插入的不稳定性，根据密码子的简并性(参考BPMV密码子的使用)，改变密码子中的第三个核苷酸，从而使编码的氨基酸残基保持不变。最初地，我们构建了表达GFP和DSPed的BPMV重组载体，证明其具有感染性和稳定性。在温室条件下，在大豆中连续传代四次后，将被BPMV-GFP 重组载体感染的大豆叶片提取物接种到大豆幼苗的初生叶上，紫外照射下荧光强度没有任何明显的降低，证明BPMV-GFP载体具有较强的感染性和稳定性。

进一步修改BPMV载体以包括额外的克隆位点，可以通过BamHI和 MscI消化载体pGG7R2-V(用于定向克隆)或通过MscI消化(用于平末端克隆) 来克隆外源基因。构建了对应于BPMV RNA2亚组I和亚组II的两组BPMV RNA2载体。优先的，我们使用BPMV RNA2载体，即pGG7R2-V。

利用修饰载体中的BamHI和MscI酶切位点，将不同大小和生物活性的几个基因克隆到BPMV RNA2载体pGG7R2-V中。在所有情况下，外源蛋白都被放置在两个人工切割位点之间，该位点带有27个病毒来源的氨基酸，以进行有效的加工，如GFP构建所描述的那样。这些基因大小从520bp到 1400bp(图1C)，包括除草剂抗性bar基因(编码草甘膦乙酰转移酶)和几个病毒编码的宿主介导的RNA沉默抑制子：包括番茄丛矮病毒(TBSV)、芜菁皱缩病毒(TCV)分别编码的P-19和外壳蛋白(CP)，以及大豆花叶病毒(SMV)和烟草蚀刻病毒(TEV)编码的辅助成分蛋白酶(HCPro)。

所有测序验证质粒载体准确性及方向性均使用ABI Prism 310遗传分析仪和BigDye^TM双脱氧终止DNA测序试剂盒完成。使用DNA Strider和Vector NTI 软件进行序列分析。

实施例2 BPMV-GFP载体的外源基因表达水平分析

构建的重组质粒载体BPMV-GFP用于检测外源基因在大豆中的表达水平。将来自亚组I(K-G7)或亚组II(K-Ha1)BPMV RNA2的BPMV-GFP 质粒载体接种于7日龄至10日龄大豆幼苗的初生叶。接种3周后，从第一和第二三小叶叶片中提取总可溶性蛋白，并进行Westernblot分析。并以在大肠杆菌中表达具有亲和纯化的His标签的GFP作为对照。为评估GFP的表达水平，扫描Western blot，并用ImageOuantTMV5.2程序(Amersham)分析产生的条带强度图像。结果显示，亚组I pGG7R2 GFP和亚组II pGHoR2-GFP 感染的大豆RNA中能够稳定检测到GFP蛋白表达，GFP的表达量约占大豆总蛋白的1％。有趣的是，亚组I pGG7R2 GFP载体提供的表达水平高于亚组II pGHoR2-GFP载体在第一和第二三小叶叶片中的表达水平。

实施例3 BPMV RNA2载体表达外源基因稳定性的分析

为了评估插入的外源基因在植物连续传代过程中的稳定性，从先前感染 BPMV-GFP或BPMV-DsRed的大豆植株中纯化病毒粒子。经历三次传代的重组BPMV载体，从纯化的病毒粒子中提取病毒RNA，并进行Northern杂交分析。结果显示，只有包含GFP或DsRed编码序列的重组RNA2的预测大小的单个条带被解析到。只解析到包含GFP或Dsked编码序列的重组RNA2的预测大小的单个条带。即使在长时间过度暴露斑点后，也没有检测到野生型RNA2。此外，在未成熟种子的种皮中很容易检测到GFP或DsRed 的表达所致的荧光，表明外源基因在荚果形成的后期发育阶段稳定表达。

如本文所揭示的，BPMV-GFP载体在大豆中连续传代4代后也表现稳定， Northern杂交分析未检测到野生型病毒的踪迹。并且明亮的绿色荧光在整个大豆植株中都保持着，包括未成熟种子的种皮，这为绿色荧光蛋白结构的持久稳定性提供了进一步的证据性。在菜豆中三次连续传代后，BPMV-GFP载体也稳定。除大豆和少数大豆品种外，BPMV的寄主范围非常有限，仅包括部分豆科杂草。由于BPMV不会感染N.benthamiana或烟草，这两种已知的病毒载体支持大多数已建立的植物病毒载体的扩增和外源基因表达，所以在插入不稳定性方面，不可能将基于BPMV的载体与其他载体进行比较。已知宿主因素影响病毒RNA的复制和重组，从而可能导致报道的不同宿主物种之间病毒RNA重组频率的差异。大豆宿主因子可能通过抑制病毒RNA重组而影响BPMV载体的稳定性。

实施例4 BPMV RNA2载体表达的基因产物的生物活性分析

为了评估插入外源基因在植物中的生物活性，对BPMV-bar重组载体感染的植物进行0.1％草甘膦处理，结果显示出植物的抗药性。相反，未接种对照、感染BPMV K-G7质粒载体的植株和感染BPMV-GFP质粒载体的植株在除草剂处理3周后被杀死。此外，感染BPMV-bar的植株在去离子水中能经受1％(w/v)的草甘膦铵处理，并且几乎没有受到伤害。

目前已知某些由植物病毒编码的RNA沉默抑制子可以增强异源病毒诱导的症状严重程度。将3种不同的病毒RNA沉默抑制子(TBSV-P19、TCV-CP、 SMV-HC-Pro)克隆到BPMV载体中，检测它们在大豆中的活性。由此产生的重组载体具有感染性，与野生型BPMV RNA2感染引起的相对轻微的斑驳症状相比，RNA沉默抑制子感染的植物表现出非常严重的症状，包括广泛的发育迟缓、叶片变形、起泡和脉管坏死。通过免疫印迹分析和ELISA对感染BPMVHC-Pro质粒载体构建的大豆植株进行评估，表明重组BPMV载体中RNA沉默抑制子的表达显著增强了症状严重的程度(图4)和病毒外壳蛋白的积累。BPMV HC-Pro重组载体在大豆植株上的症状加重和BPMV的积累使人联想到BPMV和SMV的双重侵染，这与BPMV不能有效抑制RNA沉默的观点是一致的。RNA沉默抑制子的表达与重组BPMV载体相结合可能有助于提高外源蛋白的表达水平。虽然从同一BPMV载体表达多个产物(抑制子和目的蛋白)在理论上是可行的(插入片段大小的上限是2.4kbp)，但由于额外的重复切割位点，稳定性可能是一个令人担忧的问题。因此，表达共感染重组BPMV载体和RNA沉默抑制子可能是一种较好的方法。

因此，由BPMV RNA2载体表达的基因产物在大豆植物中具有很好的生物活性，且对宿主本身造成的影响相对较小，适用于大豆植物中进行目的基因的导入和表达。

实施例5 在大豆中沉默八氢番茄红素脱饱和酶的分析

病毒诱导的基因沉默(VIGS)是研究基因功能的一种很有吸引力的工具。为了确定基于BPMV的VIGS载体是否可用于沉默大豆内源基因，将生产类胡萝卜素色素所必需的八氢番茄红素脱饱和酶(PDS)基因的318bp片段插入到BPMV载体中，并将其用于侵染大豆。接种重组BPMV-PDS的大豆植株在接种2周后出现典型的光漂白叶片，表明PDS基因已经被沉默。BPMV-PDS 质粒载体在从上部叶片中提取，并将叶片提取物用于接种第二代健康大豆幼苗时是稳定的。从第二代植株21dpi收获的代表性上部叶片所示，PDS基因的VIGS明显不受RNA1来源(无论是来自轻度品系K-Hal还是来自重度品系 K-Hol)或所使用的大豆品种Essex、Clark、Williams或York的影响。

以上仅为本发明的具体实施例，但本发明的技术特征并不局限于此。任何以本发明为基础，为解决基本相同的技术问题，实现基本相同的技术效果，所作出的简单变化、等同替换或者修饰等，皆涵盖于本发明的保护范围之中。

Claims

1.适用于大豆中外源基因表达的病毒载体构建方法，其特征在于：菜豆荚斑驳病毒(BPMV)载体，其包含编码RNA2多蛋白开放阅读框(ORF)的核酸序列。

2.根据权利要求1所述，其特征在于，所述RNA2多蛋白ORF序列包含第一和第二QM切割位点，核酸序列之间的差异要足以减少所述QM切割位点核酸序列之间的同源重组。

3.根据权利要求2所述，其特征在于，所述QM切割位点是指含有GlinMet的蛋白酶切割位点，位于RNA2多聚蛋白编码的运动蛋白(MP)和大外壳蛋白(L-CP)之间。

4.根据权利要求3所述，其特征在于，编码所述QM切割位点的每个密码子在编码第一QM切割位点和第二QM切割位点的核酸序列之间不同，但氨基酸序列是相同的。

5.根据权利要求2的所述，其特征在于，所述QM切割位点包含8个源自MP的C末端的氨基酸和19个源自L-CP的氨基酸，氨基酸序列为QYNEVOAQMETNLFKLSLDDVETPKGS(SEQ IDNO：1)。

6.根据权利要求2所述，其特征在于，所述载体在QM切割位点之间包含了限制性内切酶位点以供外源序列插入，构建了一种BPMV全长cDNA重组质粒pGG7R2。

7.根据权利要求7所述，其特征在于，修改质粒pGG7R2，并引入荧光报告蛋白GFP，构建一种绿色荧光蛋白GFP感染性重组质粒pCG7R2-GFP和pGHoR2-GFP。

8.根据权利要求13所述，其特征在于，为了产生合适的BPMV RNA2载体用于克隆和表达外源基因，对GFP结构的pGG7R2-GFP进行了修改，以去除大部分GFP序列并插入两个新的内切酶限制位点，产生新的载体命名为pGG7R2-V。

9.根据权利要求14所述，其特征在于，为了评估插入外源基因在植物中的生物活性，修改pGG7R2-V载体，产生用于生物活性评估的载体pGG7R2-Bar。

10.根据权利要求14所述，其特征在于，为了研究BPMV载体在大豆基因功能研究中作为病毒诱导的基因沉默(VIGS)的作用，构建了一种在大豆植株中进行病毒诱导的基因沉默的方法和可用于病毒诱导基因沉默的载体pGG7R2-PDS。