KR101103705B1 - 고감염성 고추모틀바이러스 핵산분자 및 이로부터 유래된 식물 바이러스 벡터 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 고추모틀바이러스 (Pepper mottle virus, PepMoV)-유래 식물 감염성 핵산분자, 이를 포함하는 재조합 벡터, 형질전환 세포 및 식물체에 관한 것이다. 본 발명은 바이러스가 감염된 고추에서 분리한 감염성을 지닌 전장의 고추모틀바이러스 cDNA 클로닝을 최초로 성공한 것으로, 고추와 담배 식물체에서 고추모틀바이러스의 분자 생물학적 연구를 가능케 하고 유용한 외래단백질의 고발현용 식물바이러스벡터를 제공할 수 있다.
고추모틀바이러스, 고추, 담배, 감염, cDNA, 벡터, 진딧물 전염성

Description

고감염성 고추모틀바이러스 핵산분자 및 이로부터 유래된 식물 바이러스 벡터{Highly Infectious Nucleic Acid Molecules from Pepper Mottle Virus and Plant Viral Vector Derived from the Same}
본 발명은 고추모틀바이러스(Pepper mottle virus)-유래 식물 감염성 핵산분자, 이를 포함하는 재조합 벡터, 형질전환 세포 및 식물체에 관한 것이다.
전장 cDNA 클론으로부터 유래된 인 비트로 또는 인 비보 전사된 감염성 RNA를 이용하여 바이러스 병원성의 다양한 측면들이 연구되고 있다. 전장 클론으로부터 바이러스 단백질들이 어떻게 발현되는지는 아직까지 알려진 바 없으며, 그 이유는 박테리아 세포에서 바이러스 RNA를 전사시키는 프로모터를 벡터 서열이 가지고 있지 않기 때문이다. Fakhfakh 및 그의 동료는 바이러스 RNA가 바이러스 cDNA 서열에 있는 크립틱(cryptic) 프로모터로부터 전사되고 크립틱 라이보좀 결합 위치에서 단백질 합성이 개시된다는 발표를 하였다 (Fakhfakh et al., 1996). 그러나 포티바이러스 전장 클론의 조작 및 증폭은 매우 어려운 작업이며, 이는 박테리아 세포에서 바이러스 염기 서열이 불안정하거나 또는 독성을 나타내기 때문이다(Chen and Hruening, 1992; Boyer and Haenni, 1994; Fakhfakh et al., 1996). E. coli에서 바이러스 단백질의 발현은 숙주 세포에 대하여 독성 효과를 나타낸다는 것이 알려져 있다(Lama and Carrasco, 1992). 원하지 않는 단백질 발현으로부터 나오는 독성 효과는 플라스미드 카피수를 감소시키는 E. coli에서 클로닝하거나 (Greener, 1993) 또는 낮은 카피수의 클로닝 벡터를 이용(Uhlin et. al., 1979)함으로써, 감소시킬 수 있다.
포티바이러스(potyviruses) 중에서, 박테리아파아지 프로모터를 갖는 전장 cDNA 클론으로부터 생물학적으로 활성인 RNA를 인 비트로(in vitro) 합성 논문들이 발표되었으며, 예를 들어, TVMV (Tobacco vein mottling virus) (Domier et al., 1989 ; Nicolas et al., 1996), PPV (Plum pox virus) (Riechmann et al., 1990), ZYMV (Zucchini yellow mosaic virus) (Gal-On et al., 1991 Lin et al., 2001, 2002), TEV (Tobacco etch virus) (Dolja et al., 1992), PStV (Peanut stripe virus) (Flasinski et al., 1996), PSbMV (Pea seed - borne mosaic virus) (Johansen et al., 1996), PVA (Potato virus A) (Puurand et al., 1996), PRSV (Papaya ringspot virus) (Chiang and Yeh, 1997), PVY (Potato virus Y) (Jakab et al., 1997), PRSV (Papaya ringspot virus) (Chiang and Yeh, 1997), TuMV (Turnip mosaic virus) (Sanchez et al., 1998) 및 JGMV-Jg (Johnsongrass mosaic virus) (Kim et al., 2003) 등과 같은 바이러스가 있다.
식물 세포에 감염을 유도하기 위한 다른 시스템은, cDNA로 코팅된 입자를 운 반하거나 또는 플라스미드를 직접적으로 식물세포에 도입하는 것이다. 내재적 숙주 RNA 중합효소에 의해 전사될 수 있는 CaMV (Cauliflower mosaic virus) 35S 프로모터에 의한 인 비보 감염성 전사체에 대한 발표 논문들이 있으며, 예컨대, PPV-NAT (Maiss et al., 1992), ZYMV (Gal-On et al., 1995), PVY-NTN (Fakhfakh et al., 1996), PSbMV (Johansen, 1996), ClYVV(Clover yellow vein virus) (Takahashi et al., 1997), PRSV (Chiang and Yeh, 1997), PVY-N605 (Jakab et al., 1997), TuMV (Sanchez et al., 1998), LMV(Lettuce mosaic virus) (Yang et al., 1998), 및 PSbMV-L1 (Olsen and Johansen, 2001)에 대한 발표가 있다. 전장 cDNA 클론으로부터 유래된 인 비트로- 또는 인 비보-전사된 감염성 RNA는 RNA 바이러스에 대한 연구에서 매우 중요한 실험 도구이다. 이들 클론들은, 녹색형광 단백질(GFP) 유전자 또는 β-글루큐로니다아제(GUS) 유전자와 같은 리포터 유전자를 표지하지 않아도, 바이러스 감염에 대한 비파괴 모니터링 연구를 촉진시킬 수 있다.
포티바이러스 중에서, TEV는 리포터 유전자를 발현하기 위하여 처음으로 개발되었다 (Dolja et al., 1992; Carrington et al., 1993). 이후, 많은 포티바이러스, 예컨대 asPPV (Guo et al., 1998; Fernandez-Fernandez et al., 2001), LMV (German-Retana et al., 2000), ClYVV (Masuta et al., 2000), WSMV(Wheat streak mosaic virus) (Choi et al., 2000), TVMV(Tobacco vein mottling virus vector) (Dietrich and Maiss, 2003), ZYMV (Arazi et al., 2001; Hsu et al., 2004), PVA (Ivanov et al., 2003) 및 TuMV (Beauchemin et al., 2005) 등이 리포터 유전자의 효과적인 발현을 위하여 조작되었다.
포티바이러스 단백질은, 3개의 바이러스-인코딩 프로테아제, P1, HC-Pro 및 NIa에 의한 거대 전구 폴리단백질의 단백질분해 프로세싱을 통하여 발현된다. P1 및 HC-Pro는 자동적으로 그들 각각의 C-말단을 절단하며, NIa는 잔여물을 절단한다(Takahashi et. al., 1997; Hull, 2002). 외래 ORF들의 대부분은, 방향성 삽입을 통하여, P1 및 HC-Pro 또는 NIb 및 CP 사이의 연결위치에 인접하도록 구축된다.
식물 바이러스-기반 벡터는 식물체에서 타깃 외래 단백질의 효과적인 발현을 하기 위한 유용한 도구이다. 식물 발현 시스템은 재조합 단백질 생산의 다른 방법들과 비교하여 상당한 이점을 가지고 있는데, 그 이유는 세포 배양 방법들과 비교하여 식물체는 재배를 하는 데 있어 훨씬 저렴하고 쉽기 때문이다. 이 시스템은 식물체에서 이질의 유전자의 빠르고 일시적인 발현을 제공한다. 이들 바이러스-기반 벡터들은 의약 유전자, 농업경영 가치가 있는 유전자를 발현하는데 이용되고 왔으며, 또한 미지의 유전자의 기능을 결정하기 위하여 유전적으로 도미넌트하거나 또는 유전자-사일런싱(gene silencing) 형질을 유발하는 데 이용되어 왔다.(Donson et al., 1991; Kumagai et al., 1993, 1995; Masuta et al., 2000; Arazi et al., 2001; Fitzmaurice et al., 2002). 또한, 이 시스템은 암 백신치료제로 이용될 수 있는 백신 성분들을 생산하거나 또는 다양한 치료제로 적용될 수 있는 단백질들을 생산하는데 이용되었다(McCormick et al., 1999). 바이러스 발현벡터에 의한 식물체에서의 서열 발현은, 바이러스-유도 유전자-사일런싱(VIGS) 효과(Baulcombe et al., 1999) 또는 단백질 발현(Fitzmaurice et al., 2002)을 통 하여 식물체에서 특정 대사경로의 재프로그래밍을 초래한다. N. benthamiana에서 capsanthin-capsorubin synthase (ccs) cDNA의 이종 발현은 오렌지-적색 표현형질을 초래하고 또한 신규 카로티노이드 캡사이신 및 캡소루빈의 축적을 초래한다(Kumagai et al, 1998).
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 식물체, 특히 고추와 담배 식물체에서 병원성을 나타내는 고추모틀바이러스 (Pepper mottle virus, PepMoV)의 감염성에 대한 단서를 제공하고 식물바이러스 벡터를 개발하고자 하였다. 그 결과, 본 발명자들은 고추모틀바이러스의 고감염성 cDNA를 제작, 분리 및 염기서열을 분석하고 이를 기초로 하여 식물바이러스 벡터를 구축함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 고추모틀바이러스(Pepper mottle virus)-유래 식물 감염성 핵산분자를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 고추모틀바이러스-유래 식물 감염성 핵산분자를 포함 하는 재조합 벡터를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 고추모틀바이러스-유래 식물 감염성 핵산분자에 의해 형질전환된 형질전환 세포 또는 식물체를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열의 서열 168 내지 서열 9371의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 고추모틀바이러스 (Pepper mottle virus)-유래 식물 감염성 핵산분자를 제공한다.
본 발명자들은 식물체, 특히 고추와 담배 식물체에서 병원성을 나타내는 고추모틀바이러스의 감염성에 대한 단서를 제공하고 식물바이러스 벡터를 개발하고자하였다. 그 결과, 본 발명자들은 고추모틀바이러스의 고감염성 cDNA를 제작, 분리 및 염기서열을 분석하고, 이를 기초로 하여 식물바이러스-기반 벡터를 구축하였으며, 이를 기초로 하여 진딧물로 인한 바이러스 감염 전이를 방지하고자 진딧물 비전이성 고추모틀바이러스 벡터를 제작하였다.
본 발명은 고추 식물체로부터 분리된 전장의 감염성 고추모틀바이러스 cDNA 클로닝을 첫 번째로 성공한 발명으로서, 고추모틀바이러스의 감염성에 대한 분자적 연구를 가능하게 하며, 식물바이러스-기반 벡터를 제조하는데 이용될 수 있다. 또한, 본 발명은 진딧물로 인한 바이러스 전염의 전이 문제점을 배제시킨 진딧물 비전이성 고추모틀바이러스-기반 벡터를 제작함으로써, 제한된 환경 내에서 환경 안전성이 높은 식물체를 획득하는 데 기여할 수 있다.
본 발명의 고추모틀바이러스(pepper mottle virus)-유래 식물 감염성 핵산분자는 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열을 갖는다.
본 명세서에서 용어 “핵산 분자”는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이며, RNA 게놈 서열, cDNA 및 이로부터 전사되는 RNA 서열을 포괄하며, 다르게 특별하게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오타이드의 유사체를 포함한다 (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).
본 발명의 식물체 고감염성 고추모틀바이러스 핵산분자는 다양한 식물체에 감염되어 병원성을 나타낸다. 바람직하게는, 본 발명의 고감염성 핵산분자는 담배(Nicotiana) 및 고추(Capsicum) 속 식물체에 감염되어 병원성을 나타낸다. 보다 바람직하게는, 고감염성 핵산분자는 Nicotiana benthamiana, Nicotiana tabacum 및 Capsicum annuum 에 대하여 감염성을 나타낸다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 핵산분자는 서열목록 제1서열의 서열 1 내지 서열 167의 뉴클레오타이드 서열을 추가적으로 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 핵산분자는 서열목록 제1서 열의 서열 9372 내지 서열 9655의 뉴클레오타이드 서열을 추가적으로 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 핵산분자는 서열목록 제1서열의 9304번째 서열이 A, C 또는 T 염기로 치환된 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어, “특정부위 돌연변이 유도(site-directed mutagenesis)”는 클로닝한 유전자에서 하나 또는 그 이상의 특정 뉴클레오티드를 변화시켜 하나 또는 그 이상의 특정 아미노산의 변화된 형태를 유도하는 기술을 의미한다. 특정부위 돌연변이 유도 방법에는 Ling et al., “Approaches to DNA mutagenesis: an overview”, Anal Biochem . 254(2):157-178(1997); Dale et al., “Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioate method”, Methods Mol . Biol . 57:369-374(1996); Smith, “In vitro mutagenesis” Ann . Rev . Genet . 19:423-462(1985); Botstein & Shortle, “Strategies and applications of in vitro mutagenesis”, Science 229:1193-1201(1985); Carter, “Site-directed mutagenesis”, Biochem . J., 237:1-7(1986); 및 Kunkel, “The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis”, Nucleic Acids & Molecular Biology (Eckstein, F. and Lilley, D. M. J. eds., Springer Verlag, Berlin(1987))이 있으며, 그 내용은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 한편, 본 발명에서 특정부위 돌연변이 유도는 PCR 방법에 의해 수행하는 것이 가장 바람직하다(Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene/Wiley Interscience (1987)).
본 발명에서 상기 특정부위 돌연변이 유도에 의해 치환되는 아미노산은 진딧 물 전염성에 관여하는 부분이다.
종래의 연구에 따르면, 포티바이러스에서는 코트 단백질의 N 말단 부근의 아미노산을 삭제하거나, 특정부위 돌연변이 유도(site-directed mutagenesis)에 의해 치환하면 진딧물 전염성을 갖지 않게 된다. 특히, 진딧물 전염성의 포티바이러스에서 보존된 아미노산 서열인 Asp-Ala-Gly(DAG) 부분이 삭제되면 전염성을 잃게 된다(P. L. Atreya et al., Proc . Natl . Acad . Sci., 88:7887-7891(1991)).
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 (ⅰ) 상술한 본 발명의 고추모틀바이러스(pepper mottle virus)-유래 식물 감염성 핵산분자 및 (ⅱ) 상기 핵산 분자에 작동적으로 연결된(operatively linked) 프로모터를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 명세서에서 용어 “작동적으로 결합된”은 핵산 발현 조절 서열 (예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 트랜스레이션을 조절하게 된다.
본 발명의 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명의 벡터에 포함되는 뉴클레오타이드 서열은 식물바이러스에서 분리되었고, 식물체에 대하여 감염성을 나타내기 때문에 식물에 대하여 가장 바람직한 유 용성을 갖는다. 따라서, 본 발명의 벡터는 (ⅰ) 상술한 본 발명의 고추모틀바이러스(pepper mottle virus)-유래 식물 감염성 핵산분자; (ⅱ) 상기 (ⅰ)의 핵산분자에 작동적으로 연결되며 식물세포에서 작용하여 RNA 분자를 형성시키는 프로모터; 및 (ⅲ) 식물세포에서 작용하여 상기 RNA 분자의 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 3'-비-해독화 부위를 포함하는 식물발현용 벡터를 제공한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 적합한 프로모터는, 식물체의 유전자 도입을 위해 당업계에서 통상적으로 이용되는 어떠한 것도 이용될 수 있으며, 예를 들어, SP6 프로모터, T7 프로모터, T3 프로모터, PM 프로모터, 옥수수의 유비퀴틴 프로모터, 컬리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV) 35S 프로모터, 노팔린 씬타아제 (nos) 프로모터, 피그워트 모자이크 바이러스 35S 프로모터, 수가크레인 바실리폼 바이러스 프로모터, 콤멜리나 엘로우 모틀 바이러러스 프로모터, 리불로오스-1,5-비스-포스페이트 카르복실라아제 스몰 서브유티트 (ssRUBISCO)의 광유도성 프로모터, 벼 사이토졸 트리오스포스페이트 이소머라아제 (TPI) 프로모터, 아라비돕시스의 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라아제 (APRT) 프로모터 및 옥토파인 신타아제 프로모터를 포함한다.
가장 바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 프로모터는 박테리오파아지 SP6 프로모터이다. 박테리오파이지 SP6 프로모터의 서열은 서열목록 제5서열에 예시되어 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 적합한 폴리아데닐화를 야기시키는 3'-비-해독화 부위는 아그로박테리움 튜머페이션스의 노팔린 신타아제 유 전자로부터 유래된 것 (nos 3' end) (Bevan et al., Nucleic Acids Research, 11(2):369-385(1983)), 아그로박테리움 튜머페이션스의 옥토파인 신타아제 유전자로부터 유래된 것, 토마토 또는 감자의 프로테아제 억제자 I 또는 Ⅱ 유전자의 3' 말단 부분, CaMV 35S 터미네이터 및 서열목록 제1서열의 서열 9372 내지 서열 9655에 있는 서열을 포함한다.
가장 바람직하게는 본 발명에 적합한 폴리아데닐화를 야기시키는 3'-비-해독화 부위는 서열목록 제1서열의 서열 9372 내지 서열 9655에 있는 서열이다.
선택적으로, 본 발명의 벡터는 리포터 분자(예: 녹색형광단백질(GFP), 노란형광단백질(YFP), 붉은형광단백질 (RFP), GFP-유래의 변이단백질류, 루시퍼라아제 및 β-글루쿠로니다아제(GUS))를 코딩하는 유전자를 추가적으로 운반할 수 있다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 벡터는 GFP-코딩 뉴클레오타이드 서열을 추가적으로 포함한다.
바람직하게는, GFP-코딩 뉴클레오타이드 서열은 본 발명의 고추모틀바이러스 cDNA의 NIb 및 CP 시스트론 사이에 위치한다. GFP-코딩 뉴클레오타이드 서열이 포함되어 있는 본 발명의 고추모틀바이러스-유래 식물 감염성 핵산분자는 서열목록 제3서열에 예시되어 있다.
하기의 실시예에 기재된 바와 같이, 본 발명은 리포터 분자(예컨대, GFP)의 발현을 식물체에서 관찰할 수 있는 고추모틀바이러스 벡터에 대한 첫 번째 성공 사례를 제시한다.
또한, 본 발명의 벡터는 상기 리포터 분자를 코딩하는 유전자 대신 외래 유 전자를 추가적으로 운반할 수도 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, “외래 유전자”는 본 발명에서 사용하는 식물체 내에 자연적으로 존재하지 않는 유전자를 의미한다. 이러한 외래 유전자는 다른 식물체 내에서 자연적으로 존재하는 유전자 또는 유전자들로부터 변형된 것일 수 있으며, 인공적으로 합성하거나 둘 또는 그 이상의 유전자들이 융합된 것일 수도 있다. 이러한 외래 유전자들을 포함하는 식물체는 그 자체가 자연적으로 생산하지 못하는 유전자의 산물들을 발현할 수 있다.
인공적으로 합성된 유전자들을 만들기 위해서는 DNA 합성 기술 및 핵산 화학 방법이 사용된다. 예컨대, Gait, M. J. (1985). Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Gait, M. J. (1990). Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Eckstein, F. (1991). Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, IRL Press; Adams, R. L. et al. (1992). The Biochemistry of the Nucleic Acids, Chapman & Hall; Shabarova, Z. et al. (1994) Advanced Organic Chemistry of Nucleic Acids, Weinheim; Blackburn, G. M. et al. (1996). Nucleic Acids in Chemistry and Biology, Oxford University Press; 및 Hermanson, G. T. (1996). Bioconjugate Techniques, Academic Press에 기재된 방법들이 사용될 수 있으며, 그 내용은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명에서 외래 유전자는 식물체에서 다량으로 발현될 수 있는 유용한 단백질을 코딩하는 어떠한 유전자들도 포함된다. 예컨대, 약학적 활성을 갖는 펩타이드(예를 들어, 사이토카인(인터류킨, 키모카인, 과립대식세포 콜로니자극인 자(GM-CSF), 대식세포 콜로니자극인자(M-CSF), 과립콜로니자극인자(G-CSF), 멀티-CSF(IL-3), 에리스로포이에틴(EPO), 류케미아 억제인자(LIF), c-kit 리간드와 같은 조혈인자(SCF), 종양 괴사 인자, 인터페론, 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 표피 성장 인자(EGF), 섬유아세포성장인자(FGF), 간세포성장인자(HGF) 또는 혈관내피세포성장인자(VEGF)), 호르몬(예를 들어, 인슐린, 성장 호르몬 또는 갑상선 자극 호르몬), 백신 항체, 혈액 생산물들, 항박테리아 단백질과 같은 농업적으로 유용한 펩타이드들, 2차 대사산물을 합성할 수 있는 여러 가지 효소, 효소 작용을 조절하는 억제제, 혈압을 낮추는 콩의 글리시닌 또는 바이오에탄올 생산의 전처리 과정에 필요한 효소(예를 들어, 셀룰라아제, 헤미셀룰라아제 또는 펙티네아제) 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 벡터는 선택 표지로서 항생제(예: 네오마이신, 카베니실린, 카나마이신, 스펙티노마이신, 하이그로마이신 등) 내성 유전자 (예: 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 (npt Ⅱ), 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라아제 (hpt), 등)를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 식물 감염성 핵산분자, 그의 전사체, 상술한 본 발명의 재조합 벡터 또는 그의 유전자가 도입된 형질전환된 세포를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 식물 감염성 핵산분자, 그의 전사체, 상술한 본 발명의 재조합 벡터 또는 그의 유전자가 도입된 형질전환 식물체를 제공한다.
본 발명의 형질전환 세포 및 형질전환 식물체의 제조는 상술한 야생형의 고추모틀바이러스-유래 식물 감염성 핵산분자는 물론, 상기 특정부위 돌연변이 유도에 의해 제작된 진딧물 전염성을 갖지 않는 돌연변이형의 고추모틀바이러스-유래 식물 감염성 핵산분자를 이용하여 실시될 수 있다.
본 발명의 형질전환 세포 및 형질전환 식물체를 제조하기 위하여, cDNA 서열 및 그의 전사체(transcripts)가 이용될 수 있으며, 바람직하게는 cDNA 유전자가 이용된다.
전사체를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있는 방법에 따라 실시할 수 있다. 재조합 벡터를 이용하여 전사체를 제조하는 경우에는 우선, 벡터를 선형화 하여 전사체를 제조하는 것이 바람직하다.
외래성 뉴클레오티드 서열을 식물체에 도입시키는 방법은 당업계에 일반적으로 공지된 방법(Methods of Enzymology, Vol. 153, 1987, Wu and Grossman 편집, Academic Press; 그 내용은 본 명세서에 참조로서 삽입된다)에 따라 실시될 수 있다. 외래성 폴리뉴클레오티드를 플라스미드나 바이러스 등과 같은 벡터 등의 운반체에 삽입하여 식물을 형질전환시킬 수 있고, 아그로박테리움 박테리아를 매개체로 사용할 수 있으며(Chilton 등, 1977, Cell 11:263:271; 그 내용은 본 명세서에 참조로서 삽입된다), 직접 외래성 폴리뉴클레오티드를 식물 세포내로 도입시켜 식물을 형질전환시킬 수 있다(Lorz 등, 1985, Mol . Genet . 199:178-182; 그 내용은 본 명세서에 참조로서 삽입된다). 예를 들어, T-DNA 부위를 포함하지 않는 벡터를 이용하는 경우에는 전기천공법(electroporation), 입자충격법(microparticle bombardment), 폴리에틸렌 글리콜 침전법(polyethylene glycol-mediated uptake)을 이용할 수 있다.
본 명세서에서, 용어 “식물(체)”는 성숙한 식물뿐만 아니라 성숙한 식물로 발육할 있는 식물 세포, 식물 조직 및 식물의 종자 등을 모두 포함하는 의미로서 이해된다.
본 발명의 형질전환 식물체는, 바람직하게는 담배(Nicotiana) 및 고추(Capsicum) 속 형질전환 식물체이고, 보다 바람직하게는, Nicotiana benthamiana, Nicotiana tabacum 및 Capsicum annuum 형질전환 식물체이다.
본 발명은 고추와 담배 식물체에서 병원성을 나타내는 고추모틀바이러스의 감염성에 대한 분자적 연구를 가능하며, 고추 또는 담배 등과 같은 식물체에 유전자를 효과적으로 발현 및 운반할 수 있는 식물바이러스-기반 벡터를 제공할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실험 재료 및 실험 방법
1. 식물체
야생형 담배인 Nicotiana benthamiana를 고추모틀바이러스 (PepMoV-Vb1)의 증식에 일반적으로 이용하였다. 이 식물체는 고추모틀바이러스 cDNA 클론에서 합성된 RNA 및 이로 감염된 식물체의 즙액 (sap)의 물리적 접종에 의해 쉽게 감염시킬 수 있었다. pSP6PepMoV-Vb1/GFP의 숙주 범위를 연구하기 위하여, 다음의 식물 종을 SP6PepMoV-Vb1/GFP로 감염시킨 식물의 즙액을 이용하여 접종하였다. Nicotiana tabacum cv. Xanthi-nc, Samsun NN, Samsun nn, Solanum lycopersicon, Chenopodium amaranticolor, zucchini squash (C. pepo cv. Black Beauty). 그리고 고추 식물체를 서울여자대학교(서울, 대한민국)의 실험실내 식물생장실 및 온실에서 성장시켰다. SP6PepMoV-Vb1/GFP으로 감염된 N. benthamiana를 0.01 M 포스페이트 완충액, pH 7.2에서 분쇄하였다. 분쇄된 즙액 (sap)을 탄소가루(carborundum)를 이용하여 건전 식물체의 잎에 물리적 접종을 수행하였다.
2. 바이러스원
본 연구 전체에 걸쳐 이용된 고추모틀바이러스(PepMoV-Vb1)는 대한민국, 경기도 화성에서 재배된 Capsicum annuum L. var. grossum으로부터 처음 분리된 것이다.
3. 박테리아 및 플라스미드
이용된 대장균 균주들은 ABLE K, SURE, XL10-Gold (Stratagene, USA), DH5α 및 JM109이다. 전장 클론은 대장균 XL10-Gold에서 증폭 및 유지되었다. 플라스미드 pBluescript SK 2(-) (Stratagene, USA) 및 pGEM T-Easy (Promega, USA)는 PepMoV-Vb1의 cDNA의 전장 구축 및 서브클로닝에 이용되었다.
4. PepMoV - Vb1 의 전장 cDNA 의 구축
PepMoV-Vb1의 인 비트로 및 인 비보 감염성 전장 cDNA 클론의 구축에 대한 과정의 개요는 도 1에 나타나 있다.
4-1. SP6 프로모터를 가지는 PepMoV - Vb1 RNA 의 전장 cDNA 카피
Kpn I-SP6 5' 및 polyA-Sac Ⅱ 3'의 프라이머 세트를 이용하여 긴 주형 RT-PCR 방법으로 PepMoV-Vb1 RNA의 전장 cDNA 카피를 합성하였다. PepMoV-Vb1의 cDNA의 합성을 위하여 이용된 프라이머는 표 1에 기재되어 있다. RT-PCR(Reverse transcription-PCR)은 다음을 포함하는 반응액 50 ㎕를 이용하여 실시하였다: 총 RNA 주형, 1 x 완충액, 0.5 mM dNTP, 1 pM 다운스트림 프라이머, 및 10 U SuperScriptⅡ 역전사효소. PCR은 다음을 포함하는 반응액 50 ㎕를 이용하여 실시하였다: 1 ㎕ 제1쇄 cDNAs, 1x 완충액, 0.5 mM dNTP, 0.75 mM MgCl2, 0.5 pM 프 라이머 및 익스팬드 롱 템플레이트 DNA 중합효소(Roche). RT-PCR은 다섯 개의 상이한 어닐링 온도의 사이클에 따라 실시하였다. PCR은 다음의 온도 조건에서 실시하였다: 94℃에서 4분; 이어 94℃에서 20초, 55℃에서 40초 및 68℃에서 10분의 5 사이클; 94℃에서 20초, 56℃에서 40초 및 68℃에서 9분의 10 사이클; 94℃에서 20초, 57℃에서 40초 및 68℃에서 10분의 10 사이클; 94℃에서 20초, 58℃에서 40초 및 68℃에서 10분의 5 사이클. 최종적으로, 68℃에서 15분 동안 연장반응 시켰다.
PepMoV-Vb1 전장 클론의 구축 및 시퀀싱 염기서열 분석을 위한 프라이머
단편 프라이머 프라이머 서열(5' → 3')
1 KpnI-SP6 5' 5'-GAGAGGTACCATTTAGGTGACACTATAG
AAATTAAAACATAACATACAA-3'
BamHI 3' 5'-CCCTTAAATGTTGTCGAG-3'
2 BamHI 5' 5'-CTTCAAAATGATTGGATC-3'
PacI 3' 5'-ATCGAGGGTGAGAGAATG-3'
3 PacI 5' 5'-AGTGAGCGAGTTTCATGC-3'
BglⅡ 3' 5'-AGTGAGCACACAACACCC-3'
4 BglⅡ 5' 5'-AACTGAAGATCTCAAGAA-3'
SpeI 3' 5'-CCACCTGGCAGAGAGGTGGAG -3'
5 SpeI 5' 5'-GGCTTACTCTTTGTTCCTCGTG -3'
ClaI 3' 5'-TAGCTCTGAGTGCATTTG-3'
6 ClaI 5' 5'-TTGCGATCATCATCGATT-3'
NcoI 3' 5'-CTCAAACAGCTTTGCCGG-3'
7 NcoI 5' 5'-CATGCAGATCCATGGCTT-3'
SalI 3' 5'-AATATTTGGGGACGTGCC-3'
8 SalI 5' 5'-CTTGAATACAAACCAAGC-3'
polyA-KpnI 3' 5'-GGGGTACCT(30)GTCTCTCTCATGCCAAC-3'
4-2. CaMV 35S 프로모터를 가지는 PepMoV - Vb1 의 전장 cDNA 카피
플라스미드 p35SPepMoV-Vb1는 CaMV 35S 프로모터, 완전한 PepMoV-Vb1 DNA 및 폴리 (A) 30 트랙을 포함한다. 우선, CaMV 35S 프로모터 및 PepMoV-Vb1의 5'-부위 (1-1393 nt)를 SphI 35S pro 5'과 35S pro 3' 또는 35S pro-end 5'과 BamHI PepMoV 3' 프라이머 세트를 이용하는 PCR로 융합시키고, 융합된 PCR 산물(PepMoV-Vb1/5'SphI-BamHI)을 SphI-BamHI으로 절단하였다. 35SPepMoV-Vb1 벡터를 구축하기 위한 백본을 얻기 위하여 플라스미드 pBS/SK2(-)(홋카이도 대학의 I. Uyeda 박사로부터 제공받음)에서 BamHI 및 SphI 위치를 제외한 멀티플-클로닝 위치를 결손시켰다. 이어, 상기 단편을 변형된 pBS/SK2(-)에 도입시켰다. 그런 다음, KpnI-NcoI-PstI 링커를 pPepMoV-Vb1/SphI-BamHI의 BamHI 위치에 삽입하고 KpnI-NcoI PepMoV-Vb1(폴리(A)30을 포함하는 7305-9670 nt)의 부위를 pPepMoV-Vb1/5'SphIBamHI-NcoIKpnI3'에 삽입시켰다. 최종적으로, PepMoV-Vb1 의 BamHI-NcoI (1393-7305 nt) 부위를 pPepMoV-Vb1/5'Sph IBamHI-NcoIKpnI3'에 삽입시켜 PepMoV-Vb1의 전장 컨스트럭트를 완성하였다. 이 클론을 “p35SPepMoV-Vb1”으로 명명하였다(도 2).
5. pSP6PepMoV - Vb1 에 기초한 GFP 발현 벡터의 구축
GFP cDNA를 turboGFP 벡터(Evrogen, 러시아)로부터 PCR-증폭하고, pSP6PepMoV-Vb1에 도입하여 GFP의 오픈리딩 프레임이 NIb 및 CP의 코딩 서열 사이에 인-프레임으로 위치하도록 하여, 재조합 플라스미드 pSP6PepMoV-Vb1/GFP를 얻었다. 5' turboGFP (5'-ATGGAGAGCGACGAGAGC-3') 및 3' turboGFP (5'-TTCTTCACCGGCATCTGC-3') 프라이머 세트를 이용하여 GFP를 클로닝 하였다. NIa 프로테아제 절단위치는 GFP 및 CP 사이에 도입하였다. pSP6PepMoV-Vb1/GFP를 구축하기 위한 프라이머는 표 2에 정리되어 있다.
pSP6PepMoV-Vb1/GFP를 제조하기 위하여, NIb-GFP, GFP 및 GFP-CP 프라이머를 이용하여 PCR 단편을 얻었다. NIb-GFP 및 GFP-CP의 PCR 단편은, 각각 오버래핑된 NIb의 3'-부위 및 GFP의 5'-부위, 또는 중복된 GFP의 3'-부위 및 CP의 5'-부위가 되도록 디자인 된 것이다. turboGFP에 융합된 NIb의 3'-부위의 DNA 단편은, 프라이머 Nco I-5' 및 NIbGFP3'으로 처음 증폭되었고(도 3, A-I), 이어 NIb::GFP에 융합된 CP의 5‘-부위의 DNA 단편은 GFPCP 5' 및 PepMoV-Sac I 3'의 프라이머쌍을 이용하여 증폭되었다(도 3, A-Ⅲ). NIb-GFP 및 GFP-CP 유전자를, 각각 프라이머 Nco I-5'와 CPGFP3'(도 3, A-I::Ⅱ) 또는 Nco I-5'와 polyA-Sac Ⅱ3'(도 3, A-I::Ⅱ::Ⅲ)를 이용하여 증폭하였다. GFP 유전자를 NIbGFP 5' 및 GFPCP 3'를 이용하여 증폭하였다(도 3, A-Ⅲ). 최종적으로, 융합 PCR 산물을 pGEM T-Easy 벡터에 클로닝 하였다(도 3, B). 연결부위 및 삽입 서열을 시퀀싱으로 확인하였다. NIb::GFP::CP 단편을 EcoNI-SalI으로 절단하고, EcoNI-SalI으로 처리된 pSP6PepMoV-Vb1에 연결하여, 재조합 플라스미드 pSP6PepMoV-Vb1/GFP을 제조한 후 E. coil XL10-Gold에서 증폭하고 유지시켰으며, 이를 “PepMoV-Vb1/GFP”라 명명 하였다(도 3, C).
SP6PepMoV-Vb1/GFP 구축을 위한 융합 PCR에 이용된 프라이머
단편 프라이머 프라이머 서열
I Nco I-5' 5'-CATGCAGATCCATGGCTT-3'
NIbGFP3' 5'-CTCGTCGCTCTCCATGCTGCTCTGATGATGAACTTC-3'
Ⅱ NIbGFP5' 5'-GTTCATCAGAGCAGCATGGAGAGCGACGAGAGCGG-3'
CPGFP3' 5'-GATGAACTTCATATTCTTCACCGGCATCTGCATCCCG-3'
Ⅲ GFPCP5' 5'-GATGCCGGTGAAGAATATGAAGTTCATCATCAGAGCAG-3'
polyA-SacⅡ3' 5'-GAGACCGCGGT15GTCTCTCTCATGCCAACTACG-3'
I::Ⅱ Nco I-5' 5'-CATGCAGATCCATGGCTT-3'
CPGFP3' 5'-GATGAACTTCATATTCTTCACCGGCATCTGCATCCCG-3'
I::Ⅱ::Ⅲ Nco I-5' 5'-CATGCAGATCCATGGCTT-3'
polyA-SacⅡ3' 5'-GAGACCGCGG T15GTCTCTCTCATGCCAACTACG-3'
GFP TurboGFP5' 5'-ATGGAGAGCGACGAGAGC-3'
TurboGFP3' 5'-TTCTTCACCGGCATCTGC-3'
CP PepMoV-CP5' 5'-AGCGCTCAAGCTCAGACAC-3'
PepMoV-CP3' 5'-CATATTTCTGACCCCAAGCAG-3'
VPg PepMoV-VPg5' 5'-GCTCTAGAGGACGCTCTAAGACG-3'
PepMoV-VPg5' 5'-GGGGTACCTTCGTGCTTCACAAC-3'
NAT1 NAT5' 5'-GAGCAGCTCAAGATCAGACACATTGGACGCTGAAGAGGAGAAAAAG-3'
NAT2 NAT3' 5'-GTGGCTACTTCTTTATTTTTCTTTTTCTCCTCTTCAGCGTCCAATGTGTC-3'
6. pSP6PepMoV - Vb1 and pSP6PepMoV - Vb1 / GFP 의 감염성에 대한 평가
6-1. 인 비트로 전사 및 감염성 시험
pSP6PepMoV-Vb1 및 pSP6PepMoV-Vb1/GFP 의 전장 cDNA 클론을 SacⅡ로 선형화 하고, 이를 주형으로 이용하여 인 비트로 전사 하였다. 인 비트로 전사 반응을 다음을 포함하는 50 ㎕ 반응액에서 실시하였다: 10 mM DTT, 5 mM rATP, 5 mM rCTP, 5 mM rUTP, 0.5 mM rGTP, 0.5 mM 캡 유사체 (m7GpppG), 20 유닛 SP6 RNA 중합효소, 1 유닛 RNase 억제제 (TAKARA, Japan) 및 1 ㎍ SacⅡ-선형화 플라스미드 DNA. 37℃에서 15분 동안 반응시킨 후, 5 ㎕ 5 mM rGTP를 첨가하고 추가적으로 1시간 동안 반응시켰다. pSP6PepMoV-Vb1 및 pSP6PepMoV-Vb1/GFP의 감염성 시험을 하기 위하여, N. benthamiana 식물체가 5주령이 되었을 때 첫 번째 본엽에 접종하였다. 인 비트로 전사체에 의한 접종은, SacⅡ로 선형화되고 SP6 RNA 중합효소 얻어진 pSP6PepMoV-Vb1 및 pSP6PepMoV-Vb1/GFP의 전사체를 가지고 실시하였다. 5개 이상의 독립된 실험을 동일한 조건 하에서 실시하였다. 증상을 나타내는 식물체에 대하여 PepMoV-Vb1-코딩된 RNA 또는 단백질 및 GFP가 축적되었는지 여부를 RT-PCR, 웨스턴 블롯팅 및 GFP 형광 모니터링으로 분석하였다.
6-2. 역전사 -중합효소 연쇄 반응( RT - PCR )
RT-PCR을 실시하여, 시험된 숙주에서 PepMoV-Vb1 감염이 발생하였는지 여부를 확인하였다. 페놀/클로로포름 방법을 이용하여 감염된 식물로부터 총 핵산을 추출하고 이를 주형으로 이용하였다. RT를 다음을 포함하는 20 ㎕ 반응 혼합물을 이용하여 42℃에서 60분 동안 실시하였다: 2.5 mM MgCl2, 0.5 mM dNTPs, 1 ㎕ 50 pM 역방향 프라이머, 1 x 완충액, 1 유닛 RNase 억제제 및 2.5 유닛 MuLV 역전사효소(Qbiogene, France). PCR은 다음을 포함하는 50 ㎕ 반응혼합물에서 실시하였다. 합성 cDNA, 1 x 완충액, 2.5 mM MgCl2, 0.04 unit Ex-Taq 중합효소(TAKARA, Japan) 및 1 ㎕ 50 pM 프라이머. CP, VPg 및 삽입된 전체 GFP를 검출하기 위하여 상기 표 2의 프라이머를 이용하였다.
재조합 PepMoV-Vb1 RNA 또는 다른 위치에 있는 GFP 서열인지를 구별하기 위하여, 본 발명자들은 프라이머쌍 NcoI 5' 및 SalI 3'(표 1)을 이용하였다. 이 것은 도 4에 나타나 있는 NIb 시스트론(뉴클레오타이드 7295-7312)의 3'부위 및 CP 시스트론(뉴클레오타이드 8937-8954)의 5'부위에 해당하는 것이다.
6-3. 웨스턴 블롯 분석
웨스턴 블롯 분석을 하기 위하여, 단백질 시료를 SDS-폴리아크릴아마이드 젤에서 분리하고 전기전이 장치(Bio-Rad, USA)를 이용하여 전기-블롯팅 방식으로 NC 막에 전이시켰다. TBST 완충액(20 mM Tris (pH 7.5), 150 mM NaCl, 및 0.1 % Tween 20)으로 막을 3회 세척한 다음, 5% 비지방 건유로 1시간 동안 블록킹 하였다. 이어, PepMoV-CP 또는 turboGFP에 대한 항체(1:1,000 희석; IgG 분획; 1 mg/ml)로 막을 프로빙 하였다. 막을 TBST 완충액으로 3회 세척한 다음, 알칼라인 포스파타아제(AP)-접합 이차항체(1:7,500 희석; Promega, USA)와 반응시켰다. 막을 TBST 완충액으로 3회 세척하고, AP-기질 완충액[0.1 M Tris (pH 9.5), 100 mM NaCl 및 50 mM MgCl2]으로 다시 세척하였다. 항체-특이 단백질을 가시화하기 위하여, AP-기질 용액(Western Blue Stabilized Substrate Solution, Promega, USA)과 막을 반응시킨 다음, 발색 반응을 0.05 M EDTA 용액으로 종결시켰다.
6-4. GFP 형광의 검출
GFP 특이파장을 가지는 UV 광의 조사하에서 그리고 형광현미경(Leica, epifluorescence microscope; Leica, Solms, Germany)를 이용하여 접종된 잎 및 상부 비접종된 잎에서의 GFP 발현을 모니터링 하였다. GPF 발현 식물체 및 식물조직을 Nikon 디지탈 카메라(D-70)로 촬영하였다.
7. pSP6PepMoV - Vb1 / GFP 의 안정성 및 패시지 실험
전신적으로 감염된 식물 조직으로부터 재조합체의 연속적인 패시지를 실시함으로써 pSP6PepMoV-Vb1/GFP의 안정성을 평가하였다. N. benthamiana의 감염된 식물체에서 재조합체 자손 바이러스를 7일 간격으로 기계적으로 건강한 식물체에 옮겼다. 몇 회의 패시지 후, GFP 또는 CP 항혈청 및 적합한 프라이머쌍을 이용하여, 시험된 숙주 식물체로부터 수집한 잎에 대하여 웨스턴 블롯팅 및 RT-PCR을 실시하였다. 추가적인 분석을 위하여, pSP6PepMoV-Vb1/GFP로부터 바이러스의 게놈 또는 GFP의 이스케이프의 가능한 결손, 그리고 자손-감염된 숙주에 대한 RT-PCR 분석을 실시하였다.
8. pSP6PepMoV - Vb1 / GFP 에 기초한 NAT ( Non - Aphid Transmission ) 벡터의 구축
pSP6PepMoV-Vb1/GFP-NAT를 위한 특정부위 돌연변이 유도는 돌연변이 유도 키트 (Stratagene, USA)를 이용하여 진행하였다. pSP6PepMoV-Vb1/GFP를 주형으로 NAT5'와 NAT3' 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하여 얻어진 PCR 산물을 Dpn I으로 처리하여 돌연변이가 일어나지 않은 pSP6PepMoV-Vb1/GFP 주형을 제거하고 XL1-Blue 대장균에 형질전환 하였다. 염기서열 분석을 통하여 DAG에서 G가 E로 치환된 것을 확인 한 후 획득된 pSP6PepMoV-Vb1/GFP-NAT에서 PCR 오류로 인한 감염성의 손실이나 다른 문제점을 배제하기 위해 NcoI-5'와 polyA-SacⅡ3' 프라이머로 증폭한 부위를 pGEM T-Easy 벡터에 클로닝하고 재차 염기서열을 확인한 후 EcoNI-SalI으로 절단하고, EcoNI-SalI으로 처리된 pSP6PepMoV-Vb1/GFP에 연결하여, 재조합 플라스미드 pSP6PepMoV-Vb1/GFP-NAT를 구축하였다. 이것을 E. coil XL10-Gold에서 증폭하고 유지시켰으며, 최종적으로 이를 “PepMoV-Vb1/GFP-NAT”라 명명하였다(도 5).
9. 진딧물 전염성 분석
진딧물을 사육하고 다루는 과정 및 식물을 분석하는 과정은 기존에 보고된 방법에 따라 진행하였다(Atreya, D. D., Raccah, B. and Pirone, T. P. Virology 178:161-165(1990)). 목화진딧물과 복숭아혹진딧물의 무시성충을 이용하여 바이러스 매개 검정 실험을 수행하였다. 진딧물에 의한 매개 전이 비교를 위한 접종 전 2시간 동안 진딧물을 절식시키기 위해 식물로부터 격리하고, 이 진딧물을 pSP6PepMoV-Vb1/GFP-NAT 전사체가 감염된 고추 및 담배 식물체에서 15분간 흡즙(acquisition access period)시켰다. 이후 진딧물을 취해 건전 식물에 옮겨 1시간동안 접종하였다(inoculation access period). 이 때 진딧물의 오염 및 정확한 결과를 얻기 위해 전용 배양시스템을 이용하였고, 식물체는 배양실에 두고 증상을 관찰하였다 (도 25).
실험 결과
1. PepMoV - Vb1 의 완전한 뉴클레오타이드 서열
PepMoV-Vb의 감염성 전장 cDNA 클론을 구축하기 위하여, 도 6에 기재된 바와 같이 PepMoV-Vb 게놈을 독특한 제한효소 위치를 갖는 오버랩핑된 단편들로 RT-PCR로 분할하였다. 전체 게놈을 나타내는 8개의 PCR 산물을 합성하였고, 각각의 PCR 산물을 pGEM-T Easy 벡터 시스템(Promega, U.S.A.)에 클로닝 하였다(도 7). 각각의 클론을 시퀀싱 하였고, PepMoV-Vb의 전체 게놈 RNA 서열을 PepMoV-Vb 서열에 기초하여 어셈블링 하였다. 모든 프라이머들은 PepMoV-Vb 서열(GenBank/EMBL/DDBJ accession No.AB126033)에 기초하여 디자인 하였다. PCR 단편들의 완전한 뉴클레오타이드 서열은 PepMoV-Vb와 일치하지 않았다. 이에, 본 발명자들은 어셈블링된 전장 PepMoV-Vb을 “PepMoV-Vb1”으로 명명하였다. PCR 증폭 및 cDNA 클론의 시퀀싱에 이용된 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 표 1에 기재되어 있다.
PepMoV-Vb1의 게놈은 9,640 뉴클레오타이드의 길이를 가지며, 5'-말단에 여분의 구아노신 잔기가 있고, 3'-말단에는 폴리(A)15 트랙이 있다. 게놈 RNA는 하나의 거대한 ORF를 인코딩하며, 이는 349 kDa (3068 aa)의 폴리단백질을 코딩하는 것이고, 이는 포티바이러스의 전형적인 게놈 구조이다. ORF는 위치 168-170에 있는 AUG 시작 코돈으로부터 시작하여 위치 9372-9374에 있는 UGA 종결코돈으로 종결된다. 5'- 및 3' NTR은 각각 168 뉴클레오타이드 및 267 뉴클레오타이드로 이루어져 있다. PepMoV-Vb1의 5' NTR은 두 개의 보존성 서열 블록을 포함하며, 이는 포티바이러스에서 박스 “a" 및 ”b"로 언급되는 것이다. 박스 a (AUACAACAU) 및 b (UCAAGCAU)는 PepMoV-Vb1에서 5'-말단에서 검출되었다. 이들 서열 및 이차구조는 캡시드화, 해독 또는 복제 과정과 같은 과정들에서 중요한 역할을 한다(Riechmann et al., 1992).
PepMoV-Vb1은 9개의 잠재적 절단 위치를 가지며, PepMoV-Vb1의 게놈 구성은 하기 표 3에 정리되어 있다.
PepMoV-Vb1 폴리단백질의 예측되는 절단위치의 아미노산 잔기의 위치 및 절단위치에 인접한 아미노산 서열
연결부 아미노산 위치 프로테아제
P6 P5 P4 P3 P2 P1 P'1 P'2 P'3
P1/HC-Pro L H M E Q Y S T S P1-Pro
HC-Pro/P3 K H Y R V G G T V HC-Pro
P3/6K1 K Q V I H Q R S T NIa-Pro
6K1/CI S E V R H Q S L D NIa-Pro
CI/6K2 Q F V H H Q S K S NIa-Pro
6K2/VPg S E V S H Q G R S NIa-Pro
VPg/NIa E V V K H E A K T NIa-Pro
NIa/NIb E C V R E Q A H T NIa-Pro
NIb/CP Y E V H H Q S S S NIa-Pro
P1의 C-말단에 있는 절단위치는 다이펩타이드 Y/S (287-288 aa)에 있으며, HC-Pro/P3 절단위치는 G/G 다이펩타이드(743-744 aa)에 위치해 있다. 나머지 7개의 프로테아제 인식위치는 NIa-Pro 다이펩타이드 Q/R (1104-11-5 aa), Q/S (1156-1157, 1790-1791, 2795-2796 aa), E/A (2030-2031 aa),Q/G (1842-1843) 및 Q/A (2276-2277 aa)이며, 이는 다른 포티바이러스 게놈에서도 발견되는 것이다. PepMoV-Vb1의 모든 절단위치는 다른 공지의 PepMoV 분리물들과 동일하였다.
또한, 포티바이러스의 기능적 모티브에 있는 몇 개의 보존성 아미노산 잔기들은 PepMoV-Vb1 폴리단백질에서 검출 되었다. PI의 FIVRG 모티프 (259-263 aa)는 단백질분해성 도메인으로 발표된 바가 있다. CCCTT 모티프 (577-581 aa) 및 LAIGN 모티프 (533-537 aa)는 PepMoV-Vb1의 HC-Pro에 있으며, 이는 각각 바이러스 장거리 이동 및 세포 대 세포 이동에 관여하는 것으로 판단된다. 보존성 뉴클레오타이드-결합 모티프 VGSGKST (1243-1249 aa) 및 RNA 헬리카아제 모티프 DECH (1330-1333 aa)는 게놈의 CI에서 발견되었다. 포지티브-가닥 바이러스의 보존성 RNA-의존 RNA 중합효소 모티프, CDADGS (2521-2526 aa) 및 SGC35X3NTX30GDD (2586-2629 aa)는 게놈의 NIb에서 발견되었다. 진딧물(aphid) 전이에 관여하는 것으로 알려져 있는 모티프들, KLTC (337-340aa), PTK (595-597 aa), FRNK (466-469 aa) 및 DAG (2804-2896 aa)는 PepMoV-Vb1의 HC-Pro 및 CP에서 발견되었다. CP 시스트론은 아미노산 모티프, RX43D (2958-3002 aa)을 포함하며, 이는 바이러스 장거리 이동에 필요한 것이다.
2. 염기서열 비교 분석 및 PepMoV - Vb1 의 계통학적 분석
PepMoV-Vb1의 완전한 서열은 다른 PepMoV 분리물들, PepMoV-Vb (99.3%), PepMoV-C (94.9%) 및 PepMoV-FL (94.0%)와 뉴클레오타이드 수준에서 높은 서열 상동성을 나타내었고, PepMoV-Vb1 폴리단백질 아미노산 서열도 PepMoV-Vb (98.7 %), PepMoV-C (95.8 %) 및 PepMoV-FL (95.9 %)와 높은 상동성을 나타내었다. 표 4는, 가지과 식물(Solanaceous species)에 감염되는 포티바이러스의 단백질에 대한 PepMoV-Vb1 기능 단백질들의 아미노산 상동성을 보여준다. 전체 PepMoV-Vb와 PepMoV 분리물들 사이의 아미노산 상동성은 98.7% (Vb1) 내지 95.8% (PepMoV-C)이고, 다른 포티바이러스와의 상동성은 66.8% (PTV) 내지 44.1% (ChiVMV 및 PSbMV)이다.
연역추론된 아미노산 서열의 멀티플 얼라인먼트는, P1이 매우 변화가 많다는 것을 보여준다. 가장 높은 상동성은 PepMoV, Vb (93.7%), C (87.8%) 및 FL (85.0%) 분리물들 사이에서 발견되었고, 다른 포티바이러스와의 상동성은 13.5%(PSbMV) 및 35.1%(PTV) 이었다. PepMoV-Vb1 CP는 분리물 Vb (99.3%), C (98.2%) 및 FL (97.1%)와 가장 높은 상동성을 나타내었고, 이어 ChiVMV, PTV 및 PVY와 높은 상동성을 나타내었다. PepMoV-Vb1-CP 사이의 전체 상동성은 TVMV의 CP(55.9%)와 가장 낮은 상동성을 나타내었다. P1 및 CP 단백질의 N-말단 부위는 길이와 아미노산 서열의 측면에서 변화가 많은 포티바이러스 단백질이다.
PepMoV-Vb1의 가지과 식물-감염 포티바이러스와의 서열 상동성
바이러스 P1 HC-Pro P3 6K1 CI 6K2 VPg NIa-Pro NIb CP 폴리
단백질
ChiVMV 14.7 46.9 19.4 38.5 49.6 52.0 50.0 46.9 58.5 73.4 44.1
PepMoV-Vb 93.7 98.2 99.2 100.0 98.9 100 99.5 98.8 99.2 99.3 98.7
PepMoV-C 87.8 97.4 96.6 98.1 97.3 98.0 96.3 97.6 91.8 98.2 95.8
PepMoV-FL 85.0 94.2 96.4 98.1 98.4 100.0 94.1 97.6 97.1 97.1 95.9
PepSMV 25.4 61.6 32.8 63.5 68.1 62.7 71.3 70.0 75.5 72.0 60.6
PSbMV 13.5 45.6 18.2 34.6 52.9 37.3 48.6 43.8 59.4 57.4 44.1
PTV 35.1 66.1 40.7 76.9 76.5 66.7 79.8 75.1 78.4 73.4 66.8
PVA 24.4 47.6 25.5 38.5 53.3 39.2 48.7 51.2 58.0 57.9 46.6
PVMV 17.5 47.9 20.0 40.4 51.3 52.9 49.5 50.6 59.9 60.5 45.6
PVV 34.4 59.3 42.4 78.8 76.7 68.6 78.7 71.4 77.9 69.7 65.5
PVY 32.7 63.7 34.4 67.3 69.8 54.9 69.1 65.0 73.4 74.3 61.4
TEV 18.7 47.0 27.3 48.1 55.1 49.0 53.2 47.4 60.0 60.2 46.8
TVMV 22.9 46.7 24.1 51.9 52.9 39.2 45.3 43.8 63.7 55.9 46.3
WPMV 40.0 65.2 43.8 76.9 74.4 68.6 80.3 71.8 77.9 73.4 66.7
PepMoV-Vb1의 진화수 및 계통학적 관계를 연구하기 위하여, P1, CP 및 전체 폴리단백질의 10개의 기능 단백질들의 아미노산 서열을 가지식물-감염 포티바이러스와 비교하였다. PepMoV-Vb1은, 종래에 발표된 바가 있는 PepMoV-Vb, PepMoV-C 및 PepMoV-FL와 높은 상동성을 나타내었다. 따라서, PepMoV-Vb1 분리물은 PepMoV-Vb, PepMoV-C 및 PepMoV-FL와 그룹핑 되었다(도 8).
3. PepMoV - Vb1 의 전장 cDNA 의 클로닝
감염성 전장 cDNA 클론을 생성하기 위하여, KpnI-SP6 5' 및 polyA-Sac Ⅱ 3' 프라이머 세트를 이용하여 RT-PCR을 실시하였다. 비록 본 발명자들은, 롱 템플레티이트 RT-PCR 시스템에 의한 9.6 kb의 PepMoV-Vb 전장 cDNA 카피를 증폭하였지만(도 9), 가상의 전장 PCR 산물의 직접적인 클로닝은 매우 힘든 작업이었다. 따라서 바이러스 게놈의 독성을 회피하기 위한 전략을 수립하였다. SP6 RNA 프로모터를 가지는 PepMoV-Vb1의 전장 cDNA 클론을 구축하기 위한 과정은 도 4에 나타나 있다. pSP6PepMoV-Vb1은 PepMoV-Vb1에 기초한 것이다. CI 시스트론 내의 독특한 효소위치를 이용하여, PepMoV-Vb1 게놈을 두 부분으로 분할 하였다. CI 부위에 있는 독특한 SpeI 제한효소 위치를, 서브클로닝 과정에서 PepMoV-Vb1의 오버랩핑된 두 부분을 연결하는 데 이용하였다. 5' 부위의 부분적 클론(pPepMoV-Vb1-N)은 SP6 RNA 프로모터를 포함하며 바이러스 게놈의 4531 위치까지 해당되는 것이다. SpeI 5' 및 polyA-SacⅡ 3' 프라이머쌍을 이용하여 오버랩핑 C-말단 PepMoV-Vb1 단편을 제1쇄 cDNA로부터 증폭하였다. SpeI 및 SacⅡ 제한효소 위치를 이용하여 C-말단 RT-PCR 단편을 pPepMoV-Vb1-N에 삽입시켰다. 최종적으로, SP6 RNA 프로모터가 앞에 위치하여 있고 PepMoV-Vb 게놈의 1-4437를 포함하는 SpeI- SacⅡ 절단된 pSKPepMoV-Vb-N 및 SpeI SacⅡ RT-PCR 단편 (PepMoV-Vb1의 4437-9640 nt)을 연결하여, 15 잔기의 poly (A) 테일을 가지는 PepMoV-Vb1 전장 cDNA 클론을 구축하였다(도 10). 본 발명자들은 SP6 RNA 프로모터에 의해 조절되는 PepMoV-Vb1 전장 cDNA 클론을 “pSP6PepMoV-Vb1”으로 명명하였다. 제한효소 BamHI, ClaI, EcoRV, PstI, SacI, SalI, SpeI, XbaI 및 XhoI과 pPepMoV-Vb1을 이용하여 RFLP 분석을 실시하였다. 전장 클론의 RFLP 패턴은 PepMoV-Vb1의 전체 뉴클레오타이드 서열과 일치하였다(도 11).
서열정보에 기초하여, CaMV 35S 프로모터의 조절을 받는 클론의 어셈블리를 제작하기 위한 전략을 수립하였다(도 6). 도 6은 CaMV 35S 프로모터의 조절 하에 있는 전장 cDNA 클론을 포함하는 플라스미드의 구축 과정을 보여준다. 본 발명자들은 CaMV 35S 프로모터의 조절 하에 있는 전장 cDNA 클론을 “p35SPepMoV-Vb1”이라 명명하였다. 제한효소 SphI/PstI, EcoRV 및 PstI으로 p35SPepMoV-Vb1에 대하여 RFLP 분석을 실시하였다. 전장 클론의 RFLP 패턴은 PepMoV-Vb1의 전체 뉴클레오타이드 서열과 동일하였다. 그리고, 프라이머 35S pro 5' 및 BamHI 3'를 이용하여 p35SPepMoV-Vb1에 대하여 RT-PCR을 실시하였다(도 12). 기계적 접종 방식으로, 10개의 선택된 구축물의 감염성을 N. benthamiana에 대하여 평가하였다. 플라스미드 p35SpepMoV-Vb1는 기계적 접종 방식으로 N. benthamiana에 감염되지 않았다. 감염 실험을 20개 이상의 N. benthamiana에 대하여 10회 반복하였으나, 여전히 감염성을 나타내지 않았다.
4. 인 비트로 감염성 SP6PepMoV - Vb1 클론의 감염능 분석
SP6PepMoV-Vb1 클론의 감염능을 분석하기 위하여, SacⅡ-절단 전장 cDNA 클론을 인 비트로 전사의 주형으로 이용하였다. 인 비트로 전사-생성된 캡핑된 pPepMoV-Vb1 및 PepMoV-Vb1의 전장 PCR 산물을, 기계적 접종 방법으로 N. benthamiana에 감염시켰다(도 13). pPepMoV-Vb1 전장 클론은 전신적으로 감염성을 나타내었으나, PCR-지시 인 비트로 전사체는 N. benthamiana에 감염되지 않았다. 증상은 PepMoV-Vb/Sap에 의한 감염 개시보다 조금 빠르게(1일 또는 2일) 3-5 dpi(days post-inoculation) (온실 조건에 의존함)를 유도하였다. SP6PepMoV-Vb1로 접종된 N. benthamiana의 초기 증상은 4 dpi에서 상부 잎에서 심각한 엽맥투화를 나타내었다. N. benthamiana의 상부 잎에서 pSP6PepMoV-Vb1 및 PepMoV-Vb 사이에 증상의 차이는 없었다. PepMoV-Vb1의 인 비트로 전사체는 N. benthamiana에 대하여 전형적인 엽맥녹대, 심각한 모자이크 증상, 잎 기형, 잎 변형 및 황화 현상을 나타내었다(도 14).
5. SP6PepMoV - Vb1 클론의 감염성 확인
pSP6PepMoV-Vb1의 감염성을 확인하기 위하여, pSP6PepMoV-Vb1의 인 비트로 전사를 반복적으로 여러번 실시하고 각각의 전사체를 N. benthamiana 식물체에 접종시켰다. pSP6PepMoV-Vb1 접종된 N. benthamiana에 대하여 RT-PCR (도 15A) 분석을 하고 웨스턴 블롯팅 (도 15B) 분석을 실시하였으며, 이 경우 PepMoV-CP 특이 프라이머 및 PepMoV-Vb에 대한 항혈청을 사용하여 바이러스의 감염성을 검증하였다. PepMoV-CP의 기대되는 크기에 해당하는 RT-PCR 산물 및 단백질이 pSP6PepMoV-Vb1-감염 잎 조직에서 검출되었다. 모크-처리된 (무처리된) 식물체 시료에서는 시그널이 검출되지 않았다 (도 15).
또한, SP6PepMoV-Vb1의 인 비트로 전사체로 접종되어 바이러스 감염 증상을 나타내는 N. benthamiana 식물체를 N. benthamiana 및 고추 식물체들의 새로운 세트를 감염시키기 위한 접종원으로 이용하였다. 고추 식물체에서 pSP6PepMoV-Vb1의 감염성을 확인하기 위하여, 감염된 N. benthamiana의 잎 조직으로부터 얻은 크루드 샙(crude sap)을 ECW 고추에 접종하였다. 3 및 4 dpi의 SP6PepMoV-Vb1으로부터 얻은 크루드 샙으로 접종한 N. benthamiana뿐만 아니라 고추 식물체에서도 PepMoV-Vb 감염의 전형적인 증상들이 나타났다. 접종 약 12일 이후에 고추의 상부 잎에서 심각한 모자이크 증상 및 기형 증상을 나타내었다 (도15B). 고추 식물체에서, 상기 바이러스는 전형적인 반점, 심각한 모자이크 증상 및 잎 변형을 야기하였다(도 16D, 도 16F 및 도 16H). 이 시험을, 5개 이상의 N. benthamiana 식물체에 대하여 반복적으로 실시하였으며, SP6PepMoV-Vb1의 감염성은 계속적으로 유지되었다. 모든 식물체에 대하여 PepMoV-CP (도 17A) 또는 PepMoV-VPg (도 17B)의 특이적 프라이머쌍으로 RT-PCR 분석을 실시하였으며, 또한 PepMoV-Vb에 대한 항혈청으로 웨스턴 블롯팅 분석을 실시하여, N. benthamiana의 접종된 잎 및 비접종된 상부 잎에서 바이러스의 감염을 확인하였다. SP6PepMoV-Vb1로부터 유래된 인 비트로 전사체로 감염된 식물체에 대하여 면역블롯팅 분석을 실시하였으며, PepMoV의 CP에 해당하는 30 kDa 단백질이 검출되었다(도 17C). 본 발명은 고추 식물체로부터 분리된 PepMoV의 감염성 전장 cDNA 클로닝에 대한 첫 번째 보고이다.
6. SP6PepMoV - Vb1 게놈에 기초한 신규한 바이러스 벡터의 구축
SP6PepMoV-Vb1의 고감염성 cDNA 클론을 바이러스 벡터로 개발하였다. pSP6PepMoV-Vb1/GFP는 PepMoV-Vb1의 게놈에 기초한 것으로, 구축 과정은 도 3에 나타나 있다. 2단계 융합 PCR 방법을 이용하여, pSP6PepMoV-Vb1의 NIb 및 CP 시스트론 사이에 녹색형광단백질을 인코딩하는 GFP 유전자 (turboGFP)를 삽입시켰다. 폴리단백질에 삽입된 GFP 서열 옆에는 바이러스 NIa 프로테아제에 의해 인식되는 절단위치(YEVHHQ/SS)가 놓여 있도록 하였다. 최종적으로, 융합 PCR 산물을 pGEM T-Easy 벡터에 클로닝하였다(도 3B). 2단계 융합 PCR 산물의 NIb::GFP::CP 단편을 EcoNI-SalI으로 얻고 EcoNI-SalI 처리된 pSP6PepMoV-Vb1에 연결하여, 최종적으로 재조합 플라스미드 pSP6PepMoV-Vb1/GFP를 얻었다.
7. pSP6PepMoV - Vb1 / GFP 에 의한 N. benthamiana 의 감염 및 GFP 유전자의 전신성 발현
GFP 유전자를 포함하고 SacⅡ-처리된 전장 cDNA 클론을 주형으로 이용하여 인 비트로 전사를 실시하였으며, 그 방법은 전술한 pSP6PepMoV-Vb1의 제작과정에서의 방법과 동일하다. pSP6PepMoV-Vb1/GFP 및 pSP6PepMoV-Vb1의 인 비트로 전사체를 N. benthamiana 식물체에 접종시켰다(도 18). 접종된 N. benthamiana 식물체는 4 dpi에서 GFP 형광을 나타내었으며, 이를 통하여 pSP6PepMoV-Vb1/GFP가 전신적으로 감염되었음을 알 수 있다(도 19). pSP6PepMoV-Vb1로 감염된 단백질에서는 녹색 형광이 검출되지 않았다. 증상들은 pSP6PepMoV-Vb1에 의해 유도된 증상들과 유사하였다. 이러한 결과는 pSP6PepMoV-Vb1/GFP가 감염성이 있음을 명확하게 보여준다. 전신적으로 감염된 잎은 심각한 모자이크 증상 및 잎 기형을 나타내었다(도 19). 또한, PepMoV-Vb1/GFP로 감염된 식물체로부터 바이러스 증상이 나타나기 전 3 dpi에서 UV 조사 하에서, 녹색 형광 시그널을 검출할 수 있었다. 점차적으로 형광 부위는 증가하였고, 엽맥을 따라 식물체 전체로 확대되었다 (도 19). 바이러스의 가시적 증상 출현보다 빠르게 GFP 발현을 검출할 수 있었다. GFP 형광은 N. benthamiana의 꽃과 뿌리 조직에서도 관찰할 수 있었다(도 20). 전신적으로 감염된 상부 잎으로부터 분리된 자손 바이러스로부터 RNA를 얻고 RT-PCR을 함으로써, 증상을 나타내는 조직에서 GFP 삽입을 분석하였다. 재조합 PepMoV-Vb1 RNA에서 PepMoV-CP, GFP 및 GFP 서열을 검출하기 위하여, RT-PCR에서 3종의 서로 상이한 프라이머 세트를 이용하였다. 기대되는 크기의 PCR 산물이 검출되었으며, 이는 재조합 바이러스 게놈에 GFP 서열이 안정되게 보존되어 있음을 보여준다(도 4). PepMoV-Vb1/GFP에 의해 전신적으로 감염된 N. benthamiana의 잎에 대하여, 웨스턴 블롯팅을 실시하였으며, 이 경우 항-PepMoV-Vb-CP 및 항-turboGFP (avrogen) 항체를 이용하였고, 실험 결과, 바이러스 프로테아제 NIa에 의해 바이러스 폴리단백질로부터 GFP이 정확하게 절단되어 나온다는 것과 따라서 식물체에서 GFP가 고발현되는 것을 확인하였다(도 21).
8. pSP6PepMoV - Vb1 / GFP 의 숙주 범위 연구
PepMoV-Vb1/GFP의 숙주 범위를 결정하기 위하여, C. amaranticolor , Solanum lycopersicon, N. tabacum cv. Xanthi-nc, N. tabacum cv. Samsun NN, N. tabacum cv. Samsun nn 및 Capsicum annuum 식물체를 pSP6PepMoV-Vb1/GFP로 기계적으로 감염시켰다. pSP6PepMoV-Vb1/GFP로부터 유래된 자손 바이러스로 식물체를 감염시켰다. 고추 식물체(C. annuum L.)을 pSP6PepMoV-Vb1/GFP 감염된 식물로부터 얻은 PepMoV-Vb1/GFP 자손 바이러스로 접종시켰다. 3 dpi에서 첫 번째 잎에서 형광 병변들이 나타났다. 3 dpi의 전신성 숙주 고추 식물체의 접종 잎에서 pSP6PepMoV-Vb1/GFP는 국소적인 원형 형광 사인을 유도하였다. 형광은 줄기를 따라 아래로 이동하였고, 상기 시그널들은 줄기 및 엽병을 따라 상부 엽맥쪽으로 퍼져 나갔다. 점진적으로, PepMoV-Vb1/GFP의 초기 감염에 의해 유도된 국소적 형광이 상부 잎에서도 나타났다. 최종적으로, pSP6PepMoV-Vb1/GFP에 의한 GFP 형광이 식물체 전체 부위에 전신적으로 나타났다. GFP 형광의 전신적 확대 동안, 국소적 원형 형광이 감염된 잎에서 검출되었다(도 22). pSP6PepMoV-Vb1/GFP는, 다른 숙주들에 대한 실험에서도 바이러스 자손을 생성하기 위한 숙주 시스템으로 이용될 수 있음을 알 수 있다. 원형 형광 사인은 엽맥을 따라 퍼져 나갔다(표 5).
SP6PepMoV-Vb1/GFP의 숙주 범위 및 병징학적 분석 결과
식물종 증상
접종된 잎 상부 잎
가시적 증상 형광 가시적 증상 형광
Nicotiana benthamiana - - sM, Mal, VB SF
N. tabacum cv. Xanthi-nc - CSF mM SF, CSF
N. tabacum cv. Samsun NN - CSF mM SF, CSF
N. tabacum cv. Samsun nn - CSF mM SF, CSF
Capsicum annuum L. P915 CSF sM, Mal SF
Capsicum annuum ECW CSF sM, Mal SF
Capsicum annuum Avelar - - - -
Solanum lycopersicon - - - -
Chenopodium amaranticolor - - - -
C. pepo cv. Black Beauty - - - -
mM, 약한 모자이크; sM, 심한 모자이크; Y, 황화; Mal, 기형; VB, 엽맥 녹대; CSF, 원반 형광; SF, 전신 형광; -, 비감염.
9. pSP6PepMoV - Vb1 / GFP 의 안정성 및 패시지 실험
GFP 유전자가 삽입된 벡터의 유전적 안정성을 보다 자세히 모니터링 하고, 활성 PepMoV-Vb1 재조합체에서 GFP의 구조적 운명을 이해하기 위하여, 초기 감염 및 그 이후의 패시지 후에, 숙주 식물체에 대하여 RT-PCR 분석을 실시하였다. 초기 감염 및 새로운 숙주들에게 활성 바이러스 자손을 연속적으로 트랜스-접종한 후에 pSP6PepMoV-Vb1/GFP 안정성을 시간의 경과에 따라 분석하였다. PepMoV-Vb1/GFP 자손은, N. benthamiana에 기계적 접종으로 7일째에 3회 이상 패시지하여 한달까지 패시징을 하였다. 각각의 패시지에서, 녹색형광 및 RT-PCR을 이용하여 재조합 바이러스의 존재 및 안정성을 모니터링 하였다. SP6PepMoV-Vb1/GFP 자손으로 접종된 N. benthamiana 식물체에서, 심각한 모자이크 및 잎 기형 병징이 어린 잎에서 계속적으로 관찰되었다. 이러한 병징 발현 증상은 SP6PepMoV-Vb1에 의한 증상을 보이는 식물체의 병징과 유사하였다. 삽입된 GFP는, 적어도 30 dpi 동안 SP6PepMoV-Vb1-기반 벡터에서 안정하였다(도 23). 야생형 바이러스와 비교하여 병징의 출현에서의 차이는 없었다. 또한, 발현 수준 및 안정성에서의 차이가 삽입 위치에 무관하게 관찰되지 않았다. 시험 기간 동안, 외래 유전자의 결실 및 탈출이 검출되지 않았다는 사실에 기초하여, pSP6PepMoV/GFP는 식물체의 생존 동안 매우 안정하다는 것을 알 수 있다. 따라서, 바이러스 게놈으로의 GFP의 삽입은 PepMoV-Vb1의 식물체 감염능력에 영향을 미치지 않는다는 결론을 내릴 수 있다.
본 발명은 GFP의 발현을 관찰할 수 있는 PepMoV 바이러스 벡터에 대한 첫 번째 개발이다.
10. SP6PepMoV - Vb1 / GFP - NAT 의 식물체 감염성 실험
SacII-처리된 SP6PepMoV-Vb1/GFP-NAT를 주형으로 이용하여 인 비트로 전사를 실시하였으며, N. benthamiana 식물체에 접종하였다. 상기 본 발명의 SP6PepMoV-Vb1/GFP 및 병징의 발현 및 진딧물 전이 유무를 비교 분석하기 위하여 SP6PepMoV-Vb1/GFP를 이용한 인 비트로 전사체를 또한 N. benthamiana 식물체에 접종하여 비교 분석하였다(도 24). GFP 발현 및 병징의 육안검정을 통해 SP6PepMoV-Vb1/GFP-NAT가 접종된 N. benthamiana 식물체는 SP6PepMoV-Vb1/GFP가 접종된 식물과 같은 양상으로 병징이 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 또한 GFP 발현은 잎조직, 줄기 부분에서 강하게 발현하며 상엽으로 이동하여 전신 감염되는 것을 확인하였다. 이는 새롭게 발명된 SP6PepMoV-Vb1/GFP-NAT가 바이러스 벡터로 이용될 수 있는 병원성을 보유하고 외래 유전자인 GFP를 발현하는데 응용될 수 있음을 제시한다.
11. pSP6PepMoV - Vb1 / GFP - NAT 벡터에 대한 진딧물 전염성 검정 분석
SP6PepMoV-Vb1/GFP-NAT의 진딧물에 의한 전염성 전이를 분석하기 위하여 SP6PepMoV-Vb1/GFP-NAT가 감염된 N. benthamiana에 목화진딧물과 복숭아혹진딧물의 무시성충을 이용하여 바이러스 매개 검정 실험을 수행하였다. 그 결과 진딧물에 의한 매개 유무를 리포터 단백질인 GFP의 발현을 이용해 분석하였고, 진딧물의 매개로 인한 GFP 발현이 관찰되지 않았다. 따라서 본 발명의 SP6PepMoV-Vb1/GFP-NAT 벡터는 종래의 고추모틀바이러스가 진딧물로 매개되는 문제점을 배제할 수 있는 가능성을 보여주며, 또한 본 발명의 SP6PepMoV-Vb1/GFP-NAT가 식물바이러스 벡터로서 응용 가치가 높음을 보여준다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
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도 2는 CaMV 35S 프로모터의 다운스트림에 있는 PepMoV-Vb1 RNA의 전장 cDNA 카피를 구축하기 위한 개략도이다. 최종 플라스미드를 “p35SPepMoV-Vb1”이라 명명하였고, 이는 PepMoV-Vb1 게놈의 완전한 DNA 카피를 나타낸다.
도 3은 pSP6PepMoV-Vb1/GFP의 구축 과정을 보여주는 개략도이다. GFP 유전자를 pSP6PepMoV-Vb1의 NIb 및 CP 시스트론 사이에 삽입시켰다. NIb/CP 인식 펩타이드를 NIb 및 CP 사이에 도입시켰다.
도 4는 pSP6PepMoV-Vb1/GFP로 감염된 N. benthamiana 식물체로부터 얻은 RNA의 RT-PCR 결과 사진 (A) 및 바이러스 게놈에서의 프라이머 위치(B)를 보여준다. PepMoV-Vb1-CP (~820 bp) 및 GFP (~700 bp)를 증폭하기 위하여 특이적 프라이머가 이용되었다. 프라이머는 서로 다른 크기의 PCR 산물이 생성되도록 디자인하였다.
도 5는 pSP6PepMoV-Vb1/GFP-NAT 벡터 제조 방법에 관한 개략도이다. 염기서열은 벡터 제조에 사용된 프라이머를 나타낸다.
도 6은 PepMoV-Vb1의 완전한 게놈 시퀀싱 전략을 보여 주는 개략도이다.
도 7은 PepMoV-Vb의 RT-PCR 산물이다.
도 8은 가지과 식물을 감염시키는 포티바이러스의 15종에 대한 계통학적 관계도이며 이는 완전한 폴리단백질(A), P1(B) 및 CP 서열(C)의 멀티플 얼라인먼트에 기초한 것이다.
도 9는 PepMoV-Vb1 cDNA의 추정 전장 RT-PCR 산물이다. M. 1 kb DNA 래더; F 및 화살표는 PCR 산물을 나타낸다.
도 10은 박테리오파아지 SP6 RNA 프로모터를 갖는 pSP6PepMoV-Vb1 벡터의 구축 과정 및 PepMoV-Vb의 RT-PCR 산물을 보여준다. N-PepMoV-Vb, N-말단 부위의 RT-PCR 산물(-4.4 kb); C-PepMoV-Vb, C-말단 부위의 RT-PCR 산물(-5.2 kb).
도 11은 pSP6PepMoV-Vb1의 전장 cDNA의 RFLP(restriction fragment length polymorphism) 패턴의 비교이며, 이는 PepMoV-Vb1의 뉴클레오타이드 서열에 기초한 것이다. 상부 패널; 제한효소 맵, 굵은 수평선, pSP6PepMoV-Vb1 전장 cDNA, 가는선, pBSSK(-)Ⅱ 벡터; 하부 패널, pSP6PepMoV-Vb1의 RFLP 패턴, M. 1 kb DNA 래더, 레인 1. 비절단, 2. EcoRI, 3. EcoRV, 4. PstI, 5. SacI, 6. SalI, 7. XbaI, 8. XhoI, 9. BamHI/ClaI, 10. SpeI/SalI.
도 12는 p35SPepMoV-Vb1의 추정 전장 cDNAs에 대한 RFLP(restriction fragment length polymorphism) 패턴의 비교이다. RT-PCR 분석 (A) 및 해당 제한효소 맵 또는 PCR 분석에 이용된 프라이머 위치 (B).
도 13은 pSP6PepMoV-Vb1의 인 비트로 전사 산물을 보여주는 1% 아가로스 젤. 레인 M, 1 kb DNA 래더; 레인 1, SP6PepMoV-Vb1의 전사체; 레인 2, 추정 전장 RT-PCR 산물로부터 유래된 전사체.
도 14은 야생형 PepMoV-Vb 및 pSP6PepMoV-Vb1의 인 비트로 전사체로 기계적으로 접종된 N. benthamiana에서의 증상을 보여주는 사진이다. 접종 후 5-14일째에 사진을 촬영하였다. A (5 dpi), C 및 E (10 dpi), PepMoV-Vb/Sap 감염된 식물 체 B (5 dpi), D 및 F (10 dpi), pSP6PepMoV-Vb1 감염된 식물체.
도 15는 pSP6PepMoV-Vb1 클론으로 감염된 N. benthamiana에 대한 RT-PCR(A) 및 웨스턴 블롯팅 (B) 분석 결과이다. 레인 1, 야생형 PepMoV-Vb으로 감염된 식물체의 잎 추출물; 레인 2, 네가티브 대조군으로서 건강한 식물체; 레인 3-9, pSP6PepMoV-Vb1의 인 비트로 전사체로 기계적으로 접종된 식물체의 잎 추출물; M, 1kb+ DNA 래더 및 단백질 마커. 실험은 2회 반복하였다.
도 16는 pSP6PepMoV-Vb1으로 접종된 C. annuum ECW에서의 증상을 보여주는 사진이다. 사진 A, C, E 및 G. 야생형 PepMoV-Vb/Sap; B, D, F 및 H. pSP6PepMoV-Vb1/sap.
도 17은 pSP6PepMoV-Vb1의 인 비트로 전사체로 접종된 N. benthamiana 식물체에 대한 바이러스-특이 유전자 또는 단백질의 검출 결과이다. N. benthamiana 식물체에 대한 pSP6PepMoV-Vb1의 감염성을 CT 프라이머(A) 및 VPg 특이 프라이머(B)를 이용하여 RT-PCR 분석 하였고, 또한 PepMoV-CP에 대한 항혈청으로 웨스턴 블롯팅 분석(C)을 하였다. 레인 1, pSP6PepMoV-Vb1으로 감염된 식물체의 접종 잎; 레인 2, pSP6PepMoV-Vb1으로 감염된 식물체의 전신성 상부 잎; 레인 3, PepMoV-Vb/Sap으로 감염된 식물체의 접종 잎; 레인 4, PepMoV-Vb/Sap으로 감염된 식물체의 전신성 상부 잎; 레인 5, 네가티브 대조군으로서 건강한 식물체. M, 1 kb+ DNA 래더 및 단백질 크기 마커.
도 18은 pSP6PepMoV-Vb1/GFP의 인 비트로 전사 생성물을 보여주는 1% 아가로스 젤 사진이다. M1, 1 kb+ DNA 래더 ~100ng; M2, 1 kb+ DNA 래더 ~300ng; i-T, SacⅡ 선형화 pSP6PepMoV-Vb1 주형; i-I, pSP6PepMoV-Vb1의 인 비트로 전사체; ii-T, SacⅡ 선형화 pSP6PepMoV-Vb1/GFP 주형; i-I, pSP6PepMoV-Vb1/GFP 인 비트로 전사체.
도 19은 pSP6PepMoV-Vb1/GFP 감염된 N. benthamiana 식물체에서 녹색 형광 단백질(GFP)의 UV 하에서의 가시화 결과를 보여주는 사진이다. N. benthamiana 식물체에 대한 사진은 감염 후 4, 5, 7, 10 및 14 일 후에 촬영 하였다.
도 20는 pSP6PepMoV-Vb1/GFP로 감염된 N. benthamiana 식물체의 30 dpi 시점에서의 꽃(A) 및 뿌리(B)를 UV 광 하에서 GFP에 의해 발광된 녹색 형광을 보여주는 사진이다.
도 21은 14 dpi 시점에 있는 전신성 감염 담배 잎에서의 PepMoV-Vb 코트 단백질에 대한 웨스턴 블롯팅 분석 결과이다. M, 단백질 마커; 레인 1, 건강한 식물체; 레인 2, pSP6PepMoV-Vb1 감염 식물체; 레인 3, pSP6PepMoV-Vb1/GFP 감염 식물체 Ls-CMV 접종 식물체. PepMoV-Vb 코트 단백질의 위치는 화살표로 표시되어 있다.
도 22은 고추 식물체의 접종된 전신성 잎에서의 녹색 형광을 촬영한 사진이다. pSP6PepMoV-Vb1/GFP로 감염된 N. benthamiana 식물체로부터 얻은 자손 바이러스로 고추 식물체의 첫 번째 진엽(true leaves)에 접종하였다. 모든 잎에 대하여 5 (a, a', b, b'), 12 (c, c') 및 30 (d, d', e, e') dpi 시점에서 UV 광 하에서 사진 촬영을 하였다. 사진 e'은 d'의 원형 표시 지역을 확대한 사진이다.
도 23는 N. benthamiana 식물체의 전신성 감염 잎에서 패시지 (P)를 통한 pPepMoV-Vb1/GFP의 안정성 분석 결과이다. PepMoV-Vb1-CP 및 GFP의 RT-PCR 증폭을 하기 위한 프라이머가 이용되었다. 레인 1, pSP6PepMoV-Vb1 감염된 식물체 30 dpi (P0); 레인 2, pSP6PepMoV-Vb1/GFP 감염된 식물체, 30 dpi (P0); 레인 3-5, pSP6PepMoV-Vb1/GFP 감염된 식물체, 7, 14 및 21 dpi (P1); 레인 6-7, pSP6PepMoV-Vb1/GFP 감염된 식물체, 7, 14 dpi (P2).
도 24는 SP6PepMoV-Vb1/GFP-NAT의 감염성을 분석한 결과이다. SP6PepMoV-Vb1/GFP-NAT와 SP6PepMoV-Vb1/GFP의 전사체를 고추식물체에 접종하여 GFP의 발현 양상을 통해 고추 식물체의 잎과 줄기 및 전체 식물에서 SP6PepMoV-Vb1/GFP-NAT의 감염성이 SP6PepMoV-Vb1/GFP와 유사하다는 것을 확인한 결과이다.
도 25는 진딧물 비전이 매개용 벡터로 제작된 pSP6PepMoV-Vb1/GFP-NAT의 진딧물 전염성 분석을 위한 시스템이다. 정확한 진딧물 매개 분석을 위해 제작한 배양시스템을 이용하여 진딧물로 인한 오염 및 결과의 비정확성을 배제하고자 격리용 배양 시스템을 제작 및 이용하여 고추 및 담배 식물체에서 분석하였다.
<110> Seoul Women's University <120> Highly Infectious Nucleic Acid Molecules from Pepper Mottle Virus and Plant Viral Vector Derived from the Same <150> KR10-2007-0137270 <151> 2007-12-26 <160> 5 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 9655 <212> DNA <213> Pepper mottle virus <220> <221> CDS <222> (168)..(9371) <400> 1 aaattaaaac ataacataca acataaacga aagcaatcaa attttcaagc aatttccttg 60 aactctttaa ttctcttcta caagttaagc attttgatta acactactgt cttaatttga 120 atattttaat cattttcagt ttcttctact agcactctac actagca atg gca att 176 Met Ala Ile 1 aac gtt att cag ttt ggt tca ttt gtg tgc aat ctt cca aag ttt caa 224 Asn Val Ile Gln Phe Gly Ser Phe Val Cys Asn Leu Pro Lys Phe Gln 5 10 15 tca tcg tgc aca act atg cac tgc cca aag cag agc ata agc acc aat 272 Ser Ser Cys Thr Thr Met His Cys Pro Lys Gln Ser Ile Ser Thr Asn 20 25 30 35 gta gtg cac cca agt aac cca ttc gct gaa ctc gag gaa cgt ctc gaa 320 Val Val His Pro Ser Asn Pro Phe Ala Glu Leu Glu Glu Arg Leu Glu 40 45 50 cca tac ttg caa agg agg atg gat gca 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385 agg cag ctc act gaa gca tcc aat cat ggg atg gaa gta ttc gat gaa 1376 Arg Gln Leu Thr Glu Ala Ser Asn His Gly Met Glu Val Phe Asp Glu 390 395 400 atc ttc aaa atg att gga tcc aaa aca cag agt cct ttc act cat tta 1424 Ile Phe Lys Met Ile Gly Ser Lys Thr Gln Ser Pro Phe Thr His Leu 405 410 415 aat aag ctc aat gaa ttt atg ttg aaa ggg aac gag aat aca agt gag 1472 Asn Lys Leu Asn Glu Phe Met Leu Lys Gly Asn Glu Asn Thr Ser Glu 420 425 430 435 gaa tgg ttg act gct cga caa cgc tta aag gag ctg gtg aga ttt cag 1520 Glu Trp Leu Thr Ala Arg Gln Arg Leu Lys Glu Leu Val Arg Phe Gln 440 445 450 aag aat aga act gat aat ata aag aaa ggt gac ttg gca tca ttc aga 1568 Lys Asn Arg Thr Asp Asn Ile Lys Lys Gly Asp Leu Ala Ser Phe Arg 455 460 465 aat aag ctt tct gct cgt gca cag tac aat ttg tat tta tca tgc gat 1616 Asn Lys Leu Ser Ala Arg Ala Gln Tyr Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Asp 470 475 480 aat cag ctt gac aag aat gct agt ttt cta tgg ggt cag cga gaa tac 1664 Asn Gln Leu Asp Lys Asn Ala Ser Phe Leu Trp Gly Gln Arg Glu Tyr 485 490 495 cat gca cgt cgg ttt ttc cta aac ttc ttt caa caa ata gac cca tca 1712 His Ala Arg Arg Phe Phe Leu Asn Phe Phe Gln Gln Ile Asp Pro Ser 500 505 510 515 aaa ggt tat ttg tcg tat gaa gat cgg acc ata cca aat ggt tct cga 1760 Lys Gly Tyr Leu Ser Tyr Glu Asp Arg Thr Ile Pro Asn Gly Ser Arg 520 525 530 aag tta gct ata ggc aac tta att gtt cca ctc gat tta gct gaa ttc 1808 Lys Leu Ala Ile Gly Asn Leu Ile Val Pro Leu Asp Leu Ala Glu Phe 535 540 545 cga aaa cgc atg aaa ggc atc gac act cag caa cca cca att ggc aag 1856 Arg Lys Arg Met Lys Gly Ile Asp Thr Gln Gln Pro Pro Ile Gly Lys 550 555 560 tac tgt aca agc caa ttg gat ggg aat ttt gtg tat ccg tgc tgc tgc 1904 Tyr Cys Thr Ser Gln Leu Asp Gly Asn Phe Val Tyr Pro Cys Cys Cys 565 570 575 acg acg ctt gat gat ggc caa cca att cga tca gct gtt tac gca ccg 1952 Thr Thr Leu Asp Asp Gly Gln Pro Ile Arg Ser Ala Val Tyr Ala Pro 580 585 590 595 act aag aaa cat tta gtt gtt ggt aac aca gga gac aca aag tac atc 2000 Thr Lys Lys His Leu Val Val Gly Asn Thr Gly Asp Thr Lys Tyr Ile 600 605 610 aac ttg cct aaa gga gat aca gag atg cta tat att gca ctc gat ggc 2048 Asn Leu Pro Lys Gly Asp Thr Glu Met Leu Tyr Ile Ala Leu Asp Gly 615 620 625 tat tgt tac att aac att tat ctg gca atg ttg gtc aat ata agc gag 2096 Tyr Cys Tyr Ile Asn Ile Tyr Leu Ala Met Leu Val Asn Ile Ser Glu 630 635 640 gaa gag gcc aag gac ttc aca aag aaa gtt cgg gat att ttc atg cca 2144 Glu Glu Ala Lys Asp Phe Thr Lys Lys Val Arg Asp Ile Phe Met Pro 645 650 655 aag ctt ggg aag tgg cca aca ttg atg gat ttg gct acg aca tgt gct 2192 Lys Leu Gly Lys Trp Pro Thr Leu Met Asp Leu Ala Thr Thr Cys Ala 660 665 670 675 caa ctt cgg ata ttc cac cct gat gta cat gac gca gag ctg cct cgt 2240 Gln Leu Arg Ile Phe His Pro Asp Val His Asp Ala Glu Leu Pro Arg 680 685 690 att cta gtg gat cac aac aca caa aca tgt cat gtg gtc gat tca tat 2288 Ile Leu Val Asp His Asn Thr Gln Thr Cys His Val Val Asp Ser Tyr 695 700 705 gga tca att agt act ggg tat cac att ctg aaa gct gca act gtt tca 2336 Gly Ser Ile Ser Thr Gly Tyr His Ile Leu Lys Ala Ala Thr Val Ser 710 715 720 caa tta gtg ttg ttt gct gac gac aac ttg gag tct gag ata aag cac 2384 Gln Leu Val Leu Phe Ala Asp Asp Asn Leu Glu Ser Glu Ile Lys His 725 730 735 tat aga gtt ggt gga act gta gag aat cat aaa gtg aaa ata gat gac 2432 Tyr Arg Val Gly Gly Thr Val Glu Asn His Lys Val Lys Ile Asp Asp 740 745 750 755 caa cct ggt aga tgt gga gtg agc gag ttt cat gct ata cgc atg tta 2480 Gln Pro Gly Arg Cys Gly Val Ser Glu Phe His Ala Ile Arg Met Leu 760 765 770 att aaa ggg atc tac agg cca agt gtc atg tat gag tta ctc tcc gaa 2528 Ile Lys Gly Ile Tyr Arg Pro Ser Val Met Tyr Glu Leu Leu Ser Glu 775 780 785 gag cca tac ttg tta gtg ttc tcc att ctc tca ccc tcg ata ttg ata 2576 Glu Pro Tyr Leu Leu Val Phe Ser Ile Leu Ser Pro Ser Ile Leu Ile 790 795 800 gcg atg tac aat gat agg gct ttc gag cta gct gtt caa ata tgg ttg 2624 Ala Met Tyr Asn Asp Arg Ala Phe Glu Leu Ala Val Gln Ile Trp Leu 805 810 815 gag aag gaa cag tca att cca ttg att gcc act att tta aca 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Gly Ser Glu Val Arg His 1140 1145 1150 1155 cag tct ttg gat gat ttt gtg aat aca atg gat gag aag aat ttc gtt 3680 Gln Ser Leu Asp Asp Phe Val Asn Thr Met Asp Glu Lys Asn Phe Val 1160 1165 1170 gtt gat ttt gaa ttg aat gat agt gtc caa agg aag aat cta aca act 3728 Val Asp Phe Glu Leu Asn Asp Ser Val Gln Arg Lys Asn Leu Thr Thr 1175 1180 1185 gag atc acc ttt gaa aac tgg tgg gat gag caa gtt gct cgg ggt ttc 3776 Glu Ile Thr Phe Glu Asn Trp Trp Asp Glu Gln Val Ala Arg Gly Phe 1190 1195 1200 aca ata cca cac tat aga aca gag ggg agg ttt atg gaa ttc aca aga 3824 Thr Ile Pro His Tyr Arg Thr Glu Gly Arg Phe Met Glu Phe Thr Arg 1205 1210 1215 gca aca gca gct aaa gtc gct agt gat ata tca atc tca tct gag cgc 3872 Ala Thr Ala Ala Lys Val Ala Ser Asp Ile Ser Ile Ser Ser Glu Arg 1220 1225 1230 1235 gac ttt ttg att cga gga gct gtg ggt tct ggt aaa tcc act ggg tta 3920 Asp Phe Leu Ile Arg Gly Ala Val Gly Ser Gly Lys Ser Thr Gly Leu 1240 1245 1250 cca cac cat ttg agc act tac ggc agg gtt ttg ctg ata gaa cca aca 3968 Pro His His Leu Ser Thr Tyr Gly Arg Val Leu Leu Ile Glu Pro Thr 1255 1260 1265 cgg cca cta gca gaa aat gtt ttc aaa cag tta tct ggt ggt cca ttt 4016 Arg Pro Leu Ala Glu Asn Val Phe Lys Gln Leu Ser Gly Gly Pro Phe 1270 1275 1280 ttt cta aaa ccc aca atg aga atg cgt ggt aat agt gtg ttt ggg tcg 4064 Phe Leu Lys Pro Thr Met Arg Met Arg Gly Asn Ser Val Phe Gly Ser 1285 1290 1295 tcg cct att tct gta atg aca agt ggg ttt gct ttg cat ttc ttt gct 4112 Ser Pro Ile Ser Val Met Thr Ser Gly Phe Ala Leu His Phe Phe Ala 1300 1305 1310 1315 aat aac atc act caa ctt caa gag att cag ttt ata att ata gac gag 4160 Asn Asn Ile Thr Gln Leu Gln Glu Ile Gln Phe Ile Ile Ile Asp Glu 1320 1325 1330 tgc cat gtt atg gat gca tct tca atg gca ttt aga agc tta att cat 4208 Cys His Val Met Asp Ala Ser Ser Met Ala Phe Arg Ser Leu Ile His 1335 1340 1345 aca tac cac act aat tgt aag gtt ttg aag gtt tca gca aca cca cct 4256 Thr Tyr His Thr Asn Cys Lys Val Leu Lys Val Ser Ala Thr Pro Pro 1350 1355 1360 ggc aga gag gtg gag ttc aca aca caa ttc cca gtg aaa tta gtg gtt 4304 Gly Arg Glu Val Glu Phe Thr Thr Gln Phe Pro Val Lys Leu Val Val 1365 1370 1375 gaa gat agt ctg tct ttt aag aca ttt gtt gag agt caa ggc aca ggt 4352 Glu Asp Ser Leu Ser Phe Lys Thr Phe Val Glu Ser Gln Gly Thr Gly 1380 1385 1390 1395 agc aat tgt gac atg atc caa tac gga aat aac tta tta gtg tat gta 4400 Ser Asn Cys Asp Met Ile Gln Tyr Gly Asn Asn Leu Leu Val Tyr Val 1400 1405 1410 gct agt tat aat gaa gta gac caa ctg tca aaa tta cta gta gct cgt 4448 Ala Ser Tyr Asn Glu Val Asp Gln Leu Ser Lys Leu Leu Val Ala Arg 1415 1420 1425 gag ttc aat gtc acg aaa gta gat ggt agg acg atg aag cat ggt gag 4496 Glu Phe Asn Val Thr Lys Val Asp Gly Arg Thr Met Lys His Gly Glu 1430 1435 1440 ctc gag att gtg aca cga gga aca aag agt aag cca cac ttt gtt gtc 4544 Leu Glu Ile Val Thr Arg Gly Thr Lys Ser Lys Pro His Phe Val Val 1445 1450 1455 gcc act aat att att gaa aat gga gta act ttg gat ata gat gtt gtt 4592 Ala Thr Asn Ile Ile Glu Asn Gly Val Thr Leu Asp Ile Asp Val Val 1460 1465 1470 1475 att gac ttt gga atg aaa gtt agc cca ttt tta gat gta gat aat agg 4640 Ile Asp Phe Gly Met Lys Val Ser Pro Phe Leu Asp Val Asp Asn Arg 1480 1485 1490 tct gta gca tac aat aag gtc tcc att agt tac gga gaa cga att cag 4688 Ser Val Ala Tyr Asn Lys Val Ser Ile Ser Tyr Gly Glu Arg Ile Gln 1495 1500 1505 cgg ctt gga agg gta ggt cgc ata cag aag ggc acc gca ctt cgg ata 4736 Arg Leu Gly Arg Val Gly Arg Ile Gln Lys Gly Thr Ala Leu Arg Ile 1510 1515 1520 ggt cac act gag aaa ggg cta ata gaa ata cct caa atg ata tca act 4784 Gly His Thr Glu Lys Gly Leu Ile Glu Ile Pro Gln Met Ile Ser Thr 1525 1530 1535 gaa gct gct ttg tat tgc ttt gcg tac aat tta cca gtc atg tct agt 4832 Glu Ala Ala Leu Tyr Cys Phe Ala Tyr Asn Leu Pro Val Met Ser Ser 1540 1545 1550 1555 ggc gtc tcc aca agc atg att aaa aat tgt aca ata cca caa gtt cgc 4880 Gly Val Ser Thr Ser Met Ile Lys Asn Cys Thr Ile Pro Gln Val Arg 1560 1565 1570 aca atg cat aca ttt gag ttg agt cca ttt ttc atg tac aat ttt gtg 4928 Thr Met His Thr Phe Glu Leu Ser Pro Phe Phe Met Tyr Asn Phe Val 1575 1580 1585 tca cat gat gga aca atg cat ccg gtt gtc cat gaa att ctc aag cgc 4976 Ser His Asp Gly Thr Met His Pro Val Val His Glu Ile Leu Lys Arg 1590 1595 1600 tat aaa ctg cgt gat tcg gtt att cca tta agt gag agt tcc atc cca 5024 Tyr Lys Leu Arg Asp Ser Val Ile Pro Leu Ser Glu Ser Ser Ile Pro 1605 1610 1615 tac aga gct tct agc gac tgg atc acg gct ggt gac tac agg cgt att 5072 Tyr Arg Ala Ser Ser Asp Trp Ile Thr Ala Gly Asp Tyr Arg Arg Ile 1620 1625 1630 1635 gga gtg aaa ctg gat atc cca gat gaa acg cga att gca ttt cat atc 5120 Gly Val Lys Leu Asp Ile Pro Asp Glu Thr Arg Ile Ala Phe His Ile 1640 1645 1650 aaa gac att cca cca caa att cac caa caa ttg tgg gag tca gtt ctc 5168 Lys Asp Ile Pro Pro Gln Ile His Gln Gln Leu Trp Glu Ser Val Leu 1655 1660 1665 aag tat aag gca tct gca gca ttc cca aca ttg cga tca tca tcg att 5216 Lys Tyr Lys Ala Ser Ala Ala Phe Pro Thr Leu Arg Ser Ser Ser Ile 1670 1675 1680 aca aag att gca tac aca ctg agc act gat tta tac gca att ccg cgt 5264 Thr Lys Ile Ala Tyr Thr Leu Ser Thr Asp Leu Tyr Ala Ile Pro Arg 1685 1690 1695 act tta gca gtt gtg gaa agc ctg ctg gaa gat gag agg aca aaa caa 5312 Thr Leu Ala Val Val Glu Ser Leu Leu Glu Asp Glu Arg Thr Lys Gln 1700 1705 1710 1715 tat caa ttc aaa agc ttg att gac aat ggt tgc tca agt atg ttc tca 5360 Tyr Gln Phe Lys Ser Leu Ile Asp Asn Gly Cys Ser Ser Met Phe Ser 1720 1725 1730 gtg gtt gga att tca aat gca ctc aga gct aaa tat tcg aaa gat tac 5408 Val Val Gly Ile Ser Asn Ala Leu Arg Ala Lys Tyr Ser Lys Asp Tyr 1735 1740 1745 acc gtg gag aat ata aat aag ctt gaa gct gtc aaa gca caa ctc aaa 5456 Thr Val Glu Asn Ile Asn Lys Leu Glu Ala Val Lys Ala Gln Leu Lys 1750 1755 1760 gag ttc cac aat cta aat ggc tct ggt gat gag tta aat ttg atc aaa 5504 Glu Phe His Asn Leu Asn Gly Ser Gly Asp Glu Leu Asn Leu Ile Lys 1765 1770 1775 aga ttc gag tcg tta caa ttt gtg cat cac cag tcc aag tct tct ctt 5552 Arg Phe Glu Ser Leu Gln Phe Val His His Gln Ser Lys Ser Ser Leu 1780 1785 1790 1795 gcg aag gcc ctt gga tta aga ggc gtt tgg aac aaa tca ctc att gtt 5600 Ala Lys Ala Leu Gly Leu Arg Gly Val Trp Asn Lys Ser Leu Ile Val 1800 1805 1810 cgc gat gcg atc att gcg gcc ggt gtt gca tgt ggt ggt gcg tgg cta 5648 Arg Asp Ala Ile Ile Ala Ala Gly Val Ala Cys Gly Gly Ala Trp Leu 1815 1820 1825 ttg tat aca tgg ttc act gga aag atg tct gaa gtg agt cat cag gga 5696 Leu Tyr Thr Trp Phe Thr Gly Lys Met Ser Glu Val Ser His Gln Gly 1830 1835 1840 cgc tct aag acg aaa aga att cag gca ttg aaa ttc agg aag gca cgt 5744 Arg Ser Lys Thr Lys Arg Ile Gln Ala Leu Lys Phe Arg Lys Ala Arg 1845 1850 1855 gat aag aga gct gga ttt gag att gat aac aat gaa gat act att gaa 5792 Asp Lys Arg Ala Gly Phe Glu Ile Asp Asn Asn Glu Asp Thr Ile Glu 1860 1865 1870 1875 gag tac ttc ggc tct gct tat act aag aaa gga aaa ggt aaa ggc aca 5840 Glu Tyr Phe Gly Ser Ala Tyr Thr Lys Lys Gly Lys Gly Lys Gly Thr 1880 1885 1890 acc gtt ggc atg ggc aaa aca aac aga cga ttc atc aac atg tat ggg 5888 Thr Val Gly Met Gly Lys Thr Asn Arg Arg Phe Ile Asn Met Tyr Gly 1895 1900 1905 ttt gag ccc ggg caa ttc tct tat atc aaa ttt gtt gat cca ctc aca 5936 Phe Glu Pro Gly Gln Phe Ser Tyr Ile Lys Phe Val Asp Pro Leu Thr 1910 1915 1920 ggt gca caa atg gag gaa aat gtt tac gct gat att gtc gat gtg caa 5984 Gly Ala Gln Met Glu Glu Asn Val Tyr Ala Asp Ile Val Asp Val Gln 1925 1930 1935 gac aaa ttt ggt gag att cgg agg caa atg ata att gat gac gag ttg 6032 Asp Lys Phe Gly Glu Ile Arg Arg Gln Met Ile Ile Asp Asp Glu Leu 1940 1945 1950 1955 gat aac cga caa aca gaa gtc cat aac act att cat gct tac ctc ata 6080 Asp Asn Arg Gln Thr Glu Val His Asn Thr Ile His Ala Tyr Leu Ile 1960 1965 1970 aaa gat tgg tca aat aag gca tta aaa gtg gac ttg act ccg cat aat 6128 Lys Asp Trp Ser Asn Lys Ala Leu Lys Val Asp Leu Thr Pro His Asn 1975 1980 1985 cct ctt cgg gta agc gat aag gca agt gcc ata atg aag ttc cct gag 6176 Pro Leu Arg Val Ser Asp Lys Ala Ser Ala Ile Met Lys Phe Pro Glu 1990 1995 2000 cgg gaa gga gaa ttg cgc caa act gga caa gca gtg gag gtt gat 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aag gat ttt cca gtt ttc cca caa cga ctc aaa ttc aga 6560 Lys Met Pro Lys Asp Phe Pro Val Phe Pro Gln Arg Leu Lys Phe Arg 2120 2125 2130 gaa cct gcg tca aca gac aga gtg tgt ctc att ggt tca aac ttc caa 6608 Glu Pro Ala Ser Thr Asp Arg Val Cys Leu Ile Gly Ser Asn Phe Gln 2135 2140 2145 gaa aga tac att tct aca aca gtg tca gaa acc agt gcc act cac cca 6656 Glu Arg Tyr Ile Ser Thr Thr Val Ser Glu Thr Ser Ala Thr His Pro 2150 2155 2160 gtc cca cgc agc aca ttt tgg aag cat tgg atc tcc aca gat gat ggt 6704 Val Pro Arg Ser Thr Phe Trp Lys His Trp Ile Ser Thr Asp Asp Gly 2165 2170 2175 cat tgt ggt ttg cct att gtt agc aca aca gat gga ttt atc cta ggg 6752 His Cys Gly Leu Pro Ile Val Ser Thr Thr Asp Gly Phe Ile Leu Gly 2180 2185 2190 2195 cta cat agt tta gca aat aat agg aac agt gaa aat tat tac act gct 6800 Leu His Ser Leu Ala Asn Asn Arg Asn Ser Glu Asn Tyr Tyr Thr Ala 2200 2205 2210 ttc gat tct gat ttt gaa atg aaa ata tta agg agt gga gaa aac acc 6848 Phe Asp Ser Asp Phe Glu Met Lys Ile Leu Arg Ser 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aat ggg tct cta aaa gct gaa ctg 7520 Tyr Thr Gly Lys Leu Gly Val Trp Asn Gly Ser Leu Lys Ala Glu Leu 2440 2445 2450 aga agt aag gaa aag ata gag gct aat aag aca cgg act ttc aca gca 7568 Arg Ser Lys Glu Lys Ile Glu Ala Asn Lys Thr Arg Thr Phe Thr Ala 2455 2460 2465 gcc cca att gat act tta tta ggt ggt aag gtg tgt gta gat gat ttc 7616 Ala Pro Ile Asp Thr Leu Leu Gly Gly Lys Val Cys Val Asp Asp Phe 2470 2475 2480 aac aac cag ttt tat tcg aaa aat att gaa tgt tgt tgg acg gtt ggg 7664 Asn Asn Gln Phe Tyr Ser Lys Asn Ile Glu Cys Cys Trp Thr Val Gly 2485 2490 2495 atg acc aaa ttt tat ggt gga tgg aat aag ctt ttg aca gct ttg cct 7712 Met Thr Lys Phe Tyr Gly Gly Trp Asn Lys Leu Leu Thr Ala Leu Pro 2500 2505 2510 2515 gat gga tgg ata tat tgt gat gca gat ggc tcg caa ttc gat agt tca 7760 Asp Gly Trp Ile Tyr Cys Asp Ala Asp Gly Ser Gln Phe Asp Ser Ser 2520 2525 2530 ttg aca cct tac ctc ata aat gct gta ttg act ata cgg tat gct ttc 7808 Leu Thr Pro Tyr Leu Ile Asn Ala Val Leu Thr Ile Arg Tyr Ala Phe 2535 2540 2545 atg gaa gat tgg gac att ggg tat aag atg ttg caa aac ttg tac aca 7856 Met Glu Asp Trp Asp Ile Gly Tyr Lys Met Leu Gln Asn Leu Tyr Thr 2550 2555 2560 gaa ata atc tac aca cca ata tcc acg cct gat gga aca atc gtg aag 7904 Glu Ile Ile Tyr Thr Pro Ile Ser Thr Pro Asp Gly Thr Ile Val Lys 2565 2570 2575 aag ttc aga ggc aat aac agt ggg caa cct tcc acc gtt gta gac aac 7952 Lys Phe Arg Gly Asn Asn Ser Gly Gln Pro Ser Thr Val Val Asp Asn 2580 2585 2590 2595 tca ctt atg gtt gta ctt gct atg cat tat gca ttt gta cgg gaa ggt 8000 Ser Leu Met Val Val Leu Ala Met His Tyr Ala Phe Val Arg Glu Gly 2600 2605 2610 gtg gta ttt gaa gaa att gac tcc ata tgc aag ttc ttc gtt aat gga 8048 Val Val Phe Glu Glu Ile Asp Ser Ile Cys Lys Phe Phe Val Asn Gly 2615 2620 2625 gat gat ttg cta ata gcc gtg aac cca gaa cgt gaa aac tta ttg gac 8096 Asp Asp Leu Leu Ile Ala Val Asn Pro Glu Arg Glu Asn Leu Leu Asp 2630 2635 2640 aca ctg tca agt cat ttt tct gat tta ggg ctc aat tat gat ttc tca 8144 Thr Leu Ser Ser His Phe Ser Asp Leu Gly Leu Asn Tyr Asp Phe Ser 2645 2650 2655 tct cgg acg agg gat aaa tca gaa ttg tgg ttc atg tca cat tgt ggg 8192 Ser Arg Thr Arg Asp Lys Ser Glu Leu Trp Phe Met Ser His Cys Gly 2660 2665 2670 2675 att cct gtt gaa ggt atg tat ata cct aag ctt gaa gag gag cga att 8240 Ile Pro Val Glu Gly Met Tyr Ile Pro Lys Leu Glu Glu Glu Arg Ile 2680 2685 2690 gta tca att ctc caa tgg gac cga gcg gag cta cca gag tac aga ttg 8288 Val Ser Ile Leu Gln Trp Asp Arg Ala Glu Leu Pro Glu Tyr Arg Leu 2695 2700 2705 gag gct att tgt gca gca atg att gaa tca tgg gga tac cca caa tta 8336 Glu Ala Ile Cys Ala Ala Met Ile Glu Ser Trp Gly Tyr Pro Gln Leu 2710 2715 2720 act cat gag att cga aga ttc tat agc tgg tta att gag aag aac cca 8384 Thr His Glu Ile Arg Arg Phe Tyr Ser Trp Leu Ile Glu Lys Asn Pro 2725 2730 2735 tac gct gac ttg gca tct gaa gga aaa gct cca tat att tct gaa cta 8432 Tyr Ala Asp Leu Ala Ser Glu Gly Lys Ala Pro Tyr Ile Ser Glu Leu 2740 2745 2750 2755 gct cta aag aag cta tat ctg aat cag gat gta caa aat gat gag ctt 8480 Ala Leu Lys Lys Leu Tyr Leu Asn Gln Asp Val Gln Asn Asp Glu Leu 2760 2765 2770 cag gtc tac ctc aga tat ttc gct gaa gca gat gaa gag ttt gaa tgt 8528 Gln Val Tyr Leu Arg Tyr Phe Ala Glu Ala Asp Glu Glu Phe Glu Cys 2775 2780 2785 ggt aca tat gaa gtt cat cat cag agc agc tca aga tca gac aca ttg 8576 Gly Thr Tyr Glu Val His His Gln Ser Ser Ser Arg Ser Asp Thr Leu 2790 2795 2800 gac gct gga gag gag aaa aag aaa aat aaa gaa gta gcc act gtg tcc 8624 Asp Ala Gly Glu Glu Lys Lys Lys Asn Lys Glu Val Ala Thr Val Ser 2805 2810 2815 gat gga atg aaa aag aag gag gtt gaa tca aca cgc gat tct gat gtg 8672 Asp Gly Met Lys Lys Lys Glu Val Glu Ser Thr Arg Asp Ser Asp Val 2820 2825 2830 2835 aat gcg gga act gtt gga aca ttc acc gtt cca aga atc aaa tca atc 8720 Asn Ala Gly Thr Val Gly Thr Phe Thr Val Pro Arg Ile Lys Ser Ile 2840 2845 2850 act gag aag atg cgt atg cca aaa caa aag aaa aag ggt gtt ctc aac 8768 Thr Glu Lys Met Arg Met Pro Lys Gln Lys Lys Lys Gly Val Leu Asn 2855 2860 2865 ttg gct cat tta ctt gaa tac aaa cca agc caa gtc gac ata tcg aat 8816 Leu Ala His Leu Leu Glu Tyr Lys Pro Ser Gln Val Asp Ile Ser Asn 2870 2875 2880 act cgt tca acc cag gca caa ttt gac aat tgg tat aat gaa gtt atg 8864 Thr Arg Ser Thr Gln Ala Gln Phe Asp Asn Trp Tyr Asn Glu Val Met 2885 2890 2895 aaa gca tac gat cta caa gag gag gca atg ggt aca gtg atg aat ggc 8912 Lys Ala Tyr Asp Leu Gln Glu Glu Ala Met Gly Thr Val Met Asn Gly 2900 2905 2910 2915 tta atg gtt tgg tgc att gaa aat ggc acg tcc cca aat att agt gga 8960 Leu Met Val Trp Cys Ile Glu Asn Gly Thr Ser Pro Asn Ile Ser Gly 2920 2925 2930 aca tgg acc atg atg gat gga gac gaa cag gtg gaa ttc cca tta aag 9008 Thr Trp Thr Met Met Asp Gly Asp Glu Gln Val Glu Phe Pro Leu Lys 2935 2940 2945 ccc gtg ata gag aat gct aag ccg act ttt cgg cag ata atg gcg cat 9056 Pro Val Ile Glu Asn Ala Lys Pro Thr Phe Arg Gln Ile Met Ala His 2950 2955 2960 ttt tct gat gtg gct gag gca tat ata gaa atg cgc aat aag caa gaa 9104 Phe Ser Asp Val Ala Glu Ala Tyr Ile Glu Met Arg 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20 25 30 35 gta gtg cac cca agt aac cca ttc gct gaa ctc gag gaa cgt ctc gaa 320 Val Val His Pro Ser Asn Pro Phe Ala Glu Leu Glu Glu Arg Leu Glu 40 45 50 cca tac ttg caa agg agg atg gat gca aca ata cgc cta act aga ggc 368 Pro Tyr Leu Gln Arg Arg Met Asp Ala Thr Ile Arg Leu Thr Arg Gly 55 60 65 ggg acg ctt gtg tat aaa cac atg agc gaa gct aaa cgc gcc aag aag 416 Gly Thr Leu Val Tyr Lys His Met Ser Glu Ala Lys Arg Ala Lys Lys 70 75 80 ctt aga aag aag cag cgt gag gaa gag gag gtg cat ttg ttc atg aat 464 Leu Arg Lys Lys Gln Arg Glu Glu Glu Glu Val His Leu Phe Met Asn 85 90 95 gca gct cca tat att gtg agt aac atc aca ata gga gga ggg gtg gcg 512 Ala Ala Pro Tyr Ile Val Ser Asn Ile Thr Ile Gly Gly Gly Val Ala 100 105 110 115 ccc tct aag atg gag gaa gtg tct att aag cga ccg cta aat aaa act 560 Pro Ser Lys Met Glu Glu Val Ser Ile Lys Arg Pro Leu Asn Lys Thr 120 125 130 cct tct caa aag gct aag aaa tca ttc aca cca gtg act ttt agg gac 608 Pro Ser Gln Lys Ala Lys Lys Ser Phe Thr Pro Val Thr Phe Arg Asp 135 140 145 gga cac atg gaa aag ttc ttg aga gga ctt aag aat tgt gca acc cgc 656 Gly His Met Glu Lys Phe Leu Arg Gly Leu Lys Asn Cys Ala Thr Arg 150 155 160 aac aac atg aca gta cac ttg att gga aag cgg aaa acc gag ctt gct 704 Asn Asn Met Thr Val His Leu Ile Gly Lys Arg Lys Thr Glu Leu Ala 165 170 175 ttc aaa agg cgc gct agt tca gat gct gtg tac gct aca ctg cac cac 752 Phe Lys Arg Arg Ala Ser Ser Asp Ala Val Tyr Ala Thr Leu His His 180 185 190 195 atg cgt gga gtt gat cgc aag cgc gat att gtg ctc gaa gaa tgg atg 800 Met Arg Gly Val Asp Arg Lys Arg Asp Ile Val Leu Glu Glu Trp Met 200 205 210 aat gag tat gtt cac aat ttg tca aga gtt ggc aca tgg ggt tca cta 848 Asn Glu Tyr Val His Asn Leu Ser Arg Val Gly Thr Trp Gly Ser Leu 215 220 225 ttt cac gcc gaa tct cta aag cga ggt gat agt ggg tta ata ctg aat 896 Phe His Ala Glu Ser Leu Lys Arg Gly Asp Ser Gly Leu Ile Leu Asn 230 235 240 gcg aga gca ctg agg ggt aaa ttc gga cga tgt agc aga gga ttt ttc 944 Ala Arg Ala Leu Arg Gly Lys Phe Gly Arg Cys Ser Arg Gly Phe Phe 245 250 255 ata gtt cgc gga aaa tcg gat gga att gta ttg gat gca aga tcc aag 992 Ile Val Arg Gly Lys Ser Asp Gly Ile Val Leu Asp Ala Arg Ser Lys 260 265 270 275 ctt tct atg gca act gta ctt cat atg gaa cag tat tca aca tct gaa 1040 Leu Ser Met Ala Thr Val Leu His Met Glu Gln Tyr Ser Thr Ser Glu 280 285 290 gca ttt tgg agc ggt cta gag aag aag tgg agc gtg atg cgc aag cca 1088 Ala Phe Trp Ser Gly Leu Glu Lys Lys Trp Ser Val Met Arg Lys Pro 295 300 305 acc gcg cat act tgt aaa ccg acg tat tcg gtt tcg aat tgt ggg gaa 1136 Thr Ala His Thr Cys Lys Pro Thr Tyr Ser Val Ser Asn Cys Gly Glu 310 315 320 gta gcc gct att ata gcg caa gcc tta ttt ccg tgc cac aag ttg acg 1184 Val Ala Ala Ile Ile Ala Gln Ala Leu Phe Pro Cys His Lys Leu Thr 325 330 335 tgt ggt gaa tgc tcg aaa gag att tgc gat ctc act tcg agt gaa tgc 1232 Cys Gly Glu Cys Ser Lys Glu Ile Cys Asp Leu Thr Ser Ser Glu Cys 340 345 350 355 gtg caa gag tta tac aag aat atc tct ttg gca ctg gaa agg atg aac 1280 Val Gln Glu Leu Tyr Lys Asn Ile Ser Leu Ala Leu Glu Arg Met Asn 360 365 370 aat cta cat ccc gaa ttt caa cac att gtt aag gtg ttg agc gtt gtt 1328 Asn Leu His Pro Glu Phe Gln His Ile Val Lys Val Leu Ser Val Val 375 380 385 agg cag ctc act gaa gca tcc aat cat ggg atg gaa gta ttc gat gaa 1376 Arg Gln Leu Thr Glu Ala Ser Asn His Gly Met Glu Val Phe Asp Glu 390 395 400 atc ttc aaa atg att gga tcc aaa aca cag agt cct ttc act cat tta 1424 Ile Phe Lys Met Ile Gly Ser Lys Thr Gln Ser Pro Phe Thr His Leu 405 410 415 aat aag ctc aat gaa ttt atg ttg aaa ggg aac gag aat aca agt gag 1472 Asn Lys Leu Asn Glu Phe Met Leu Lys Gly Asn Glu Asn Thr Ser Glu 420 425 430 435 gaa tgg ttg act gct cga caa cgc tta aag gag ctg gtg aga ttt cag 1520 Glu Trp Leu Thr Ala Arg Gln Arg Leu Lys Glu Leu Val Arg Phe Gln 440 445 450 aag aat aga act gat aat ata aag aaa ggt gac ttg gca tca ttc aga 1568 Lys Asn Arg Thr Asp Asn Ile Lys Lys Gly Asp Leu Ala Ser Phe Arg 455 460 465 aat aag ctt tct gct cgt gca cag tac aat ttg tat tta tca tgc gat 1616 Asn Lys Leu Ser Ala Arg Ala Gln Tyr Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Asp 470 475 480 aat cag ctt gac aag aat gct agt ttt cta tgg ggt cag cga gaa tac 1664 Asn Gln Leu Asp Lys Asn Ala Ser Phe Leu Trp Gly Gln Arg Glu Tyr 485 490 495 cat gca cgt cgg ttt ttc cta aac ttc ttt caa caa ata gac cca tca 1712 His Ala Arg Arg Phe Phe Leu Asn Phe Phe Gln Gln Ile Asp Pro Ser 500 505 510 515 aaa ggt tat ttg tcg tat gaa gat cgg acc ata cca aat ggt tct cga 1760 Lys Gly Tyr Leu Ser Tyr Glu Asp Arg Thr Ile Pro Asn Gly Ser Arg 520 525 530 aag tta gct ata ggc aac tta att gtt cca ctc gat tta gct gaa ttc 1808 Lys Leu Ala Ile Gly Asn Leu Ile Val Pro Leu Asp Leu Ala Glu Phe 535 540 545 cga aaa cgc atg aaa ggc atc gac act cag caa cca cca att ggc aag 1856 Arg Lys Arg Met Lys Gly Ile Asp Thr Gln Gln Pro Pro Ile Gly Lys 550 555 560 tac tgt aca agc caa ttg gat ggg aat ttt gtg tat ccg tgc tgc tgc 1904 Tyr Cys Thr Ser Gln Leu Asp Gly Asn Phe Val Tyr Pro Cys Cys Cys 565 570 575 acg acg ctt gat gat ggc caa cca att cga tca gct gtt tac gca ccg 1952 Thr Thr Leu Asp Asp Gly Gln Pro Ile Arg Ser Ala Val Tyr Ala Pro 580 585 590 595 act aag aaa cat tta gtt gtt ggt aac aca gga gac aca aag tac atc 2000 Thr Lys Lys His Leu Val Val Gly Asn Thr Gly Asp Thr Lys Tyr Ile 600 605 610 aac ttg cct aaa gga gat aca gag atg cta tat att gca ctc gat ggc 2048 Asn Leu Pro Lys Gly Asp Thr Glu Met Leu Tyr Ile Ala Leu Asp Gly 615 620 625 tat tgt tac att aac att tat ctg gca atg ttg gtc aat ata agc gag 2096 Tyr Cys Tyr Ile Asn Ile Tyr Leu Ala Met Leu Val Asn Ile Ser Glu 630 635 640 gaa gag gcc aag gac ttc aca aag aaa gtt cgg gat att ttc atg cca 2144 Glu Glu Ala Lys Asp Phe Thr Lys Lys Val Arg Asp Ile Phe Met Pro 645 650 655 aag ctt ggg aag tgg cca aca ttg atg gat ttg gct acg aca tgt gct 2192 Lys Leu Gly Lys Trp Pro Thr Leu Met Asp Leu Ala Thr Thr Cys Ala 660 665 670 675 caa ctt cgg ata ttc cac cct gat gta cat gac gca gag ctg cct cgt 2240 Gln Leu Arg Ile Phe His Pro Asp Val His Asp Ala Glu Leu Pro Arg 680 685 690 att cta gtg gat cac aac aca caa aca tgt cat gtg gtc gat tca tat 2288 Ile Leu Val Asp His Asn Thr Gln Thr Cys His Val Val Asp Ser Tyr 695 700 705 gga tca att agt act ggg tat cac att ctg aaa gct gca act gtt tca 2336 Gly Ser Ile Ser Thr Gly Tyr His Ile Leu Lys Ala Ala Thr Val Ser 710 715 720 caa tta gtg ttg ttt gct gac gac aac ttg gag tct gag ata aag cac 2384 Gln Leu Val Leu Phe Ala Asp Asp Asn Leu Glu Ser Glu Ile Lys His 725 730 735 tat aga gtt ggt gga act gta gag aat cat aaa gtg aaa ata gat gac 2432 Tyr Arg Val Gly Gly Thr Val Glu Asn His Lys Val Lys Ile Asp Asp 740 745 750 755 caa cct ggt aga tgt gga gtg agc gag ttt cat gct ata cgc atg tta 2480 Gln Pro Gly Arg Cys Gly Val Ser Glu Phe His Ala Ile Arg Met Leu 760 765 770 att aaa ggg atc tac agg cca agt gtc atg tat gag tta ctc tcc gaa 2528 Ile Lys Gly Ile Tyr Arg Pro Ser Val Met Tyr Glu Leu Leu Ser Glu 775 780 785 gag cca tac ttg tta gtg ttc tcc att ctc tca ccc tcg ata ttg ata 2576 Glu Pro Tyr Leu Leu Val Phe Ser Ile Leu Ser Pro Ser Ile Leu Ile 790 795 800 gcg atg tac aat gat agg gct ttc gag cta gct gtt caa ata tgg ttg 2624 Ala Met Tyr Asn Asp Arg Ala Phe Glu Leu Ala Val Gln Ile Trp Leu 805 810 815 gag aag gaa cag tca att cca ttg att gcc act att tta aca aat ttg 2672 Glu Lys Glu Gln Ser Ile Pro Leu Ile Ala Thr Ile Leu Thr Asn Leu 820 825 830 835 gca gcg aag gtt tct gtg gcc aca act ctc gtt caa caa ttg cag ttg 2720 Ala Ala Lys Val Ser Val Ala Thr Thr Leu Val Gln Gln Leu Gln Leu 840 845 850 att gaa tta tct gca gat cag cta ctg aat gtg act tgt gat ggg ttt 2768 Ile Glu Leu Ser Ala Asp Gln Leu Leu Asn Val Thr Cys Asp Gly Phe 855 860 865 cgg gtg agt ttt gct tat caa tca gct cta act cta ctc aca agg atg 2816 Arg Val Ser Phe Ala Tyr Gln Ser Ala Leu Thr Leu Leu Thr Arg Met 870 875 880 cga gat caa gcc aaa gca aat agt gag ttg ata agc gga ggg ttc aat 2864 Arg Asp Gln Ala Lys Ala Asn Ser Glu Leu Ile Ser Gly Gly Phe Asn 885 890 895 gaa tat gac cag gat ttg gcg tgg acc ttg gaa aaa aat tat caa ggc 2912 Glu Tyr Asp Gln Asp Leu Ala Trp Thr Leu Glu Lys Asn Tyr Gln Gly 900 905 910 915 ctc tta cac gac caa tgg aaa gaa tta agc tcg ctg gaa aaa ttt cgc 2960 Leu Leu His Asp Gln Trp Lys Glu Leu Ser Ser Leu Glu Lys Phe Arg 920 925 930 tac tat tgg tcc tca aga aag cga aag act cgt ttg cgg tca aat atc 3008 Tyr Tyr Trp Ser Ser Arg Lys Arg Lys Thr Arg Leu Arg Ser Asn Ile 935 940 945 aaa agc aga agt tcg ccc gtt gcc agc gca ata tcc agt tta tca ccg 3056 Lys Ser Arg Ser Ser Pro Val Ala Ser Ala Ile Ser Ser Leu Ser Pro 950 955 960 aaa cca ttt atg gga aag gtt ttc tcc cac atg aaa gca ggt gca gtg 3104 Lys Pro Phe Met Gly Lys Val Phe Ser His Met Lys Ala Gly Ala Val 965 970 975 cgc acc aag cga gga act aag agt ttc att gac gca agg tgt ttg ggt 3152 Arg Thr Lys Arg Gly Thr Lys Ser Phe Ile Asp Ala Arg Cys Leu Gly 980 985 990 995 att tca acc tac ttt gta gga tca cta atg cgc aag ttt cct agt gcg 3200 Ile Ser Thr Tyr Phe Val Gly Ser Leu Met Arg Lys Phe Pro Ser Ala 1000 1005 1010 aaa gta ctg ctt agt agt tta ttc gta ttg gga gcg ctt cta aat ata 3248 Lys Val Leu Leu Ser Ser Leu Phe Val Leu Gly Ala Leu Leu Asn Ile 1015 1020 1025 aca cgt gct gcg aat agg ata ata att gat aat cgc att tca cgc gaa 3296 Thr Arg Ala Ala Asn Arg Ile Ile Ile Asp Asn Arg Ile Ser Arg Glu 1030 1035 1040 cat gca gca gca ttg gaa ttg tat agg aaa gaa gat act tgc cat gag 3344 His Ala Ala Ala Leu Glu Leu Tyr Arg Lys Glu Asp Thr Cys His Glu 1045 1050 1055 tta tac acc gca ctc gag cgg aag ttg gga gaa aaa cca acc tgg gac 3392 Leu Tyr Thr Ala Leu Glu Arg Lys Leu Gly Glu Lys Pro Thr Trp Asp 1060 1065 1070 1075 gag tac tgc tca tat gtg gct aag att aat cct gca acg cta gaa ttc 3440 Glu Tyr Cys Ser Tyr Val Ala Lys Ile Asn Pro Ala Thr Leu Glu Phe 1080 1085 1090 att aag gac tca tat gat gaa aaa cag gtc atc cac caa aga tca act 3488 Ile Lys Asp Ser Tyr Asp Glu Lys Gln Val Ile His Gln Arg Ser Thr 1095 1100 1105 gaa gat ctc aag aaa gtt gaa cac ata ata gca ttt gtt aca ctg gca 3536 Glu Asp Leu Lys Lys Val Glu His Ile Ile Ala Phe Val Thr Leu Ala 1110 1115 1120 ata atg ctt ttt gat tct gaa agg agt gat tgt gta ttc aaa act ttg 3584 Ile Met Leu Phe Asp Ser Glu Arg Ser Asp Cys Val Phe Lys Thr Leu 1125 1130 1135 aac aag ttt aag ggt gtt gtg tgc tca cta ggt tca gaa gtt aga cat 3632 Asn Lys Phe Lys Gly Val Val Cys Ser Leu Gly Ser Glu Val Arg His 1140 1145 1150 1155 cag tct ttg gat gat ttt gtg aat aca atg gat gag aag aat ttc gtt 3680 Gln Ser Leu Asp Asp Phe Val Asn Thr Met Asp Glu Lys Asn Phe Val 1160 1165 1170 gtt gat ttt gaa ttg aat gat agt gtc caa agg aag aat cta aca act 3728 Val Asp Phe Glu Leu Asn Asp Ser Val Gln Arg Lys Asn Leu Thr Thr 1175 1180 1185 gag atc acc ttt gaa aac tgg tgg gat gag caa gtt gct cgg ggt ttc 3776 Glu Ile Thr Phe Glu Asn Trp Trp Asp Glu Gln Val Ala Arg Gly Phe 1190 1195 1200 aca ata cca cac tat aga aca gag ggg agg ttt atg gaa ttc aca aga 3824 Thr Ile Pro His Tyr Arg Thr Glu Gly Arg Phe Met Glu Phe Thr Arg 1205 1210 1215 gca aca gca gct aaa gtc gct agt gat ata tca atc tca tct gag cgc 3872 Ala Thr Ala Ala Lys Val Ala Ser Asp Ile Ser Ile Ser Ser Glu Arg 1220 1225 1230 1235 gac ttt ttg att cga gga gct gtg ggt tct ggt aaa tcc act ggg tta 3920 Asp Phe Leu Ile Arg Gly Ala Val Gly Ser Gly Lys Ser Thr Gly Leu 1240 1245 1250 cca cac cat ttg agc act tac ggc agg gtt ttg ctg ata gaa cca aca 3968 Pro His His Leu Ser Thr Tyr Gly Arg Val Leu Leu Ile Glu Pro Thr 1255 1260 1265 cgg cca cta gca gaa aat gtt ttc aaa cag tta tct ggt ggt cca ttt 4016 Arg Pro Leu Ala Glu Asn Val Phe Lys Gln Leu Ser Gly Gly Pro Phe 1270 1275 1280 ttt cta aaa ccc aca atg aga atg cgt ggt aat agt gtg ttt ggg tcg 4064 Phe Leu Lys Pro Thr Met Arg Met Arg Gly Asn Ser Val Phe Gly Ser 1285 1290 1295 tcg cct att tct gta atg aca agt ggg ttt gct ttg cat ttc ttt gct 4112 Ser Pro Ile Ser Val Met Thr Ser Gly Phe Ala Leu His Phe Phe Ala 1300 1305 1310 1315 aat aac atc act caa ctt caa gag att cag ttt ata att ata gac gag 4160 Asn Asn Ile Thr Gln Leu Gln Glu Ile Gln Phe Ile Ile Ile Asp Glu 1320 1325 1330 tgc cat gtt atg gat gca tct tca atg gca ttt aga agc tta att cat 4208 Cys His Val Met Asp Ala Ser Ser Met Ala Phe Arg Ser Leu Ile His 1335 1340 1345 aca tac cac act aat tgt aag gtt ttg aag gtt tca gca aca cca cct 4256 Thr Tyr His Thr Asn Cys Lys Val Leu Lys Val Ser Ala Thr Pro Pro 1350 1355 1360 ggc aga gag gtg gag ttc aca aca caa ttc cca gtg aaa tta gtg gtt 4304 Gly Arg Glu Val Glu Phe Thr Thr Gln Phe Pro Val Lys Leu Val Val 1365 1370 1375 gaa gat agt ctg tct ttt aag aca ttt gtt gag agt caa ggc aca ggt 4352 Glu Asp Ser Leu Ser Phe Lys Thr Phe Val Glu Ser Gln Gly Thr Gly 1380 1385 1390 1395 agc aat tgt gac atg atc caa tac gga aat aac tta tta gtg tat gta 4400 Ser Asn Cys Asp Met Ile Gln Tyr Gly Asn Asn Leu Leu Val Tyr Val 1400 1405 1410 gct agt tat aat gaa gta gac caa ctg tca aaa tta cta gta gct cgt 4448 Ala Ser Tyr Asn Glu Val Asp Gln Leu Ser Lys Leu Leu Val Ala Arg 1415 1420 1425 gag ttc aat gtc acg aaa gta gat ggt agg acg atg aag cat ggt gag 4496 Glu Phe Asn Val Thr Lys Val Asp Gly Arg Thr Met Lys His Gly Glu 1430 1435 1440 ctc gag att gtg aca cga gga aca aag agt aag cca cac ttt gtt gtc 4544 Leu Glu Ile Val Thr Arg Gly Thr Lys Ser Lys Pro His Phe Val Val 1445 1450 1455 gcc act aat att att gaa aat gga gta act ttg gat ata gat gtt gtt 4592 Ala Thr Asn Ile Ile Glu Asn Gly Val Thr Leu Asp Ile Asp Val Val 1460 1465 1470 1475 att gac ttt gga atg aaa gtt agc cca ttt tta gat gta gat aat agg 4640 Ile Asp Phe Gly Met Lys Val Ser Pro Phe Leu Asp Val Asp Asn Arg 1480 1485 1490 tct gta gca tac aat aag gtc tcc att agt tac gga gaa cga att cag 4688 Ser Val Ala Tyr Asn Lys Val Ser Ile Ser Tyr Gly Glu Arg Ile Gln 1495 1500 1505 cgg ctt gga agg gta ggt cgc ata cag aag ggc acc gca ctt cgg ata 4736 Arg Leu Gly Arg Val Gly Arg Ile Gln Lys Gly Thr Ala Leu Arg Ile 1510 1515 1520 ggt cac act gag aaa ggg cta ata gaa ata cct caa atg ata tca act 4784 Gly His Thr Glu Lys Gly Leu Ile Glu Ile Pro Gln Met Ile Ser Thr 1525 1530 1535 gaa gct gct ttg tat tgc ttt gcg tac aat tta cca gtc atg tct agt 4832 Glu Ala Ala Leu Tyr Cys Phe Ala Tyr Asn Leu Pro Val Met Ser Ser 1540 1545 1550 1555 ggc gtc tcc aca agc atg att aaa aat tgt aca ata cca caa gtt cgc 4880 Gly Val Ser Thr Ser Met Ile Lys Asn Cys Thr Ile Pro Gln Val Arg 1560 1565 1570 aca atg cat aca ttt gag ttg agt cca ttt ttc atg tac aat ttt gtg 4928 Thr Met His Thr Phe Glu Leu Ser Pro Phe Phe Met Tyr Asn Phe Val 1575 1580 1585 tca cat gat gga aca atg cat ccg gtt gtc cat gaa att ctc aag cgc 4976 Ser His Asp Gly Thr Met His Pro Val Val His Glu Ile Leu Lys Arg 1590 1595 1600 tat aaa ctg cgt gat tcg gtt att cca tta agt gag agt tcc atc cca 5024 Tyr Lys Leu Arg Asp Ser Val Ile Pro Leu Ser Glu Ser Ser Ile Pro 1605 1610 1615 tac aga gct tct agc gac tgg atc acg gct ggt gac tac agg cgt att 5072 Tyr Arg Ala Ser Ser Asp Trp Ile Thr Ala Gly Asp Tyr Arg Arg Ile 1620 1625 1630 1635 gga gtg aaa ctg gat atc cca gat gaa acg cga att gca ttt cat atc 5120 Gly Val Lys Leu Asp Ile Pro Asp Glu Thr Arg Ile Ala Phe His Ile 1640 1645 1650 aaa gac att cca cca caa att cac caa caa ttg tgg gag tca gtt ctc 5168 Lys Asp Ile Pro Pro Gln Ile His Gln Gln Leu Trp Glu Ser Val Leu 1655 1660 1665 aag tat aag gca tct gca gca ttc cca aca ttg cga tca tca tcg att 5216 Lys Tyr Lys Ala Ser Ala Ala Phe Pro Thr Leu Arg Ser Ser Ser Ile 1670 1675 1680 aca aag att gca tac aca ctg agc act gat tta tac gca att ccg cgt 5264 Thr Lys Ile Ala Tyr Thr Leu Ser Thr Asp Leu Tyr Ala Ile Pro Arg 1685 1690 1695 act tta gca gtt gtg gaa agc ctg ctg gaa gat gag agg aca aaa caa 5312 Thr Leu Ala Val Val Glu Ser Leu Leu Glu Asp Glu Arg Thr Lys Gln 1700 1705 1710 1715 tat caa ttc aaa agc ttg att gac aat ggt tgc tca agt atg ttc tca 5360 Tyr Gln Phe Lys Ser Leu Ile Asp Asn Gly Cys Ser Ser Met Phe Ser 1720 1725 1730 gtg gtt gga att tca aat gca ctc aga gct aaa tat tcg aaa gat tac 5408 Val Val Gly Ile Ser Asn Ala Leu Arg Ala Lys Tyr Ser Lys Asp Tyr 1735 1740 1745 acc gtg gag aat ata aat aag ctt gaa gct gtc aaa gca caa ctc aaa 5456 Thr Val Glu Asn Ile Asn Lys Leu Glu Ala Val Lys Ala Gln Leu Lys 1750 1755 1760 gag ttc cac aat cta aat ggc tct ggt gat gag tta aat ttg atc aaa 5504 Glu Phe His Asn Leu Asn Gly Ser Gly Asp Glu Leu Asn Leu Ile Lys 1765 1770 1775 aga ttc gag tcg tta caa ttt gtg cat cac cag tcc aag tct tct ctt 5552 Arg Phe Glu Ser Leu Gln Phe Val His His Gln Ser Lys Ser Ser Leu 1780 1785 1790 1795 gcg aag gcc ctt gga tta aga ggc gtt tgg aac aaa tca ctc att gtt 5600 Ala Lys Ala Leu Gly Leu Arg Gly Val Trp Asn Lys Ser Leu Ile Val 1800 1805 1810 cgc gat gcg atc att gcg gcc ggt gtt gca tgt ggt ggt gcg tgg cta 5648 Arg Asp Ala Ile Ile Ala Ala Gly Val Ala Cys Gly Gly Ala Trp Leu 1815 1820 1825 ttg tat aca tgg ttc act gga aag atg tct gaa gtg agt cat cag gga 5696 Leu Tyr Thr Trp Phe Thr Gly Lys Met Ser Glu Val Ser His Gln Gly 1830 1835 1840 cgc tct aag acg aaa aga att cag gca ttg aaa ttc agg aag gca cgt 5744 Arg Ser Lys Thr Lys Arg Ile Gln Ala Leu Lys Phe Arg Lys Ala Arg 1845 1850 1855 gat aag aga gct gga ttt gag att gat aac aat gaa gat act att gaa 5792 Asp Lys Arg Ala Gly Phe Glu Ile Asp Asn Asn Glu Asp Thr Ile Glu 1860 1865 1870 1875 gag tac ttc ggc tct gct tat act aag aaa gga aaa ggt aaa ggc aca 5840 Glu Tyr Phe Gly Ser Ala Tyr Thr Lys Lys Gly Lys Gly Lys Gly Thr 1880 1885 1890 acc gtt ggc atg ggc aaa aca aac aga cga ttc atc aac atg tat ggg 5888 Thr Val Gly Met Gly Lys Thr Asn Arg Arg Phe Ile Asn Met Tyr Gly 1895 1900 1905 ttt gag ccc ggg caa ttc tct tat atc aaa ttt gtt gat cca ctc aca 5936 Phe Glu Pro Gly Gln Phe Ser Tyr Ile Lys Phe Val Asp Pro Leu Thr 1910 1915 1920 ggt gca caa atg gag gaa aat gtt tac gct gat att gtc gat gtg caa 5984 Gly Ala Gln Met Glu Glu Asn Val Tyr Ala Asp Ile Val Asp Val Gln 1925 1930 1935 gac aaa ttt ggt gag att cgg agg caa atg ata att gat gac gag ttg 6032 Asp Lys Phe Gly Glu Ile Arg Arg Gln Met Ile Ile Asp Asp Glu Leu 1940 1945 1950 1955 gat aac cga caa aca gaa gtc cat aac act att cat gct tac ctc ata 6080 Asp Asn Arg Gln Thr Glu Val His Asn Thr Ile His Ala Tyr Leu Ile 1960 1965 1970 aaa gat tgg tca aat aag gca tta aaa gtg gac ttg act ccg cat aat 6128 Lys Asp Trp Ser Asn Lys Ala Leu Lys Val Asp Leu Thr Pro His Asn 1975 1980 1985 cct ctt cgg gta agc gat aag gca agt gcc ata atg aag ttc cct gag 6176 Pro Leu Arg Val Ser Asp Lys Ala Ser Ala Ile Met Lys Phe Pro Glu 1990 1995 2000 cgg gaa gga gaa ttg cgc caa act gga caa gca gtg gag gtt gat gtc 6224 Arg Glu Gly Glu Leu Arg Gln Thr Gly Gln Ala Val Glu Val Asp Val 2005 2010 2015 agc gac ata cca aag gaa gtt gtg aag cac gaa gcg aaa act tta atg 6272 Ser Asp Ile Pro Lys Glu Val Val Lys His Glu Ala Lys Thr Leu Met 2020 2025 2030 2035 agg ggc ctt cgt gat tac aat cca ata gcc caa act gtt tgc aag ttg 6320 Arg Gly Leu Arg Asp Tyr Asn Pro Ile Ala Gln Thr Val Cys Lys Leu 2040 2045 2050 act gta aaa tcc gaa ttg ggt gaa aca tca aca tat ggt tta ggt ttt 6368 Thr Val Lys Ser Glu Leu Gly Glu Thr Ser Thr Tyr Gly Leu Gly Phe 2055 2060 2065 ggt ggg tta atc att gca aat cac cat ttg ttc aag agc ttt aat ggc 6416 Gly Gly Leu Ile Ile Ala Asn His His Leu Phe Lys Ser Phe Asn Gly 2070 2075 2080 agt ctt gaa gtt aaa tcg cat cat ggg gtt ttt aga gtg cca aac ctg 6464 Ser Leu Glu Val Lys Ser His His Gly Val Phe Arg Val Pro Asn Leu 2085 2090 2095 atg gct ata agc gtc tta ccg ttg aag ggg aga gat atg atc ata att 6512 Met Ala Ile Ser Val Leu Pro Leu Lys Gly Arg Asp Met Ile Ile Ile 2100 2105 2110 2115 aag atg cca aag gat ttt cca gtt ttc cca caa cga ctc aaa ttc aga 6560 Lys Met Pro Lys Asp Phe Pro Val Phe Pro Gln Arg Leu Lys Phe Arg 2120 2125 2130 gaa cct gcg tca aca gac aga gtg tgt ctc att ggt tca aac ttc caa 6608 Glu Pro Ala Ser Thr Asp Arg Val Cys Leu Ile Gly Ser Asn Phe Gln 2135 2140 2145 gaa aga tac att tct aca aca gtg tca gaa acc agt gcc act cac cca 6656 Glu Arg Tyr Ile Ser Thr Thr Val Ser Glu Thr Ser Ala Thr His Pro 2150 2155 2160 gtc cca cgc agc aca ttt tgg aag cat tgg atc tcc aca gat gat ggt 6704 Val Pro Arg Ser Thr Phe Trp Lys His Trp Ile Ser Thr Asp Asp Gly 2165 2170 2175 cat tgt ggt ttg cct att gtt agc aca aca gat gga ttt atc cta ggg 6752 His Cys Gly Leu Pro Ile Val Ser Thr Thr Asp Gly Phe Ile Leu Gly 2180 2185 2190 2195 cta cat agt tta gca aat aat agg aac agt gaa aat tat tac act gct 6800 Leu His Ser Leu Ala Asn Asn Arg Asn Ser Glu Asn Tyr Tyr Thr Ala 2200 2205 2210 ttc gat tct gat ttt gaa atg aaa ata tta agg agt gga gaa aac acc 6848 Phe Asp Ser Asp Phe Glu Met Lys Ile Leu Arg Ser Gly Glu Asn Thr 2215 2220 2225 gag tgg gtg aag aat tgg aag tat aat cca gac aca gtt ttg tgg gga 6896 Glu Trp Val Lys Asn Trp Lys Tyr Asn Pro Asp Thr Val Leu Trp Gly 2230 2235 2240 cct cta caa ctc acc aag gga aca ccg agt gga atg ttt aaa acc acc 6944 Pro Leu Gln Leu Thr Lys Gly Thr Pro Ser Gly Met Phe Lys Thr Thr 2245 2250 2255 aag atg att gaa gac tta ctg gca ttc aag agt gaa tgt gtg agg gag 6992 Lys Met Ile Glu Asp Leu Leu Ala Phe Lys Ser Glu Cys Val Arg Glu 2260 2265 2270 2275 caa gca cac aca tca cct tgg atg ctt gaa gtc ctg aaa gag aat ttg 7040 Gln Ala His Thr Ser Pro Trp Met Leu Glu Val Leu Lys Glu Asn Leu 2280 2285 2290 aag gcc gtt gca tat atg aag agt caa ctc gtc acc aag cat gtt gtg 7088 Lys Ala Val Ala Tyr Met Lys Ser Gln Leu Val Thr Lys His Val Val 2295 2300 2305 aag ggt gag tgt acg atg ttt aaa cag tat ttg cag gaa aac tcc agg 7136 Lys Gly Glu Cys Thr Met Phe Lys Gln Tyr Leu Gln Glu Asn Ser Arg 2310 2315 2320 gca aat gag ttt ttc cag cct aag atg tgg gcg tat gga aag agt atg 7184 Ala Asn Glu Phe Phe Gln Pro Lys Met Trp Ala Tyr Gly Lys Ser Met 2325 2330 2335 ttg aat aag gaa gcc tat atc aag gat ata atg aaa tat tca aaa gtc 7232 Leu Asn Lys Glu Ala Tyr Ile Lys Asp Ile Met Lys Tyr Ser Lys Val 2340 2345 2350 2355 att gat gta gga gta gtc gat tgc gac gca ttt gag gaa gct atc att 7280 Ile Asp Val Gly Val Val Asp Cys Asp Ala Phe Glu Glu Ala Ile Ile 2360 2365 2370 aga gtt att gta tac atg cag atc cat ggc ttt cgc aaa tgt tct tac 7328 Arg Val Ile Val Tyr Met Gln Ile His Gly Phe Arg Lys Cys Ser Tyr 2375 2380 2385 atc aca gat gaa gag gag ata ttc aag gca ttg aat atg aac aca gct 7376 Ile Thr Asp Glu Glu Glu Ile Phe Lys Ala Leu Asn Met Asn Thr Ala 2390 2395 2400 gtt gga gct atg tat ggg gga aag aaa aag gag tac ttt gaa aag ttc 7424 Val Gly Ala Met Tyr Gly Gly Lys Lys Lys Glu Tyr Phe Glu Lys Phe 2405 2410 2415 aca aca gag gat aag gct gag att ctc cgg caa agc tgt ttg agg ttg 7472 Thr Thr Glu Asp Lys Ala Glu Ile Leu Arg Gln Ser Cys Leu Arg Leu 2420 2425 2430 2435 tac acg ggt aaa ctg ggt gtg tgg aat ggg tct cta aaa gct gaa ctg 7520 Tyr Thr Gly Lys Leu Gly Val Trp Asn Gly Ser Leu Lys Ala Glu Leu 2440 2445 2450 agg agt aag gaa aag ata gag gct aat aag aca cgg act ttc aca gca 7568 Arg Ser Lys Glu Lys Ile Glu Ala Asn Lys Thr Arg Thr Phe Thr Ala 2455 2460 2465 gcc cca att gat act tta tta ggt ggt aag gtg tgt gta gat gat ttc 7616 Ala Pro Ile Asp Thr Leu Leu Gly Gly Lys Val Cys Val Asp Asp Phe 2470 2475 2480 aac aac cag ttt tat tcg aaa aat att gaa tgt tgt tgg acg gtt ggg 7664 Asn Asn Gln Phe Tyr Ser Lys Asn Ile Glu Cys Cys Trp Thr Val Gly 2485 2490 2495 atg acc aaa ttt tat ggt gga tgg aat aag ctt ttg aca gct ttg cct 7712 Met Thr Lys Phe Tyr Gly Gly Trp Asn Lys Leu Leu Thr Ala Leu Pro 2500 2505 2510 2515 gat gga tgg ata tat tgt gat gca gat ggc tcg caa ttc gat agt tca 7760 Asp Gly Trp Ile Tyr Cys Asp Ala Asp Gly Ser Gln Phe Asp Ser Ser 2520 2525 2530 ttg aca cct tac ctc ata aat gct gta ttg act ata cgg tat gct ttc 7808 Leu Thr Pro Tyr Leu Ile Asn Ala Val Leu Thr Ile Arg Tyr Ala Phe 2535 2540 2545 atg gaa gat tgg gac att ggg tat aag atg ttg caa aac ttg tac aca 7856 Met Glu Asp Trp Asp Ile Gly Tyr Lys Met Leu Gln Asn Leu Tyr Thr 2550 2555 2560 gaa ata atc tac aca cca ata tcc acg cct gat gga aca atc gtg aag 7904 Glu Ile Ile Tyr Thr Pro Ile Ser Thr Pro Asp Gly Thr Ile Val Lys 2565 2570 2575 aag ttc aga ggc aat aac agt ggg caa cct tcc acc gtt gta gac aac 7952 Lys Phe Arg Gly Asn Asn Ser Gly Gln Pro Ser Thr Val Val Asp Asn 2580 2585 2590 2595 tca ctt atg gtt gta ctt gct atg cat tat gca ttt gta cgg gaa ggt 8000 Ser Leu Met Val Val Leu Ala Met His Tyr Ala Phe Val Arg Glu Gly 2600 2605 2610 gtg gta ttt gaa gaa att gac tcc ata tgc aag ttc ttc gtt aat gga 8048 Val Val Phe Glu Glu Ile Asp Ser Ile Cys Lys Phe Phe Val Asn Gly 2615 2620 2625 gat gat ttg cta ata gcc gtg aac cca gga cgt gaa aac tta ttg 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tct gaa gga aaa gct cca tat att tct gaa cta 8432 Tyr Ala Asp Leu Ala Ser Glu Gly Lys Ala Pro Tyr Ile Ser Glu Leu 2740 2745 2750 2755 gct cta aag aag cta tat ctg aat cag gat gta caa aat gat gag ctt 8480 Ala Leu Lys Lys Leu Tyr Leu Asn Gln Asp Val Gln Asn Asp Glu Leu 2760 2765 2770 cag gtc tac ctc aga tat ttc gct gaa gca gat gaa gag ttt gaa tgt 8528 Gln Val Tyr Leu Arg Tyr Phe Ala Glu Ala Asp Glu Glu Phe Glu Cys 2775 2780 2785 ggt aca tat gaa gtc cat cat cag agc agc atg gag agc gac gag agc 8576 Gly Thr Tyr Glu Val His His Gln Ser Ser Met Glu Ser Asp Glu Ser 2790 2795 2800 ggc ctg ccc gcc atg gag atc gag tgc cgc atc acc ggc acc ctg aac 8624 Gly Leu Pro Ala Met Glu Ile Glu Cys Arg Ile Thr Gly Thr Leu Asn 2805 2810 2815 ggc gtg gag ttc gag ctg gtg ggc ggc gga gag ggc acc ccc gag cag 8672 Gly Val Glu Phe Glu Leu Val Gly Gly Gly Glu Gly Thr Pro Glu Gln 2820 2825 2830 2835 ggc cgc atg acc aac aag atg aag agc acc aaa ggc gcc ctg acc ttc 8720 Gly Arg Met Thr Asn Lys Met Lys Ser Thr Lys Gly Ala Leu Thr Phe 2840 2845 2850 agc ccc tac ctg ctg agc cac gtg atg ggc tac ggc ttc tac cac ttc 8768 Ser Pro Tyr Leu Leu Ser His Val Met Gly Tyr Gly Phe Tyr His Phe 2855 2860 2865 ggc acc tac ccc agc ggc tac gag aac ccc ttc ctg cac gcc atc aac 8816 Gly Thr Tyr Pro Ser Gly Tyr Glu Asn Pro Phe Leu His Ala Ile Asn 2870 2875 2880 aac ggc ggc tac acc aac gcc cgc atc gag aag tac gag gac ggc ggc 8864 Asn Gly Gly Tyr Thr Asn Ala Arg Ile Glu Lys Tyr Glu Asp Gly Gly 2885 2890 2895 gtg ctg cac gtg agc ttc agc tac cgc tac gag gcc ggc cgc gtg atc 8912 Val Leu His Val Ser Phe Ser Tyr Arg Tyr Glu Ala Gly Arg Val Ile 2900 2905 2910 2915 ggc gac ttc aag gtg atg ggc acc ggc ttc ccc gag gac agc gtg atc 8960 Gly Asp Phe Lys Val Met Gly Thr Gly Phe Pro Glu Asp Ser Val Ile 2920 2925 2930 ttc acc gac aag atc atc cgc agc aac gcc acc gtg gag cac ctg cac 9008 Phe Thr Asp Lys Ile Ile Arg Ser Asn Ala Thr Val Glu His Leu His 2935 2940 2945 ccc atg ggc gat aac gat ctg gat ggc agc ttc acc cgc acc ttc agc 9056 Pro Met Gly Asp Asn Asp Leu Asp Gly Ser Phe Thr Arg Thr Phe Ser 2950 2955 2960 ctg cgc gac ggc ggc tac tac agc tcc gtg gtg gac agc cac atg cac 9104 Leu Arg Asp Gly Gly Tyr Tyr Ser Ser Val Val Asp Ser His Met His 2965 2970 2975 ttc aag agc gcc atc cac ccc agc atc ctg cag aac ggg ggc ccc atg 9152 Phe Lys Ser Ala Ile His Pro Ser Ile Leu Gln Asn Gly Gly Pro Met 2980 2985 2990 2995 ttc gcc ttc cgc cgc gtg gag gag gat cac agc aac acc gag ctg ggc 9200 Phe Ala Phe Arg Arg Val Glu Glu Asp His Ser Asn Thr Glu Leu Gly 3000 3005 3010 atc gtg gag tac cag cac gcc ttc aag acc ccg gat gca gat gcc ggt 9248 Ile Val Glu Tyr Gln His Ala Phe Lys Thr Pro Asp Ala Asp Ala Gly 3015 3020 3025 gaa gaa tat gaa gtt cat cat cag agc agc tca aga tca gac aca ttg 9296 Glu Glu Tyr Glu Val His His Gln Ser Ser Ser Arg Ser Asp Thr Leu 3030 3035 3040 gac gct gga gag gag aaa aag aaa aat aaa gaa gta gcc act gtg tcc 9344 Asp Ala Gly Glu Glu Lys Lys Lys Asn Lys Glu Val Ala Thr Val Ser 3045 3050 3055 gat gga atg aaa aag aag gag gtt gaa tca aca cgc gat tct gat gtg 9392 Asp Gly Met Lys Lys Lys Glu Val Glu Ser Thr Arg Asp Ser Asp Val 3060 3065 3070 3075 aat gcg gga act gtt gga aca ttc acc gtt cca aga atc aaa tca atc 9440 Asn Ala Gly Thr Val Gly Thr Phe Thr Val Pro Arg Ile Lys Ser Ile 3080 3085 3090 act gag gag atg cgt atg cca aaa caa aag aaa aag ggt gtt ctc aac 9488 Thr Glu Glu Met Arg Met Pro Lys Gln Lys Lys Lys Gly Val Leu Asn 3095 3100 3105 ttg gct cat tta ctt gaa tac aaa cca agc caa gtc gac ata tcg aat 9536 Leu Ala His Leu Leu Glu Tyr Lys Pro Ser Gln Val Asp Ile Ser Asn 3110 3115 3120 act cgt tca acc cag gca caa ttt gac aat tgg tat aat gaa gtt atg 9584 Thr Arg Ser Thr Gln Ala Gln Phe Asp Asn Trp Tyr Asn Glu Val Met 3125 3130 3135 aaa gca tac gat cta caa gag gag gca atg ggt aca gtg atg aat ggc 9632 Lys Ala Tyr Asp Leu Gln Glu Glu Ala Met Gly Thr Val Met Asn Gly 3140 3145 3150 3155 tta atg gtt tgg tgc att gaa aat ggc acg tcc cca aat att agt gga 9680 Leu Met Val Trp Cys Ile Glu Asn Gly Thr Ser Pro Asn Ile Ser Gly 3160 3165 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Leu Asp Gly Gly Ile Gly Thr Gln 3270 3275 3280 gga gaa aac aca gag cgc cat acc act gaa gat gtg agc ccc gac atg 10064 Gly Glu Asn Thr Glu Arg His Thr Thr Glu Asp Val Ser Pro Asp Met 3285 3290 3295 cat acc ctg ctt ggg gtc aga aat atg tgactgatg tggtctctgg 10110 His Thr Leu Leu Gly Val Arg Asn Met 3300 3305 gatgaaatat tattatatgt agtatgcaat atatagtatg gcttttctcg ttccagtctt 10170 tatattaatg agagtaactt aagtaagtaa tttgtacttc aaggattaat caaggtgact 10230 ctttgacact ctcagtgagg tgacttgttt agtctgagtt tacttatcgt gagtataaag 10290 aatctctcag aaaacgagag tgacttctag acacactcta ggaggtgacc gtagttggca 10350 tgagagagac aaaaaaaaaa aaaaa 10375 <210> 4 <211> 3308 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 4 Met Ala Ile Asn Val Ile Gln Phe Gly Ser Phe Val Cys Asn Leu Pro 1 5 10 15 Lys Phe Gln Ser Ser Cys Thr Thr Met His Cys Pro Lys Gln Ser Ile 20 25 30 Ser Thr Asn Val Val His Pro Ser Asn Pro Phe Ala Glu Leu Glu Glu 35 40 45 Arg Leu Glu Pro Tyr Leu Gln Arg Arg Met Asp Ala Thr Ile Arg Leu 50 55 60 Thr Arg Gly Gly 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Lys Leu Leu Thr 2500 2505 2510 Ala Leu Pro Asp Gly Trp Ile Tyr Cys Asp Ala Asp Gly Ser Gln Phe 2515 2520 2525 Asp Ser Ser Leu Thr Pro Tyr Leu Ile Asn Ala Val Leu Thr Ile Arg 2530 2535 2540 Tyr Ala Phe Met Glu Asp Trp Asp Ile Gly Tyr Lys Met Leu Gln Asn 2545 2550 2555 2560 Leu Tyr Thr Glu Ile Ile Tyr Thr Pro Ile Ser Thr Pro Asp Gly Thr 2565 2570 2575 Ile Val Lys Lys Phe Arg Gly Asn Asn Ser Gly Gln Pro Ser Thr Val 2580 2585 2590 Val Asp Asn Ser Leu Met Val Val Leu Ala Met His Tyr Ala Phe Val 2595 2600 2605 Arg Glu Gly Val Val Phe Glu Glu Ile Asp Ser Ile Cys Lys Phe Phe 2610 2615 2620 Val Asn Gly Asp Asp Leu Leu Ile Ala Val Asn Pro Gly Arg Glu Asn 2625 2630 2635 2640 Leu Leu Asp Thr Leu Ser Ser His Phe Ser Asp Leu Gly Leu Asn Tyr 2645 2650 2655 Asp Phe Ser Ser Arg Thr Arg Asp Lys Ser Glu Leu Trp Phe Met Ser 2660 2665 2670 His Cys Gly Ile Pro Val Glu Gly Met Tyr Ile Pro Lys Leu Glu Glu 2675 2680 2685 Glu Arg Ile Val Ser Ile Leu Gln Trp Asp Arg Ala Glu Leu Pro Glu 2690 2695 2700 Tyr Arg Leu Glu Ala Ile Cys Ala Ala Met Ile Glu Ser Trp Gly Tyr 2705 2710 2715 2720 Pro Gln Leu Thr His Glu Ile Arg Arg Phe Tyr Ser Trp Leu Ile Glu 2725 2730 2735 Lys Asn Pro Tyr Ala Asp Leu Ala Ser Glu Gly Lys Ala Pro Tyr Ile 2740 2745 2750 Ser Glu Leu Ala Leu Lys Lys Leu Tyr Leu Asn Gln Asp Val Gln Asn 2755 2760 2765 Asp Glu Leu Gln Val Tyr Leu Arg Tyr Phe Ala Glu Ala Asp Glu Glu 2770 2775 2780 Phe Glu Cys Gly Thr Tyr Glu Val His His Gln Ser Ser Met Glu Ser 2785 2790 2795 2800 Asp Glu Ser Gly Leu Pro Ala Met Glu Ile Glu Cys Arg Ile Thr Gly 2805 2810 2815 Thr Leu Asn Gly Val Glu Phe Glu Leu Val Gly Gly Gly Glu Gly Thr 2820 2825 2830 Pro Glu Gln Gly Arg Met Thr Asn Lys Met Lys Ser Thr Lys Gly Ala 2835 2840 2845 Leu Thr Phe Ser Pro Tyr Leu Leu Ser His Val Met Gly Tyr Gly Phe 2850 2855 2860 Tyr His Phe Gly Thr Tyr Pro Ser Gly Tyr Glu Asn Pro Phe Leu His 2865 2870 2875 2880 Ala Ile Asn Asn Gly Gly Tyr Thr Asn Ala Arg Ile Glu Lys Tyr Glu 2885 2890 2895 Asp Gly Gly Val Leu His Val Ser Phe Ser Tyr Arg 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Leu Ala His Leu Leu Glu Tyr Lys Pro Ser Gln Val Asp 3105 3110 3115 3120 Ile Ser Asn Thr Arg Ser Thr Gln Ala Gln Phe Asp Asn Trp Tyr Asn 3125 3130 3135 Glu Val Met Lys Ala Tyr Asp Leu Gln Glu Glu Ala Met Gly Thr Val 3140 3145 3150 Met Asn Gly Leu Met Val Trp Cys Ile Glu Asn Gly Thr Ser Pro Asn 3155 3160 3165 Ile Ser Gly Thr Trp Thr Met Met Asp Gly Asp Glu Gln Val Glu Phe 3170 3175 3180 Pro Leu Lys Pro Val Ile Glu Asn Ala Lys Pro Thr Phe Arg Gln Ile 3185 3190 3195 3200 Met Ala His Phe Ser Asp Val Ala Glu Ala Tyr Ile Glu Met Arg Asn 3205 3210 3215 Lys Gln Glu Pro Tyr Met Pro Arg Tyr Gly Leu Val Arg Asn Leu Arg 3220 3225 3230 Asp Met Gly Leu Ala Arg Tyr Ala Phe Asp Phe Tyr Glu Val Thr Ser 3235 3240 3245 Arg Thr Ser Thr Arg Ala Arg Glu Ala His Ile Gln Met Lys Ala Ala 3250 3255 3260 Ala Leu Lys Ser Ala Gln Thr Arg Leu Phe Gly Leu Asp Gly Gly Ile 3265 3270 3275 3280 Gly Thr Gln Gly Glu Asn Thr Glu Arg His Thr Thr Glu Asp Val Ser 3285 3290 3295 Pro Asp Met His Thr Leu Leu Gly Val Arg Asn Met 3300 3305 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Bacteriophage SP6 <400> 5 atttaggtga cactatagaa 20

Claims (12)

  1. 서열목록 제1서열의 서열 168 내지 서열 9371의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 핵산분자에 있어서 9304번째 염기가 G인 경우 A 염기로 치환하여 진딧물 매개 전염성이 제거된 고추모틀바이러스(pepper mottle virus)-유래 식물 감염성 핵산분자를 제조하는 방법.
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  12. 서열목록 제1서열의 서열 168 내지 서열 9371의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 핵산분자에 있어서 9304번째 서열이 G인 경우 A 염기로 치환하는 단계를 포함하는 고추모틀바이러스(pepper mottle virus)-유래 식물 감염성 핵산분자에서 진딧물 매개 전염성을 제거하는 방법.
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