ES2350187T3

ES2350187T3 - Sistema de expresión de plantas derivado de virus de arn de dos componentes.

Info

Publication number: ES2350187T3
Application number: ES05701045T
Authority: ES
Inventors: Yuri Gleba; Sylvestre Marillonnet; Victor Klimyuk; Carola Engler
Original assignee: Icon Genetics AG
Current assignee: Icon Genetics AG
Priority date: 2004-01-23
Filing date: 2005-01-19
Publication date: 2011-01-19
Anticipated expiration: 2025-01-19
Also published as: DK1706497T3; CA2554214A1; EP1706497B1; US20070300330A1; AU2005206283A1; WO2005071090A8; DE602005023581D1; AU2005206283B2; US8597950B2; JP2007518412A; WO2005071090A1; ATE481494T1; EP1564295A1; EP1706497A1

Abstract

Sistema para replicar o para replicar y expresar una secuencia de interés en una planta, que comprende: (i) un precursor de ADN de un replicón de ARN, derivando dicho replicón de ARN de un virus de ARN monocatenario de sentido positivo y que comprende al menos una secuencia de interés, conteniendo dicho precursor de ADN de dicho replicón de ARN, en la ORF de replicasa o en una ORF de proteína de desplazamiento de dicho replicón de ARN, uno o más intrones cerca o en lugares ricos en A/U de secuencias derivadas de dicho virus de ARN; y (ii) un precursor de ADN de un replicón auxiliar, en el que dicho replicón auxiliar (a) no puede desplazarse sistémicamente en una planta tanto en presencia como en ausencia de dicho replicón de ARN (i), y (b) puede expresar una planta o una o más proteínas necesarias para el desplazamiento sistémico de dicho replicón de ARN (i), por lo que la no posibilidad de desplazamiento sistémico de dicho replicón auxiliar se debe a la ausencia de un origen funcional de ensamblaje de las partículas virales o se debe a una incompatibilidad de dicha una o más proteínas definidas en el punto (b) con dicho replicón auxiliar (ii); por lo que dicho replicón de ARN (i) puede replicar o replicar y expresar dicha secuencia de interés en una planta, pero no puede desplazarse sistémicamente en una planta en ausencia de dicha una o más proteínas expresadas por dicho replicón auxiliar (ii).

Description

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un sistema de vector viral para la replicación o para la expresión de una secuencia de interés en una planta. La invención también proporciona un proceso para replicar y/o expresar una secuencia de interés en una planta. Este proceso puede usarse para expresar una proteína de interés en plantas, particularmente en plantas de cultivo. El sistema puede basarse en una gran diversidad de vectores virales diferentes. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los sistemas de expresión basados en virus se pueden usar para la producción rápida de proteínas en plantas (como revisión véase: Porta & Lomonossoff, 1996, Mol. Biotechnol., 5 209-221; Yusibov et al., 1999, Curr.Top. Microbiol. Immunol., 240, 81-94) y son una herramienta poderosa para los estudios funcionales en genómica (Dalmay et al., 2000, Plant Cell, 12 369-379; Ratcliff et al., 2001, Plant J., 25, 237-245; Escobar et al., 2003, Plant Cell, 15, 1507-1523). Numerosas publicaciones y patentes en el campo describen sistemas basados en vectores virales de ADN y ARN (Kumagai et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 427-430; Mallory et al., 2002, Nature Biotechnol 20, 622-625; Mor et al., 2003, Biotechnol. Bioeng, 81; 430-437; documentos US5316931; US5589367; US5866785; US5491076; US5977438; US5981236; WO02088369; WO02097080; WO9854342). Los sistemas de vectores virales existentes normalmente están limitados a un estrecho intervalo de hospedadores, en términos de su mejor rendimiento e incluso el nivel de expresión de dichos vectores, en su hospedador más favorable, está muy por debajo de los límites biológicos superiores del sistema.

Los virus de ARN son los más adecuados para usar como vectores de expresión, ya que ofrecen un nivel de expresión más alto en comparación con los virus de ADN. Existen varias patentes publicadas que describen vectores virales adecuados para la expresión sistémica de material transgénico en plantas (documentos US5316931; US5589367; US5866785). En general, estos vectores pueden expresar un gen extraño como una fusión traduccional con una proteína viral (documentos US5491076; US5977438), a partir de un promotor subgenómico adicional (documentos US5466788; US5670353; US5866785), o a partir de ARN viral policistrónico usando elementos IRES para la traducción de proteínas independiente (documento WO0229068). El primer planteamiento -fusión traduccional de una proteína recombinante con una proteína estructural viral (Hamamoto et al., 1993, Bio Technology, 11, 930-932; Gopinath et al., 2000, Virology, 267, 159-173; documentos JP6169789; US5977438) proporciona un rendimiento significativo. Sin embargo, el uso de este planteamiento es limitado, ya que la proteína recombinante no se puede separar fácilmente de la proteína viral. Una de las versiones de este planteamiento emplea la fusión traduccional mediante una secuencia peptídica reconocida por una proteasa viral específica de sitio o mediante un péptido catalítico (Dolja et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 10208-10212; Gopinath et al., 2000, Virology, 267, 159-173; documentos US5162601; US5766885; US5491076).

Los procesos de expresión que utilizan vectores virales construidos en promotores subgenómicos heterólogos proporcionan un buen nivel de producción de proteínas (documento US5316931). La desventaja más importante de estos vectores y de muchos otros es su capacidad limitada en relación con el tamaño del ADN a amplificar. Normalmente, las construcciones estables incluyen insertos de no más de un kb. En algunas áreas de la genómica funcional en las plantas, puede que esto no sea tal limitación importante puesto que G. della-Cioppa et al. (documento WO993651) describieron el uso de vectores virales basados en TMV para expresar genotecas de ADNc en planta con objeto de silenciar genes endógenos. Adicionalmente, como estos vectores son capaces de desplazamiento sistémico y de producir proteínas de cubierta, desde la síntesis de proteínas recombinantes se dedican recursos significativos de la planta. Los bajos niveles de expresión conseguidos hasta ahora con estos sistemas de expresión viral en plantas son una razón principal de por qué estos sistemas son apenas competitivos con otros sistemas de expresión como los sistemas de expresión bacterianos, fúngicos o en células de insectos. Los bajos niveles de expresión dan lugar a costes muy elevados aguas abajo para el aislamiento y la purificación de proteínas en un enorme fondo de material de plantas. Por lo tanto, los costes para el procesamiento aguas abajo disminuyen rápidamente, a medida que aumenta la producción de la proteína o el producto de interés por unidad de biomasa vegetal. La seguridad biológica de estos vectores es también otra cuestión, ya que pueden formar partículas virales infecciosas.

Turpen (documentos US 5 811.653; US 5.889.191; US 5.965.794) desarrolló un sistema alternativo de dos componentes que necesitaba un virus auxiliar; este planteamiento se basa en un sistema de un virus y un virus auxiliar, mediante el cual el virus auxiliar proporciona una función replicasa, mientras que el replicón principal carece de actividad replicasa. Este sistema no es práctico porque la ARN polimerasa dependiente de ARN viral (replicasa) no funciona eficazmente con los ARN de sustrato proporcionados en trans. Una posible explicación de dicha ineficacia es que la ARN polimerasa dependiente de ARN del TMV es un heterodímero que consiste en una proteína de 126 kDa y una proteína completamente leída de 183 kDa (Watanabe et al., 1999, J. Virol., 73, 2633-2640). Se demostró que al menos un componente de este heterodímero, la proteína de 126 kDa, parecía funcionar principalmente en cis (Lewandowsky & Dawson, 2000, Virology, 271, 90-98). Existen varias publicaciones relacionadas con la complementación en trans de otras funciones virales, como el desplazamiento célula a célula y sistémico. Un hospedador transgénico u otro virus pueden proporcionar en trans el MP y la CP. Por ejemplo, mutantes del TMV con desplazamientos de fase de lectura dentro del gen MP o CP no fueron capaces de infectar local o sistémicamente plantas de tabaco inoculadas, pero adquirieron las funciones perdidas en las plantas de tabaco transgénicas que expresaban el gen MP o CP de tipo silvestre (Holt & Beachy, 1991, Virology, 181, 109-117; Osbourn, Sarkar & Wilson, 1990, Virology, 179, 921-925). Estos trabajos no abordaron la cuestión de crear vectores basados en virus para la expresión de una secuencia heteróloga de interés, sino que más bien estudiaron las funciones biológicas de diferentes proteínas virales. Otro trabajo describe la complementación del desplazamiento de larga distancia de un TMV carente de CP que expresaba GFP mediante un TMV quimérico que portaba la ORF3 del umbravirus de la roseta del cacahuete (GRV) (Ryabov, Robinson & Taliansky, 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 1212-12170). Sin embargo, como se deduce de los resultados, la eficacia de la expresión de la GFP en hojas de plantas sistémicas infectadas conjuntamente por el TMV carente de CP que expresa la GFP y el TMV que tiene la CP sustituida por la ORF3 del GRV fue significativamente menor que en plantas infectadas por el TMV sistémico que expresa la GFP. Parece que este bajo nivel de expresión puede deberse a la presencia y competición de ambos vectores virales en hojas sistémicas. Además, todos los experimentos mencionados anteriormente conducen a la formación de partículas virales infecciosas en hojas sistémicas y por lo tanto no son aceptables para su uso en el medio ambiente desde el punto de vista de seguridad biológica.

Otro sistema propuesto por C. Masuta et al. (documento US 5.304.731) propone el uso de un virus satélite de ARN del CMV para usarse como un transportador de la secuencia heteróloga de interés y un virus auxiliar que proporciona las funciones necesarias para la replicación del ARN del CMV. Hasta donde alcanza el conocimiento de los inventores, el sistema es altamente ineficaz.

Una cuestión importante con los sistemas de expresión en plantas basados en virus de la técnica anterior es la seguridad biológica. Por un lado, la elevada infectividad del virus recombinante es muy deseada para facilitar la propagación del virus en toda la planta y en las plantas colindantes, aumentando por lo tanto la producción del producto génico deseado. Por otro lado, dicha infectividad elevada compromete la contención del material recombinante puesto que puede producirse fácilmente la propagación a plantas no deseadas. Por consiguiente, son muy deseados los sistemas de expresión en plantas basados en virus más seguros.

Hasta ahora no existen sistemas de expresión transgénica a gran escala biológicamente seguros construidos en vectores virales de ARN en plantas que puedan desplazarse sistémicamente y proporcionar la producción y eficacia necesarias para aplicaciones técnicas. Los vectores sistémicos existentes adolecen de una baja producción de producto recombinante.

Por lo tanto, es un objeto de esta invención proporcionar un sistema de expresión viral en plantas ambientalmente seguro para la producción de alto rendimiento de una proteína de interés. Otro objeto de la invención es proporcionar un proceso de replicación y/o de expresión de una secuencia de nucleótidos de interés en una planta o parte de una planta, que tenga seguridad ecológica y biológica mejorada. Otro objeto es proporcionar un proceso de producción de proteínas en plantas que tenga una eficacia que permita una producción de proteínas competitiva a gran escala en plantas. DESCRIPCIÓN GENERAL DE LA INVENCIÓN

Los objetivos anteriores se resuelven mediante un sistema para la replicación o para la replicación y expresión de una secuencia de interés en una planta, que comprende:

(i): un replicón de ARN o un precursor del mismo, derivándose dicho replicón de ARN de un virus de ARN monocatenario de sentido positivo y comprendiendo al menos una secuencia de interés, y

(ii): un replicón auxiliar, o un precursor del mismo, en el que dicho replicón auxiliar es

(a): incapaz de desplazamiento sistémico en dicha planta tanto en presencia como en ausencia de dicho replicón de ARN

(i): y

(b): capaz de expresar en una planta una o más proteínas necesarias para el desplazamiento sistémico de dicho replicón de ARN (i),

por lo cual dicho replicón de ARN (i) es capaz de replicar o de replicar y expresar dicha secuencia de interés en dicha planta, pero es incapaz de desplazarse sistémicamente en dicha planta en ausencia de dicha una o más proteínas expresadas mediante dicho replicón auxiliar (ii), como define adicionalmente la reivindicación 1.

La invención proporciona adicionalmente un proceso de replicación o de replicación y expresión de una secuencia de interés en una planta, que comprende proporcionar a las células de dichas plantas dicho replicón de ARN

(i) y dicho replicón auxiliar (ii), como define la reivindicación 24. La invención puede usarse para replicar una secuencia de interés en una planta o para replicar una secuencia de interés y expresar dicha secuencia de interés, por ejemplo, para producir una proteína de interés como una enzima industrial o una proteína farmacéutica en dicha planta. La invención también se refiere a proteínas producidas o que pueden producirse mediante el proceso de la invención. Además, la invención proporciona un proceso de producción de proteínas en plantas o en células de plantas.

Dicho replicón de ARN (i) y/o dicho replicón auxiliar (ii) se proporcionan a una planta mediante precursores de ADN que se introducen en los núcleos celulares de dicha planta. Estos precursores de ADN pueden generar el replicón de ARN (i) y/o el replicón auxiliar (ii) mediante transcripción en los núcleos celulares. Para mejorar la formación y aumentar el replicón de ARN (i) y/o el replicón auxiliar (ii) en el citoplasma celular, dicho precursor de dicho replicón de ARN (i) y/o dicho precursor de dicho replicón auxiliar (ii) puede contener uno o más intrones. Generalmente, derivándose el precursor de ADN de dicho replicón de ARN (i) y/o el precursor de ADN de dicho replicón auxiliar

(i) que contiene las secuencias para la función de replicón (como una ORF de replicasa o una ORF de MP en el caso de que dicho replicón de ARN (i)) de secuencias de un virus de ARN, presentándose dichas secuencias para la función del replicón preferiblemente en lugares seleccionados de dicha secuencia de dichas diferencias conservativas de función del virus de ARN de dicha secuencia de dicho virus de ARN, ocasionando dichas diferencias una frecuencia aumentada de la formación del replicón de ARN (i) y/o del replicón auxiliar (ii) en comparación con unos replicones de ARN que no presentan dichas diferencias. Esta tecnología se describe con detalle en el documento PCT/EP04/012743 para un replicón de ARN y se aplica en la presente invención a dicho replicón de ARN (i) y opcionalmente a dicho replicón auxiliar (ii).

Los inventores han identificado sorprendente un nuevo principio para la replicación o para la replicación y expresión de una secuencia de interés en una planta. Los inventores han descubierto que un replicón auxiliar que no tiene la capacidad de ensamblar partículas virales, por ejemplo, cuando se proporciona a una planta mediante agro suministro como una copia de ADN, puede expresar una cantidad suficiente de proteína de cubierta en tejido localmente transfectado para restablecer el desplazamiento sistémico de dicho replicón de ARN (i). Se descubrió adicionalmente que ese desplazamiento sistémico de dicho replicón de ARN (i) dio como resultado hojas sistémicamente infectadas que expresaban la secuencia de interés pero tenían una cantidad muy reducida de proteína de cubierta en comparación con el caso en el que un virus que expresa proteína de cubierta expresa una secuencia de interés. La proteína de cubierta es normalmente la proteína más fuertemente expresada en células de plantas infectadas por virus. Sin embargo, con el sistema y proceso de la invención, no se agotan los recursos de las células sistémicamente infectadas mediante la expresión de la proteína de cubierta. Por consiguiente, los niveles de expresión de dicha secuencia de interés en células de plantas sistémicamente infectadas son más altos que en sistemas de expresión viral convencionales. Además, las células de plantas sistémicamente infectadas producen pequeñas cantidades de partículas virales ensambladas a partir de dicho replicón de ARN (i), por lo cual la propagación del replicón de ARN (i) a plantas hospedadoras secundarias se produce con muy poca probabilidad. Si se produce la propagación de dicho replicón de ARN

(i) a una planta no deseada en un suceso poco frecuente, no puede desplazarse sistemáticamente en dicha planta no deseada debido a la ausencia de dicho replicón auxiliar y por lo tanto plantea un riesgo ambiental insignificante. Por tanto, el sistema y el proceso de la invención poseen una seguridad ambiental/biológica excelente. Al mismo tiempo, el sistema y el proceso de la invención conservan la característica fundamental de los sistemas de expresión virales de que, para conseguir la replicación o la replicación y expresión de una secuencia de interés en otras partes de la planta, preferiblemente en toda la planta, es suficiente la infección de una parte de una planta.

Las características ventajosas de la invención pueden resumirse de la siguiente manera:

1.: El sistema proporciona infección sistémica de la planta hospedadora mediante un replicón de ARN que no tiene una proteína de cubierta y por tanto puede incluir insertos de ADN más grandes.

2.: La expresión en hojas sistémicas se dedica totalmente a la secuencia heteróloga de interés y no hay o hay escasa competición con la expresión de la proteína de cubierta.

3.: Debido a la pequeña cantidad de proteínas virales (la proteína de cubierta esta presente en pequeñas cantidades ya que la produce el replicón auxiliar en la hoja localmente infectada) y de las proteínas del hospedador (debido a la interrupción de la maquinaria biosintética de la célula de la planta), puede conseguirse la mayor producción relativa y absoluta de la proteína de interés o del ARN de interés.

4.: La producción de partículas virales ensambladas es muy baja y las partículas virales ensambladas no tienen la proteína (o proteínas) necesaria para el desplazamiento sistémico, por lo tanto el sistema de expresión es mucho más seguro, que el de un vector que conserva todas las funciones del virus de tipo silvestre.

5.: La incorporación de intrones u otras diferencias conservativas de función como se define en las reivindicaciones, en el precursor de ADN

del replicón de ARN (i) y opcionalmente también en el replicón auxiliar

(ii), mejora la eficacia del replicón de ARN (y opcionalmente del replicón

auxiliar) aumentada en el citosol, lo que proporciona la eficacia

necesaria para un proceso de producción competitivo de proteínas a

gran escala/industrial.

En este documento se describen modificaciones adicionales del replicón de ARN (i) y del replicón auxiliar (ii) que minimizan el riesgo de reconstrucción del virus de tipo silvestre debido a la recombinación entre dicho replicón de ARN (i) y dicho replicón auxiliar (ii). Además, la invención no tiene límite detectable del tamaño de la secuencia de interés a expresar, lo que permite la expresión de genes múltiples en la misma célula y planta y posee parámetros de elevada seguridad ecológica y biológica.

El sistema y el proceso de la invención pueden usarse para la replicación o para la replicación y expresión de una secuencia de interés. La replicación se refiere a la producción de ARN, particularmente la amplificación de dicha secuencia de interés junto con dicho replicón de ARN (i). La expresión se refiere a la producción de una proteína de interés codificada en dicha secuencia de interés. Preferiblemente, el sistema y el proceso de la invención se usan para la producción de una proteína de interés a partir de una secuencia de interés presente en dicho replicón de ARN (i).

El sistema de la invención comprende un precursor de ADN de dicho replicón de ARN (i) y un precursor de ADN de dicho replicón auxiliar (ii). Preferiblemente, dichos precursores de ADN están incluidos en el ADN-T de plásmidos Ti de agrobacterias. Más preferiblemente, dicho sistema de la invención es una mezcla de dos cepas de Agrobacterium, una cepa incluida en el precursor de ADN de dicho ADN-T de dicho replicón de ARN (i), incluyéndose la otra cepa en precursor de ADN de dicho ADN-T de dicho replicón auxiliar (ii). El sistema de la invención puede ser un kit para la producción de una proteína de interés, conteniendo dicho kit cualquiera de los pares de replicones, pares de precursores o mezcla de dos cepas de Agrobacterium mencionadas en este párrafo. Dicho kit puede contener adicionalmente una planta o semillas de una planta en las va a expresarse dicha secuencia de interés. Además, el sistema de la invención puede ser una planta tratada, infectada o transformada con cualquiera de los pares de replicones, pares de precursores o mezcla de dos cepas de Agrobacterium.

Un primer componente del sistema (o kit) de la invención comprende dicho precursor de ADN de dicho replicón de ARN (i). Dicho replicón de ARN (i) deriva típicamente de un virus de ARN monocatenario de sentido positivo. Los ejemplos de dichos virus son virus del mosaico del guisante pinto, virus X de la patata y virus del mosaico de la alfalfa. Los virus preferidos son los tobamovirus, siendo los más preferidos los virus del mosaico del tabaco (TMV) y los tobamovirus que infectan crucíferas. Derivar de un virus de ARN monocatenario de sentido positivo significa que dicho replicón de ARN (i) se crea típicamente usando este virus como un material de partida. Como alternativa, dicho replicón de ARN (i) puede crearse usando funciones genéticas (por ejemplo replicasa, proteína de desplazamiento) de dicho virus. Dicho replicón de ARN (i) también se puede crear usando componentes o funciones genéticas de diferentes virus de ARN monocatenarios de sentido positivo. Dicho precursor de ADN codifica dicho replicón de ARN (i) y es capaz de producir dicho replicón de ARN (i) en células de dicha planta. Como se explica adicionalmente a continuación, dicho precursor de ADN de dicho replicón de ARN (i) contiene uno o más intrones; o se ha modificado en relación al virus del que deriva mediante cambios en el uso de los codones por ejemplo eliminando sitios de corte y empalme en los que el corte y empalme destruiría la capacidad de replicón del replicón de ARN.

Para ser un replicón, dicho replicón de ARN (i) tiene que ser capaz de replicarse autónomamente en una célula de una planta. La replicación autónoma significa que el replicón codifica una replicasa (ARN polimerasa dependiente de ARN) que cataliza la replicación del replicón. Un replicón puede usar las funciones de la célula hospedadora como la maquinaria de traducción, necesaria para traducir dicha replicasa. Dicha replicasa puede proporcionarse con uno o varios intrones, particularmente si dicho replicón de ARN (i) se proporciona como un precursor de ADN en los núcleos de las células de las plantas, para aumentar la eficacia del aumento del replicón de ARN en el citoplasma (consúltense los documentos PCT/EP03/12530 y PCT/EP04/012743).

Además, dicho replicón de ARN (i) contiene dicha secuencia de interés que se va a replicar o a expresar. Preferiblemente, dicha secuencia de interés se expresa en el proceso de la invención para producir una proteína de interés. Dicha secuencia de interés es preferiblemente heteróloga a dicho (o dichos) virus de ARN monocatenario de sentido positivo a partir del cual deriva dicho replicón de ARN (i). Dicho replicón de ARN (i) generalmente contiene otras funciones genéticas necesarias para la expresión o replicación de dicha secuencia de interés como uno o más promotores subgenómicos, sitios de unión a ribosomas etc.

Dicho replicón de ARN (i) no puede desplazarse sistémicamente en dicha planta en ausencia de dicha una o más proteínas expresadas por dicho replicón auxiliar (ii). Esta propiedad se puede conseguir modificando la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína necesaria para el desplazamiento sistémico de dicho virus de ARN a partir de la cual dicho replicón de ARN (i) deriva de tal manera que esta proteína no se puede expresar en una forma funcional a partir de dicho replicón de ARN (i). La expresión en una forma funcional puede prevenirse mutando o delecionando partes de la secuencia que codifica dicha proteína o mutando o delecionando secuencias reguladoras (por ejemplo un promotor subgenómico) necesarias para la expresión de dicha proteína. En una realización preferida, dicha proteína (o dichas proteínas si dicho virus de ARN contiene más de una proteína necesaria para el desplazamiento sistémico) se deleciona en gran parte o totalmente. Dicha deleción añade varias ventajas adicionales al sistema y al proceso de la invención: se pueden incluir secuencias de interés más grandes en dicho replicón de ARN (i) sin comprometer la eficacia de dicho replicón de ARN (i), por lo cual dicha secuencia de interés puede ser mayor de 1 kb. Además, la homología entre dicho replicón de ARN (i) y dicho replicón auxiliar (ii) se reduce. De esta manera, los acontecimientos de recombinación entre dichos replicones (i) y (ii) son poco probables.

En muchos virus de plantas como tobamovirus, dicha proteína necesaria para el desplazamiento sistémico es la proteína de cubierta. Por lo tanto, dicho replicón de ARN (i) no contiene preferiblemente una fase de lectura abierta (ORF) de proteína de cubierta o carece de partes sustanciales de una ORF de proteína de cubierta. En cambio, dicha secuencia de interés puede tomar la posición de la ORF de proteína de cubierta. Esta posición es próxima a la posición 3’ en muchos virus de plantas, que es generalmente la posición de la ORF viral que se expresa más intensamente.

Para poder desplazarse sistémicamente en dicha planta en presencia de dicho replicón auxiliar, dicho replicón de ARN (i) debe tener un origen funcional de ensamblaje de las partículas virales. En el caso de los tobamovirus, el origen del ensamblaje de las partículas virales se sitúa en la ORF de la proteína de desplazamiento (MP). Por tanto se prefiere que dicho replicón de ARN (i) contenga el segmento de la secuencia u ORF que incluye el origen del ensamblaje de las partículas virales en el virus de ARN a partir del cual deriva dicho replicón de ARN (i).

El segundo componente del sistema y del proceso de la invención es dicho replicón auxiliar (ii). Dicho replicón auxiliar (ii) ayuda a dicho replicón de ARN (i) ya que puede expresar en una planta una o más proteínas necesarias para el desplazamiento sistémico de dicho replicón de ARN (i). El replicón auxiliar (ii) puede proporcionar en dicha planta cualquier proteína (o proteínas) que permita (o permitan) a dicho replicón de ARN (i) desplazarse sistémicamente en dicha planta. Preferiblemente, dicha proteína necesaria para el desplazamiento sistémico, corresponde a la delecionada o que se ha vuelto no expresable en dicho replicón de ARN (i). Más preferiblemente, es una proteína de cubierta.

Dicho replicón auxiliar (ii) puede ser un replicón de ADN y puede derivar de un virus de ADN como el virus géminis. Sin embargo, preferiblemente, dicho replicón auxiliar (ii) es un replicón de ARN y puede derivar de un virus de ARN como un virus de ARN monocatenario de sentido positivo. Dicho replicón auxiliar (ii) y dicho replicón de ARN (i) pueden derivar de los mismos o de diferentes virus de plantas, por ejemplo de un tobamovirus como el virus del mosaico del tabaco. De manera similar al igual que dicho replicón de ARN (i), dicho replicón auxiliar (ii) codifica una replicasa que puede catalizar la replicación de dicho replicón auxiliar en células de plantas.

Dicho replicón auxiliar (ii) no puede desplazarse sistémicamente en dicha planta, independientemente de si dicho replicón de ARN (i) está presente

o ausente en dicha planta. Se puede conseguir ser incapaz de desplazamiento sistémico de diversas maneras. En una realización, dicho replicón auxiliar (ii) y dicha proteína, necesaria para el desplazamiento sistémico, son incompatibles de modo que dicha proteína, necesaria para el desplazamiento sistémico de dicho replicón de ARN (i), no puede proporcionar dicho replicón auxiliar con la funcionalidad del desplazamiento sistémico. En este caso, dicho replicón de ARN (i) y dicho replicón auxiliar (ii) derivan preferiblemente de diferentes virus de plantas y el replicón auxiliar (ii) puede expresar una proteína de cubierta que proporciona dicho replicón de ARN (i) pero no dicho replicón auxiliar (ii) con la funcionalidad del desplazamiento sistémico. Como alternativa, dicho replicón de ARN (i) y dicho replicón auxiliar (ii) derivan del mismo virus de la planta.

En una realización preferida dicho replicón auxiliar (ii) no puede desplazarse sistémicamente debido a la carencia de un origen funcional de ensamblaje de partículas virales. Por consiguiente, dicha proteína, necesaria para el desplazamiento sistémico, en particular dicha proteína de cubierta, no puede compactar el replicón auxiliar (ii). El origen del ensamblaje de las partículas virales puede convertirse en disfuncional. En el TMV, el origen del ensamblaje de las partículas virales se localiza en la ORF de la proteína de desplazamiento (MP). El origen del ensamblaje de las partículas virales en la ORF de la MP también puede delecionarse. No es necesario que la ORF de la MP de dicho replicón auxiliar (ii) codifique una MP funcional. Si se desea una MP funcional para dicho replicón auxiliar (ii), dicho replicón de ARN (i) puede proporcionar, por ejemplo, la MP, además, un hospedador de plantas transgénico para la MP también puede codificar la MP. Si el origen del ensamblaje de las partículas virales se localiza en la ORF de la MP, se prefiere más que dicho replicón auxiliar carezca de la ORF de la MP. Esto tiene la ventaja adicional de que la homología entre el replicón de ARN (i), que tiene una ORF de la MP y el replicón auxiliar (ii) esté reducida, proporcionando seguridad biológica mejorada al sistema y al proceso, puesto que la probabilidad de formación del virus de ARN de tipo silvestre por recombinación homóloga no es significativa.

Experimentalmente puede ensayarse si dicho replicón auxiliar (ii) puede

o no desplazarse sistémicamente (consúltense los ejemplos) infectando una parte de una hoja de una planta con dicho replicón (o un precursor del mismo) y observando la producción del mismo replicón en otras hojas, no infectadas, (“hojas sistémicas”) de esta planta. La propiedad de no poder desplazarse sistémicamente es relativa. Se considera que dicho replicón auxiliar (ii) no puede desplazarse sistémicamente si la probabilidad de desplazamiento sistémico está sustancialmente reducida en comparación con el virus del cual deriva. En cualquier caso, la probabilidad de desplazamiento sistémico de dicho replicón auxiliar (ii) es considerablemente más baja que la de dicho replicón de ARN (i), de tal manera que la replicación o la replicación y expresión de dicha secuencia de interés a partir de dicho replicón de ARN (i) en hojas sistémicas no está suprimida en hojas sistémicas en el periodo de tiempo típico de la expresión de la proteína con sistemas de expresión virales en plantas (aproximadamente de 1 a 3 semanas). Más preferiblemente, en dicha planta no puede detectarse desplazamiento sistémico de dicho replicón auxiliar

(ii) (por ejemplo por transferencia de Western o Northern).

Preferiblemente, la planta usada en el proceso o en el sistema de la invención no contiene un gen que codifique una proteína que permita el desplazamiento sistémico de dicho replicón de ARN (i) o de dicho replicón auxiliar (ii), integrándose dicho gen establemente en un cromosoma nuclear de la planta. Esta situación comprometería la seguridad biológica del proceso o del sistema.

Para mejorar la seguridad ambiental y la eficacia del sistema, dicho replicón de ARN (i) y dicho replicón auxiliar (ii) no deben ser propensos a la recombinación entre sí. Esto puede conseguirse teniendo una baja homología entre dichos replicones (i) y (ii). Preferiblemente, dicho replicón de ARN (i) y dicho replicón auxiliar (ii) carecen de homología en regiones funcionalmente solapantes o no solapan. Las regiones funcionalmente solapantes son regiones en dichos replicones que tienen o codifican la misma función, por ejemplo la ORF de replicasa, la ORF de la MP o promotores subgenómicos. En dichas regiones la homología puede reducirse, por ejemplo, cambiando codones usando la degeneración del código genético y/o usando regiones funcionales para dicho replicón (i) y (ii) que derivan de diferentes virus de plantas.

Dependiendo de los replicones específicos, muchos acontecimientos de recombinación posibles no cambian dichos replicones o conducen a replicones no funcionales. Estas recombinaciones pueden reducir la eficacia del sistema pero no plantean un riesgo ambiental. Para conseguir la mejor seguridad ambiental, preferiblemente dicho replicón de ARN (i) y dicho replicón auxiliar (ii) carecen de una homología propensa a la recombinación en una región, en la que la recombinación entre dicho replicón de ARN (i) y dicho replicón auxiliar

(ii): crearía un replicón que puede, al mismo tiempo, (A)expresar una proteína necesaria para el desplazamiento sistémico y

(B): desplazarse sistémicamente en una planta. Dicho replicón sería comparable a vectores virales en sistemas de expresión virales convencionales en plantas. El experto en la materia puede identificar fácilmente estas regiones. En una realización en la que los dos replicones (i) y

(ii): se basan en tobamovirus y dicho replicón auxiliar (ii) carece de un origen funcional de ensamblaje de las partículas virales, dicha región es aquella cadena abajo de la localización en la ORF de la MP en la que el origen del ensamblaje se delecionó o se convirtió en no funcional. En esta región, la homología entre dicho replicón de ARN (i) y dicho replicón auxiliar (ii) debería reducirse. Puesto que en el TMV la parte 3’ de la ORF de la MP y la parte 5’ del promotor subgenómico de la CP se solapan y en algunas cepas la ORF de la MP contiene adicionalmente una parte de la ORF de la CP, las posibilidades de cambiar el uso del codón están limitadas para reducir la homología, ya que esto puede deteriorar la función del promotor subgenómico de la CP. En lugar de cambiar el uso del codón, puede usarse una sustitución funcional, es decir el uso de elementos funcionales que derivan de diferentes virus como un promotor subgenómico de diferentes virus de ARN. Son ejemplos de dichos promotores subgenómicos los promotores subgenómicos de la CP de las cepas U1 y U5 del TMV o el promotor subgenómico de la CP del crTMV (tobamovirus que infecta a crucíferas). Como un ejemplo, la CP en el replicón auxiliar puede estar bajo control del promotor subgenómico de la CP de la cepa U1 del TMV y la secuencia de interés en el replicón de ARN (i) puede estar bajo control del promotor subgenómico de la CP de la cepa U5 del TMV o del crTMV, o viceversa. En cualquier caso, tanto el promotor subgenómico de la secuencia de interés en el replicón de ARN (i) como el promotor subgenómico de la CP en el replicón auxiliar deberían ser promotores subgenómicos de la CP. En dicha realización, el virus auxiliar (ii) puede basarse en un tobamovirus (TMV) y puede contener, en dirección 5’ a 3’, (a) una (o unas) ORF de replicasa tobamoviral, un promotor subgenómico de CP, y, unido operativamente al mismo, una proteína de cubierta necesaria para el desplazamiento sistémico de dicho replicón de ARN (i), por lo que la ORF de la MP con el origen de ensamblaje de partículas se delecionará esencial o completamente. Como se ha mencionado anteriormente, el promotor subgenómico para la proteína de cubierta en el replicón auxiliar y el promotor subgenómico usado en el replicón de ARN (i) para la secuencia de interés o una proteína de desplazamiento, proceden preferiblemente de diferentes cepas de TMV.

La homología de secuencia entre dicho replicón de ARN (i) y dicho replicón auxiliar (ii), en cualquiera de los segmentos de secuencia que tenga al menos 100 nucleótidos (preferiblemente al menos 150 nucleótidos), debe ser como mucho del 90%. Dichos segmentos de secuencia se sitúan preferiblemente cadena abajo de las ORF de replicasa de dicho replicón de ARN (i) y dicho replicón auxiliar (ii). Preferiblemente, la homología de secuencia entre dicho replicón de ARN (i) y dicho replicón auxiliar (ii) en segmentos de secuencia que tienen al menos 100 nucleótidos (preferiblemente al menos 150 nucleótidos) es como mucho del 80%. Más preferiblemente, la homología de secuencia entre dicho replicón de ARN (i) y dicho replicón auxiliar (ii) en segmentos de secuencia que tienen al menos 100 nucleótidos (preferiblemente al menos 150 nucleótidos) es como mucho del 70%. Más preferiblemente, la homología de secuencia entre dicho replicón de ARN (i) y dicho replicón auxiliar (ii) en segmentos de secuencia que tienen al menos 100 nucleótidos (preferiblemente al menos 150 nucleótidos) es como mucho del 60%. En una realización muy preferida, estos valores de homología se aplican al segmento de secuencia del promotor subgenómico de la CP en el replicón auxiliar (ii) y el promotor subgenómico de la secuencia de interés en el replicón de ARN (i).

Por lo tanto, el sistema de la invención contiene al menos dichos componentes (i) y (ii). El precursor de dicho replicón de ARN (i) es ADN que codifica dicho replicón de ARN (i) y que tiene un promotor funcional en dicha planta para formar dicho replicón de ARN (i) por transcripción de dicho ADN en las células de dicha planta. De manera similar, si dicho replicón auxiliar (ii) es un replicón de ARN (replicón de ARN (ii)), el precursor de dicho replicón auxiliar

(ii) es ADN. .Dichos precursores de ADN pueden estar flanqueados por secuencias límite, derecha e izquierda, del ADN-T y pueden estar incluidos en agrobacterias. En una realización particularmente preferida de la invención, dicho sistema de la invención comprende, en un ADN-T incluido en Agrobacterium, un precursor de ADN de dicho replicón de ARN (i); y, en un ADN-T incluido en Agrobacterium, un precursor de ADN de dicho replicón auxiliar (ii). Otros precursores de ADN de dichos replicones (i) y (ii) para dicho sistema de la invención son ADN para la transformación biolística de dicha planta o para otros métodos de transformación.

Los precursores de ADN de dichos replicones típicamente tienen una secuencia que codifica dicho replicón de ARN (i) y/o dicho replicón auxiliar (ii) unido operativamente o que puede unirse a un promotor transcripcional. Si una secuencia de ADN que codifica un replicón está unida operativamente a un promotor transcripcional, el promotor transcripcional puede ser un promotor regulado, como un promotor inducible, específico de tejido o evolutivamente regulado para hacer regulable la expresión de dicha secuencia de interés. Más preferiblemente, dicho promotor es un promotor constitutivo. En este caso, el proceso de la invención se pone en marcha aplicando dichos precursores de ADN a dicha planta o partes de la misma.

El sistema de la invención puede contener adicionalmente una planta o semillas de la misma para realizar el proceso de la invención. En principio, la invención puede realizarse con cualquier planta para la que se conocen virus infecciosos. Se prefieren las plantas de cultivo incluyendo plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas, prefiriéndose las últimas. La invención se consolida con plantas de Nicotiana y puede aplicarse a otras plantas de la familia Solanaceae. Las más preferidas son Nicotiana tabacum y N. benthamiana. Estas plantas tienen la ventaja adicional de que típicamente no entran en la cadena alimenticia humana.

Dicha planta puede ser una planta de tipo silvestre o una planta transgénica. Para complementar la función de la MP de dicho replicón auxiliar (ii), como se ha descrito anteriormente, puede usarse un gen de MP integrado establemente, de manera que pueda expresarse en el genoma de dicha planta. Para este fin, una MP preferida es la MP del virus del mosaico del tabaco.

Obviamente, dicha planta usada para el proceso de la invención, dicho replicón de ARN (i) y dicho replicón auxiliar (ii) deben seleccionarse de manera apropiada para proporcionar un sistema funcional. Por ejemplo, dichos replicones (i) y (ii) deben poder replicarse en las células de dichas plantas, las MP usadas deben ser funcionales para permitir el desplazamiento célula a célula en dicha planta, la proteína de cubierta usada debe poder proporcionar desplazamiento sistémico a dicho replicón de ARN (i) en dicha planta, etc. Estas cuestiones son familiares para las personas expertas en la materia.

En el proceso de la invención, a las células de dicha planta, se las proporciona dichos precursores de ADN de dicho replicón de ARN (i) y dicho replicón auxiliar (ii). Dicho replicón de ARN (i) o dicho replicón auxiliar (ii) o tanto dicho replicón de ARN (i) como dicho replicón auxiliar (ii) se proporciona a dichas plantas como precursores de ADN de dicho replicón de ARN (i) y/o dicho replicón auxiliar (ii). El tipo de precursor depende del tipo de método de transformación a usar. A continuación, se proporcionan los métodos de transformación que pueden usarse. Un método de transformación preferido es la transformación mediada por Agrobacterium. En este caso dicha planta se proporciona con dicho replicón de ARN (i) y/o dicho replicón auxiliar (ii) mediante la transfección con agrobacteria que contiene en su ADN-T dicho precursor de dicho replicón (i) y/o con agrobacteria que contiene en su ADN-T dicho precursor de dicho replicón auxiliar (ii).

Cuando dicha planta se transforma con dicho replicón de ARN (i) y dicho replicón auxiliar (ii) o precursores de los mismos, una parte seleccionada de dicha planta debe tratarse con ambos replicones para permitir la complementación de dicho replicón de ARN (i) por dicho replicón auxiliar (ii). En el caso de la transformación mediada por Agrobacterium, esto se consigue más fácilmente tratando una parte seleccionada de dicha planta con una mezcla de dos cepas de Agrobacterium, una cepa que contiene dicho replicón de ARN (i) como un precursor de ADN en el ADN-T y otra cepa que contiene dicho replicón auxiliar (ii) como un precursor de ADN en el ADN-T. Puesto que al menos uno de dichos replicones (i) y (ii) podrá generalmente desplazarse de célula a célula debido a una MP, no es absolutamente necesario que una célula de dichas plantas se transforme con ambos replicones (i) y (ii). Sin embargo, por motivos de eficacia, se prefiere que las células de dicha planta se transformen con ambos replicones (i) y (ii).

Para usar del todo la invención, deben proporcionarse partes seleccionadas de dicha planta, como una o más hojas, preferiblemente hojas de la parte inferior, con dicho replicón de ARN (i) y dicho replicón auxiliar (ii) pero no otras partes de dicha planta. Mediante el desplazamiento sistémico, dicho replicón de ARN (i) alcanzará por tanto otras partes de dichas plantas, en particular hojas sistémicas. Adicionalmente, una o más plantas pueden pulverizarse con una suspensión de Agrobacterium que contiene dos cepas de Agrobacterium (por ejemplo cepas de A. tumefaciens), una que contiene un precursor de ADN de dicho replicón de ARN (i) y la otra que contiene un precursor de ADN de dicho replicón auxiliar (ii).

Las plantas que pueden usarse para el proceso de la invención corresponden a aquellas que pueden ser un componente del sistema de la invención.

Dicha secuencia de interés, replicada o expresada, puede obtenerse de dicha planta por medios convencionales. Estos productos pueden aislarse usando toda la planta, es decir material de la planta que se proporcionó con dichos replicones (i) y (ii) y material de la planta que no se proporcionó con dichos replicones (i) y (ii). Preferiblemente, estos productos se obtienen y se aíslan de partes de plantas que no se proporcionaron con dichos replicones (i) y (ii), como hojas sistémicamente infectadas por dicho replicón de ARN (i). REALIZACIONES PREFERIDAS

Un sistema para la replicación o para la replicación y expresión de una secuencia de interés en una planta, comprende:

(i) Agrobacterias que contienen un ADN-T que comprende un precursor de un replicón de ARN, mediante el cual dicho replicón de ARN, que deriva del virus del mosaico del tabaco, carece de una secuencia que codifica una proteína de cubierta funcional y comprende al menos una secuencia de interés, conteniendo dicho precursor de dicho replicón de ARN preferiblemente uno o más intrones, por ejemplo en la ORF de replicasa, conteniendo dicho precursor de dicho replicón de ARN preferiblemente uno

o más intrones; y

(ii) Agrobacterias que contienen un ADN-T que comprende un precursor de un replicón auxiliar derivado de un tobamovirus, en el que dicho replicón auxiliar

(a): carece de un origen funcional de ensamblaje de partículas virales y no puede desplazarse sistémicamente en dicha planta y

(b): puede expresar en dicha planta una proteína de cubierta del virus del mosaico de tabaco necesaria para el desplazamiento sistémico de dicho replicón de ARN (i),

mediante el cual dicho replicón de ARN (i) puede replicar o replicar y expresar dicha secuencia de interés en dicha planta, pero no puede desplazarse sistémicamente en dicha planta en ausencia de dicha proteína de cubierta del virus del mosaico del tabaco expresada por dicho replicón auxiliar (ii), como se define adicionalmente en la reivindicación 1.

Un proceso para expresar una secuencia de interés en una planta de Nicotiana, que comprende la transformación conjunta, de una hoja de dicha planta, con una mezcla de las Agrobacterias del sistema anterior.

Un proceso para expresar una secuencia de interés en una planta, que comprende proporcionar células de dicha planta con

(i): Agrobacterias que contienen un ADN-T que comprende un precursor de

un replicón de ARN, derivando dicho replicón de ARN de un virus de ARN monocatenario de sentido positivo y que comprende al menos una secuencia de interés, conteniendo dicho precursor de ADN de dicho replicón de ARN uno o más intrones;

(ii): Agrobacterias que contienen un ADN-T que comprende un precursor de un replicón auxiliar, en el que dicho replicón auxiliar:

(a): no puede desplazarse sistémicamente en dicha planta, tanto en presencia como en ausencia de dicho replicón de ARN (i) y

(b): puede expresar en una planta, una o más proteínas necesarias para

el desplazamiento sistémico de dicho replicón de ARN (ii),

mediante el cual dicho replicón de ARN (i) puede replicar o replicar y expresar

dicha secuencia de interés en dicha planta, pero no puede desplazarse

sistémicamente en dicha planta en ausencia de dichas una o más proteínas

expresadas por dicho replicón auxiliar (ii),

en el que dicho precursor de dicho replicón de ARN contiene uno o más

intrones, como se define adicionalmente en la reivindicación 24.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Fig.1 representa esquemas de regiones de ADN-T para los vectores plCH8543, plCH17272, plCH10595, plCH16601, plCH17501, plCH16684, plCH17344 diseñados para tener una frecuencia aumentada de la formación del replicón basado en virus de ARN en células de plantas. Algunas construcciones contienen intrones que están numerados. Los números corresponden a los intrones proporcionados en el anexo. plCH17272 y plCH17344 son replicones de ARN (i) de acuerdo con la invención. plCH16601 y plCH16684 son replicones auxiliares (ii) de acuerdo con la invención. Act2 – promotor del gen ACTIN2 de Arabidopsis; RdRp – ARN polimerasa dependiente de ARN viral; MP – proteína de desplazamiento viral; NTR – región no traducida 3’ viral; CP – proteína de cubierta viral; Tnos – región de terminación de la transcripción de la nopalina sintasa. La Fig. 2 muestra hojas sistémicas de N. benthamiana de dos plantas coinfiltradas con plCH17272 y plCH16684.

La Fig. 3 muestra una planta de N. benthamiana co-infiltrada con plCH17272 y plCH17501. El dibujo de la izquierda muestra, bajo luz UV, el área infiltrada rodeada por un círculo en el dibujo de la parte derecha. La expresión de la GFP se encuentra exclusivamente en el área co-infiltrada.

La Fig. 4 muestra una separación electroforética en gel de SDS (teñida con coomassie) de las proteínas solubles totales extraídas de hojas infiltradas y sistémicas de N. benthamiana. Carriles:

1.: Tejido de hoja superior no infiltrada con plCH16601

2.: Área infiltrada con plCH8543

3.: Marcador de peso molecular

4.: Hoja sistémica de una planta infectada con TVCV 5,6. Hoja sistémica de planta coinfiltrada con plCH16684 y plCH17272

7.: Hoja sistémica en una planta co-infiltrada con plCH16601 y plCH17272

8.: Marcador de peso molecular

9.: Área infiltrada con plCH8543

10.: Hoja sistémica de una planta infectada con TVCV

11.: Tejido de hoja superior no infiltrada con plCH466601

12 a 14. Hoja sistémica con plCH17344 La Fig. 5 es una presentación esquemática de la región de ADN-T del vector plCH10745 (A) y hojas sistémicas de N. benthamiana de una planta co-infiltrada con plCH8543, plCH16684 y plCH10745. Las Fig. 6A y B son representaciones esquemáticas de las regiones del ADN-T de vectores con y sin diferencias conservativas de función de acuerdo con la invención. La Fig. 7 muestra expresión de la GFP después de la agroinfiltración de construcciones virales en hojas de Nicotiana benthamiana y Nicotiana tabacum. Para cada área infiltrada, se indica el número de identificación del vector (plCH).

7A -Nicotiana benthamiana, 8 días después de la agroinfiltración; 7B -Nicotiana tabacum, 8 días después de la agroinfiltración; 7C -Protoplastos de Nicotiana benthamiana aislados 5 días después de la agroinfiltración. Muchas manchas claras en el dibujo de la derecha indican una frecuencia extremadamente alta de formación de replicones y expresión de la GFP.

La Fig. 8 es una representación esquemática de un precursor de replicón basado en virus de ARN diseñado de acuerdo con la presente invención, que proporciona nivel de expresión cero del gen de interés (GFP, se indica por G) en el estado no inducido. P – promotor de transcripción; T – región de terminación de la transcripción; SM – gen marcador de selección; Ac2 – promotor del gen ACTIN2 de Arabidopsis; RdRP – ARN polimerasa dependiente de ARN viral; MP – proteína de desplazamiento viral; NTR – región no traducida 3’ viral. La Fig. 9 representa regiones del ADN-T de construcciones plCH12691 y plCH16888. P – promotor de transcripción; T – región de terminación de la transcripción; SM – gen marcador de selección; Ac2 – promotor del gen ACTIN2 de Arabidopsis; RdRP – ARN polimerasa dependiente de ARN viral; MP – proteína de desplazamiento viral; NTR – región no traducida 3’ viral. La Fig. 10 muestra hojas con luz UV de diferentes líneas de N. benthamiana transformadas de manera estable que contienen las regiones del ADN-T de plCH12691 o plCH16888. Las hojas se agroinfiltraron con vectores (plCH10881 o plCH14313) proporcionando integrasa. La Fig. 11 muestra hojas de Beta vulgaris una semana después de la agroinfiltración con plCH18711 con de luz natural (izquierda) y UV (derecha). Las manchas claras en la fotografía derecha indican fluorescencia GFP. En la parte superior se muestran y se numeran los intrones (cajas punteadas) en la construcción.

Las Figuras de 1 a 5 y de 9 a 11 del documento PCT/EP04/012743 ilustran adicionalmente el principio y los ejemplos de las realizaciones en las que las secuencias para la función de replicón de un precursor de ADN de un replicón de ARN muestran, en sitios seleccionados, diferencias conservativas de función de la secuencia del virus de ARN en plantas, lo que provoca una frecuencia aumentada de la formación de replicón en comparación con un replicón de ARN que no muestra dichas diferencias. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona un proceso de expresión sistémica muy eficaz y biológicamente seguro de una secuencia o proteína de interés usando un replicón derivado de virus de ARN (dicho replicón de ARN (i)). Este proceso supera las limitaciones existentes de los sistemas de expresión basados en vectores virales de ARN, tales como limitación de tamaño para secuencias heterólogas a expresar sistémicamente y alta inestabilidad de dichos vectores. Adicionalmente, dicho proceso ofrece mejores características de bioseguridad e impide la formación de virus de tipo silvestre debido a la recombinación de componentes virales. Los replicones (i) y (ii) de la invención pueden diseñarse de tal manera que se eviten dichas recombinaciones. El planteamiento descrito en el presente documento permite una expresión rápida y altamente eficaz de una secuencia de interés en toda una planta incluyendo hojas sistémicas.

Hasta donde se sabe, no hay sistemas de dos componentes eficaces que se basen en el uso de (a) vectores que son deficientes en el desplazamiento sistémico (carecen de proteína de cubierta funcional) y (b) plantas transgénicas que proporcionan la proteína de cubierta perdida en trans. Estos sistemas no son prácticamente útiles, probablemente debido a que los niveles de proteína de cubierta expresados incluso bajo un fuerte promotor constitutivo son insuficientes para proporcionar el desplazamiento sistémico eficaz del vector. Además, la creación de plantas transgénicas consume mucho tiempo y debe evitarse en aquellas aplicaciones en las que se necesita la expresión rápida de pequeñas cantidades de proteína o ARN de interés. También, en el caso en el que un promotor constitutivo proporciona la expresión de una cantidad suficiente de proteína de cubierta, para respaldar el desplazamiento sistémico, la seguridad biológica del sistema sería baja, ya que el ensamblaje de las partículas virales infecciosas tendría lugar en hojas sistémicas.

Muchos virus de ARN diferentes que pertenecen a diferentes grupos taxonómicos son adecuados para la construcción de dicho replicón de ARN (i) y dicho replicón auxiliar (ii) de esta invención, sometidos a la identificación de los elementos virales responsables del desplazamiento sistémico y a la posibilidad de reconstituir la funcionalidad del desplazamiento sistémico del replicón de ARN (i) mediante la expresión de uno de dichos elementos en trans a partir del replicón auxiliar (ii) de la invención. A continuación se presenta una lista de virus de ARN que pueden usarse para la creación de dicho replicón de ARN (i) y dicho replicón auxiliar (ii) de esta invención. Los nombres de los taxones entre comillas (y no en cursiva) indican que este taxón no tiene un nombre internacional aprobado por el CITV (Comité Internacional de Taxonomia de Virus). Los nombres de las especies (lengua vernácula) se indican con letra normal. Se indican los virus sin asignación formal a género o familia.

Virus de ARN:

Virus de ARN monocatenarios: Familia: Bromoviridae, Género: Alfamovirus, especie tipo: virus del mosaico de la alfalfa, Género: Ilarvirus, especie tipo: virus estriado del tabaco, Género: Bromovirus, especie tipo: virus del mosaico del bromo, Género: Cucumovirus, especie tipo: virus del mosaico del pepino; Familia: Closteroviridae, Género: Closterovirus, especie tipo: virus amarillos de la remolacha, Género: Crinivirus, especie tipo: virus amarillos infecciosos de la lechuga, Familia: Comoviridae, Género: Comovirus, especie tipo: virus del mosaico del guisante pinto, Género: Fabavirus, especie tipo: virus del marchitamiento del haba 1, Género: Nepovirus, especie tipo: virus de la mancha anular del tabaco; Familia: Potyviridae, Género: Potyvirus, especie tipo: virus Y de la patata, Género: Rymovirus, especie tipo: virus del mosaico del raigrás, Género: Bymovirus, especie tipo: virus del mosaico amarillo de la cebada; Familia: Sequiviridae, Género: Sequivirus, especie tipo: virus del punteado amarillo de la chirivía, Género: Waikavirus, especie tipo: virus del tubo esférico del arroz, Familia: Tombusviridae, Género: Carmovirus, especie tipo: virus del moteado del clavel, Género: Dianthovirus, especie tipo: virus de la mancha anular del clavel, Género: Machlomovirus, especie tipo: virus del mosaico clorótico del maíz, Género: Necrovirus, especie tipo: virus de la necrosis del tabaco, Género: Tombusvirus, especie tipo: virus del enanismo ramificado del tomate, Virus de ARN monocatenarios de Género No Asignado, Género: Capillovirus, especie tipo: virus de la madera surcada del manzano; Género: Carlavirus, especie tipo: virus latente del clavel; Género: Enamovirus, especie tipo: virus del mosaico del guisante enación, Género: Furovirus, especie tipo: virus del mosaico del trigo transmitido por el suelo, Género: Hordeivirus, especie tipo: virus del mosaico estriado de la cebada, Género: Idaeovirus, especie tipo: virus del enanismo de la frambuesa; Género: Luteovirus, especie tipo: virus del enanismo amarillo de la cebada; Género: Marafivirus, especie tipo: virus rayado fino del maíz; Género: Potexvirus, especie tipo: virus X de la patata; Género: Sobemovirus, especie tipo: virus del mosaico sureño de la judía, Género: Tenuivirus, Tipo

de especie: virus rayado del arroz,

Género: Tobamovirus, especie tipo: virus del mosaico del tabaco,

Género: Tobravirus, especie tipo: virus del rayado del tabaco.

Género: Trichovirus, especie tipo: virus de la mancha clorótica folicular del

manzano; Género: Tymovirus, especie tipo: virus del mosaico amarillo del

nabo; Género: Umbravirus, especie tipo: virus moteado de la zanahoria;

Además de los sistemas de expresión basados en TMV, los vectores virales, para la expresión de genes heterólogos de interés, se desarrollaron basándose en diversos otros virus de ARN monocatenarios de sentido positivo, tales como el virus X de la patata (Mallory et al., 2002, Nat. Biotechnol., 20, 622-625), virus del mosaico de la alfalfa (Sanches-Navarro et al., 2001, Arch. Virol., 146, 923-939) y el virus del mosaico del guisante pinto (Gopinas et al., 2000, 267, 159-173). El planteamiento descrito en esta invención para vectores basados en TMV puede emplearse para los sistemas de expresión virales mencionados anteriormente.

En los ejemplos 1 a 5 se describe la construcción de diferentes tipos de vectores virales basados en TMV usados en esta invención (Fig. 1). El vector plCH8543 (ejemplo1) tiene un origen de ensamblaje (partícula viral) pero carece de una secuencia codificante de proteína de cubierta (CP). Este vector y su derivado que contienen intrones plCH17272 (ejemplo 4) pueden desplazarse de célula a célula y expresar la secuencia de interés (GFP) en hojas infectadas primarias y contienen un origen de ensamblaje, pero no pueden desplazarse sistémicamente debido a la ausencia de una proteína de cubierta. Otro par de vectores, plCH10595 (ejemplo 2) y plCH17501 (ejemplo 5),codifica, además de la MP, la CP en lugar de la GFP y pueden desplazarse sistémicamente y formar partículas virales infecciosas. La co-infiltración de los vectores plCH17272 y plCH17501 (Fig. 3) no conduce a la expresión de la GFP en hojas sistémicas. La GFP se expresa fuertemente sólo en la hoja primaria inoculada, pero los síntomas virales son claramente visibles en hojas sistémicas. La explicación de este resultado es que un vector de expresión sin CP (plCH17272) no puede competir con un virus auxiliar (plCH17501) que puede desplazarse sistémicamente.

Para tratar este problema, se generaron los vectores virales auxiliares (replicón auxiliar (ii)) plCH16601 y plCH16684 (Fig. 1, ejemplo 3) que podían expresar la CP pero carecían del origen de ensamblaje y, por consiguiente, no podían desplazarse sistémicamente. La co-infiltración de estos vectores virales auxiliares con replicones de ARN (i) que expresan GFP pero que no pueden desplazarse sistémicamente conduce a la aparición de GFP en hojas sistémicas (Fig. 2). La proteína soluble total de las hojas sistémicas de plantas infectadas con el sistema de dos vectores (Fig. 4, carriles 5-7) contenía un nivel alto de GFP que era comparable al de las hojas primarias inoculadas (Fig. 4, carril 2). Este alto nivel de expresión no se consigue cuando, para la expresión de GFP, se usa un vector viral que se desplaza sistémicamente, tal como un vector viral que expresa predominantemente CP (Fig. 4, carriles 12-14).

Mediante el sistema de dos componentes de la invención también se produce menor cantidad de CP en hojas sistémicas (Fig. 4 carril 7). Esto puede explicarse por la presencia de vectores virales recombinantes que pueden expresar CP y desplazarse sistémicamente. Sin embargo, la proporción relativa de dichos recombinantes es insignificante y no tiene ningún impacto significativo en la productividad (nivel de expresión) descrita anteriormente. Además, la frecuencia de estas recombinaciones puede reducirse adicionalmente e incluso eliminarse completamente, reduciendo la longitud de los tramos de solapamiento o la homología entre el replicón auxiliar (ii) y el replicón de ARN (i) que expresa la secuencia de interés.

La reducción o eliminación completa de regiones funcionales homólogas que son dianas para recombinación homóloga puede conseguirse mediante varios planteamientos diferentes: deleciones de dichas regiones; cambios de regiones codificantes dentro de las regiones de homología aplicando diferentes usos de codón; cambio de dichas regiones por evolución dirigida (como revisión del planteamiento véase Tobin et al., 2000, Curr. Opin. Struct. Biol., 40, 421-427). En caso de sistemas de vectores virales basados en TMV, pueden usarse diferentes ARN polimerasas dependientes de ARN (RdRp) para el replicón de ARN (i) que expresa dicha secuencia de interés y el replicón auxiliar (ii). Son RdRp bien caracterizadas, para este fin, por ejemplo, las RdRp de TVCV, TMV-U1, TMV-U5 o crTMV.

Sin embargo, una homología dentro de las regiones que codifican la RdRp no ocasiona ningún problema grave de recombinación, puesto que la recombinación entre regiones cadena arriba del origen del ensamblaje de partículas virales (en el replicón (i)) no produce virus de tipo silvestre o virus que tengan la capacidad de desplazamiento sistémico de un virus de tipo silvestre. Es más problemática una pequeña región de homología localizada en el extremo 3’ del gen MP en frente de GFP en caso del replicón de ARN (i) (véase la Fig. 1, plásmidos plCH8543; plCH17272) y la parte de la secuencia que codifica la MP localizada en frente de la ORF de la CP del replicón auxiliar

(ii) (Fig. 1, plCH16601; plCH16684), puesto que una recombinación entre estas regiones podría conducir a la formación de replicones del tipo virus de tipo silvestre comprometiendo la eficacia o la seguridad del sistema. Estas pequeñas regiones pueden modificarse fácilmente por diversos métodos para eliminar la homología y cualquier posibilidad de acontecimientos de recombinación no deseados. Además, determinadas funciones de los replicones (i) y/o replicón (ii) como la expresión de MP necesaria para el desplazamiento de célula a célula, pueden proporcionarse en trans mediante una planta hospedadora transgénica (Holt & Beachy, 1991, Virology, 181,109117). En dicha realización, en dicho replicón de ARN (i), sólo pueden dejarse aquellas partes de la ORF de la MP que solapan con la RdRp de dicho replicón auxiliar y el origen del ensamblaje. En general, para reducir o eliminar completamente la frecuencia de recombinación entre dicho replicón de ARN (i) y dicho replicón auxiliar (ii) existen muchas estrategias diferentes que un experto habitual en la técnica puede realizar fácilmente.

Como se mencionó en la descripción general, para eliminar completamente la región de homología que puede conducir a la formación de vectores virales autónomos con desplazamiento sistémico, pueden usarse promotores subgenómicos para dirigir la expresión de la CP del replicón auxiliar que es heteorólogo al virus de ARN a partir del cual deriva dicho replicón de ARN (i). Más específicamente, el promotor subgenómico usado para dirigir la expresión de la CP a partir del replicón auxiliar debe ser heteorólogo al promotor (o promotores) subgenómico usado en el replicón de ARN (i) para dirigir la expresión de la MP y/o la secuencia de interés. En el caso de un sistema basado en TMV, pueden usarse promotores subgenómicos de la CP de diferentes cepas de virus en el replicón auxiliar. Los ejemplos de dichas cepas incluyen TMV-U1, TMV-U5, crTMV, etc.

Curiosamente, la co-expresión adicional de la MP en trans, en hojas infiltradas, aumenta la eficacia del vector sistémico en el sistema de los inventores. Como se muestra en el Ejemplo 7, la expresión transitoria de la MP del TVCV, bajo el control de un promotor constitutivo, mejora significativamente la eficacia del desplazamiento sistémico del replicón que expresa la GFP. Esto puede explicarse por la producción de mayores cantidades de la CP por el replicón auxiliar que puede desplazarse célula a célula mediante dicha complementación en trans. Dicha CP adicional podría proporcionar la compactación de un gran número de replicones de ARN (i) en partículas virales con desplazamiento sistémico.

Para proporcionar células de una planta con dicho replicón de ARN (i) y/o dicho replicón auxiliar (ii), pueden usarse diferentes métodos. Dichos vectores pueden trasformarse en células de plantas mediante un vector Tiplasmídico incluido en Agrobacterium (documentos US 5.591.616; US 4.940.838; US 4.464.763) o bombardeo de partículas o microproyectiles (documentos US 05100792; EP 00444882B1; EP 00434616B1). También pueden usarse otros métodos de transformación de plantas, como microinyección (documentos WO 09209696: WO 09400583A1; EP 175966B1), electroporación (documentos EP00564595B1; EP00290395B1; WO 08706614A1) o transformación de protoplastos mediada por PEG etc. La elección del método para el suministro del vector depende de la especie de la planta a trasformar y del vector usado. Por ejemplo, para el suministro de vectores en monocotiledóneas se prefiere generalmente el bombardeo con microproyectiles, mientras que para dicotiledóneas, la transformación mediada por Agrobacterium proporciona, en general, mejores resultados.

En los ejemplos descritos a continuación, los inventores usaron el suministro de vectores mediado por Agrobacterium en células de Nicotiana. Sin embargo, los vectores pueden introducirse en las plantas de acuerdo con cualquiera de las técnicas convencionales adecuadas para la transformación estable transitoria de la especie de planta de interés. Las técnicas de transformación para las dicotiledóneas se conocen bien en la técnica e incluyen técnicas basadas en Agrobacterium y técnicas que no requieren Agrobacterium. Las técnicas que no requieren Agrobacterium implican la captación de material genético exógeno directamente por los protoplastos o las células. Estas técnicas incluyen la captación mediada por PEG o electroporación, el suministro mediado por bombardeo de partículas y la microinyección. Los ejemplos de esas técnicas se escriben en Paszkowski et al., EMBO J 3, 2717-2722 (1984), Potrykus et al., Mol. Gen. Genet. 199, 169177 (1985), Reich et al., Biotechnology 4:1001-1004 (1986), y Klein et al.,

Nature 327, 70-73 (1987). En cada caso, las células transformadas se regeneran a todas las plantas usando técnicas convencionales.

La transformación mediada por Agrobacterium es una técnica preferida para la trasformación de dicotiledóneas debido a su alta eficacia de transformación y a su amplia utilidad con muchas especies de plantas diferentes. Las muchas especies de cultivo que pueden transformarse de manera rutinaria por Agrobacterium incluyen tabaco, tomate, girasol, algodón, colza, patata, soja, alfalfa y chopo (documentos EP 0317511 (algodón), EP 0249 432 (tomate), WO 87/07299 (Brassica), Patente de Estados Unidos

4.795.855 (chopo)).

En los ejemplos de esta invención, los inventores usaron agro-inoculación, un método de suministro de ADN-T mediado por Agrobacterium, para la expresión transitoria del gen (o genes) de interés (Vaquero et al., 1999, Proc. Natl: Acad. Sci. USA, 96, 11128-11133). La agro-inoculación es una herramienta extremadamente útil, no sólo para sistemas de producción de proteínas recombinantes de pequeña a mediana escala, sino como uno de los elementos de un sistema de optimización de vectores que permite obtener resultados rápidos con diferentes variantes de construcciones.

Esta invención no se limita a vectores basados en TMV descritos en los ejemplos 1-5, sino que puede ampliarse a replicones basados en otros virus de ARN de plantas.

Las secuencias o genes de interés, sus fragmentos (funcionales o no funcionales) y sus derivados artificiales que pueden expresarse en plantas o células de las plantas usando la presente invención incluyen, pero sin limitación: enzimas modificadoras de almidón (almidón sintasa, enzima de fosforilación de almidón, enzima desramificadora, enzimas ramificadoras del almidón, enzima ramificadora de almidón II, almidón sintasa unida a gránulo), sacarosa fosfato sintasa, sacarosa fosforilasa, poligalacturonasa, polifructano sacarasa, ADP glucosa pirofosforilasa, ciclodextrina glucosiltransferasa, fructosil transferasa, glucógeno sintasa, pectina esterasa, aprotinina, avidina, levansacarasa bacteriana, proteína glgA de E.coli, MAPK4 y ortólogas, enzima del metabolismo/asimilación del nitrógeno, glutamina sintasa, osmotina de plantas, albúmina 2S, taumatina, integrasa/recombinasa específica de sitio (FLP, Cre, recombinasa R, Int, integrasa SSVI R, integrasa phiC31 o un fragmento o variante activo de los mismos), enzimas modificadoras de aceites (como desaturasas de ácidos grasos, elongasas etc), isopentenil transferasa, Sea M5 (calmoludina de soja), toxina tipo de coleópteros o un fragmento activo desde el punto de vista insecticida, proteínas de fusión de enzimas conjugadoras de ubiquitina (E2), enzimas que metabolizan lípidos, aminoácidos, azúcares, ácidos nucleicos y polisacáridos, superóxido dismutasa, la forma de proenzima inactiva de una proteasa, toxinas de proteínas de plantas, rasgos que alteran fibras en plantas productoras de fibra, toxina activa de coleópteros de Bacillus thuringiensis (toxina Bt2, proteína cristalina insecticida (ICP), toxina CrylC, endotoxina delta, toxina de polipéptido, protoxina etc), toxina AaIT específica de insectos, enzimas degradadoras de celulosa, celulasa E1 de Acidothermus celluloticus, enzimas modificadoras de lignina, cinamoil alcohol deshidrogenasa, trehalosa-6-fosfato sintasa, enzimas de la ruta metabólica de citocina, HMG-CoA reductasa, pirofosfatasa inorgánica de E. coli, proteína de almacenamiento de semilla, licopeno sintasa de Erwinia herbicola, ACC oxidasa, proteína codificada por pTOM36, fitasa, cetohidrolasa, acetacetil CoA reductasa, PHB (polihidroxibutanoato) sintasa, enzimas implicadas en la síntesis de polihidroxialcanoatos (PHA), proteína trasportadora de acilo, napina, EA9, fitoena sintasa de plantas no superiores, proteína codificada por pTOM5, ETR (receptor de etileno), piruvato fosfato diquinasa de plastidio, proteína de poro transmembrana inducible por nematodo, rasgo que potencia la función fotosintética o plastidial de la célula de la planta, estilbeno sintasa, una enzima que puede hidroxilar fenoles, catecol dioxigenasa, catecol 2,3-dioxigenasa, cloromuconato cicloisomerasa, antranilato sintasa, proteína AGL 15 de Brassica, fructosa 1,6-bifosfatasa (FBPasa), ARN3 de AMV, replicasa de PVY, replicasa de PLRV, proteína de cubierta del potivirus, proteína de cubierta del CMV, proteína de cubierta del TMV, replicasa del luteovirus, ARN mensajero del MDMV, replicasa geminiviral mutante, C12:0 de Umbellularia californica prefiriendo acil-ACP tioesterasa, C10 o C12:0 vegetal prefiriendo acil-ACP tioesterasa, C14:0 prefiriendo acil-ACP tioesterasa (luxD), factor A sintasa vegetal, factor B sintasa vegetal, D6-desaturasa, proteínas que tienen una actividad enzimática en la biosíntesis y modificaciones de ácidos grasos, por ejemplo la β-oxidación peroxisomal de ácidos grasos en células de plantas, acil-CoA oxidasa, 3-cetoacil-CoA tiolasa, lipasa, acetil-CoA-carboxilasa CoA del maíz, etc.; 5-enolpiruvilsiquimato-3-fosfato sintasa (EPSP), fosfinotricina aceltil transferasa (BAR, PAT), proteína CP4, ACC desaminasa, proteína que tiene un sitio de escisión postraduccional, el gen DHPS que confiere resistencia a sulfonamida, nitrilasa bacteriana, 2,4-D monooxigenasa, acetolactato sintasa o acelohidroxiacido sintasa (ALS, AHAS), poligalacturonasa, Taq polimerasa, nitrilasa bacteriana, muchas otras enzimas de origen bacteriano o fágico que incluyen endonucleasas de restricción, metilasas, ligasas de ADN y ARN, polimerasas de ADN y ARN, transcriptasas inversas, nucleasas (Dnasas y RNAsas), fosfatasas, transferasas etc.

La presente mención puede usarse con fines de industria molecular y purificación de proteínas farmacéuticamente importantes y comercialmente valiosas que incluyen enzimas industriales (celulasas, lipasas, proteasas, fitasas etc.) y proteínas fibrosas (colágeno, proteína de seda de araña, etc.). Usando lo descrito en el planteamiento de esta invención pueden expresarse y purificarse proteínas para la salud en seres humanos o animales. Los ejemplos de dichas proteínas de interés incluyen entre otras proteínas de respuesta inmune (anticuerpos monoclonales, anticuerpos monocatenarios, receptores de células T etc.), los antígenos que incluyen aquellos derivados de microorganismos patógenos, factor estimuladores de colonias, relaxinas, hormonas polipeptídicas incluyendo somatotropina (HGH) y proinsulina, citocinas y sus receptores, interferones, factores de crecimiento y factores de coagulación, enzima lisosomal enzimáticamente activa, polipéptidos fibrinolíticos, factores de coagulación sanguíneos, tripsinógeno, a 1-antitripsina (AAT), albúmina de suero humana, glucocerebrosidasas, tóxina B nativa del cólera así como proteínas conservativas de función como fusiones, versiones mutantes y derivados sintéticos de las proteínas anteriores. Secuencias para la función de replicón que presentan diferencias conservativas de función de la secuencia de los virus de ARN, ocasionando una frecuencia de la formación de replicones aumentada

Dicho precursor de ADN que codifica dicho replicón de ARN (i) contiene secuencias para la función de replicón de dicho replicón de ARN (i), derivando dichas secuencias de una secuencia de dicho virus de ARN, dichas secuencias para la función de replicón presentan, en lugares seleccionados de dicha secuencia de dicho virus de ARN, diferencias conservativas de función de dicha secuencia de dicho virus de ARN, ocasionando dichas diferencias una frecuencia de formación de replicón de ARN (i) aumentada en comparación con un replicón de ARN que no presenta dichas diferencias. Como alternativa o adicionalmente, dicho replicón auxiliar puede derivar de un virus de ARN monocatenario de sentido positivo y dicho precursor de ADN que codifica dicho replicón auxiliar (ii) contiene secuencias para la función de replicón de dicho replicón auxiliar (ii), derivando dichas secuencias de una secuencia de dicho virus de ARN, dichas secuencias para la función de replicón presentan, en lugares seleccionados de dicha secuencia de dicho virus de ARN, diferencias conservativas de función de dicha secuencia de dicho virus de ARN, ocasionando dichas diferencias una frecuencia de formación del replicón auxiliar aumentada en comparación con un replicón auxiliar que no presenta dichas diferencias.

Dichas diferencias conservativas de función están preferiblemente presentes en las ORF de replicasa de dichos precursores de ADN. En casos en los que dicho replicón de ARN (i) y dicho replicón auxiliar (ii) están basados en el mismo virus de ARN, las ORF de replicasa que incluyen dichas diferencias conservativas de función en el replicón de ARN (i) y en el replicón auxiliar (ii) pueden ser idénticas. Además, las diferencias conservativas de función pueden estar presentes en una ORF de la MP, particularmente del precursor de ADN de dicho replicón de ARN (i).

Dichas diferencias conservativas de función son las causantes de la formación de dicha frecuencia de formación de replicón de ARN (ii) y/o replicón auxiliar (ii) aumentada en las células de las plantas. La conexión causal entre la frecuencia de formación de replicón aumentada y dichas diferencias puede ensayarse experimentalmente comparando la frecuencia de formación de replicón entre secuencias para la función de replicón que tienen dichas diferencias con las secuencias para la función de replicón que no tienen dichas diferencias. Esta comparación experimental puede realizarse, por ejemplo, mediante el recuento de protoplastos que expresan dichas secuencias de interés como se escribe en los ejemplos. Preferiblemente, para este fin, se usa una secuencia de interés que codifica una proteína indicadora fácilmente detectable como la proteína verde fluorescente. Como adicionalmente se describe a continuación, también se prefiere realizar la comparación experimental con replicones de ADN que no pueden propagarse de célula a célula.

Dichas diferencias conservativas de función se introducen en dichas secuencias para la función de replicón en lugares seleccionados de dicha secuencia de dicho virus de ARN. Dichos lugares seleccionados son lugares en secuencias para la función de replicón de dicho virus de ARN que son responsables de una baja probabilidad de que un replicón de ARN transcrito en el núcleo aparezca en el citosol como un replicón funcional. Dichos lugares seleccionados tienen un alto contenido de A/T (U), es decir un alto contenido de A y/o un alto contenido de T (un alto contenido de U a nivel de ARN) o tienen sitios de corte y empalme ocultos, es decir, partes de secuencia que la maquinaria de corte y empalme nuclear puede reconocer como sitios de corte y empalme. Dichos lugares seleccionados pueden identificarse en un virus de ARN en el cual se basa un replicón de ARN analizando el perfil de ARN del virus de ARN como se ilustra a continuación. Además, los lugares seleccionados pueden identificarse experimentalmente analizando el ARN formado en una célula de la planta después de la transformación con un ADN heterólogo que codifica un replicón de ARN que no presenta dichas diferencias (conservativas de función) de acuerdo con la invención. Este análisis experimental puede realizarse mediante RT-PCR, preferiblemente junto con la secuenciación de los productos de la RT-PCR. En el ensayo RT-PCR, la replicasa se hace preferiblemente disfuncional, por ejemplo, mediante una mutación de desplazamiento de la fase de lectura para prevenir que los replicones de ARN lleguen al citoplasma a partir de la amplificación; dicha amplificación puede conducir a una contaminación de transcritos de ARN con virus de tipo silvestre o a un predominio de replicones de ARN amplificados en el citoplasma. De esta manera, pueden identificarse productos de corte y empalme no deseados que indican acontecimientos de corte y empalme que destruyen el replicón de ARN. Además, los sitios exactos de corte y empalme no deseados pueden identificarse y después subsanarse introduciendo dichas diferencias conservativas de función en dichos lugares seleccionados.

Por lo tanto, también se describe un proceso de expresión de una secuencia de interés en una planta, parte de una planta o en un cultivo celular de una planta, en el que (A) se proporciona una planta, una parte de una planta

o un cultivo celular de una planta, con un precursor de ADN que carece de dichas diferencias conservativas de función, (B) se ensaya ARN derivado de dicho precursor de ADN para productos de corte y empalme no deseados en dichas secuencias para la función de replicón (por ejemplo mediante RT-PCR),

(C): se identifica (por ejemplo, en la secuencia de un producto de dicha RT

PCR), un lugar seleccionado como un lugar de un acontecimiento de corte y empalme no deseado, (D) se introduce una diferencia conservativa de función (por ejemplo un intrón) de acuerdo con la invención en o cerca de dicho lugar seleccionado identificado en la etapa (C) en un precursor de ADN de la etapa

(A): para producir dicho precursor de ADN que codifica dicho replicón (i) o (ii) de la invención y expresar una secuencia de interés en una planta, parte de una planta o cultivo celular de una planta de acuerdo con la invención, por ejemplo de una planta transformada transitoriamente con dicho ADN heterólogo de la invención.

Dichas diferencias conservativas de función ocasionan una frecuencia de formación de replicón aumentada suprimiendo el efecto nocivo de dichos lugares seleccionados en dicha frecuencia de formación de replicón de ARN. Dichas diferencias conservadas de función pueden introducirse en uno o, preferiblemente, en varios lugares seleccionados.

Las diferencias conservativas de función comprenden la inserción de uno o más intrones, más preferiblemente intrones nucleares, o una o más secuencias que pueden formar intrones nucleares cerca o dentro de los lugares ricos en A/U de dichas secuencias que se derivan de secuencias de dicho virus de ARN de las plantas. Sorprendentemente se ha observado que la introducción de intrones en o cerca de los lugares ricos en A/U produce una frecuencia de formación de replicón de ARN aumentada. Pueden introducirse varios intrones y en este documento se proporcionan ejemplos para diversos números de intrones introducidos. Los efectos de más de un intrón son acumulativos. Adicionalmente, la inserción de intrones puede combinarse con otras diferencias conservativas de función en otros lugares seleccionados.

La Fig. 8 muestra un ejemplo de la introducción de secuencias que pueden formar un intrón nuclear, aunque en la secuencia de interés a expresar. En el ejemplo de la Fig. 8, el intrón se forma a partir de dos mitades intrónicas después de la inversión catalizada por recombinasa de una parte de dicho ADN heterólogo. Este principio puede aplicarse también a secuencias para la función de replicón de dicho replicón de ARN. En una realización en la que se forman dos replicones de ARN diferentes en la misma célula, la recombinación entre dichos dos replicones diferentes puede producir la formación de un intrón a partir de dos mitades intrónicas presentes en diferentes replicones. Además, un replicón de ARN puede formarse por recombinación entre dos precursores, ninguno de los cuales es un replicón. También en este caso, un intrón puede ensamblarse a partir de dos mitades intrónicas derivas de moléculas precursoras diferentes.

Preferiblemente, la planta o la parte de la planta (por ejemplo, las hojas) se transforman de manera transitoria con dichos precursores de ADN de la invención para la expresión transitoria de dicha secuencia de interés. La expresión “transformación transitoria” significa la introducción de dichos precursores de ADN sin selección de células transformadas para la incorporación estable de dicho ADN heterólogo en un cromosoma de la planta. La transformación transitoria normalmente proporciona una expresión transitoria de la secuencia (o secuencias) codificadas por el precursor (o precursores) de ADN. La transformación transitoria puede conseguirse mediante cualquiera de los métodos de transformación proporcionados anteriormente. Se prefiere la agroinfiltración, por ejemplo sumergiendo la planta invertida en la suspensión de Agrobacterium, aplicando vacío y liberando rápidamente el vacío.

Preferiblemente, los precursores de ADN que codifican un replicón de ARN están unidos operativamente a un promotor transcripcional, preferiblemente un promotor transcripcional constitutivo. En otra realización, dicha planta pertenece al género Nicotiana y dichas secuencias para la función de replicón derivan de un tobamovirus, preferiblemente del virus del mosaico del tabaco. En una realización particularmente preferida, las plantas del tabaco, incluyendo el tallo en todas las hojas, se transforman transitoriamente por agroinfiltración. La última realización puede usarse para aplicaciones a gran escala del proceso de la invención. En las aplicaciones a gran escala, dicho proceso se aplica de manera simultáneamente a muchas plantas (al menos 5, preferiblemente al menos 10, más preferiblemente al menos 100 plantas).

Se sabe que los virus de ARN de las plantas (una excepción son los viroides-pequeños ARN no codificantes que se amplifican en los núcleos de las células de las plantas – como revisión véase Diener T.O., 1999, Arch. Virol. Supl.,15, 203-220; Flores, R., 2001, CR Acad. Sci. III, 324, 943-952) nunca se producen en el núcleo de las plantas, sino en el citoplasma. Por lo tanto, las secuencias de los virus de ARN no están adaptadas para resistir los acontecimientos del procesamiento de ARN nuclear debido a la presencia de motivos que deberían estar implicados en series complejas de etapas de procesamiento que incluyen el transporte del ARN procesado en el citoplasma, en el que están implicados los precursores de pre-ARNm, ARNr y ARNt. Los acontecimientos de procesamiento, tales como protección del extremo 5’, corte y empalme, generación del extremo 3’, poliadenilación, degradación, modificación de bases y azúcares así como la edición (en plastidios y mitocondrias) se estudian profundamente. Sin embargo, muchos elementos de estos acontecimientos aún no están aclarados. Los cambios más drásticos en relación con el pre-ARNm en el núcleo se producen durante el corte y empalme del pre-ARNm, el proceso mediante el cual las secuencias de ARN que intervienen (intrones) se eliminan del transcrito inicial y los exones se ligan simultáneamente. El espliceosoma media el corte y empalme, una estructura compleja que comprende pequeñas partículas de ribonucleoproteínas nucleares ricas en uridilato. El espliceosoma realiza la reacción de corte y empalme en dos etapas consecutivas: la primera es la escisión, en el sitio de corte y empalme 5’, de la unión exón/intrón cadena arriba que conduce a la formación del lazo y la segunda etapa es la escisión, en el sitio de corte y empalme 3’, de la unión intrón/exón cadena abajo, seguido del ligamiento de exones cadena arriba y cadena abajo (como revisión véase: Kramer, A., 1996, Annu. Rew. Biochem, 65, 367-409; Simpson, GG. & Filipowicz, W. 1996, Plant. Mol. Biol., 32. 1-41). Los dinucleótidos del sitio de corte y empalme en 5’ y 3’ (5’/GU; AG/3’) que flanquean las secuencias intrónicas están muy conservados en plantas superiores y sólo la sustitución de G puede descuidar la actividad de corte y empalme en el sitio en cuestión. Resulta sorprendente que, a pesar de la alta conservación de los sitios de corte y empalme entre plantas y animales, los intrones heterólogos en las plantas normalmente no se cortan y empalman

o se cortan y empalman de manera incorrecta (van Santen, VL. et al., 1987, Gene, 56, 253-265; Wiebauer, K., Herrero, J.J., Filipowicz, W 1988, Mol. Ce/. Biol., 8 2042-2051). Considerando que los ARN virales de las plantas no están bajo presión evolutiva para resistir la maquinaria de procesamiento de ARN nuclear, es muy probable que estos ARN se conviertan en objeto de dicho procesamiento, incluyendo el corte y empalme, una vez se localicen en el entorno nuclear. Los presentes inventores abordan estos problemas sometiendo el vector de expresión a modificaciones conservativas de función que aumentan significativamente la frecuencia de formación de replicón de ARN funcional, cuando el vector de expresión se introduce como un precursor de ADN en las plantas o en las células de las plantas para proporcionar la expresión transitoria. Los presentes inventores consideran que dichas modificaciones de secuencias derivadas de virus son la solución más radical para aumentar la eficacia de replicones basados en virus de ARN. En esta invención los investigadores se centran predominantemente en modificaciones (dichas diferencias conservativas de función) dentro de las secuencias derivadas de virus de ARN de las plantas, ya que son cruciales para aumentar la eficacia de la formación de replicón de ARN.

Introduciendo dichas diferencias conservativas de función (por ejemplo intrones), se ha observado de manera inesperada una mejora de órdenes de magnitud. Un análisis de la secuencia derivada del virus de ARN del vector de expresión plCH8543 (Ejemplo de Referencia 1, Fig. 6A), usando el programa del servidor Netgenell (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2/), para la presencia de intrones ocultos y sitios de corte y empalme del ARN, demostró la presencia de regiones de tipo intrón que puede cortar y empalmar la maquinaria de procesamiento del ARN nuclear (véanse las regiones rodeadas por un círculo en la Fig. 2 del documento PCT/EP04/012743). Existen muchos otros programas que pueden usarse para identificar regiones posiblemente problemáticas (dichos lugares seleccionados) dentro de las secuencias del ARN viral de las plantas, tales como el programa de predicción de exones/intrones (http://genes.mit.edu/GENSCAN.html) o el programa de predicción de señales de corte y empalme (http://125.itba.mi.cnr,lt/webgene/wwwspliceview.html) para una diversidad de organismos.

Considerando que ninguno de todos los programas existentes es ideal y que están sometidos a errores, las posibles regiones problemáticas también pueden determinarse experimentalmente. Eso puede realizarse analizando los transcritos derivados de un vector de ADN sometido a ensayo en un entorno nuclear con la ayuda de una técnica de rutina tal como la RT-PCR (Frohman, MA., 1989, Methods Enzymol., 218, 340-356) o su versión más avanzada, adecuada para la cuantificación exacta de la concentración de diferentes transcritos, denominada PCR en tiempo real (Gobson et al., 1996, Genome Res., 6, 995-1001), preferiblemente seguida de la secuenciación de los productos amplificador por PCR . Las diferencias conservativas de función de la invención cambian drásticamente el perfil del ARN, por ejemplo sustituyendo secuencias de tipo intrón por otras de tipo exón, introduciendo, por ejemplo, mutaciones silenciosas con sustitución de regiones ricas en A/U (de tipo intrón) por regiones ricas en G/C (de tipo exón) (véase la Figura 3 del documento PCT/EP04/012743, regiones rodeadas con un círculo). Los intrones de las plantas, a diferencia de los exones, son normalmente ricos en A/T (U) (Lorkovic, ZJ. et al., 2000, Treds Plant Sci., 5, 160-167; Brown, JW. & Simpson, CG. 1998, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 49, 77-95; Csank, C. et al., 1990, Nucl. Acid Res., 18, 5133-5141; Goodall & Felipowicz, 1989, Cell, 58, 473-483) pero hay excepciones, por ejemplo, cuando en plantas monocotiledóneas, se han observado intrones ricos en G/C (Goodall & Flipowicz, 1899, Cell, 58 473-483; Goodall & Flipowicz, 1991, EMBO J., 10, 2635-2644). Para la realización práctica de esta invención, los lugares seleccionados de alto contenido en A/T (U) no sólo incluyen tramos de secuencias de al menos 20 nucleótidos de longitud con al menos el 55%, preferiblemente al menos el 65%, más preferiblemente el 80% o un mayor contenido de A/T (U), sino también tramos más pequeños (“islas”) de 6-19 nucleótidos en una hilera de secuencias que contienen íntegramente A/T (U). En el presente documento, los lugares de alto contenido de A/U incluyen secuencias que son más ricas en A que en U, secuencias que son ricas en A, secuencias que son más ricas en U que en A y secuencias que son ricas en U. Adicionalmente, cualquier secuencia de interés transcrita puede ensayarse para determinar las modificaciones post-transcripcionales que causan un cambio en las secuencias de ácidos nucleicos (por ejemplo corte y empalme del ARN) por RT-PCR (Frohman, MA. 1989, Methods Enzymol., 218, 340-356). Para las personas familiarizadas con la técnica, el uso de RT-PCR para detectar las regiones, dentro del ARN, que están sometidas a modificaciones post-transcripcionales, como deleciones de secuencias a partir del transcrito de ARN original, es una labor sin importancia. El Ejemplo de Referencia 2 los presentes inventores demuestran que la modificación de la región rica de A/U aumenta el número de células que expresan la GFP al menos diez veces. Esto se demuestra claramente en la Fig. 7 comparando las áreas agroinfiltradas con plCH15466 (vector modificado, Fig. 6A) y plCH14833 (vector de control, Fig. 6A). La eliminación de la proteína de desplazamiento (MP) permite un recuento exacto de células primarias que poseen replicones de ARN funcionales, ya que no se produce el desplazamiento célula a célula desde el sitio de infección primaria a células colindantes. En el Ejemplo de Referencia 3, se realizó la modificación de otra región de tipo intrón, rica en U, que contiene muchos sitios de corte y empalme ocultos (Fig. 2B del documento PCT/EP04/012743) y que incluye el promotor subgenómigo de la proteína de desplazamiento (MP) (Fig. 4 del documento PCT/04/012743, rodeado por un círculo). Esta modificación proporcionó un efecto drástico en el incremento de la frecuencia de formación de replicón a partir del vector viral plCH1590. Como se estableció en los experimentos de recuento de protoplastos (Ejemplo de Referencia 3), el aumento fue aproximadamente cien veces en comparación con el vector no modificado plCH14833 para las dos especies de Nicotiana – N. benthamiana y

N. tobacco ensayadas (véanse las áreas infiltradas correspondientes en la Fig. 7, A, B). En general, usando los planteamientos descritos en el presente documento, la frecuencia de la formación de replicón de ARN puede aumentarse aproximadamente 300 veces, es decir aumentando la proporción de células con replicones funcionales de aproximadamente el 0,2% (vector de control) a más del 50% (vector modificado). Los presentes inventores consideran que esto no es el límite y es muy posible conseguir una frecuencia del 100%.

Esta alta eficacia de la formación de replicones abre las puertas a la expresión de dos o más genes diferentes a partir de dos replicones de ARN diferentes (como dicho replicón de ARN) (i) y dicho replicón auxiliar (ii) dentro de la misma célula de la planta, por ejemplo co-expresando diferentes genes usando dos o más vectores basados en virus de ARN de plantas (Ejemplos 4 y 5). La consecución de liberación sincronizada de dos o más replicones de manera simultánea en la misma célula es crucial para dicha co-expresión, ya que el principio “del orden de llegada” es especialmente cierto para vectores virales. El desplazamiento sistémico o de célula a célula no ayuda, ya que normalmente, diferentes vectores virales no se solapan en sus áreas de propagación o dicho solapamiento no es significativo. Cálculos sencillos demuestran la importancia de la tecnología para conseguir la co-expresión de dos secuencias de interés, en la misma célula de la planta, a partir de dos replicones. En el caso de un vector viral no optimizado con una frecuencia de formación de replicón funcional sólo del 0,2% de todas las células, la proporción de células que co-expresan dos genes a partir de dos replicones de ARN diferentes será 0,2 x 0,2 = 0,04%, mientras que para la construcción con frecuencia de formación de replicón de ARN aumentada (el 50% o 1/2 de todas las células), dicha proporción de células será 0,5 x 0,5 = 0,25 o 25%, por ejemplo, aproximadamente 625 veces más alta. Con algunos de los vectores que mejor funcionan (por ejemplo PlCH16191, Fig. 7C) la proporción de células que poseen el replicón funcional alcanza aproximadamente el 90% (Fig. 7C, parte superior derecha). Esto significa que usando dicho vector para expresar dos secuencias de interés diferentes a partir de dos replicones independientes, la co-expresión puede producirse aproximadamente en el 80% de todas las células. Parece muy probable que la tecnología pueda mejorarse adicionalmente y que pueda conseguirse el 100% de co-expresión.

Cabe señalar que las diferencias conservativas de función en las secuencias heterólogas de interés a expresar a partir de dicho replicón de ARN podrían usarse también para aumentar la frecuencia de formación de replicón de ARN, particularmente en combinación con diferencias en secuencias para la función de replicón. Por ejemplo, se pueden introducir modificaciones en dichas secuencias de interés que son necesarias para la formación y/o procesamiento de dicho replicón.

En una realización importante de esta invención, la frecuencia de la formación de replicón se mejora insertando intrones nucleares en dichas secuencias para la función de replicón (Ejemplo de Referencia 4). La incorporación de intrones en la región codificante de la ARN polimerasa dependiente de ARN viral (RdRP) (Ejemplos de Referencias 4 y 8) da como resultado un aumento significativo (de al menos 50 veces) en la frecuencia de la formación de replicón a partir (Fig. 7A, B) de vectores que incluyen las diferencias conservativas de función como se define en el presente documento (plCH15034, plCH15025, plCH15499 en las Fig. 6A, B). En la Figura 5 del documento PCT/EP04/012743, se muestra el perfil del ARN para un vector que contiene 6 intrones de Arabidopsis insertados. En otro ejemplo (Ejemplo de Referencia 7), la inserción de intrones en secuencias de MP aumenta la frecuencia de formación de replicones al menos 100 veces Para la realización práctica de esta invención pueden usarse muchos intrones nucleares. Los Ejemplos de dichos intrones incluyen intrones de genes tpi Act1 del arroz y salT (Rethmeier et al., 1997, Plant J., 12, 895-899; Xu et al., 1994, Plant Physiol., 100, 459-467; McElroy et al., 1990, Plant Cell, 2, 163-171); genes del maíz Adh1, GapA1, de actina y Bz1 (Callis et al., 1987, Genes Dev., 1, 1183-11200; Donath et al., 1995, Plant Mol. Biol., 28, 667-676; Maas et al.,

1991, Plant Mol. Biol., 16, 1999-207; Sinlbaldi & Mettler, 1992, en We Cohn, K Moldave, eds, Progress in Nuclelc Acids Research and Molecular Biologi, vol. 42, Academic Press, New York, págs. 229-257), el gen SSU301 de rubisco de petunia (Dean et al., 1989, Plant Cell, 1, 201-208), genes de Arabidopsis A1 EF1α, UBQ10, UBQ3, PAT1 (Curie et al., 1993, Mol. Gen. Genet. 228, 428436; Norris et al., 1993, Plant Mol. Biol., 21, 895-906; Rose & Last, 1997, Plant J., 11, 455-464) y muchos otros. Para esta invención, también pueden usarse intrones sintéticos. Los intrones más pequeños, o sus partes, que pueden usarse pueden estar limitados para cortar y empalmar sitios donantes y aceptores que normalmente flanquean las secuencias intrónicas internas. Preferiblemente, los intrones deben tener un tamaño de al menos 50 nt, más preferiblemente un tamaño de 100 a 200 nt, pero realmente no hay limitaciones respecto al tamaño de los intrones. Sin embargo, el tamaño de las construcciones debe mantenerse adecuado para las manipulaciones. El origen del intrón, su estructura y tamaño pueden seleccionarse individualmente dependiendo de la naturaleza del vector. Para ensayar la eficacia de un intrón seleccionado o las partes intrónicas correspondientes, pueden usarse experimentos de expresión transitoria.

Las modificaciones descritas anteriormente tienen un efecto acumulativo, como por ejemplo, si la inserción (o inserciones) del intrón se combinan con una modificación del promotor subgenómico de la MP, el aumento de la frecuencia de la formación de replicones puede ser de aproximadamente 300 veces (Ejemplo de Referencia 5). En este documento, las regiones preferidas para las inserciones intrónicas para tener un aumento en la frecuencia de la formación de replicón de RNA, se denominan lugares seleccionados. Estos lugares pueden contener estructuras “de tipo intrón”. Esto se confirma por la inserción de intrones en la MP, realmente muy próxima una región problemática tal como el promotor subgenómico de la MP (Ejemplo de Referencia 7). Se observó un aumento de 100 veces en la frecuencia de la formación de replicones. La inserción de intrones en regiones “de tipo exón” no tuvo un efecto pronunciado tal como la inserción en dichas regiones de tipo intrónicas (Ejemplo de Referencia 6). EJEMPLOS

En el documento WO02/029068, puede encontrarse información sobre la genética de los tobamovirus como el TMV y tobamovirus que infectan a crucíferas. Los Ejemplos 1 a 3 no son ejemplos de la presente invención. EJEMPLO 1 Construcción de un vector de ARN basado en el TMV que expresa GFP

En la solicitud de patente internacional PCT/EP03712530 (véase también a continuación), se ha descrito un vector viral basado en crTMV que contiene GFP, plCH8543 (Fig. 1). Este clon contiene el promotor de actina 2 de Arabidopsis, la ARN polimerasa dependiente del ARN del TVCV, una secuencia quimérica (TVC/cr-TMV) para la proteína de desplazamiento, la segunda codificante de la GFP, la región no traducida de 3’ del crTMV y por último el terminador Nos, clonado en un vector binario. Este clon carece de una secuencia codificante de la proteína de cubierta. El plCH8543 se transformó en GV3101, cepa de Agrobacterium y, usando una jeringa sin aguja, se infiltró en una hoja de una planta de Nicotiana benthamiana. Cuatro días después de la infiltración, en el área infiltrada podían observarse los focos de fluorescencia de la GFP. La fluorescencia duró varias semanas en la hoja infiltrada pero no se desplazó hacia las hojas superiores no inoculadas. Construcción del vector plPH8543

En varias etapas de clonación, se construyó un replicón que contenía un gen de la proteína verde fluorescente (GFP). La construcción resultante plCH8543, contenía, en orden secuencial: un fragmento de 787 pb del promotor de actina 2 de Arabidopsis (ACT2, ref. An et al., 1996, acceso a GenBank AB026654, pb de 5796 a 58748) el extremo 5’ del TVCV (acceso a GenBank BRU03387, pb de 1 a 5455), un fragmento del cr-TMV (acceso a GenBank Z29370, pb de 5457 a 5677, con la timina en 5606 cambiada a citosina para eliminar el codón de inicio de la proteína de cubierta, CP), las secuencias “taa tcg ata act cga g”, un gen de GFP sintético (SGFP), la región no traducida de 3’ del cr-TMV (3’ NTR; acceso a GenBank Z29370, pb de 6078 a 6312) y finalmente el terminador de la nopalina sintasa (Nos). El fragmento completo se clonó entre los límites derecho (LD) e izquierdo (LI) del ADN-T del plCBV10, un vector binario derivado de CarbR pBIN19. EJEMPLO 2 Construcción de un vector de ARN basado en TMV que expresa CP

Los ADNc clonados del tobamovirus que infecta a crucíferas (cr-TMV; Lartey et al., 1994, FEBS Lett. 350, 5-8) y del virus del aclaramiento de las nervaduras del nabo (TVCV Lartey et al., 1994, Arch. Virol. 138, 287-289) se obtuvieron del Prof. Atabekov de la Universidad de Moscú, Rusia. Se construyó un vector viral que expresaba la CP del TVCV subclonando un fragmento de EcoRI-ApaI (que contenía parte de la MP, la secuencia codificante de la CP completa y la región no traducida 3’ del TVCV) a partir del ADNc del TVCV en plCH8543. El clon resultante, plCH10595 (Fig. 1), contiene el ADNc del TVCV completo clonado entre el promotor de actina 2 de Arabidopsis y el terminador Nos, en un vector binario. El plCH10595 se transformó en la cepa de Agrobacterium GV3101 y se infiltró en una hoja de Nicotiana benthamiana. Tres semanas más tarde, las hojas superiores no infiltradas tuvieron una apariencia amarilla arrugada lo que indicaba infección viral. La electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) con tinción con Coomassie y análisis por transferencia de Western reveló que las hojas sistémicas expresaban grandes cantidades de proteína de cubierta lo que indicaba que el plCH10595 era funcional.

Para ensayar si la CP producida por plCH10595 podría compactarse en trans en el replicón del ARN de plCH8543, los dos clones se co-infiltraron en una hoja de Nicotiana benthamiana. Cinco días después de la infiltración, podía detectarse la GFP en el área de la hoja inoculada. Sin embargo, en las hojas superiores no pudo detectarse la GFP incluso 3 semanas después de la infiltración. En este momento, la planta inoculada tenía síntomas típicos de una planta inoculada con un virus de tipo silvestre: era más pequeña que una planta de control no inoculada y las hojas superiores estaban arrugadas y amarillentas. Mediante PAGE y tinción del gel con Coomassie, se demostró que la CP se expresaba en la hoja sistémica, pero no pudo detectarse la proteína GFP. El análisis por transferencia de Western tampoco detectó la GFP en las hojas sistémicas, sin embargo la GFP se detectó en la hoja inoculada. En resumen, un virus de tipo silvestre no puede desplazar un amplicón viral que expresa un gen de interés (tal como GFP) en trans. EJEMPLO 3 Construcción de un clon que expresa CP que carece de un origen de ensamblaje.

En el ejemplo anterior, el virus de tipo silvestre sólo se detectaba en las hojas superiores de tipo silvestre no inoculadas cuando las hojas inferiores se infiltraban primero con una mezcla de clones que expresaban la GFP y la CP. El clon de la CP es tan eficaz para replicar y desplazar que el clon que expresa la GFP no puede competir eficazmente ni desplazarse sistémicamente. Para impedir que el clon que expresa la CP se desplace sistémicamente, se eliminó el área que supuestamente contenía el origen de ensamblaje (OAS) del virus (el clon que expresa la CP), que corresponde a parte de la MP localizada cadena arriba del promotor subgenómico de la CP. El clon resultante, plCH16601 (Fig.1) es similar a plCH10595 pero carece de los pares de bases 4966-5454 (coordenadas relativas al acceso al GenBank BRU3387). El plCH16601 se transformó en la cepa de Agrobacterium GV3101 y se co-infiltró con plCH8543 en una hoja de Nicotiana benthamiana. Doce días más tarde, la fluorescencia de la GFP apareció en las nervaduras de las hojas superiores no infiltradas. Después, los siguientes días, la fluorescencia de la GFP desapareció de las nervaduras hacia el interior del tejido de la hoja y cubrió parte del área de la hoja. Mediante PAGE y tinción con Coomassie así como análisis por transferencia de Western se demostró que la proteína GFP se produjo en las hojas sistémicas. Por lo tanto, eliminando el OAS del clon que expresa la CP se permite que un clon de interés se desplace sistémicamente proporcionando la CP en trans. EJEMPLO 4

La adicción de intrones a la construcción que contiene el gen de interés mejora su desplazamiento sistémico

Para mejorar la eficacia de la co-expresión del clon que expresaba la CP y del clon de interés en el área infiltrada, se insertaron intrones en la RdRp y en la MP de la construcción que contenía la secuencia heteróloga de interés. El plCH8543 se modificó añadiendo diez intrones de Arabidopsis en la RdRp (intrones de 1 a 10, secuencia en el anexo) en las posiciones 1844, 2228, 2588, 2944, 3143, 3381, 3672, 3850, 4299, 4497 (coordenadas relativas al acceso al GenBank BRU03387) y dos intrones en la MP (intrones 11-12) en las posiciones 5287 y 5444. El clon resultante, plCH17272 (Fig. 1) se co-infiltró en una hoja de Nicotiana benthamiana con plCH16601. La GFP apareció en las hojas sistémicas empezando 7 días después de la infiltración, más rápido que cuando se usó un clon sin intrón. EJEMPLO 5 La adición de intrones a la construcción que expresa la CP mejora el desplazamiento sistémico de la construcción que contiene la secuencia de interés

Para mejorar la expresión de la CP en un gran número de células en el área infiltrada, se añadieron los intrones 1 a 9 (descritos anteriormente) a plCH16601, en algunas posiciones como se describe para la construcción de plCH17272. Además, el área del promotor subgenómico de la MP se sustituyó por una secuencia menos rica en T y más rica en GC. Como resultado, la secuencia entre los pb 4585 a 5460 (coordenadas relativas al acceso al GenBank BRU03387) se sustituyó por la Sec 1 proporcionada en el anexo, dando lugar a la construcción plCH16684 (Fig. 1). plCH16684 se co-infiltró con plCH17272 en una hoja de N. benthamiana. Siete días después de la infiltración, la GFP apareció en hojas sistémicas (Fig. 2). Se obtuvo más tejido que expresaba la GFP que cuando se usaron los clones sin intrones.

Se fabricó una construcción adicional que expresaba la CP mediante la adicción de 6 intrones (intrones de 1 a 3 y de 7 a 9, como se describe para la construcción de plCH172172) a plCH10595. Esta construcción, plCH17501 (Fig. 1), contiene una MP completa y por lo tanto contiene el OAS. Esta construcción se co-infiltró con plCH17272. La GFP se expresó en el área de la hoja infiltrada, pero nunca se desplazó a las hojas sistémicas superiores (Fig. 3). En la hoja sistémica sólo se observaron los amplicones que expresaban la CP. Esto muestra que la presencia de intrones no es suficiente para el desplazamiento sistémico y que la eliminación del OAS del clon que expresa la CP es esencial. EJEMPLO 6 El gen de interés se expresa a un nivel elevado en la hoja sistémica

Para comparar el planteamiento descrito en el presente documento con el desplazamiento sistémico obtenido usando vectores tradicionales que expresan la CP de la misma molécula que el gen de interés, se fabricó una construcción de control, plCH17344, que expresada tanto la GFP como la CP (Fig. 1). Esta construcción es similar a plCH17272 pero el extremo 3’ de la NTR 3’ (que corresponde a los pb 6274 a 6312 en el acceso al GenBank Z29370) se sustituyó por la secuencia 3’ terminal 1005 del virus del mosaico verde atenuado del tabaco (TMGMV) variante U5 (pb 5498 a 6502). plCH17344 se transformó en Agrobacterium GV3101 y se infiltró en una hoja de Nicotiana benthamiana. Seis días después de la inoculación, se detectó fluorescencia de la GFP en hojas sistémicas. El análisis mediante PAGE y tinción con Coomassie demostró que se produjo más CP que GFP en las hojas sistémicas de plantas inoculadas con plCH17344 (Fig. 4). Por el contrario, en las hojas sistémicas de plantas inoculadas con una mezcla de plCH16684 y plCH17272 no había ninguna o escasa CP. Por lo tanto en la presente invención, la proteína más expresada en las hojas sistémicas corresponde al gen de interés en lugar de a la CP.

En hojas sistémicas de plantas inoculadas con una mezcla de plCH16684 y plCH17272, se produce alguna CP, aunque menos que con plCH17344. Esto se produce más probablemente como un resultado de la recombinación entre plCH16684 y plCH17272, lo que produce un virus de tipo silvestre que expresa la CP. Reduciendo la homología entre ambos clones, produciendo un clon basado en un virus emparentado pero diferente (por ejemplo la cepa U1 del TMV) que expresa la CP, dichos acontecimientos de recombinación puede reducirse o eliminarse. EJEMPLO 7 Expresión transitoria de la MP en trans en hojas infiltradas

Los clones con un OAS mutado, plCH16601 y plCH16684 (Fig.1), no pueden desplazarse de célula a célula debido a una deleción de una parte de la MP (a no ser que se co-expresen con un segundo amplicón que expresa la MP). Por lo tanto, solo un número limitado de células expresan la CP en áreas de la hoja infiltradas. Se dedujo que la expresión de la MP en trans, en todas las células del área infiltrada, produciría más células expresando la CP y por lo tanto más células co-expresando las construcciones de la GFP y la CP, y finalmente, más desplazamiento sistémico eficaz. Se fabricó una construcción que contenía el gen de la MP del TVCV, bajo el control del promotor de 35S. Esta construcción, plCH10745 (Fig. 5, A), se coinfiltró con plCH17272 y plCH16684 (Fig. 5B). El desplazamiento sistémico de los amplicones que expresaban la GFP fue significativamente más eficaz con dicha complementación transitoria de la MP en trans (Fig. 5B) que cuando no se usó la construcción del MP (véase la Fig. 2). EJEMPLOS DE REFERENCIA

Los siguientes Ejemplos de Referencia corresponden a los ejemplos 1 a 11 del documento PCT/EP04/012743. EJEMPLO DE REFERENCIA 1 Construcción de un vector de ARN basado en TMV

Los ADNc clonados del tobamovirus que infecta crucíferas (cr-TMV; Dorokhov et al., 1994, FEBS Lett. 350, 5-8) y del virus del aclaramiento de las nervaduras del nabo (TVCV; Lartey et al., 1994, Arch. Virol. 138, 287-298) se obtuvieron del Prof. Atabekov de la Universidad de Moscú, Rusia. En varias etapas de clonación, se fabricó un vector viral que contenía un gen de la proteína verde fluorescente (GFP). La construcción resultante, plCH8543 (Fig. 6A), contenía, en orden secuencial: un fragmento de 787 pb del promotor de actina 2 de Arabidopsis (ACT2, ref. An et al., 1996, acceso a GenBank AB026654, pb de 5796 a 58748) el extremo 5’ del TVCV (acceso a GenBank BRU03387, pb de 1 a 5455), un fragmento del cr-TMV (acceso a GenBank Z29370, pb de 5457 a 5677, con la timina en 5606 cambiada a citosina para eliminar el codón de inicio de la proteína de cubierta, CP), las secuencias “taa tcg ata act cga g”, un gen de GFP sintético (sGFP), la región no traducida de 3’ del cr-TMV (3’ NTR; acceso a GenBank Z29370, pb de 6078 a 6312) y finalmente el terminador de la nopalina sintasa (Nos). El fragmento completo se clonó entre los límites derecho (LD) e izquierdo (LI) del plCBV10, un vector binario derivado de CarbR pBIN19. El plCH8543 se transformó en una cepa de Agrobacterium GV3101 y se infiltró en una hoja de Nicotiana benthamiana. Los focos de fluorescencia de la GFP que aparecieron a 3 dpi crecieron y se volvieron confluentes. Sorprendentemente, a pesar de que la mayoría de las células en el área infiltrada expresaron finalmente la GFP debido a la replicación viral y al desplazamiento, sólo una fracción de las células iniciaron la replicación viral, como se detectó por varios focos que expresaban la GFP de manera independiente. Se hizo evidente que el factor limitante no es el suministro de ADN en las células de las plantas, puesto que la infiltración de las hojas de Nicotiana benthamiana, con un gen de GFP bajo control del promotor 35S, conduce a la expresión de la GFP casi en cada célula en el área infiltrada (no se muestra).

Para confirmar esta observación, se fabricó una construcción de vector viral que contenía una mutación en la MP. Esta construcción, denominada plCH14833, es similar a plCH8543 pero difiere por una deleción de 389 pb en el gen de MP, cadena arriba del sitio de EcoRI presente en la MP. La secuencia del fragmento de NcoI para EcoRI que incluye esta deleción se proporciona en el anexo como la SEC ID Nº 14. La construcción viral completa (del promotor ACT2 al terminador Nos) se clonó entre los límites izquierdo y derecho del ADN-T de plCBV49, un vector binario de KanR derivado de pBIN19. Debido a la deleción en la MP los replicones producidos de esta construcción no pueden desplazarse de célula a célula pero pueden replicarse autónomamente dentro de una célula. El desplazamiento célula a célula puede restaurarse cuando la MP se proporciona en trans, por ejemplo desde un promotor constitutivo tal como el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor

Para realizar una construcción de expresión de la MP, se amplificó el gen de la MP del TVCV por PCR del ADNc del TVCV clonado (acceso a GenBank Z29370, pb 4802 a 5628) y se subclonó en un vector binario bajo el control del promotor 35S. La construcción resultante, denominada plCH10745 (no mostrada) y plCH14833 se transformaron en la cepa de Agrobacterium GV3101 y se infiltraron diversas diluciones de un cultivo durante una noche en hojas de Nicotiana benthamiana como describen English y colaboradores (1997, Plant J., 12, 597-603), con la excepción de que el medio de infiltración carecía de acetosiringona. La infiltración de plCH14833 en solitario, condujo a la aparición de algunas células que expresaban GFP dentro del área infiltrada. Mediante el recuento de protoplastos preparados a partir del área infiltrada, se observó que sólo uno de tres protoplastos expresaba la GFP de un total de 500 protoplastos (del 0,2 al 0,6%). La coinfiltración de plCH14833 y plCH10745 condujo a la formación de focos que expresaban GFP que crecieron de cada célula que expresaba la GFP inicial. Por último, debido al desplazamiento célula a célula, una gran proporción de células en el área infiltrada expresaron la GFP (Fig. 7A).

Los virus de ARN tales como tobamovirus se replican en el citoplasma y nunca entran en el núcleo. Por lo tanto, han evolucionado en un entorno en el que no se exponen a la maquinaria de procesamiento de pre-ARNm nuclear. Como resultado, no es sorprendente que la maquinaria de procesamiento de ARN no pueda reconocer ni procesar correctamente los transcritos del replicón de ARN generados en el núcleo a partir de construcciones virales artificiales. Además, los replicones de ARN de vectores virales son muy grandes: aproximadamente 7.000 nt en el caso de los replicones basados en TMV. Muy pocos genes de plantas tienen un tamaño tan largo y la mayoría de estos genes contienen intrones que facilitan el procesamiento de los pre-ARNm, que se exportan desde el núcleo y que mejoran la estabilidad de los transcriptos procesados. Por lo tanto, se generó la hipótesis de que las modificaciones de los pre-ARNm que aumentarían la eficacia del procesamiento exacto y de la exportación de transcritos procesados correctamente desde el núcleo al citosol conduciría a un aumento del número de células que iniciarían la replicación viral. Resultó que existen dos planteamientos que pueden usarse para fabricar vectores basados en virus de ARN que pueden iniciar eficazmente la replicación viral después del suministro de ADN al núcleo: (1) un planteamiento es la eliminación de las características de la secuencia que pueden inducir acontecimientos de procesamiento no deseados (tales como acontecimientos de corte y empalme alternativos usando sitios de corte y empalme ocultos o acontecimientos de terminación prematuros); (2) un segundo planteamiento es la adición de intrones para aumentar la cantidad de transcritos procesados de manera adecuada, para mejorar la exportación de ARN desde el núcleo al citoplasma y/o para mejorar la estabilidad de los transcritos. EJEMPLO DE REFERENCIA 2

La eliminación de las secuencias de tipo intrón aumenta la frecuencia de la formación de replicón de ARN viral en el citoplasma

Se analizó la secuencia del replicón de ARN de plCH4261 usando el programa del servidor Netgenell (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetGne2/) y se observaron varias características de secuencia de tipo intrón que pueden inducir a acontecimientos de corte y empalme alternativos. Una característica de este tipo es una región de 0,6 kb rica en uridina (que corresponde del nt 827 al 1462 en el acceso a GenBank BRU03387) al principio de la RdRP (Fig. 2A del documento PCT/EP04/012743). Esta región se sustituyó en plCH14833 por una secuencia mutagenizada por PCR que difiere de la secuencia original por una sustitución de 54 nucleótidos (secuencia proporcionada en el anexo como SEC ID Nº 15; consúltese la Fig. 3 del documento PCT/EP04/012743). Las sustituciones de 52 nucleótidos se realizaron para sustituir las secuencias ricas en T con secuencias más ricas en GT. Todas las sustituciones de nucleótidos fueron silenciosas para no cambiar la secuencia de la proteína RdRP. Este fragmento mutagenizado también contiene dos sustituciones de nucleótidos (en las posiciones 829 y 1459; coordenadas relativas al acceso a GenBank BRU03387) que se introdujeron para eliminar los supuestos sitios donante y aceptor de corte y empalme ocultos, respectivamente. Para ensayar el efecto de estas mutaciones, el clon resultante plCH15466 (Fig. 6A) se agroinfiltró en hojas de N. benthamiana con o sin plCH10745 (proteína de desplazamiento en trans). Ocho días después de la infiltración, en el área infiltrada con plCH15466, se observó un aumento de diez veces en el número de células que expresaban la GFP (en comparación con plCH14833, Fig. 7). Lo que sugiere que la eliminación de secuencias de tipo intrón del amplicón viral impide acontecimientos de corte y empalme alternativos no deseados y produce un inicio más eficaz de la replicación viral. La coinfiltración de plCH15466 y plCH10745 conduce al desplazamiento célula a célula del replicón modificado a una velocidad similar a la del replicón no modificado. Esto demuestra que la modificación de la secuencia de ARN no afecta al desplazamiento célula a célula del vector viral. EJEMPLO DE REFERENCIA 3

Eliminación de las secuencias de tipo intrón en el promotor subgenómico de la MP

Una segunda región posiblemente problemática corresponde al promotor subgenómico de la MP (Fig. 2B del documento PCT/EP04/012743). Esta región es muy rica en T y se asemeja bastante a las secuencias intrónicas. Como consecuencia, se predicen muchos sitios donante y aceptor de corte y empalme ocultos en secuencias cercanas mediante programas de predicción de intrones. Por desgracia, en esta región las modificaciones no pueden realizarse fácilmente sin influir en la función del promotor subgenómico. Se decidió mutagenizar completamente toda la región sin tener en cuenta el promotor subgenómico y para proporcionar la MP en trans para compensar la pérdida esperada de la expresión de la MP. Como la MP no se expresaría desde esta construcción, también se eliminó la mayoría de la secuencia de la MP excepto las secuencias de 3’ que contienen el promotor subgenómico de la CP que se necesita para dirigir la expresión del gen de interés. Por lo tanto, se sustituyó un fragmento de 383 pb en plCH14833 (pb 4584 a 5455 en el acceso a GenBank BRU03387) por un fragmento mutagenizado de 297 pb (SEC ID Nº 16). La construcción resultante plCH15900 (Fig. 6A) se agroinfiltró en hojas de Nicotiana benthamiana con o sin plCH10745. Curiosamente, se detectó un enorme aumento en el número de células que iniciaron la replicación en comparación con las áreas de las hojas infiltradas con plCH14833. Mediante el recuento de los protoplastos que expresaban la GFP, preparados a partir de áreas de hojas infiltradas, se calculó que esta modificación dio como resultado un aumento de 80 a 100 veces en el número de células que iniciaron la replicación viral en comparación con el plCH14833 no modificado. plCH15900 se coinfiltró con plCH10745 (casete de expresión p35S-MP) y se detectó un aumento en la fluorescencia de la GFP debido al desplazamiento célula a célula. Sin embargo, este aumento fue muy limitado debido a que muchas células ya expresaban la GFP incluso en ausencia del desplazamiento célula a célula. Una dilución de 100 veces (que corresponde aproximadamente a una DO de 0,004 a 600 nm) de la suspensión de Agrobacterium que contenía plCH15900 coinfiltrado con una suspensión diluida 5 veces de agrobacteria que contenía plCH10745 (que corresponde aproximadamente a una DO calculada de 0,8 a 600 nm) dio lugar a focos de expresión de la GFP separados. Los focos de fluorescencia fueron tan brillantes y del mismo tamaño como los focos del control que se obtuvieron con plCH14833. Esto quiere decir que la modificación en plCH15900 y el suministro de la MP en trans no comprometen funcionalmente al replicón con respecto al nivel de replicación, expresión del gen de interés y desplazamiento célula a célula. Se coinfiltraron las mismas construcciones (plCH14933 y plCH15900, con o sin plCH10745) a hojas de Nicotiana tabacum. Las modificaciones en plCH15900 condujeron a un aumento similar en el número de células que iniciaban la replicación (en comparación con plCH14833) como hicieron en N. benthamiana. EJEMPLO DE REFERENCIA 4

La adición de intrones mejora la frecuencia de formación de replicones de ARN funcionales en el citoplasma.

Se ensayó si la adición de intrones en las secuencias pro-replicón virales aumentaría la frecuencia de iniciación de la replicación. Se fabricaron dos construcciones, plCH15025 y plCH15034 (Fig. 6A), conteniendo cada una tres intrones diferentes de Arabidopsis thaliana en dos regiones diferentes de la RdRP. El plCH15025 se diseñó para contener intrones en el medio de la RdRP, mientras que plCH15034 contenía intrones en el extremo 3’ de la RdRP, cadena arriba del promotor subgenómico de la MP. Los intrones se amplificaron por PCR a partir de ADN genómico Arabidopsis y se incorporaron en secuencias virales usando PCR con cebadores que solapaban las uniones intrón/exón diseñadas. Los fragmentos que contenían los intrones se subclonaron en plCH14833 como un fragmento de AvaI HindIII (SEC ID Nº 17 en el anexo) para fabricar plCH15025 o como un fragmento de Pst1 NcoI (SEC ID Nº. 18 en el anexo) para fabricar plCH15034.

Ambas construcciones se infiltraron individualmente en hojas de N. benthamiana y se compararon con pICH14883. Ambas construcciones aumentaron significativamente el número de células que iniciaban la replicación viral (Fig. 7A). Se calculó que este aumento era del orden de una mejora de 50 veces en relación con plCH14833. Ambas construcciones también se coinfiltraron con un clon que expresaba MP y se descubrió que el desplazamiento de célula a célula era idéntico al de los clones sin intrones. Ambas construcciones se ensayaron también en N. tabacum, y se observó una mejora similar como en N. benthamiana (Fig. 7B).

Se construyó un tercer clon, plCH15499, que contenía todos los 6 intrones (6B, 7A, 7B). Esta construcción se ensayó en N. benthamiana y N. tabacum. Esta construcción fue más eficaz que la de cada construcción individual con 3 intrones, pero, sin embargo, la mejora fue menos aditiva. EJEMPLO DE REFERENCIA 5 La adición de intrones y la eliminación de secuencias de tipo intrón aumentan la frecuencia de la formación de replicones de ARN funcionales en el citoplasma.

La eliminación de las características de tipo intrón y la adición de intrones adicionales en una construcción mostró que ambos tipos de modificaciones podían contribuir a mejorar el inicio de la replicación viral. Se subclonaron los 6 intrones de plCH15499 en plCH15900, que contiene la región de promotor subgenómico de MP mutagenizada. El clon resultante plCH15860 (Fig. 6B) se infiltró en hojas de N. benthamiana y se descubrió que funcionaban significativamente mejor que cualquiera de los clones parentales dentro del intervalo de aproximadamente el 50% al 90% de todos los protoplastos que expresaban GFP (Fig. 7). La construcción que mejor funcionaba contenía intrones dentro de la región RdRP y de la región del promotor subgenómico de la MP modificada (plCH16191, Fig. 7C). En comparación con un clon sin ninguna modificación, esto representa una mejora de 80 a 300 veces. Esta construcción también se co-filtró con una construcción que expresaba MP (plCH10745) y se descubrió que las modificaciones no comprometían el desplazamiento de célula a célula o la replicación.

EJEMPLO DE REFERENCIA 6

No todas las adiciones intrónicas aumentan la frecuencia de aparición de replicones de ARN funcionales en el citoplasma.

Se insertaron dos intrones diferentes de Arabidopsis al inicio de la RdRP, produciendo el clon plCH15477 (la secuencia de esta región se muestra como SEC ID Nº 19 en el anexo). La secuencia de esa región ya aparece muy "de tipo exón" (por ejemplo, rica en GC sin sitios de corte y empalme ocultos) antes de la adición de intrones. En esta construcción no se observó ninguna mejora en la replicación del inicio viral. Por lo tanto, la adición de un intrón no producirá ninguna mejora del vector viral. Parece que la posición elegida para la inserción intrónica o mutagénesis es un parámetro importante. Por ejemplo, todas las inserciones de intrones o sustituciones de nucleótidos que se realizaron en regiones cercanas a estructuras problemáticas, tales como el promotor subgenómico de MP, produjeron grandes mejoras, mientras que las inserciones de intrones en secuencias que ya eran "de tipo exón" no. EJEMPLO DE REFERENCIA 7 La inserción de intrones en secuencias de la MP aumenta la frecuencia de la formación de replicón viral

En primer lugar, se realizó un desplazamiento de la fase de lectura en la MP por ingestión con la enzima de restricción Avril, se rellenó y se religó. Después, se insertaron dos intrones en la MP. El clon resultante plCH16422 (Fig. 6B) se infiltró en hojas de Nicotiana benthamiana. Se detectó un aumento de aproximadamente 100 veces en el número de células que contenían el replicón viral funcional. EJEMPLO DE REFERENCIA 8 La inserción de intrones en un vector que contiene la MP mejora la frecuencia de iniciación de la replicación viral de clones funcionales autónomos

Se subclonó un fragmento Kpn1 EcoRI desde plCH15499 a plCH8543. El clon resultante, 16700 (Fig. 6B) contenía un vector viral completo con 6 intrones en la RdRP. Este clon se infiltró en una hoja de N. benthamiana e inició eficazmente la replicación. Este clon también pudo desplazarse de célula a célula sin necesidad de proporcionar la MP adicional en trans.

EJEMPLO REFERENCIA 9

Activación de un replicón inactivo integrado de manera estable en un cromosoma

También es posible transformar de manera estable construcciones de vectores virales que contienen intrones en plantas transgénicas. Para evitar la replicación viral defectuosa que inhibiría el crecimiento de la planta, puede fabricarse un clon inactivo (pro-replicón) que tiene una parte del actual vector en orientación antisentido (Fig. 8). La incorporación de sitios de recombinación y de secuencias intrónicas en los extremos del fragmento invertido permite a ese fragmento "invertirse" en la orientación correcta usando una recombinasa apropiada. Los sitios de recombinación se eliminarán completamente del replicón por corte y empalme. Los intrones en el pro-replicón permiten la iniciación eficaz de la replicación después de la recombinación y la transcripción. En un ejemplo específico, los sitios de recombinación se localizan dentro del gen de interés y cadena abajo del pro-replicón. Esta configuración impide cualquier expresión génica antes de la recombinación. Cuando los sitios de recombinación se localizan en otras áreas del pro-replicón, pueden considerarse otras configuraciones tales como en la RdRP y cadena arriba del promotor. Las secuencias intrónicas en el sitio de recombinación tienen la ventaja de permitir la eliminación completa del sitio de recombinación del replicón, pero también aumenta la eficacia de la replicación viral, como se ha descrito anteriormente.

La parte invertida puede localizarse en el extremo 3' del vector (como se muestra en la Fig. 8), en el medio o en el extremo de 5', como se muestra en la Fig. 9. Se fabricaron dos construcciones, plCH12691 (que contenía sólo un intrón en el sitio de recombinación) y plCH16888 que contenía 6 intrones adicionales en la RdPR. La secuencia de toda la región del ADN-T del plCH12691 se proporciona en la SEC ID Nº 20. El plCH16888 es similar al plCH12691, pero, además, contiene los tres intrones descritos anteriormente en plCH15025 (SEC ID Nº 17) y los tres intrones descritos en plCH15034 (SEC ID Nº 18) insertados en la misma posición como en estas construcciones, respectivamente. Tanto plCH12691 como plCH16888 se transformaron establemente en Nicotiana benthamiana usando selección con kanamicina de la siguiente manera. Las construcciones plCH12691 y plCH16888 se inmovilizaron individualmente en A. tumefaciens (GV3101) y se usaron individualmente para la transformación de discos foliares, mediada por Agrobacterium, de plantas de Nicotiana como describen Horsh y colaboradores (1985, Science, 227, 1229-1231) con pequeñas modificaciones. Los discos foliares se co-cultivaron durante 30 minutos en una suspensión agrobacteriana en medio basal de Murashige y Skoog (MS) complementado con 1 mg/l de ácido alfa-naftaleno acético (NAA), 0,5 mg/l de 6-benzaminopurina (BAP), acetosirengona 200 microM (AS), pH 5,5 -5,6. Después, los discos foliares se colocaron en papel de filtro estéril Whatman® para eliminar el líquido sobrante y se transfirieron a un medio de co-cultivo sólido (agar al 0,8% preparado en MS complementado como se ha descrito anteriormente) durante 48 horas de cultivo en la oscuridad a 22-23ºC. Después del co-cultivo, los discos foliares se colocaron en un medio de regeneración selectivo (agar al 0,8% preparado en MS complementado con 1 mg/ml de BAP, 0,1 mg/ml de NAA, 1 mg/l de MES (pH 5,7-5,8), 300 mg/ml de cefotaxima, 50 mg/ml de kanamicina). Después de 3-6 semanas de cultivo en el medio de regeneración, los brotes regenerados de las células de las plantas resistentes a kanamicina se transfirieron a un medio selectivo de enraizamiento (agar al 0,8% preparado en MS complementado con 300 mg/l de cefotaxima, 200 mg/l de timentina para facilitar la eliminación de Agrobacterium, 50 mg/l de kanamicina, pH 5,7-5,8). Los transformantes regenerados se transfirieron a un invernadero y se ensayaron para determinar la infiltración con una jeringa sin aguja con una suspensión agrobacteriana que contenía una construcción de expresión de integrasa (plCH10881; promotor de actina 2 -integrasa PhiC31; o plCH14313; promotor de Spm de elemento reversible de Zea maize -integrasa PhiC31). Los transformantes de plCH16888 mostraron más focos de replicación viral, después de la infiltración con la construcción de integrasa, que los transformantes de plCH12691 (Fig. 10). Además, los transformantes de plCH16888 presentaron más focos de iniciación viral por infiltración. EJEMPLO DE REFERENCIA 10

Las secuencias de ARN viral en plantas contienen regiones posiblemente inestables

Se realizó el análisis del perfil de ARN de virus seleccionados de ARN en plantas así como el de un gen de plantas bien caracterizado (AtDMCI) usando el programa del servidor Netgenell (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2/). El perfil de ARN mostrado en la Fig. 9 del documento PCT/EP04/012743 para AtDMCI refleja claramente la presencia de 14 intrones (rodeados por círculos), previamente identificados comparando las secuencias de ADNc y ADN genómico. Es evidente que los perfiles de ARN de dos virus de plantas tienen regiones (véanse las Figuras 10, 11 del documento PCT/EP04/012743) que pueden ocasionar problemas para la estabilidad de dicho ARN, si se ubican en un entorno nuclear en plantas. Se han analizado los perfiles de ARN de varios representantes de otros virus de ARN en plantas (no mostrados) tales como el Virus del Mosaico del Bromo, diferentes cepas del TMV y muchos otros. Todos ellos tienen regiones posiblemente problemáticas que podrían comprometer la eficacia de la formación de replicones basada en virus de ARN de plantas si se suministran en la célula de la planta como precursores de ADN. EJEMPLO DE REFERENCIA 11

Funcionamiento de vectores optimizados en otras especies

Se realizó una construcción totalmente optimizada que contenía la región mutagenizada (descrita en plCH15466) y 16 intrones (incluyendo los seis intrones de plCH15860, los dos intrones de plCH16422 y ocho intrones adicionales). En resumen esta construcción contenía intrones insertados en las siguientes posiciones (proporcionadas en relación con la secuencia del TVCV, acceso a GenBank BRU03387): nt 209, nt 828, nt 1169, nt 1378, nt 1622, nt 1844, nt 2228, nt 2589, nt 2944, nt 3143, nt 3381, nt 3672, nt 3850, nt 4299, nt 5287, nt 5444.

Esta construcción se ensayó para determinar la expresión en Beta vulgaris. La infiltración de toda la planta se realizó como se describe a continuación. Agrobacterias que contenían plCH18711 se inocularon a 300 ml de LB que contenía 50 μg/ml de Rifampicina y 50 μg/ml de Kanamicina (selección para el vector binario) y se cultivaron hasta saturación. Las bacterias se sedimentaron a 4800 g durante 10 minutos y se resuspendieron en 3 l de tampón de infiltración (MES 10 mM pH 5,5, MgSO4 10 mM) para conseguir una dilución de 10 veces en relación con el cultivo de Agrobacterium saturado. Se colocó un vaso de precipitado que contenía la solución de infiltración en un desecador (30 mm de diámetro), con las partes aéreas de una planta sumergida en la solución. Se aplicó vacío durante 2 minutos usando una bomba de Tipo PM 16763-860.3 de KNF Neuberger (Freiburg, Alemania), que alcanzaba de 0,5 a 0,9 bares (de 50 a 90 pascales). Las plantas se pusieron de nuevo en el invernadero en condiciones convencionales.

La expresión de la GFP fue alta en hojas de las plantas infiltradas con plCH18711 (Fig. 11). Por el contrario, en las plantas de control infiltradas con pICH 16700 que no contenían intrones (no mostrado) sólo pudieron observarse unas pequeñas manchas.

ANEXO SEC ID Nº: 1: intrón 1

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SEC ID Nº: 2: intrón 2

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SEC ID Nº: 3: intrón 3

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SEC ID Nº: 4: intrón 4

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SEC ID Nº: 5: intrón 5

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SEC ID Nº: 6: intrón 6

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SEC ID Nº: 7: intrón 7

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SEC ID Nº: 8: intrón 8

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SEC ID Nº: 9: intrón 9

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SEC ID Nº: 10: intrón 10

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SEC ID Nº: 11: intrón 11

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SEC ID Nº: 12: intrón 12

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SEC ID Nº: 13: Seq1

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SEC ID Nº 14 (fragmento Ncol-EcoRI de pICH14833):

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SEC ID Nº 15 (parte de pICH15466):

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SEC ID Nº 16 (parte de pICH15900):

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SEC ID Nº 17 (parte de pICH15025): (contiene 3 intrones que se muestran subrayados en cursiva)

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SEC ID Nº 18 (parte de pICH15034): (contiene 3 intrones mostrados subrayados en cursiva) ctgcag

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SEC ID Nº 19 (fragmento de pICH15477, contiene 1 intrón mostrado subrayado en cursiva) SEC ID Nº 20: Región ADN-T de plCH12691, en la que los segmentos de la secuencia tienen la siguiente función:

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5 Nucleótidos 1 a 25: límite izquierdo (cadena opuesta), Nucleótidos 86 a 1484: promotor Nos -secuencia codificante NPTII -Terminador Nos (en la cadena opuesta) Nucleótidos 1506 a 1552: sitio de recombinación AttP (cadena opuesta), Nucleótidos 1553 a 1599: parte intrónica 5' (cadena opuesta),

10 Nucleótidos 1600 a 2022: extremo 5’ de la RdRP del TVCV (cadena opuesta), Nucleótidos 2023 a 2809: promotor de actina 2 de Arabidopsis (cadena opuesta), Nucleótidos 2836 a 2903: sitio de recombinación AttB

15 Nucleótidos 2904 a 2959: parte intrónica 3' Nucleótidos 2960 a 7991: parte 3' de la RdRP del TVCV -parte 5' de la MP, Nucleótidos 7992 a 8168: extremo 3' de la MP del cr-TMV, Nucleótidos 8248 a 8967: secuencia codificante de la GFP Nucleótidos 8961 a 9215: región no traducida 3' del cr-TMV,

Nucleótidos 9234 a 9497: terminador Nos, Nucleótidos 9549 a 9473: límite derecho del ADN-T (cadena opuesta):

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Sistema para replicar o para replicar y expresar una secuencia de interés en una planta, que comprende:

(i)

un precursor de ADN de un replicón de ARN, derivando dicho replicón de ARN de un virus de ARN monocatenario de sentido positivo y que comprende al menos una secuencia de interés, conteniendo dicho precursor de ADN de dicho replicón de ARN, en la ORF de replicasa o en una ORF de proteína de desplazamiento de dicho replicón de ARN, uno o más intrones cerca o en lugares ricos en A/U de secuencias derivadas de dicho virus de ARN; y

(ii)

un precursor de ADN de un replicón auxiliar, en el que dicho replicón auxiliar

(a)

no puede desplazarse sistémicamente en una planta tanto en presencia como en ausencia de dicho replicón de ARN (i), y

(b)

puede expresar una planta o una o más proteínas necesarias

para el desplazamiento sistémico de dicho replicón de ARN (i),

por lo que la no posibilidad de desplazamiento sistémico de dicho

replicón auxiliar se debe a la ausencia de un origen funcional de

ensamblaje de las partículas virales o se debe a una incompatibilidad

de dicha una o más proteínas definidas en el punto (b) con dicho

replicón auxiliar (ii);

por lo que dicho replicón de ARN (i) puede replicar o replicar y expresar dicha secuencia de interés en una planta, pero no puede desplazarse sistémicamente en una planta en ausencia de dicha una o más proteínas expresadas por dicho replicón auxiliar (ii).
2.

El sistema de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho replicón auxiliar (ii) puede expresar, en una planta, una proteína de cubierta y/o una proteína de desplazamiento necesaria o útil para dicho desplazamiento sistémico de dicho replicón de ARN (i) en dicha planta.
3.

El sistema de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho replicón de ARN (i) no puede expresar una proteína necesaria para el desplazamiento sistémico de dicho replicón de ARN (i) en dicha planta.
4.

El sistema de acuerdo con la reivindicación 3, en el que dicho replicón de ARN (i) carece de una fase de lectura abierta de la proteína de cubierta y dicha secuencia de interés es más grande que 1 kb.
5.

El sistema de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho replicón de ARN (i) está basado en o contiene componentes de un tobamovirus.
6.

El sistema de acuerdo con la reivindicación 5, en el que dicho tobamovirus es un virus del mosaico del tabaco.
7.

El sistema de acuerdo con la reivindicación 5 ó 6, en el que dicho replicón de ARN (i) está basado en un tobamovirus en el que la fase de lectura abierta de la proteína de cubierta se sustituye por dicha secuencia de interés.
8.

El sistema de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho replicón de ARN (i) está basado en o contiene componentes del virus del mosaico de la alfalfa.
9.

El sistema de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho replicón de ARN (i) está basado en o contiene componentes del virus X de la patata.
10.

El sistema de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho replicón de ARN (i) esta basado en o contiene componentes del virus de mosaico del guisante pinto.
11.

El sistema de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a10, en el que dicho precursor de dicho replicón auxiliar (ii) es ADN que codifica dicho replicón auxiliar (ii), por lo que dicho ADN puede producir dicho replicón auxiliar (ii) en las células de dicha planta.
12.

El sistema de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que dicho precursor de dicho replicón de ARN (i) o dicho precursor de dicho replicón auxiliar (ii) están incluidos en agrobacterias.
13.

El sistema de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que el sistema comprende adicionalmente una planta, o semillas de la misma, para replicar o para replicar y expresar dicha secuencia de interés.
14.

El sistema de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que dicha planta es una planta dicotiledónea, preferiblemente una planta Solanácea, más preferiblemente una planta de Nicotiana, más preferiblemente de tabaco.
15.

El sistema de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que dicha planta es transgénica y expresa una proteína viral necesaria o útil para el desplazamiento célula a célula de dicho replicón de ARN (i) o de dicho replicón auxiliar (ii).
16.

El sistema de acuerdo con la reivindicación 15, en el que dicha proteína viral es una proteína de desplazamiento del virus del mosaico del tabaco.
17.

El sistema de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en el que dicho replicón de ARN (i) y dicho replicón auxiliar (ii) carecen de homología en regiones funcionalmente solapantes.
18.

El sistema de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, mediante el cual dicho replicón de ARN (i) y dicho replicón auxiliar (ii) carecen de una homología propensa a la recombinación en una recombinación de región en la que entre dicho replicón de ARN (i) y dicho replicón auxiliar (ii) se crearía un replicón de ARN que podría expresar una proteína necesaria para el desplazamiento sistémico y que podría desplazarse sistémicamente en dicha planta.
19.

El sistema de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en el que la homología de secuencia entre dicho replicón de ARN (i) y dicho

replicón auxiliar (ii) en cualquiera de los segmentos de secuencia que tiene al menos 100 nucleótidos es como máximo del 80%.
20.

El sistema de acuerdo con la reivindicación 19, en el que dichos segmentos de secuencia se localizan cadena abajo de las ORF de replicasa de dicho replicón de ARN (i) y dicho replicón auxiliar (ii).
21.

El sistema de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, en el que dicho replicón auxiliar (ii) carece de una ORF de proteína de desplazamiento pero contiene un ORF de replicasa y una ORF que codifica una proteína necesaria para el desplazamiento sistémico de dicho replicón de ARN (i), estando la última ORF bajo el control de un promotor subgenómico, derivando dicho promotor subgenómico de un virus de ARN de una cepa diferente del virus del ARN a partir del cual deriva el promotor subgenómico que controla la expresión de dicha secuencia de interés en dicho replicón de ARN (i).
22.

El sistema de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, en la que la secuencia de dicho replicón de ARN (i) y la secuencia de dicho replicón auxiliar (ii) no se solapan.
23.

El sistema de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, en el que dicho precursor de ADN de dicho replicón de ARN (i) contiene uno o más intrones en la ORF de replicasa de dicho replicón de ARN (i).
24.

Un proceso de replicación o de replicación y expresión de una secuencia de interés en una planta, que comprende proporcionar células de una planta con

(i) un precursor de ADN de un replicón de ARN, derivando dicho replicón de ARN de un virus de ARN monocatenario de sentido positivo y comprendiendo al menos una secuencia de interés, conteniendo dicho precursor de ADN de dicho replicón de ARN, en la ORF de replicasa o en una ORF de la proteína de desplazamiento de dicho replicón de ARN, uno

o más intrones cerca o en lugares ricos en A/U de secuencias derivadas de dicho virus de ARN; y

(ii) un precursor de ADN de un replicón auxiliar, en el que dicho replicón auxiliar

(a)

no puede desplazarse sistémicamente en dicha planta tanto en presencia como en ausencia de dicho replicón de ARN (i), y

(b)

puede expresar, en una planta, o una o más proteínas necesarias para el desplazamiento sistémico de dicho replicón de ARN (i),

por lo que la no posibilidad de desplazamiento sistémico de dicho replicón auxiliar se debe a la ausencia de un origen funcional de ensamblaje de las partículas virales o se debe a una incompatibilidad de dicha una o más proteínas definidas en el punto (b) con dicho replicón auxiliar (ii);

por lo que dicho replicón de ARN (i) puede replicar o replicar y expresar dicha secuencia de interés en una planta, pero no puede desplazarse sistémicamente en dicha planta en ausencia de dicha una o más proteínas expresadas por dicho replicón auxiliar (ii).
25.

El proceso de acuerdo con la reivindicación 24, en el que dicha planta se proporciona con dicho replicón de ARN (i) y/o dicho replicón auxiliar (ii) por transfección con agrobacterias que contienen en su ADN-T dicho precursor de dicho replicón (i) y/o con agrobacterias que contienen en su ADN-T dicho precursor de dicho replicón auxiliar (ii).
26.

El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 24 a 25, en el que una parte de dicha planta, como una hoja, se proporciona con dicho replicón de ARN (i) y dicho replicón auxiliar (ii) pero no otras partes de dicha planta.
27.

El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 24 a 26, en el que dicha secuencia de interés puede replicarse o replicarse y expresarse sistémicamente en partes de dicha planta no proporcionadas ni con dicho replicón de ARN (i) ni dicho replicón auxiliar (ii).
28.

El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 24 a 26, en el que dicha planta es un planta dicotiledónea, preferiblemente una

planta Solanácea, más preferiblemente una planta de Nicotiana, más preferiblemente dicha planta es tabaco.
29.

El proceso de acuerdo con la reivindicación 24, en el que dicho replicón

5 auxiliar (ii) deriva de un virus de ARN monocatenario de sentido positivo y dicho precursor de ADN que codifica dicho replicón auxiliar (ii) contiene secuencias para la función de replicón de dicho replicón auxiliar (ii), seleccionándose dichas secuencias para la función de replicón de una ORF de replicasa y de una ORF de la proteína de desplazamiento y derivando de una secuencia de

10 dicho virus de ARN, dichas secuencias para la función de replicón presentan, en lugares seleccionados de dicha secuencia de dicho virus de ARN, la inserción de uno o más intrones, ocasionando dicha inserción una frecuencia de formación de replicón auxiliar aumentada en comparación con la de un replicón auxiliar que no presenta dicha inserción.

15
30. El proceso de acuerdo con la reivindicación 29, en el que dichas células de una planta que se proporcionan con dicho replicón de ARN (i) y dicho replicón auxiliar (ii) comprenden la transformación transitoria mediada por Agrobacterium con dicho precursor de ADN (i) y dicho precursor de ADN (ii).

20
31. El uso del sistema de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23 para expresar una proteína de interés en una planta a partir de dicha secuencia de interés.