JPWO2018038249A1 - ウイルス抵抗性タバコおよびその作出方法 - Google Patents

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Abstract

ウイルスに対して抵抗性を有するタバコを提供するため、本発明に係るタバコは、ウイルスに対して非機能的な翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質を生産するか、または翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の発現が抑制されており、さらに、ウイルスに対して非機能的な翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２タンパク質を生産するか、または翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２遺伝子の発現が抑制されている。

Description

本発明は、ウイルス抵抗性タバコおよびその作出方法に関するものである。
Potyvirus属は植物ウイルスの中で最大のグループであり、様々な植物を宿主とする。Potato virus Y（以下、ＰＶＹ）は、Potyvirus属のウイルスであり、アブラムシを通じて非永続的に伝搬し、ナス科植物の多様な種に感染する。タバコ（Nicotiana tabacum）においては、ＰＶＹは、その系統および感染するタバコ品種によって、葉肉の濃緑淡、葉脈および茎の壊疽、葉の黄化、ならびに生育抑制等の症状を引き起こし、その結果葉たばこの品質ならびに収量の低下をもたらし、世界中の葉たばこ生産に大きな被害を及ぼす。特に葉脈および茎の壊疽症状が生じると、その後葉の黄化および褐変から、植物体自体が枯死に到る場合が多く、葉たばこの品質および収量に与える影響が大きい（非特許文献１）。またＰＶＹに感染し品質が低下した葉たばこを原料に使用した場合、生産されるたばこ製品の品質も大きく低下する。
一方、Tobacco bushy top virus（以下、ＴＢＴＶ）は、Umbravirus属に属するウイルスであり、アフリカおよびアジアに発生しているタバコブッシートップ病の原因ウイルスである。このウイルスは、自然界ではアブラムシによって永続的に伝搬され、タバコに生育停滞および葉のモットリング症状を引き起こし、品質および収量の低下をもたらす。タバコブッシートップ病は、特にアフリカ諸国における重要病害となっている。
タバコでは、ＰＶＹに対する抵抗性を示す既存遺伝資源Virgin A mutant（以下、ＶＡＭ）が知られており、積極的にタバコ育種プログラムに活用されてきた。しかし最近、ＶＡＭの抵抗性を打破するＰＶＹの新系統であるVAM-Breaking系統（PVY-Breaking系統、またはＰＶＹ−Ｂと表記することもある）が世界中で報告された。よって、現在、このVAM-Breaking系統に対する抵抗性タバコが強く求められている。過去、放射線照射によって、VAM-Breaking系統への抵抗性を獲得したタバコが報告されたが（非特許文献２）、原因遺伝子の同定には至っていない。また、例えばNicotiana africana等のタバコ野生種の中にPVY-Breaking系統に抵抗性を示すものがあることは知られており、タバコ（Nicotiana tabacum）への応用が進んでいるが、実用化には至っていない。
一方、タバコブッシートップ病に対する抵抗性源の探索が、４３種類のタバコ品種およびNicotiana属野生種を使って実施された。その結果、タバコ品種の中には抵抗性を示すものはなかったが、数種の野生種で症状を示さなかったことが報告されている（非特許文献３）。しかし、その抵抗性の遺伝様式は明らかにされておらず、さらに野生種から栽培種であるN. tabacumに抵抗性を導入した場合、品質および収量に悪影響を与える形質も同時に導入されることが予想されるため、実用化には未だ長い道のりがある。
およそ２００種類ある既知の植物ウイルス抵抗性遺伝子の約半分は劣性遺伝をする（非特許文献４）。これらはウイルス増殖および細胞間移行等に必要な宿主因子であると考えられる。ここ１０年の研究から、これらの因子の一部が明らかとなってきた。例えばｅＩＦ４ＥおよびｅＩＦ４Ｇ等の翻訳開始因子、DEAD-box RNA helicase-like protein（非特許文献５）、システインリッチなVPg-interacting protein（非特許文献６）、およびTranslation elongation factor（非特許文献７）等が、劣性のウイルス抵抗性遺伝因子として同定された。勿論これらが全てではなく、他にも多数の候補があると考えられ（非特許文献４）、例えば、植物ウイルスの師管輸送に関連する様々な植物因子（非特許文献８）が挙げられる。
ウイルスは自分自身のゲノムからタンパク質を合成する際、宿主の翻訳開始機構を利用する。２００２年に、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）におけるTurnip mosaic virus（ＴｕＭＶ）に対する劣性の抵抗性遺伝因子が、翻訳開始因子であるｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの変異であることが示された（非特許文献９）。それ以来、既知のPotyvirus属のウイルスに対する劣性抵抗性へのｅＩＦ４Ｅ遺伝子ファミリーの関与が幾つかの植物で検討されてきた。そして、実際にｅＩＦ４ＥまたはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの変異によって、劣性のウイルス抵抗性が獲得されたことが示されている。
例えば、特許文献１では、ｅＩＦ４Ｅをサイレンシングすることによってウイルス抵抗性を植物に付与する方法が記載されている。また、特許文献２では、トウガラシｅＩＦ４Ｅの機能抑制によるウイルス抵抗性付与の方法に関する記載があり、具体的には特定のアミノ酸に変異を生じたｅＩＦ４Ｅ（ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅは含まれない）をコードする遺伝子の過剰発現によるウイルス抵抗性付与の方法が述べられている。また特許文献３では、ｅＩＦ４Ｅ遺伝子またはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子のスプライシング変異により、ウイルスが作用しないｅＩＦ４ＥまたはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅを持つ変異体が述べられている。変異はｅＩＦ４ＥもしくはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの非コード領域、またはスプライシングエレメント（エキソン／イントロン境界部位の±１０塩基の領域）の少なくとも１塩基に挿入、欠失、または置換を生じるものであり、望ましくはイントロン、より望ましくは第１イントロンが対象である。さらに特許文献４には、ｅＩＦ４ＥおよびｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの両変異の組合せによるトウガラシ葉脈斑紋病（Pepper veinal mottle virus、ＰＶＭＶ）に対する抵抗性植物の選抜に関する方法、具体的には、ｅＩＦ４ＥおよびｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅが全く発現せず、かつ変異ｅＩＦ４Ｅが発現する植物を選別する方法が述べられている。
さらに例えば、コショウのＰＶＹに対する劣性抵抗性の原因遺伝子はｅＩＦ４Ｅであることが示されている（非特許文献１０）。また、Clover yellow vein virusはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ欠損シロイヌナズナでは増殖するが、ｅＩＦ４Ｅ欠損シロイヌナズナでは増殖しないこと、そして、これとは逆に、ＴｕＭＶはｅＩＦ４Ｅ欠損シロイヌナズナでは増殖するが、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ欠損シロイヌナズナでは増殖しないことが示されている（非特許文献１１）。さらにＰＶＭＶに対する抵抗性を獲得するには、ｅＩＦ４ＥおよびｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの両方が同時に機能喪失していなければならない（非特許文献１２）。近年の翻訳開始因子および植物ウイルス抵抗性を総説したものとして、例えば、非特許文献１３および非特許文献１４等がある。
Potyvirus属以外のウイルスと翻訳開始因子との関連性も、限定的ではあるが指摘されている。例えば、Cucumber mosaic virus（ＣＭＶ）は、Cucumovirus属ウイルスであり、ｅＩＦ４ＥまたはｅＩＦ４Ｇが破壊されたシロイヌナズナでは、ＣＭＶの細胞間移行に関与する３ａ ｐｒｏｔｅｉｎの生産が阻害される（非特許文献１５）。また、Rice yellow mottle virus（ＲＹＭＶ）はSobemovirus属ウイルスであり、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｇが突然変異したイネはこのウイルスに抵抗性となる（非特許文献１６）。
タバコと同じナス科植物のトマトにおいては、トマト変異体パネルの網羅的解析に基づいて、Potyvirus抵抗性と翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅとの関係が研究されている。その中で、ｅＩＦ４Ｅ遺伝子ファミリーの一つであるｅＩＦ４Ｅ１の機能抑制が、ＰＶＹおよびPepper mottle virus（ＰｅｐＭｏＶ）に対する抵抗性を付与する一方、Tobacco etch virus（ＴＥＶ）に対しては抵抗性を付与しないことが示された（非特許文献１７）。また、ｅＩＦ４Ｅ２、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ、ｅＩＦ４Ｇ、およびｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｇの機能抑制はこれらのPotyvirus属のウイルスに抵抗性を付与しないことも同時に示された。また、ＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）を用いてｅＩＦ４Ｅ１とｅＩＦ４Ｅ２とを同時に機能抑制すると、ＰＶＹ、ＰｅｐＭｏＶおよびＴＥＶを含む７種類のPotyvirus属のウイルスに抵抗性になることが示された（非特許文献１８）。しかしながら一方で、興味深いことに、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４ＥのＲＮＡｉではこれらのどのウイルスに対しても抵抗性にはならないことが示された（非特許文献１７）。また、トマトのｅＩＦ（ｉｓｏ）４ＥはPotyvirus属以外のウイルス抵抗性との関連性もないことも併せて示された（非特許文献１８）。
ｅＩＦ（ｉｓｏ）４ＥはｅＩＦ４Ｅファミリーにカテゴライズされるが、植物では一般に、ｅＩＦ４ＥとｅＩＦ（ｉｓｏ）４ＥとのＤＮＡ配列同一性は６０％に満たない。また、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４ＥはｅＩＦ４Ｅとは異なる翻訳複合体を形成する。具体的には、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４ＥはｅＩＦ（ｉｓｏ）４ＧとともにｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｆという翻訳複合体を形成し、ｅＩＦ４ＥはｅＩＦ４ＧとともにｅＩＦ４Ｆという翻訳複合体を形成する。
タバコ（N. tabacum）においては、ｅＩＦ４Ｅ１またはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの発現量を低下させた報告がある（非特許文献１９）。この報告ではアンチセンス技術を用いてタバコのｅＩＦ４Ｅ１またはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの転写を抑制している。そして、ｅＩＦ４Ｅ１の転写物の量が対照の３０〜４０％まで抑制されたタバコ、およびｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの転写物の量が対照の６０％にまで抑制されたタバコを作出したこと、ならびに両者を交配した後代ではｅＩＦ４Ｅ１の転写物の量が対照の２６％、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの転写物の量が対照の３１％にまで低減していたことが記載されているものの、ウイルス抵抗性との関連性は全く述べられていない。また、ＰＶＹのＨＣ−Ｐｒｏタンパク質がタバコのｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅと相互作用する可能性が、Nicotiana benthamianaを使ったアッセイ系から示唆されているものの（非特許文献２０）、抵抗性との関連性は指摘されていなかった。
最近、タバコにおいて、ＰＶＹ抵抗性のＶＡＭタバコおよびＰＶＹ感受性のタバコの転写物の網羅的解析から、ＶＡＭタバコにおいて特異的に転写量の低い遺伝子の中にｅＩＦ４Ｅがあることが見出され、この遺伝子に変異が生じたタバコはＰＶＹ抵抗性になることが示された（非特許文献２１、非特許文献２２）。タバコ（N. tabacum）は、Nicotiana sylvestris（S）由来のゲノムとNicotiana tomentosiformis（T）由来のゲノムとを有する複二倍体であり、それゆえN. sylvestris（S）由来の遺伝子とN. tomentosiformis（T）由来の遺伝子が基本的には１組ずつ存在するが、非特許文献２２ではＳ由来のｅＩＦ４Ｅの機能抑制が、ＰＶＹ抵抗性をもたらすことが記載されている。
さらに最近、タバコにおいて、翻訳開始因子の１つであるｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の機能抑制によって、ＰＶＹ−ＢおよびTobacco Bushy Top Virus（ＴＢＴＶ）に抵抗性になることが示された（特許文献５）。より具体的には、Ｔ由来のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の機能抑制によってＰＶＹ−Ｂ抵抗性になり、Ｓ由来のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の機能抑制によってＴＢＴＶに抵抗性になることが示された（特許文献５）。
上述のようにタバコ（N. tabacum）は複二倍体であり、通常の二倍体植物に比べて遺伝子の数が２倍で、N. sylvestris由来の遺伝子とN. tomentosiformis由来の遺伝子が、基本的には常に１組ずつ存在する。そのため、他の二倍体の植物と比べて遺伝様式が複雑である。シロイヌナズナにおいてはｅＩＦ４Ｅが３種類、およびｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅが１種類存在するとされており（非特許文献１３）、タバコではシロイヌナズナで見られる翻訳開始因子は全て組になって存在すると考えられる。ｅＩＦ４Ｅと機能的に類似するcap-binding proteinまで含めると、タバコのｅＩＦ４Ｅファミリーは、少なくとも１２個存在することが分っている（非特許文献２２）。さらにｅＩＦ４ＧおよびｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｇまで含めると、その数はさらに多くなる。したがって、これらの中から機能抑制によって所望のウイルスの抵抗性に関与する因子を見出すことは、多大な労力を必要とする。また、翻訳開始因子を機能抑制させたタバコを作出し、それらを組み合わせて交配することにより、異なる複数の翻訳開始因子が機能抑制されたタバコを作出し、それらのウイルス抵抗性を調査し、所望のウイルスの抵抗性に関与する因子の組合せを見出すことは、さらに多大な労力を必要とする。
米国特許出願公開第２００６／２９４６１８号明細書 米国特許第７７７２４６２号明細書 米国特許出願公開第２０１３／１１７８７９号明細書 国際公開第２００５／１１８８５０号 国際公開第２０１５／１９９２４２号
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ＰＶＹ−Ｂに対して抵抗性を有するタバコは知られているが、上述のように、わずか数例に過ぎず、それらの抵抗性の持続性も未だ不明である。したがって、潜在的な遺伝的脆弱性を回避するためにも、PVY-Breaking系統を含むウイルスに対する別の新しい抵抗性タバコを開発することが必要である。同様に、ＰＶＹに関しても、遺伝的脆弱性を回避するために、新しい抵抗性タバコを開発することが必要である。
そこで、本発明は上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、ＰＶＹまたはＰＶＹ−Ｂに対してより強い抵抗性を有する新たな抵抗性タバコを提供することにある。
本発明に係るウイルス抵抗性タバコの一態様は、ウイルスに対して非機能的な翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質を生産するか、または翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の発現が抑制されており、さらに、ウイルスに対して非機能的な翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２タンパク質を生産するか、または翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２遺伝子の発現が抑制されており、上記翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅは、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−ＳおよびｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｔの少なくとも一方であり、上記翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２は、ｅＩＦ４Ｅ２−ＳおよびｅＩＦ４Ｅ２−Ｔの少なくとも一方である。
本発明に係るウイルス抵抗性タバコ作出方法の一態様は、ウイルスに対して非機能的な翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質を生産するか、またはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の発現を抑制する変異をｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子に導入すること、および
ウイルスに対して非機能的な翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２タンパク質を生産するか、またはｅＩＦ４Ｅ２遺伝子の発現を抑制する変異をｅＩＦ４Ｅ２遺伝子に導入することによって、ウイルスに対して抵抗性を有するタバコを作出することを含み、
上記翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅは、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−ＳおよびｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｔの少なくとも一方であり、
上記翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２は、ｅＩＦ４Ｅ２−ＳおよびｅＩＦ４Ｅ２−Ｔの少なくとも一方である。
本発明に係るウイルス抵抗性タバコ作出方法の別の一態様は、翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の発現量を野生型と比較して少なくさせる因子を導入すること、および
翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２遺伝子の発現量を野生型と比較して少なくさせる因子を導入することによって、ウイルスに対して抵抗性を有するタバコを作出することを含み、
上記翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅは、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−ＳおよびｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｔの少なくとも一方であり、
上記翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２は、ｅＩＦ４Ｅ２−ＳおよびｅＩＦ４Ｅ２−Ｔの少なくとも一方である。
本発明に係るウイルス抵抗性タバコの育種後代の作出方法の一態様は、上述のウイルス抵抗性タバコ作出方法において作出されたウイルス抵抗性タバコまたはその後代を自家受粉または他家受粉させるものである。
本発明に係る検出用ポリヌクレオチドの組み合わせ物の一態様は、タバコの翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２遺伝子における変異を検出するためのポリヌクレオチドであって、当該変異は、ウイルスに対して非機能的なｅＩＦ４Ｅ２タンパク質を生産するか、またはｅＩＦ４Ｅ２遺伝子の発現を抑制する変異である、第一の検出用ポリヌクレオチドと、タバコの翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子における変異を検出するためのポリヌクレオチドであって、当該変異は、ウイルスに対して非機能的なｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質を生産するか、またはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の発現を抑制する変異である、第二の検出用ポリヌクレオチドと、を含む。
本発明に係るウイルス抵抗性タバコ選抜方法の一態様は、タバコにおいて、ゲノムＤＮＡにおける上記変異の有無を、上述の検出用ポリヌクレオチドの組み合わせ物を利用して検査する検査工程と、上記検査工程において上記変異が検出されたタバコをウイルス抵抗性タバコとして選抜する選抜工程とを含む。
本発明に係る判定用ＤＮＡマーカーの組み合わせ物の一態様は、翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２遺伝子における変異を含む連続した塩基配列またはその相補配列からなるポリヌクレオチドを含んでおり、当該変異は、ウイルスに対して非機能的なｅＩＦ４Ｅ２タンパク質を生産するか、またはｅＩＦ４Ｅ２遺伝子の発現を抑制する変異である、第一の判定用ＤＮＡマーカーと、
翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子における変異を含む連続した塩基配列またはその相補配列からなるポリヌクレオチドを含んでおり、当該変異は、ウイルスに対して非機能的なｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質を生産するか、またはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の発現を抑制する変異である、第二の判定用ＤＮＡマーカーと、を含む、ウイルスに対するタバコの抵抗性の判定用ＤＮＡマーカーである。
本発明に係る葉たばこの一態様は、上記ウイルス抵抗性タバコの葉たばこである。
本発明に係るたばこ製品の一態様は、上記葉たばこを原料として含むものである。
本発明によれば、ウイルスに抵抗性を有する新たなウイルス抵抗性タバコを提供することができる。
タバコ品種ＴＮ９０にｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子のＲＮＡｉコンストラクトを導入した組換えタバコにおける、定量ＰＣＲによるＳ型並びにＴ型のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の発現解析の結果を示す図である。図１では、対照の転写物の量の平均値を１とした場合の相対発現量を示している。 タバコ品種ＳＲ１にｅＩＦ４Ｅ２遺伝子またはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子のＲＮＡｉコンストラクトを導入した組換えタバコにおける、定量ＰＣＲによるｅＩＦ４Ｅ２遺伝子およびｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の遺伝子発現解析の結果を示す図である。図２では、対照の転写物の量の平均値を１とした場合の相対発現量を示している。棒線は標準誤差を示す。
本願発明者らは、タバコの翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２およびｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの２種類の遺伝子の機能を抑制することで、複合ウイルス抵抗性を付与する方法を見出した。当該方法により作出されたタバコは、Potyvirus属ウイルスであるＰＶＹ（potato virus Y）およびＰＶＹ−Ｂ（PVYのVAM-breaking strain）、さらにUmbravirus属ウイルスであるＴＢＴＶ（tobacco bushy top virus）に対して抵抗性となった。具体的にはｅＩＦ４Ｅ２−Ｓが欠失したタバコ品種ＴＮ９０に、後述するｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｔ遺伝子およびｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｓの両方の遺伝子の転写を抑制するＲＮＡｉコンストラクトを導入した組換えタバコを作出し、ウイルスアッセイを実施したところ、ＰＶＹ、ＰＶＹ−Ｂ、ＴＢＴＶの３つのウイルス全てに対して抵抗性となった。さらにこの組換えタバコは、ｅＩＦ４Ｅ２−Ｓが機能抑制されたタバコよりもＰＶＹに対して強い抵抗性を示し、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−ＳおよびｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｔの両方が機能破壊されたタバコよりもＰＶＹ−Ｂに対して強い抵抗性を示した。一方、ｅＩＦ４Ｅ２−ＳおよびｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｔが機能破壊されたタバコ変異体を作出し、ウイルスアッセイを行ったところ、ｅＩＦ４Ｅ２−Ｓが機能抑制されたタバコよりもＰＶＹに対して強い抵抗性を示し、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｔが機能破壊されたタバコ、ならびにｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−ＳおよびｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｔの両方が機能破壊されたタバコよりもＰＶＹ−Ｂに対して強い抵抗性を示した。さらに、ｅＩＦ４Ｅ２−Ｓ、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−ＳおよびｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｔの３つが機能破壊されたタバコ変異体を作出し、ウイルスアッセイを行ったところ、ｅＩＦ４Ｅ２−Ｓが機能抑制されたタバコよりもＰＶＹに対して強い抵抗性を示し、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−ＳおよびｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｔの両方が機能破壊されたタバコよりもＰＶＹ−Ｂに対して強い抵抗性を示した。
ＰＶＹに関しては、ＶＡＭの抵抗性の原因が翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２−Ｓ遺伝子の欠失であることが示され、また、ＰＶＹ−ＢおよびＴＢＴＶに関してはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の機能破壊による抵抗性が報告されているが、３つのウイルス全てに抵抗性のタバコは知られていなかった。
ｅＩＦ４Ｅ２およびｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ両方の機能が抑制されたタバコは、ＰＶＹ、ＰＶＹ−ＢおよびＴＢＴＶ全てに抵抗性となり、実用性がさらに高まった。なお、ｅＩＦ４Ｅ２−ＳおよびｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ両方の機能が抑制されたタバコがＰＶＹおよびＰＶＹ−Ｂに対して、それぞれ既存の抵抗性タバコ、すなわち、ｅＩＦ４Ｅ２−Ｓ機能抑制タバコ、並びにｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ機能抑制タバコよりも抵抗性が増強されたことは想定の範囲外であり、予期せぬ相乗効果であった。
以下、本発明に係るウイルス抵抗性タバコの実施形態について説明する。なお、本明細書において、特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ〜Ｂ」は、「Ａ以上、Ｂ以下」を意図する。
〔１．ウイルス抵抗性タバコおよびその作出方法〕
本実施形態におけるウイルス抵抗性タバコは、ウイルスに対して非機能的な翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質を生産するか、または翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の発現が抑制されており、さらに、ウイルスに対して非機能的な翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２タンパク質を生産するか、または翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２遺伝子の発現が抑制されている、ウイルス抵抗性タバコである。
本明細書において、「ウイルス抵抗性」とは、罹病性タバコ品種と比較して、ウイルス感染により、タバコに発生する症状が遅延するか、もしくは軽微となるか、または発生しないことを指す。タバコに発生する症状としては、生育停滞、葉脈壊疽、茎壊疽、葉脈透過、およびモットリング等が挙げられる。あるいは、「ウイルス抵抗性」とは、罹病性タバコ品種と比較して、ウイルスの増殖が抑制される、またはウイルスの細胞間移行が抑制されることを指す。
また、「タバコ」には、タバコの植物全体、植物組織（例えば、葉、茎、花、根、生殖器官、胚およびそれらの一部など）、苗および種子、ならびに乾燥した葉、茎、花、根および種子等が含まれ得る。
Nicotiana属植物であるNicotiana tabacumは複二倍体であり、祖先種であるNicotiana sylvestris由来のゲノム（Ｓ型ゲノム）およびNicotiana tomentosiformis由来のゲノム（Ｔ型ゲノム）の両方を有する。そのため、N. tabacumは、塩基配列が異なる２組のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子および塩基配列が異なる２組のｅＩＦ４Ｅ２遺伝子を有する。そのため、「非機能的な翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質を生産する」とは、非機能的な翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｓタンパク質を生産すること、非機能的な翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｔタンパク質を生産すること、またはその両方であることが意図される。同様に、「翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の発現が抑制されている」とは、翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｓ遺伝子の発現が抑制されていること、翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｔ遺伝子の発現が抑制されていること、またはその両方であることが意図される。また、「非機能的な翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２タンパク質を生産する」とは、非機能的な翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２−Ｓタンパク質を生産すること、非機能的な翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２−Ｔタンパク質を生産すること、またはその両方であることが意図される。同様に、「翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２遺伝子の発現が抑制されている」とは、翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２−Ｓ遺伝子の発現が抑制されていること、翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２−Ｔ遺伝子の発現が抑制されていること、またはその両方であることが意図される。すなわち、本明細書において、特に断りのない限り、単に「ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ」という場合には、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−ＳもしくはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｔまたはその両方を指すことを意図している。同様に、特に断りのない限り、単に「ｅＩＦ４Ｅ２」という場合には、ｅＩＦ４Ｅ２−ＳもしくはｅＩＦ４Ｅ２−Ｔまたはその両方を指すことを意図している。また、各遺伝子のうち、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−ＳおよびｅＩＦ４Ｅ２−Ｓを、単に「Ｓ型」と称する場合もあり、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−ＴおよびｅＩＦ４Ｅ２−Ｔを、単に「Ｔ型」と称する場合もある。
したがって、各遺伝子のＳ型およびＴ型に関し、非機能的なタンパク質を生産するか、または遺伝子の発現が抑制されているものを小文字「ｓ」および「ｔ」で表し、そうでない正常なものを大文字「Ｓ」および「Ｔ」で表す場合、本実施形態におけるウイルス抵抗性タバコには、
（１）eIF4E2-ssTT/eIF(iso)4E-ssTT
（２）eIF4E2-ssTT/eIF(iso)4E-SStt
（３）eIF4E2-ssTT/eIF(iso)4E-sstt
（４）eIF4E2-SStt/eIF(iso)4E-ssTT
（５）eIF4E2-SStt/eIF(iso)4E-SStt
（６）eIF4E2-SStt/eIF(iso)4E-sstt
（７）eIF4E2-sstt/eIF(iso)4E-ssTT
（８）eIF4E2-sstt/eIF(iso)4E-SStt
（９）eIF4E2-sstt/eIF(iso)4E-sstt
の９通りの組み合わせが存在するが、いずれも本発明の範疇に含まれる。
本明細書では、N. tabacumに含まれるものに限らず、N. sylvestris由来のゲノムを有するNicotiana属植物における当該N. sylvestris由来のゲノムにコードされているｅＩＦ（ｉｓｏ）４ＥおよびｅＩＦ４Ｅ２を、それぞれ「ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｓ」および「ｅＩＦ４Ｅ２−Ｓ」と称する。同様に、N. tomentosiformis由来のゲノムを有するNicotiana属植物における当該N. tomentosiformis由来のゲノムにコードされているｅＩＦ（ｉｓｏ）４ＥおよびｅＩＦ４Ｅ２を、それぞれ「ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｔ」および「ｅＩＦ４Ｅ２−Ｔ」と称する。
したがって、本明細書において、「タバコ」とは、N. tabacumだけでなく、N. sylvestris由来のゲノムおよびN. tomentosiformis由来のゲノムの少なくとも一方を有するNicotiana属の他の種も包含する。このようなNicotiana属の他の種としては、N. sylvestris、およびTomentosae節に含まれるNicotiana属植物、例えば、N. tomentosa、N. tomentosiformis、N. kawakamii、N. otophora、N. setchellii、およびN. Glutinosaが挙げられる。
「ウイルスに対して非機能的なｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質」とは、ウイルスが自己増殖または細胞間移行の際に利用できない（少なくとも部分的に利用が阻害される）ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質を指し、タバコにおいて正常なｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質の機能（翻訳開始因子としての機能）を果たしていない場合、および、タバコにおいては正常なｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質の機能を果たしているが、ウイルスが利用できない場合の両方を包含する。「ウイルスに対して非機能的なｅＩＦ４Ｅ２タンパク質」についても同様のことを意図している。これらのタンパク質は、例えば、細胞内において生産され得る。
ウイルスに対して非機能的となっているか否かは、ウイルスアッセイによって確認することができる。ウイルスアッセイは、病徴調査によって、あるいはウイルスタンパクまたはウイルスゲノムの検出または測定等によって行うことができる。ウイルスタンパクの検出および測定には、例えばウイルスタンパクに対する抗体を使ったＥＬＩＳＡ法およびウェスタンブロット法が用いられ得る。当該抗体およびＥＬＩＳＡキットについては市販のものを利用することもできる。例えばＰＶＹおよびＰＶＹ−Ｂに対しては、agdia（登録商標）社のＰＶＹ ＰａｔｈｏＳｃｒｅｅｎ Ｋｉｔ（登録商標）等を用いることができる。また、ウイルスＲＮＡゲノムの検出および測定には、例えば、逆転写定量ＰＣＲ法が用いられ得る。具体的には、公共データベースから例えばＰＶＹのゲノム配列を入手し、適宜定量ＰＣＲ用のプライマーおよびプローブ配列を設計し、植物サンプルから抽出したＲＮＡを逆転写したｃＤＮＡサンプルを鋳型にＰＣＲを行えばよい。病徴調査によって、対象とするタバコが、翻訳開始因子に変異のないタバコに比べて、病徴が遅れる、病徴が軽微、あるいは病徴が見られなければ、ウイルスに対して非機能的である。あるいは、ウイルスタンパクまたはウイルスゲノムの検出または測定等によって、対象とするタバコが、翻訳開始因子に変異のないタバコに比べて、当該ウイルスタンパクまたはウイルスゲノムの量が、好ましくは半分以下、より好ましくは１/３以下、さらに好ましくは１/４以下、最も好ましくは１/５以下であれば、ウイルスに対して非機能的である。
「ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の発現量」は、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４ＥのｍＲＮＡへの転写の量（転写レベルあるいは転写物の量）およびｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質への翻訳の量（翻訳レベルあるいは翻訳産物の量）の何れであってもよいし、両方であってもよい。そのため、「ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの発現が抑制されている」とは、野生型と比較して転写が抑制されている場合も、野生型と比較して翻訳が抑制されている場合も、野生型と比較して転写および翻訳の両方が抑制されている場合も包含する。なお、「転写が抑制されている」には、転写物が分解される場合も包含される。すなわち、「ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの発現が抑制されている」には、例えば転写産物が分解されることにより、野生型と比較してｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の発現量が抑えられていることも包含する。「ｅＩＦ４Ｅ２遺伝子の発現量」および「ｅＩＦ４Ｅ２の発現が抑制されている」についても同様のことを意図している。これらの遺伝子の発現は、例えば、細胞内におけるものが意図される。
ウイルス抵抗性タバコが抵抗性を示すウイルスは、特に限定されないが、例えば、タバコに感染するAlfamovirus属ウイルス（例えばAlfalfa mosaic virus）、Curtovirus属ウイルス（例えばBeet curly top virus）、Begomovirus属ウイルス（例えばTobacco leaf curl virus）、Cucumovirus属ウイルス（例えばCucumber mosaic virus、およびPeanut stunt virus）、Ilarvirus属ウイルス（例えばTobacco streak virus）、Potyvirus属ウイルス（例えばPotato virus Y（PVY）、Tobacco etch virus、Tobacco vein mottling virus、およびTobacco vein banding mosaic virus）、Tobamovirus属ウイルス（例えばTobacco mosaic virus）、Tobravirus属ウイルス（例えばTobacco rattle virus）、Necrovirus属ウイルス（例えばTobacco necrosis virus）、Varicosavirus属ウイルス（例えばTobacco stunt virus）、Nepovirus属ウイルス（例えばTobacco ringspot virus）、Umbravirus属ウイルス（例えばTobacco bushy top virus、およびTobacco mottle virus）、Polerovirus属ウイルス（例えばTobacco vein distorting virus）、Mastrevirus属ウイルス（例えばTobacco yellow dwarf virus）、およびTospovirus属ウイルス（例えばTomato spotted wilt virus）等のウイルスが挙げられる。本発明に係るウイルス抵抗性タバコは、１種類のウイルスに対して抵抗性を有する態様でもあり得るし、複数種のウイルスに対して抵抗性を有する態様でもあり得る。本発明に係るウイルス抵抗性タバコは、Potyvirus属のウイルスに対して顕著な抵抗性を有している態様であり得る。なかでもPotato virus Y（PVY）のPVY-O系統、PVY-C系統、PVY-Z系統、PVY-N（NTNおよびNWを含む）系統、特にタバコのVirgin A mutantのウイルス抵抗性、あるいはeIF4E2-Sが欠失または機能抑制されたタバコ系統のウイルス抵抗性を打破するPVY系統（ＶＡＭ−Ｂｒｅａｋｉｎｇ系統）に対して抵抗性を有し得る。また、本発明に係るウイルス抵抗性タバコは、Umbravirus属のウイルスに対して顕著な抵抗性を有していてもよく、なかでもTobacco bushy top virus（TBTV）に対して抵抗性を有し得る。
（ｅＩＦ４Ｅ２遺伝子）
野生型のｅＩＦ４Ｅ２−Ｓ遺伝子のｃＤＮＡ配列の一例を配列番号１（GenBankアクセッション番号：KF155696）に示す。配列番号１において、オープンリーディングフレームは、１１２番目から７７１番目の塩基である。また、野生型のｅＩＦ４Ｅ２−Ｓタンパク質のアミノ酸配列およびゲノムの塩基配列のそれぞれの一例を、配列番号２および３に示す。配列番号３において、翻訳開始コドンは第２４１番目から２４３番目の塩基であり、翻訳終止コドンは第５３０７番目から５３０９番目の塩基である。また、エキソンは、１３１番目から４９１番目の塩基（第１エキソン）、３０３１番目から３１９６番目の塩基（第２エキソン）、３３０９番目から３４３４番目の塩基（第３エキソン）、５１０６番目から５１７１番目の塩基（第４エキソン）、および５２５９番目から５５４０番目の塩基（第５エキソン）である。
野生型のｅＩＦ４Ｅ２−Ｔ遺伝子のｃＤＮＡ配列の一例を配列番号４（GenBankアクセッション番号：KM202068）に示す。配列番号４において、オープンリーディングフレームは、６１番目から７１７番目の塩基である。また、野生型のｅＩＦ４Ｅ２−Ｔタンパク質のアミノ酸配列およびゲノムの塩基配列のそれぞれの一例を、配列番号５および６に示す。配列番号６において、翻訳開始コドンは第１７６５番目から１７６７番目の塩基であり、翻訳終止コドンは第７１１２番目から７１１４番目の塩基である。また、エキソンは、１７０５番目から２０１２番目の塩基（第１エキソン）、４６３９番目から４８０４番目の塩基（第２エキソン）、４９１５番目から５０４０番目の塩基（第３エキソン）、６９２７番目から６９９２番目の塩基（第４エキソン）、および７０６４番目から７１１４番目の塩基（第５エキソン）である。
なお、GenBankアクセッション番号ＫＭ２０２０６８のｅＩＦ４Ｅ２−Ｔ遺伝子とGenBankアクセッション番号ＫＦ１５５６９６のｅＩＦ４Ｅ２−Ｓ遺伝子とは、タンパク質コード領域のＤＮＡの配列同一性が９３．２％（６５７塩基中６１２塩基が一致）である。またアミノ酸配列の同一性は８７．７％（２１９アミノ酸中１９２アミノ酸が一致）、類似性は９７％である。
同一機能を有する植物の遺伝子のタンパク質コード領域の塩基配列は、遺伝子によっては栽培品種間において１％から数％程度の差異があり得、栽培品種と近縁野生種間においては数％から１０％程度の差異があり得る。本明細書において、変異を生じる前の野生型のｅＩＦ４Ｅ２遺伝子には、配列番号１または配列番号４に示す塩基配列からなるｃＤＮＡに対応するｍＲＮＡが生成される遺伝子、および、配列番号２または配列番号５に示すアミノ酸配列からなるｅＩＦ４Ｅ２タンパク質をコードする遺伝子が包含される。さらに、本明細書において、変異を生じる前の野生型のｅＩＦ４Ｅ２遺伝子には、配列番号１または配列番号４に示す塩基配列からなるｃＤＮＡに対応するｍＲＮＡと、９４％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９９％以上の配列同一性を有するｍＲＮＡが生成されるものであり、かつ機能的なｅＩＦ４Ｅ２タンパク質をコードする遺伝子も包含される。さらに、本明細書において、野生型のｅＩＦ４Ｅ２遺伝子には、配列番号２または配列番号５に示すアミノ酸配列と８８％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９９％以上の配列同一性を有する機能的なｅＩＦ４Ｅ２タンパク質をコードする遺伝子も包含される。さらに、本明細書において、野生型のｅＩＦ４Ｅ２遺伝子には、配列番号１または配列番号４に示す塩基配列において１〜５０個、１〜４０個、１〜３０個、１〜２０個、１〜１５個、１〜１２個、１〜１０個、１〜８個、１〜５個、１〜３個、１〜２個、または１個の塩基が置換、欠失、挿入および／または付加された塩基配列に対応するｍＲＮＡが生成されるものであり、かつ機能的なｅＩＦ４Ｅ２タンパク質をコードする遺伝子も包含される。さらに、本明細書において、野生型のｅＩＦ４Ｅ２遺伝子には、配列番号２または配列番号５に示すアミノ酸配列において１〜２０個、１〜１５個、１〜１２個、１〜１０個、１〜８個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個、または１個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を有する機能的なｅＩＦ４Ｅ２タンパク質をコードする遺伝子も包含される。
例えば本明細書において、変異を生じる前の野生型のｅＩＦ４Ｅ２−Ｔ遺伝子には、ｍＲＮＡ配列がGenBankアクセッション番号ＫＭ２０２０６８の配列となる遺伝子も包含される。この配列はタバコ系統Ｔ０２１６５８のｅＩＦ４Ｅ２−Ｔ遺伝子に由来する配列であり、ＫＭ２０２０６８のタンパク質コード領域に対応するＤＮＡ配列と、タバコ品種Ｋ３２６のｅＩＦ４Ｅ２−ＴのゲノムＤＮＡ配列のエキソン配列との配列同一性は９９．２％（６５７塩基中６５２塩基が一致）である。約１％の違い（６５７塩基中５塩基の違い）はタバコ系統／品種間の差異によるものと考えられる。
なお、本明細書において、「塩基配列の同一性」とは、複数の塩基配列において、全く同じ塩基の並びがどの程度の比率で存在するかを指す。同様に、「アミノ酸配列の同一性」とは、複数のアミノ酸配列において、全く同じアミノ酸の並びがどの程度の比率で存在するかを指す。さらに、本明細書において、「アミノ酸配列の類似性」とは、複数のアミノ酸配列において、全く同じアミノ酸、または性質の似たアミノ酸の並びがどの程度の比率で存在するかを指す。性質の似たアミノ酸の例として例えば、正電荷をもつ残基を有するリシン、アルギニン、およびヒスチジン；負電荷をもつ残基を有するアスパラギン酸、およびグルタミン酸；非極性すなわち疎水性の残基を有するアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、トリプトファン、フェニルアラニン、およびプロリン；極性だが電荷のないグリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミン；が挙げられる。
「塩基配列の同一性」、「アミノ酸配列の同一性」、または「アミノ酸配列の類似性」に関しては、当業者が通常用いる配列解析（相同性検索）プログラムBLAST（文献：Altschul et al. (1990) Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 215:403-410.）等、または市販の核酸・アミノ酸解析ソフトを用いて、計算することができる。BLAST検索は、GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）またはDNA Data Bank of Japan（http://www.ddbj.nig.ac.jp/index-j.html）等のウェブサイトにおいて実施可能である。その際、各種の検索パラメーターの変更が可能であるが、通常はデフォルト値を用いる。
また、本明細書において、「変異」とは、ＤＮＡにおける点変異、欠失、挿入、重複、転座および逆位を指し、特に記載がない場合は、野生型の塩基配列に対する差異を指す。
上述した野生種のｅＩＦ４Ｅ２遺伝子の塩基配列は、配列番号１または配列番号４に示す塩基配列を用いて、GenBankに登録されているN. sylvestris、N. tomentosiformis、またはN. otophoraのゲノム（Whole genome shotgun contigs）をBLASTプログラム等によって相同性検索することによって得られる。あるいは、Nicotiana属植物に由来する植物種のｅＩＦ４Ｅ２遺伝子の塩基配列は、例えば、本明細書に示されたｅＩＦ４Ｅ２の遺伝子配列に基づき設計されたプライマー配列を用いて、当該植物種のゲノムＤＮＡから、ＰＣＲ法によってｅＩＦ４Ｅ２遺伝子を増幅し、塩基配列を決定することによって得ることができる。相同性検索としてはBLASTプログラムを用いてもよいし、市販の核酸・アミノ酸配列解析ソフトを用いてもよい。
また、配列番号１または配列番号４に示す塩基配列をプローブとして用いて、タバコ野生種のゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーから、ストリンジェントな条件でハイブリダイゼーション実験を行うことによって、タバコ野生種のｅＩＦ４Ｅ２遺伝子の塩基配列を取得することが可能である。
（ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子）
野生型のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｓ遺伝子のｃＤＮＡ配列の一例を配列番号７（GenBankアクセッション番号：AY699609）に示す。配列番号７において、オープンリーディングフレームは、７０番目から６７２番目の塩基である。また、野生型のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｓタンパク質のアミノ酸配列およびゲノムの塩基配列のそれぞれの一例を、配列番号８および９に示す。配列番号９において、翻訳開始コドンは第２０１番目から２０３番目の塩基であり、翻訳終止コドンは第４９３８番目から４９４０番目の塩基である。また、エキソンは、１３２番目から３９７番目の塩基（第１エキソン）、１７３０番目から１８９８番目の塩基（第２エキソン）、２０２９番目から２１５４番目の塩基（第３エキソン）、４７２３番目から４７８５番目の塩基（第４エキソン）、および４８９３番目から５０９６番目の塩基（第５エキソン）である。
野生型のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｔ遺伝子のｃＤＮＡ配列の一例を配列番号１０（GenBankアクセッション番号：EB683576）に示す。配列番号１０において、オープンリーディングフレームは、３７番目から６２４番目の塩基である。また、野生型のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｔタンパク質のアミノ酸配列およびゲノムの塩基配列のそれぞれの一例を、配列番号１１および１２に示す。配列番号１２において、翻訳開始コドンは第２０１番目から２０３番目の塩基であり、翻訳終止コドンは第３４１８番目から３４２０番目の塩基である。また、エキソンは、１６４番目から３８２番目の塩基（第１エキソン）、１６２０番目から１７８８番目の塩基（第２エキソン）、１９１９番目から２０４４番目の塩基（第３エキソン）、３２０５番目から３２６７番目の塩基（第４エキソン）、および３３７３番目から３５９３番目の塩基（第５エキソン）である。
同一機能を有する植物の遺伝子のタンパク質コード領域の塩基配列は、遺伝子によっては栽培品種間において１％から数％程度の差異があり得、栽培品種と近縁野生種間においては数％から１０％程度の差異があり得る。本明細書において、変異を生じる前の野生型のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子には、配列番号７または配列番号１０に示す塩基配列からなるｃＤＮＡに対応するｍＲＮＡが生成される遺伝子、および、配列番号８または配列番号１１に示すアミノ酸配列からなるｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質をコードする遺伝子が包含される。さらに、本明細書において、変異を生じる前の野生型のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子には、配列番号７または配列番号１０に示す塩基配列からなるｃＤＮＡに対応するｍＲＮＡと、９２％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９９％以上の配列同一性を有するｍＲＮＡが生成されるものであり、かつ機能的なｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質をコードする遺伝子も包含される。さらに、本明細書において、野生型のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子には、配列番号８または配列番号１１に示すアミノ酸配列と９２％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９９％以上の配列同一性を有する機能的なｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質をコードする遺伝子も包含される。さらに、本明細書において、野生型のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子には、配列番号７または配列番号１０に示す塩基配列において１〜５０個、１〜４０個、１〜３０個、１〜２０個、１〜１５個、１〜１２個、１〜１０個、１〜８個、１〜５個、１〜３個、１〜２個、または１個の塩基が置換、欠失、挿入および／または付加された塩基配列に対応するｍＲＮＡが生成されるものであり、かつ機能的なｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質をコードする遺伝子も包含される。さらに、本明細書において、野生型のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子には、配列番号８または配列番号１１に示すアミノ酸配列において１〜２０個、１〜１５個、１〜１２個、１〜１０個、１〜８個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個、または１個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を有する機能的なｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質をコードする遺伝子も包含される。
例えば本明細書において、変異を生じる前の野生型のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｔ遺伝子には、ｃＤＮＡ配列がGenBankアクセッション番号ＦＮ６６６４３４の配列となる遺伝子も包含される。この配列はタバコ品種Samsun NN由来のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｔ遺伝子に由来する配列であり、タバコ品種Ｋ３２６由来のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−ＴのｃＤＮＡ配列ＥＢ６８３５７６との配列同一性は９７％である。これら２つの遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列の同一性は９７％、類似性は９９％である。
上述したNicotiana属植物のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子のｃＤＮＡ配列は、配列番号７または配列番号１０に示す塩基配列と９０％以上の配列同一性を有すると考えられる。実際、配列番号７に示す塩基配列はN. sylvestrisのｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子のｃＤＮＡ配列と１００％の配列同一性を示す（イントロンは除く）。配列番号１０に示す塩基配列はN. tomentosiformisのｅＩＦ（ｉｓｏ）４ＥのｃＤＮＡ配列と９９％の配列同一性を示す（イントロンは除く）。配列番号７に示す塩基配列および配列番号１０に示す塩基配列はN. otophoraのｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅのゲノム配列におけるイントロンを除く部分とそれぞれ９８％および９９％の配列同一性を示す。
上述した野生種のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の塩基配列は、配列番号７または配列番号１０に示す塩基配列を用いて、GenBankに登録されているN. sylvestris、N. tomentosiformis、またはN. otophoraのゲノム（Whole genome shotgun contigs）をBLASTプログラム等によって相同性検索することによって得られる。あるいは、Nicotiana属植物に由来する植物種のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の塩基配列は、例えば本明細書に示されたｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の塩基配列に基づき設計されたプライマー配列を用いて、当該植物種のゲノムＤＮＡから、ＰＣＲ法によってｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子を増幅し、塩基配列を決定することによって得ることができる。相同性検索としてはBLASTプログラムを用いてもよいし、市販の核酸・アミノ酸配列解析ソフトを用いてもよい。
また、配列番号７または配列番号１０に示す塩基配列をプローブとして用いて、タバコ野生種のゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーから、ストリンジェントな条件でハイブリダイゼーション実験を行うことによって、タバコ野生種のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の塩基配列を取得することが可能である。
（ウイルス抵抗性タバコの第一の態様）
ウイルス抵抗性タバコの一態様では、翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子に変異を有していることにより、ウイルスに対して非機能的な翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質を生産するか、または翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の発現が抑制されている。
または、翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２遺伝子に変異を有していることにより、ウイルスに対して非機能的な翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２タンパク質を生産するか、または翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２遺伝子の発現が抑制されている。
または、翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子および翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２遺伝子の両方に変異を有している。
本発明に係るウイルス抵抗性タバコがｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子のコード領域に変異を有している場合、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質のアミノ酸配列の変異を引き起こし得る。同様に、本発明に係るウイルス抵抗性タバコがｅＩＦ４Ｅ２遺伝子のコード領域に変異を有している場合、ｅＩＦ４Ｅ２タンパク質のアミノ酸配列の変異を引き起こし得る。アミノ酸配列の変異としては、置換、欠失および挿入等が挙げられる。変異がアミノ酸の置換である場合、置換されるアミノ酸および置換後のアミノ酸は、対象遺伝子のタンパク質をウイルスに対して非機能的なものにする限り特に限定されないが、例えば、非保存的置換（non-conservative substitutions）であることが好ましい。非保存的置換としては、アミノ酸を電荷または疎水性が異なる別のアミノ酸に置換すること（塩基性アミノ酸から酸性アミノ酸への置換、または極性アミノ酸から非極性アミノ酸への置換等）、および、あるアミノ酸を側鎖のかさが異なる別のアミノ酸に置換することが挙げられる。これらのうちウイルスに対して非機能的なものとする変異が本発明の意図する範囲内のものである。ウイルスに対して非機能的であるか否かはウイルスアッセイによって確認することができる。また、コード領域に変異を有している場合、フレームシフト変異またはナンセンス変異（ストップコドンになる変異）であってもよい。ナンセンス変異の場合、nonsense-mediated mRNA decay（文献：Brogna and Wen 2009, Nat. Structural Mol. Biol. 16: 107-113）が生じ、転写物が分解されることがある。この場合、ナンセンス変異の位置は、第１エキソン、第２エキソン、および／または第３エキソンにあることが好ましく、第１エキソンおよび／または第２エキソンにあることがより好ましい。フレームシフト変異またはナンセンス変異の場合、当該変異の位置は遺伝子の５’末端側半分程度より５’末端側であることが好ましい。具体的には第１エキソン、第２エキソン、および／または第３エキソンに変異があることが好ましい。５’末端に近いほど、タンパク質における正常な部分が短くなるため、ウイルスに対して非機能的になる可能性が高くなる。
本発明に係るウイルス抵抗性タバコが非コード領域に変異を有している場合、コードされるｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質およびｅＩＦ４Ｅ２タンパク質のアミノ酸配列に影響を及ぼさないが、ＤＮＡもしくはｍＲＮＡの二次構造を変更させる、転写もしくは翻訳機構のための結合部位を変更させる、またはｔＲＮＡ結合効率を減少させ得る。それによって、転写レベルを減少させたり、翻訳レベルを減少させたりし得る。
あるいは、対象とする遺伝子の翻訳開始コドンＡＴＧのＧがＡに変異した場合、正しい翻訳開始が行われず、正しい目的タンパク質が翻訳されない。さらに、５’末端側の非コード領域に変異を有している場合において、その変異によって正しいフレームとは異なるフレームにＡＴＧ（開始コドン）が生じる場合、その誤ったフレームから翻訳が開始される可能性がある。このような場合においても正常な目的タンパク質は生産されない。例えば変異原が後述のエチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）の場合において、ＧＴＧのＧがＡに変異した場合またはＡＣＧのＣがＴに変異した場合、新たなＡＴＧが生じる。この場合においてフレームがずれた場合、正しい目的タンパク質が翻訳されない。
各遺伝子のイントロンの５’末端のＧＴのＧ、あるいは３’末端のＡＧのＧが、Ａに変異した場合、正しい位置でイントロンが除去されず、正しいタンパク質が翻訳されない。
ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子またはｅＩＦ４Ｅ２遺伝子の転写が抑制されている場合、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子またはｅＩＦ４Ｅ２遺伝子の転写物の量は、野生型と比較して、好ましくは２０％以下、より好ましくは１０％以下、さらに好ましくは５％以下である。また、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子またはｅＩＦ４Ｅ２遺伝子の翻訳が抑制されている場合、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子またはｅＩＦ４Ｅ２遺伝子の翻訳産物の量は、野生型と比較して、好ましくは２０％以下、より好ましくは１０％以下、さらに好ましくは５％以下である。
また、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の変異によって、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子におけるＲＮＡのスプライシングが正常に機能しない場合もあり得る。あるいは、ｅＩＦ４Ｅ２遺伝子の変異によって、ｅＩＦ４Ｅ２遺伝子におけるＲＮＡのスプライシングが正常に機能しない場合もあり得る。例えば、イントロンの５’末端側のＧＴを含む前後１０塩基、好ましくは５塩基、より好ましくは１塩基、またはイントロンの３’末端側のＡＧを含む前後１０塩基、好ましくは５塩基、より好ましくは１塩基に、変異が生じている場合、イントロンの切り出しがうまくいかず、異常なｍＲＮＡが生じて、ウイルスに対して非機能的なｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質もしくはｅＩＦ４Ｅ２タンパク質を生産するか、またはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子もしくはｅＩＦ４Ｅ２遺伝子の翻訳が抑制され得る。
対象遺伝子に変異を生じさせる方法は特に限定されず、公知の方法を用いることができる。
変異原としては、例えば、エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）、アジ化ナトリウム、エチジウムブロマイド、および亜硝酸等の化学薬剤を用いることができるが、タバコのゲノムＤＮＡに変異を生じさせる化学薬剤であればこれらに限定されない。また、変異原として、例えば、γ線、重イオンビーム、Ｘ線、中性子線、またはＵＶ等が挙げられるが、タバコのゲノムＤＮＡに変異を生じさせる放射線等であればこれらに限定されない。変異原として好ましくはＥＭＳである。
変異原処理されるタバコの組織または器官としては、種子、根、葉、および花等が挙げられ、植物体を再生できれば特にその種類は限定されないが、好ましくは種子である。変異誘発集団に関して、変異誘発性の化学薬剤または放射線の用量は、致死性または生殖不稔性に至る閾値レベルよりも低い変異頻度が得られるように、それぞれのタイプの植物組織に関して経験的に決定される。
また、変異原としてトランスポゾン（可動性遺伝因子）を用いることもできる。トランスポゾンがタバコゲノム上で転移し、対象遺伝子の機能を抑制することができる。このようなトランスポゾンの好ましい例として、タバコのレトロトランスポゾンtnt1が挙げられる。あるいは、他の植物のトランスポゾンをタバコに導入して使用することもできる。そのようなトランスポゾンとして、例えば、トウモロコシのトランスポゾンAc/Ds、Spm/dSpm、およびMu、イネのトランスポゾンnDart、ならびにキンギョソウのトランスポゾンtam等が挙げられるが、これらに限定されない。
さらに、アグロバクテリウムのＴｉプラスミドの中にあるＴ−ＤＮＡをタバコにat randomに挿入して、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子またはｅＩＦ４Ｅ２遺伝子の機能を抑制することも可能である。したがって、Ｔ−ＤＮＡを挿入したタバコ変異体集団（パネル）を作製し、その中からｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子またはｅＩＦ４Ｅ２遺伝子の塩基配列を指標に、その機能が抑制された個体を選抜することが可能である。
対象とする遺伝子にホモに変異を有するウイルス抵抗性タバコの作出方法の一例では、上述のようにタバコを変異原で処理し、タバコゲノム全体に変異を生じさせたタバコ変異体集団（パネル）を作製し、ゲノムＤＮＡを抽出する。遺伝子特異的プライマーを利用して、パネルのゲノムＤＮＡそれぞれから、またはそれらをプールしたものから、対象とする遺伝子を増幅し、その産物の塩基配列を決定し、変異の入った系統を選抜する。変異の種類は、好ましくはアミノ酸変異を伴う変異またはナンセンス変異であり、より好ましくはナンセンス変異である。選抜された系統の種子をまいて育成した植物からＤＮＡを抽出し、対象とする遺伝子についてホモ接合変異の入った個体を選抜する。このようにして得られた、目的遺伝子にホモ接合変異が生じている系統について、ウイルスアッセイを行って抵抗性を確認する。この際、定量ＰＣＲ等を用いて目的遺伝子の発現解析を行い、転写量が低減したことを確認してもよい。
したがって、ウイルス抵抗性タバコ作出方法の一態様において、タバコゲノム全体に変異を生じさせたタバコ変異体集団（パネル）を作製する工程、ゲノムＤＮＡを抽出する工程、対象遺伝子の塩基配列を決定する工程、ホモ接合変異の入った系統を選抜する工程、およびウイルスアッセイを行って抵抗性を確認する工程のうちの少なくとも１つの工程を含んでいてもよい。
さらに、対象遺伝子以外のＤＮＡの箇所に入った変異を取り除く目的で、変異処理をした系統を、変異処理をしていない系統と任意のタイミングで掛け合わせてもよい。
タバコ変異体からのゲノムＤＮＡの抽出は、公知の方法に基づいて行えばよく、市販の抽出キットを用いてもよい。また、ゲノムＤＮＡは、粗精製物であってもよいし、いくつかの精製工程を経た精製品であってもよい。
ポリヌクレオチドの増幅は、例えばＰＣＲ法によって行うことができるが、他の公知の遺伝子増幅方法、例えば、ＬＣＲ（ligase chain reaction）法またはＬＡＭＰ（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法等によって行ってもよい。
各ポリヌクレオチドを増幅するためのプライマー配列は、例えば、次のようにして設計できる。ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｓ遺伝子の塩基配列とｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｔ遺伝子の塩基配列との相同性解析結果から、Ｓ型特異的な領域およびＴ型特異的な領域を見つけ、その領域にプライマーを設計すればよい。当該プライマーを用いることにより、Ｓ型およびＴ型が混在するタバコゲノムから、Ｓ型およびＴ型の遺伝子をそれぞれ特異的に増幅することができる。ｅＩＦ４Ｅ２遺伝子についても同様である。設計する部位としては、Ｓ型またはＴ型特異的な領域から選択することができるが、好ましくはイントロン、５’非翻訳領域または３’非翻訳領域である。プライマーの長さは、好ましくは１５塩基〜３０塩基、特に好ましくは１７塩基〜２５塩基である。また、変異箇所を含む所定塩基数の配列を増幅するためのプライマーとして機能し得る限り、その配列において１またはそれ以上の置換、欠失、および／または付加を含んでいてもよい。また、プライマーは必要に応じて蛍光物質または放射性物質等で標識されていてもよい。
増幅する各ポリヌクレオチドの長さは、後述する各種検出方法が利用可能な長さであれば特に限定されないが、例えば、２０塩基〜５０００塩基、より好ましくは５０塩基〜２０００塩基、さらに好ましくは１００塩基〜７００塩基、よりさらに好ましくは１００塩基〜５００塩基である。
以下、変異を検出する方法として代表的なものを挙げるが、これらに限定されない。
（１）市販のシーケンサー等を利用し、各ポリヌクレオチドの塩基配列を直接読み取ることによって変異の有無を検出する方法。
（２）ＳＳＣＰ（Single Strand Conformation Polymorphism：一本鎖高次構造多型）法を用いて変異の有無を検出する方法。
上記方法によって変異の検出されたタバコ変異体から、対象の遺伝子に特異的なプライマーを利用して、増幅された（ＰＣＲ）産物の塩基配列を確認することで、変異が、ホモ接合変異かヘテロ接合変異かが判明し得る。
ＥＭＳ処理の場合、多くのＤＮＡの変異はＣ→ＴおよびＧ→Ａである。そのため、ＥＭＳ処理によって変異するとストップコドンになる（すなわち、ナンセンス変異の候補になる）コドンは、ＣＡＡ（最初のＣがＴに置換）、ＣＧＡ（最初のＣがＴに置換）、ＴＧＧ（２つ目のＧ、または３つ目のＧがＡに置換）、およびＣＡＧ（最初のＣがＴに置換）の４種類である。
例えば、配列番号３に示すｅＩＦ４Ｅ２−Ｓ遺伝子のゲノム配列の場合、（１）３８９番目のＧがＡに置換、（２）３９０番目のＧがＡに置換、（３）３９８番目のＧがＡに置換、（４）３９９番目のＧがＡに置換、（５）４２７番目のＣがＴに置換、（６）４３７番目のＧがＡに置換、（７）４３８番目のＧがＡに置換、（８）４８８番目のＧがＡに置換、（９）４８９番目のＧがＡに置換、（１０）３１１４番目のＧがＡに置換、（１１）３１１５番目のＧがＡに置換、（１２）３１４７番目のＧがＡに置換、（１３）３１４８番目のＧがＡに置換、（１４）３１８６番目のＧがＡに置換、（１５）３１８７番目のＧがＡに置換、（１６）３３３０番目のＣがＴに置換、（１７）３３７５番目のＣがＴに置換、（１８）３４０３番目のＧがＡに置換、（１９）３４０４番目のＧがＡに置換、（２０）３４３２番目のＣがＴに置換、（２１）５１２１番目のＣがＴに置換、（２２）５１２５番目のＧがＡに置換、（２３）５１２６番目のＧがＡに置換されれば、終止コドン（ＴＡＡ、ＴＡＧ、またはＴＧＡ）となる。そのため、ウイルス抵抗性タバコの好ましい一例では、変異は、配列番号３に示すｅＩＦ４Ｅ２−Ｓ遺伝子のゲノム配列における上記（１）〜（２３）に示す１つ以上の変異である。これらのうち好ましくは、（１）〜（２２）の何れかに変異が起きる場合、より好ましくは、（１）〜（２０）の何れかに変異が起きる場合である。
また、配列番号６に示すｅＩＦ４Ｅ２−Ｔ遺伝子のゲノム配列の場合、（１）１９１３番目のＧがＡに置換、（２）１９１４番目のＧがＡに置換、（３）１９２２番目のＧがＡに置換、（４）１９２３番目のＧがＡに置換、（５）１９４８番目のＣがＴに置換、（６）１９５８番目のＧがＡに置換、（７）１９５９番目のＧがＡに置換、（８）２００９番目のＧがＡに置換、（９）２０１０番目のＧがＡに置換、（１０）４７２２番目のＧがＡに置換、（１１）４７２３番目のＧがＡに置換、（１２）４７５５番目のＧがＡに置換、（１３）４７５６番目のＧがＡに置換、（１４）４７９４番目のＧがＡに置換、（１５）４７９５番目のＧがＡに置換、（１６）４９３６番目のＣがＴに置換、（１７）４９８１番目のＣがＴに置換、（１８）５００９番目のＧがＡに置換、（１９）５０１０番目のＧがＡに置換、（２０）５０３８番目のＣがＴに置換、（２１）６９４２番目のＣがＴに置換、（２２）６９４６番目のＧがＡに置換、（２３）６９４７番目のＧがＡに置換されれば、終止コドン（ＴＡＡ、ＴＡＧ、またはＴＧＡ）となる。そのため、ウイルス抵抗性タバコの好ましい一例では、変異は、配列番号６に示すｅＩＦ４Ｅ２−Ｔ遺伝子のゲノム配列における上記（１）〜（２３）に示す１つ以上の変異である。これらのうち好ましくは、（１）〜（２２）の何れかに変異が起きる場合、より好ましくは、（１）〜（２０）の何れかに変異が起きる場合である。
また、配列番号９に示すｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｓ遺伝子のゲノム配列の場合、（１）２７０番目のＣがＴに置換、（２）２９５番目のＧがＡに置換、（３）２９６番目のＧがＡに置換、（４）３０４番目のＧがＡに置換、（５）３０５番目のＧがＡに置換、（６）３１５番目のＣがＴに置換、（７）３３０番目のＣがＴに置換、（８）３４３番目のＧがＡに置換、（９）３４４番目のＧがＡに置換、（１０）３５７番目のＣがＴに置換、（１１）３９４番目のＧがＡに置換、（１２）３９５番目のＧがＡに置換、（１３）１７４０番目のＣがＴに置換、（１４）１８１３番目のＧがＡに置換、（１５）１８１４番目のＧがＡに置換、（１６）１８４６番目のＧがＡに置換、（１７）１８４７番目のＧがＡに置換、（１８）１８８８番目のＧがＡに置換、（１９）１８８９番目のＧがＡに置換、（２０）２０５０番目のＣがＴに置換、（２１）２１０４番目のＣがＴに置換、（２２）２１２３番目のＧがＡに置換、（２３）２１２４番目のＧがＡに置換、（２４）２１５２番目のＣがＴに置換、（２５）４７４２番目のＧがＡに置換、（２６）４７４３番目のＧがＡに置換、または（２７）４９２６番目のＣがＴに置換されれば、終止コドン（ＴＡＡ、ＴＡＧ、またはＴＧＡ）となる。そのため、ウイルス抵抗性タバコの好ましい一例では、変異は、配列番号９に示すｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｓ遺伝子のゲノム配列における上記（１）〜（２７）に示す１つ以上の変異である。これらのうち好ましくは、（１）〜（２６）の何れかに変異が起きる場合、より好ましくは、（１）〜（２４）の何れかに変異が起きる場合である。
また、配列番号１２に示すｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｔ遺伝子のゲノム配列の場合、（１）２６４番目のＣがＴに置換、（２）２８９番目のＧがＡに置換、（３）２９０番目のＧがＡに置換、（４）２９８番目のＧがＡに置換、（５）２９９番目のＧがＡに置換、（６）３１５番目のＣがＴに置換、（７）３２８番目のＧがＡに置換、（８）３２９番目のＧがＡに置換、（９）３４２番目のＣがＴに置換、（１０）３７９番目のＧがＡに置換、（１１）３８０番目のＧがＡに置換、（１２）１６３０番目のＣがＴに置換、（１３）１７０３番目のＧがＡに置換、（１４）１７０４番目のＧがＡに置換、（１５）１７３６番目のＧがＡに置換、（１６）１７３７番目のＧがＡに置換、（１７）１７７８番目のＧがＡに置換、（１８）１７７９番目のＧがＡに置換、（１９）１９４０番目のＣがＴに置換、（２０）１９９４番目のＣがＴに置換、（２１）２０１３番目のＧがＡに置換、（２２）２０１４番目のＧがＡに置換、（２３）２０４２番目のＣがＴに置換、（２４）３２２４番目のＧがＡに置換、（２５）３２２５番目のＧがＡに置換、または（２６）３４０６番目のＣがＴに置換されれば、終止コドン（ＴＡＡ、ＴＡＧ、またはＴＧＡ）となる。そのため、ウイルス抵抗性タバコの好ましい一例では、変異は、配列番号１２に示すｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｔ遺伝子のゲノム配列における上記（１）〜（２６）に示す１つ以上の変異である。これらのうち好ましくは、（１）〜（２５）の何れかに変異が起きる場合、より好ましくは、（１）〜（２３）の何れかに変異が起きる場合である。
あるいは、変異は、（ａ）配列番号２または配列番号５に示すアミノ酸配列からなるｅＩＦ４Ｅ２タンパク質をコードする野生型のｅＩＦ４Ｅ２遺伝子のエキソン、（ｂ）配列番号２または配列番号５に示すアミノ酸配列と８８％以上の配列同一性を有する機能的なｅＩＦ４Ｅ２タンパク質をコードする野生型のｅＩＦ４Ｅ２遺伝子のエキソン、（ｃ）配列番号８または配列番号１１に示すアミノ酸配列からなるｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質をコードする野生型のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子のエキソン、または（ｄ）配列番号８または配列番号１１に示すアミノ酸配列と９２％以上の配列同一性を有する機能的なｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質をコードする野生型のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子のエキソンにおけるものであってもよく、また、これらエキソンにおける下記（１）〜（４）に示す１つ以上の変異であってもよい；（１）コドンＣＡＡのＣがＴに置換、（２）コドンＣＧＡのＣがＴに置換、（３）コドンＣＡＧのＣがＴに置換、（４）コドンＴＧＧのＧ（２つのＧのうちの何れか一方または両方）がＡに置換。
対象とする遺伝子に変異を生じさせる別の手段として、遺伝子編集技術を用いることもできる。遺伝子編集技術とは、ゲノムの任意の領域に変異を導入する技術である。このような技術としては、例えば、ＴＡＬＥＮ（Transcription activator-like effector nuclease）、ＣＲＩＳＰＲ（Clustered regularly interspaced short palindromic repeat）／ＣＡＳ、ＯＤＭ（Oligonucleotide Directed Mutagenesis）、およびＺＦＮ（Zinc Finger Nuclease）等が挙げられる。
ＯＤＭおよびＺＦＮの定義は、文献：Lusser et al. (2012) Nature Biotechnology 30: 231-239に記載されている。また、ＯＤＭについては、例えば、文献：Zhu et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 8768-8773、および文献：Oh and May (2001) Current Opinion in Biotechnology 12:169-172.に植物への適用が記載されている。ＺＦＮについては、文献：Durai et al. (2005) Nucleic Acids Res 33: 5978-5990に植物への適用が記載されている。これらに記載された方法に従えば、対象とする遺伝子に変異を導入することが可能である。
ＴＡＬＥＮについては次のとおりである。植物病原菌由来のＤＮＡ結合タンパクTranscription activator-like (TAL) effectorは、３４アミノ酸が繰り返された構造部分を有し、この繰り返し構造の１つ１つがそれぞれＤＮＡの１つの塩基を認識する。ＤＮＡには４種の塩基（Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）があるが、TAL effectorの繰り返し構造の１３番目および１４番目の２つのアミノ酸によって、ＤＮＡ配列の結合特異性が決定される。すなわち、各繰り返し構造の１３〜１４番目のアミノ酸を選択することによって、人工的にTAL effectorを所望のＤＮＡ領域に結合させることができる。このTAL effectorに、二量体のときＤＮＡ切断活性を示す酵素ＦｏｋＩと融合させたものをTAL effector nuclease（ＴＡＬＥＮ）という。このＴＡＬＥＮを２つ近傍に結合させるように設計すると、ＦｏｋＩが二量体を形成し、２つのＴＡＬＥＮの間のＤＮＡを切断する。切断が起こった後、ＤＮＡの修復が行われるが、その際、切断部位が多少削れたり、新たに付加が入ったりすることがある。ＴＡＬＥＮは植物でも機能することが分っている（文献：Zhang et al. (2013) Plant Physiology 161: 20-27）。
例えば、好ましくはタンパク質コード領域において、対象とする遺伝子に特異的な、好ましくは１５塩基〜２５塩基、より好ましくは１８塩基〜２２塩基のヌクレオチド配列を設計する。さらにそこから好ましくは９塩基〜１５塩基離れた場所に同様にヌクレオチド配列を設計する。これら２つのヌクレオチドに挟まれた部分が後に切断されることになる。
設計したヌクレオチド配列が対象とする遺伝子特異的か否かを判断するために、設計したヌクレオチド配列を、例えばN. tabacumまたはN. sylvestrisもしくはN. tomentosiformisの公知の配列データベースに対して相同性検索することによって、配列そのものの他に、その配列を含め相同性の高い領域があるか否かを調べてもよい。配列データベースとしては、例えば、GenBank、EMBL（The European Molecular Biology Loboratory）、またはDDBJ（DNA Data Bank of Japan）等を利用することができる。配列分析アルゴリズムとしては、例えば、BLAST等を利用することができる。また、データベースの配列の種類としては、Nucleotide Collection(nr/nt)、Expressed Sequence Tags(EST)、Genomic survey sequences(GSS)、およびWhole genome shotgun contigs(WGS)等があるが、これらに限定されない。
設計した特異的ヌクレオチド配列を基に、ＴＡＬＥの遺伝子配列を設計する。複数の繰り返し構造の結合には、例えば、GoldenGateTALEN Kit（Addgene社）を用いることができるが、これに限定されない。ＴＡＬＥとＦｏｋＩとを融合させる際には、例えば、適当なリンカー配列を配置してもよい。なお、ＦｏｋＩ配列は公知データベースに収載されている。ＴＡＬＥ／ＦｏｋＩ融合遺伝子をタバコで発現させるためのプロモーターは高発現するものが好ましく、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ ＲＮＡ遺伝子のプロモーター、アクチン遺伝子のプロモーター、およびユビキチン遺伝子のプロモーター等の構成的発現プロモーター；Rubisco small subunit遺伝子のプロモーター、ＰＰＤＫ遺伝子プロモーター等の緑色組織特異的プロモーター；ならびにその他の器官または時期特異的プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。発現量を上げるために所望のイントロンをプロモーターとＴＡＬＥ／ＦｏｋＩとの間に配置してもよい。さらに発現量を上げるために、ＴＡＬＥ／ＦｏｋＩのコドンを植物（タバコ）のコドンに最適化してもよい。植物コドンは、例えばCodon Usage Database（http://www.kazusa.or.jp/codon/）等の公知のデータベースに記載されている。
ＴＡＬＥＮ発現カセットを植物に導入するためのベクターには、上記の他に、その発現カセットが導入された植物細胞を選抜するための薬剤耐性遺伝子（選抜マーカー）の発現カセットが組み込まれていてもよい。薬剤耐性遺伝子としては、タバコ細胞を選抜可能な薬剤の耐性遺伝子であればよく、例えばカナマイシン抵抗性遺伝子（ネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼ：ＮＰＴ−ＩＩ）、およびハイグロマイシン抵抗性遺伝子（ハイグロマイシンフォスフォトランスフェラーゼ：ＨＰＴ）等が挙げられるが、これらに限定されない。またプロモーターは構成的発現をするものであれば特に限定されない。
さらに、ＴＡＬＥＮ発現カセットを安定的に植物に導入する際にアグロバクテリウムを利用する場合は、ＴＡＬＥＮ発現カセットおよび選抜マーカー発現カセットがＴ−ＤＮＡに存在することが必要である。この場合、Ｔ−ＤＮＡの境界配列としてライトボーダー（ＲＢ）配列およびレフトボーダー（ＬＢ）配列がＴ−ＤＮＡの両端に配置される。
ＴＡＬＥＮ発現カセットを植物に導入するためのベクターであって、タバコに遺伝子を導入できるものとしては、例えば、pBI系、pSB系（文献：Komari et al. 2006 Methods in Mol. Biol. 343: 15-41.）、pLC系（文献：米国特許第８２９８８１９号明細書）、およびpGreen（文献：Hellens et al. 2000 Plant Mol. Biol. 42: 819-832.）等が挙げられるがこれらに限定されない。
ＴＡＬＥＮ発現カセットを植物に導入する方法は特に限定されず、上述のアグロバクテリウムを使用する方法、パーティクルガン法、ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法、またはアグロインフィルトレーション法等、当業者が通常使用する方法を用いればよい。また、導入されるタバコの組織または器官としては、植物体を再生できれば特にその種類は限定されず、例えば、種子、根、葉、および花等が挙げられる。
形質転換植物の選抜および育成は、当業者であれば容易に実施することが可能である。選抜に用いる薬剤としては、これらに限定されるわけではないが、カナマイシン、およびハイグロマイシン等が挙げられる。薬剤の濃度は、例えば２０ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬとすることができ、好ましくは５０ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬである。植物培養物の育成用の培地は通常用いられるものでよく、無機塩の種類としてＭＳおよびＬＳ等が挙げられ、これに例えば、ショ糖、寒天、または植物ホルモン等を添加する。これらの使用濃度は、当業者が通常用いるプロトコールに従えばよい。
遺伝子導入を行う組織または器官として、上述に加えて、プロトプラストを使用ことができる。プロトプラストは細胞壁分解酵素を用いて常法に従い調製することができる。また、遺伝子導入法として、上述の安定形質転換法に加えて、トランジェント法を用いることも可能である。トランジェントアッセイは、エレクトロポレーション法、またはＰＥＧ法等の常法を用いて実施すればよい。また別のトランジェントアッセイ法として、Agro-infiltration、およびウイルスベクター等が挙げられる。ウイルスベクターとしては、ＡＬＳＶ（Apple latent spherical virus）またはＴＲＶ（Tobacco rattle virus）等を用いることができるが、これらに限定されない。
遺伝子を導入した細胞から再生した個体、または組織もしくは器官において、対象とする遺伝子に変異が生じたか否かは、標的とした領域を挟む形で、プライマーを設計し、所望の植物組織からＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ等によって当該領域を増幅し、その産物の塩基配列を調べることによって確認することができる。
遺伝子発現を解析する方法は、特に限定されず、ノーザンハイブリダイゼーション法または定量ＰＣＲ法等の公知の方法で行えばよい。ハイブリダイゼーションに使用するプローブは、対象遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列もしくはその一部、またはこれらに１もしくは複数の塩基の置換、欠失もしくは挿入がある塩基配列とすることができ、プローブの長さは例えば２０塩基〜配列全長とすることができる。
上記発現解析を行うためのＲＮＡの抽出は、グアニジン塩酸法またはＳＤＳ−フェノール法等、公知の方法で行えばよく、市販のキットを用いてもよい。また、総ＲＮＡからさらにｍＲＮＡ（ｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡ）を精製してもよい。
定量ＰＣＲを実施するためのｃＤＮＡの合成は、逆転写酵素とオリゴｄＴプライマーまたは遺伝子特異的プライマーとを用いた公知の方法で行うことができ、市販のキットを用いてもよい。
また、定量ＰＣＲのためのプライマーは、対象遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列に基づき設計することができる。プライマーの長さとしては好ましくは１５塩基〜３０塩基、特に好ましくは１７塩基〜２５塩基である。一組のプライマーセットが標的とする増幅配列の長さは、特に限定されず、例えば４０塩基〜配列全長とすることができ、好ましくは５０塩基〜５００塩基である。
蛍光ＰＣＲ装置を用いた定量ＰＣＲを実施する際には、上記プライマーに加え、標的配列の中にプローブ配列を設定する。標的配列の長さは、好ましくは４０塩基〜２００塩基、さらに好ましくは５０塩基〜１５０塩基である。プライマーおよびプローブを標識するレポーター色素としてＦＡＭ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、およびＣｙａｎｉｎｅ５が挙げられ、クエンチャー色素としてＴＡＭＲＡ、およびＢＨＱ１等が挙げられるが、これらに限定されず、当業者が適宜選択して組合せることができる。定量ＰＣＲの内部標準として用いる遺伝子は、構成的発現遺伝子であれば特に限定されないが、好ましい遺伝子として、elongation factor遺伝子およびアクチン遺伝子等が挙げられる。
ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳについては次のとおりである。ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳシステムは、ＤＮＡ配列を認識するガイドＲＮＡと、ＣＡＳヌクレアーゼを使用する遺伝子編集技術であり、植物においても機能することが知られている（文献：Belhaj et al. (2013) Plant Methods 9:39）。この技術は、ゲノム上の所望の配列を有するＤＮＡを切断する技術であり、標的ゲノム配列の欠失、付加および挿入に関しては、ＴＡＬＥＮと同様に、宿主のＤＮＡ修復系のミスに頼るものである。
ＣＡＳ９を植物で発現させるためのプロモーターとしては、高発現するものが好ましく、例えば、上述の３５Ｓ ＲＮＡ遺伝子のプロモーター、ユビキチン遺伝子のプロモーター、およびＰＰＤＫ遺伝子プロモーター等が挙げられるが、これらに限定されない。発現量を上げるために所望のイントロンをプロモーターとＣＡＳ９との間に配置してもよい。なお、ＣＡＳ９の塩基配列は公知である。さらに発現量を上げるために、ＣＡＳ９のコドンを植物（タバコ）のコドンに最適化してもよい。また、ＣＡＳ９に核局在シグナルＮＬＳ（Nuclear localize Signal）を付加してもよい。
所望のゲノム配列および相補的なガイドＲＮＡを設計する。例えば、好ましくはタンパク質コード領域において、対象となる遺伝子に特異的な、好ましくは１９塩基〜２２塩基のヌクレオチド配列を決定する。この際、その配列の３’末端側にはprotospacer-adjacent motif（ＰＡＭ）と呼ばれるＮＧＧ配列が存在する必要がある。また、後述のプロモーターの種類がＵ６の場合、転写開始点（ガイドＲＮＡの５’末端）はＧ、Ｕ３プロモーターの場合はＡであることが必要である。
ガイドＲＮＡの配列が対象とする遺伝子特異的か否かを判断するために、設計した配列を、例えばN. tabacumまたはN. sylvestrisもしくはN. tomentosiformisの配列データベースに対して相同性検索し、配列そのものの他に、その配列を含め相同性の高い領域があるか否かを調べることができる。配列データベースおよび分析アルゴリズムについては、上述と同様である。
ガイドＲＮＡを設計後、その３’末端側にｓｇＲＮＡ ｓｃａｆｆｏｌｄ配列を融合、ｓｇＲＮＡ（ガイド(g)RNA＋gRNA scaffold）とし、このｓｇＲＮＡを発現するためのコンストラクトを作製する。その際、プロモーターとして、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩのＵ６またはＵ３等のプロモーターが使用できる。適当なベクターを用いて完成したコンストラクトをタバコに導入し、組換え体を選抜、再生する。なお、より確実に変異を生じさせるために、対象遺伝子内部に複数のガイドＲＮＡを設計し、それらを発現するコンストラクトを同時にタバコに導入することもできる。この場合は、１つのＴ−ＤＮＡ上に複数のガイドＲＮＡ発現カセットおよびＣＡＳ９発現カセットを同時に配置させてもよい。
なお、ガイドＲＮＡおよびＣＡＳ９を発現させるカセットを植物に導入するためのベクター、ならびにタバコ形質転換の方法は、上述のＴＡＬＥＮにおける説明と同様である。
遺伝子導入を行う組織または器官として、上述に加えて、プロトプラストを使用することができる。プロトプラストは細胞壁分解酵素を用いて常法に従い調製することができる。また、遺伝子導入法として、上述の安定形質転換法に加えトランジェント法を用いることも可能である。トランジェントアッセイについては、上述のＴＡＬＥＮにおける説明と同様である。
遺伝子を導入した細胞から再生した個体、または組織もしくは器官において、対象遺伝子に変異が生じたか否かは、上述のＴＡＬＥＮにおける説明と同様の方法で確認することできる。
ウイルスアッセイ方法としては、ウイルス溶液とカーボランダム等の固形粉体とを組み合わせた機械接種法、および、ウイルスを保毒させたアブラムシを用いる虫媒接種法等が挙げられるが、これらに限定されない。また、用いるウイルスは、特に限定されず、ウイルス抵抗性タバコが抵抗性を示すウイルスとして上記に列挙したウイルスを用いることができる。
ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子およびｅＩＦ４Ｅ２遺伝子の両方に変異を有するウイルス抵抗性タバコの作出方法は特に制限されず、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子に変異を有するウイルス抵抗性タバコとｅＩＦ４Ｅ２遺伝子に変異を有するウイルス抵抗性タバコとの交配を利用した方法、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子に変異を有するウイルス抵抗性タバコに対して、ｅＩＦ４Ｅ２遺伝子に変異を導入する方法、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子に変異を有するウイルス抵抗性タバコに対して、ｅＩＦ４Ｅ２遺伝子の発現量を低下させる因子を導入する方法、ｅＩＦ４Ｅ２遺伝子に変異を有するウイルス抵抗性タバコに対して、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子に変異を導入する方法、およびｅＩＦ４Ｅ２遺伝子に変異を有するウイルス抵抗性タバコに対して、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の発現量を低下させる因子を導入する方法等が挙げられる。
また、Ｓ型のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子、Ｔ型のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子、またはその両方の遺伝子の機能が抑制されたタバコ変異体としては、特許文献５に記載された変異体を用いることができる。
なお、本実施形態において「ウイルス抵抗性タバコ」には、上記のようにして作出および選抜された当代のタバコだけでなく、その子孫（後代）のタバコも包含される。
（ウイルス抵抗性タバコの第二の態様）
ウイルス抵抗性タバコの一態様では、翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の発現量を野生型と比較して少なくさせる因子がタバコに導入されていることにより、翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の発現が抑制されている。
または、翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２遺伝子の発現量を野生型と比較して少なくさせる因子がタバコに導入されていることにより、翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２遺伝子の発現が抑制されている。
または、翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の発現量を野生型と比較して少なくさせる因子および翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２遺伝子の発現量を野生型と比較して少なくさせる因子の両方が導入されている。
対象遺伝子の発現量を野生型と比較して少なくさせる方法としては、従来公知の方法が利用可能であり、例えば、アンチセンス、コサプレッション、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ＶＩＧＳ（Ｖｉｒｕｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）、リボザイム、相同組換え、およびドミナントネガティブ遺伝子産物の発現等を利用した方法が挙げられる。
「発現量を野生型と比較して少なくさせる」とは、野生型と比較して少なくなる限り制限はないが、野生型の発現量を１００％とした場合に、好ましくは２０％以下、より好ましくは１０％以下、さらに好ましくは５％以下まで減少していることを意図している。ここで、「野生型」とは、対象とする遺伝子の発現を抑制させる因子が導入されておらず、かつ、対象とする遺伝子に変異を有していないタバコを指す。
なお、本実施形態において、「ウイルス抵抗性タバコ」には、上記の因子等を導入した当代のタバコだけでなく、その子孫（後代）のタバコも包含される。
対象遺伝子の発現を抑制する方法として好ましくは、ＲＮＡｉである。具体的には、対象となる遺伝子（ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子またはｅＩＦ４Ｅ２遺伝子）の塩基配列またはその一部をトリガーとして用いたＲＮＡｉコンストラクトを作製し、植物で発現するプロモーターと接続し、ベクターを用いてこれをタバコに導入する。そして、ＲＮＡｉコンストラクトを発現させて、対象遺伝子の発現を抑制させたウイルス抵抗性タバコを得る。したがって、一態様におけるウイルス抵抗性タバコは、対象遺伝子の発現を抑制するためのＲＮＡｉコンストラクトを保持し得る。
トリガーの長さは、例えば２１塩基〜配列全長とすることができるが、好ましくは５０塩基以上、より好ましくは１００塩基以上である。トリガー配列には、１または複数の塩基の置換、欠失または挿入があってもよい。
トリガーの配列として、Ｓ型の遺伝子とＴ型の遺伝子とで配列の同一性が高い部分を用いることにより、一種類のＲＮＡｉコンストラクトにより、Ｓ型の遺伝子およびＴ型の遺伝子の両方の遺伝子の発現を抑制することが可能である。すなわち、例えば、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｓ遺伝子の配列をトリガーとしたＲＮＡｉコンストラクトを導入した場合に、当該トリガーの配列がｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｔ遺伝子の配列と配列の同一性が高ければ、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｓ遺伝子の発現のみならず、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｔ遺伝子の発現も抑制することができる。ｅＩＦ４Ｅ２遺伝子についても同様である。
ＲＮＡｉでは、トリガー配列を１つがセンス方向、もう１つがアンチセンス方向となるように機能的に連結させて、トリガー配列が逆位反復となる様なＲＮＡｉコンストラクトを作製する。その際、両トリガーの間にスペーサー配列を入れることが好ましい。そのようなスペーサー配列としては、タバコのゲノムに含まれない配列、またはイントロン配列等の成熟ｍＲＮＡに含まれない領域が好ましい。このような配列としては、例えば、βグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子ならびにpyruvate dehydrogenase kinase（ｐｄｋ）およびカタラーゼ（ｃａｔ）遺伝子等のイントロン配列が挙げられるが、これらに限定されない。
ＲＮＡｉコンストラクトを植物の中で転写させるためのプロモーターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ ＲＮＡ遺伝子のプロモーター、アクチン遺伝子のプロモーター、およびユビキチン遺伝子のプロモーター等の構成的発現プロモーター；Rubisco small subunit遺伝子のプロモーター、およびＰＰＤＫ遺伝子プロモーター等の緑色組織特異的プロモーター；ならびにその他の器官または時期特異的プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。上記プロモーターとして好ましくは、ウイルスの感染する組織で発現するプロモーターである。
また、ターミネーターとしては、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ ＲＮＡまたは１９Ｓ ＲＮＡ遺伝子のターミネーター、およびノパリンシンターゼ遺伝子のターミネーター等が挙げられるが、植物で機能するものであれば、これらに限定されない。
ＲＮＡｉ発現カセットを植物に導入するためのベクターには、上記の他に、その発現カセットが導入された植物細胞を選抜するための薬剤耐性遺伝子の発現カセットが組み込まれていてもよい。薬剤耐性遺伝子としては、タバコ細胞を選抜可能な薬剤の耐性遺伝子であればよく、例えばカナマイシン抵抗性遺伝子（ネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼ：ＮＰＴ−ＩＩ）、およびハイグロマイシン抵抗性遺伝子（ハイグロマイシンフォスフォトランスフェラーゼ：ＨＰＴ）等が挙げられるが、これらに限定されない。またプロモーターも構成的発現をするものであれば特に限定されない。
さらに、ＲＮＡｉ発現カセットを安定的に植物に導入する際にアグロバクテリウムを利用する場合は、ＲＮＡｉ発現カセットおよび選抜マーカー発現カセットが、Ｔ−ＤＮＡに存在することが必要である。この場合、Ｔ−ＤＮＡの境界配列として、ライトボーダー（ＲＢ）配列およびレフトボーダー（ＬＢ）配列がＴ−ＤＮＡの両端にそれぞれ配置される。
また、遺伝子発現を視覚的に予測するために、蛍光タンパク質の発現カセットをＴ−ＤＮＡの中に配置してもよい。蛍光タンパク質としては、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）および黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）等が挙げられるが、これらに限定されない。蛍光タンパク質として好ましくは、ＧＦＰである。蛍光はイメージアナライザーで観察することができる。
ＲＮＡｉ発現カセットを植物に導入するためのベクターであって、タバコに遺伝子を導入できるものとしては、例えば、pBI系、pSB系（文献：Komari et al. 2006 Methods in Mol. Biol. 343: 15-41.）、pLC系（文献：米国特許第８２９８８１９号明細書）、pGreen（文献：Hellens et al. 2000 Plant Mol. Biol. 42: 819-832.）、pHellsgate（文献：Wesley et al. 2001 Plant J 27: 581-590.）、およびpSP231（文献：国際公開第２０１１／１０２３９４号公報）等が挙げられるが、これらに限定されない。
ＲＮＡｉ発現カセットを植物に導入する方法は特に限定されず、上述のアグロバクテリウムを使用する方法、パーティクルガン法、ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法、またはアグロインフィルトレーション法等、当業者が通常使用する方法を用いればよい。また、導入されるタバコの組織または器官としては、植物体を再生できれば特にその種類は限定されず、例えば、種子、根、葉、および花等が挙げられる。
形質転換植物の選抜および育成は、当業者であれば容易に実施することが可能である。選抜に用いる薬剤としては、これらに限定されるわけではないが、カナマイシン、およびハイグロマイシン等が挙げられる。薬剤の濃度は、例えば２０ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬとすることができ、好ましくは５０ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬである。植物培養物の育成用の培地は通常用いられるものでよく、無機塩の種類としてＭＳおよびＬＳ等が挙げられ、これに例えば、ショ糖、寒天、または植物ホルモン等を添加する。これらの使用濃度は、当業者が通常用いるプロトコールに従えばよい。
遺伝子発現を解析する方法およびウイルスアッセイ方法については、上述のとおりである。
なお、ウイルス抵抗性タバコが、上述の第一の態様と上述の第二の態様との組み合わせでもよいことは、当業者であれば容易に理解できる。すなわち、対象となる遺伝子のうちの何れかにおいては、変異を有していることにより、ウイルスに対して非機能的なタンパク質を生産するか、または遺伝子の発現が抑制されており、他の対象遺伝子については、対象遺伝子の発現量を野生型と比較して少なくさせる因子がタバコに導入されていることにより、対象遺伝子の発現が抑制されているような態様であってもよい。
また、対象となる遺伝子のうちのいずれかの遺伝子の機能が欠失していると考えられるタバコ品種、系統または在来種を利用して上述の第一の態様または上述の第二の態様と組み合わせるものであってもよい。そのようなタバコ品種、系統または在来種の例としては、例えば、Ｓ型のｅＩＦ４Ｅ２遺伝子の機能が欠失していると考えられるタバコ品種、系統、在来種として、非限定的に、Virgin A Mutant、Perevi、SCR、Bursana、Kerti、Havana 211、遠州、沖縄1、TN86、TN90、TN97、K326 PVY、NC291、およびNC745等が挙げられる。また、非特許文献Yamamoto, Y. (1992) Studies on Breeding of Tobacco VarietiesResistant to Veinal Necrosis Disease by Potato Virus Y Strain T. Bulletin of the Leaf Tobacco Research Laboratory, 1-87.に記載のタバコ植物であって、Ｓ型のｅＩＦ４Ｅ２遺伝子自体が欠失、あるいは同遺伝子内部に塩基の欠失、塩基の置換または塩基の挿入があるタバコが挙げられる。なおここでいう遺伝子とはタンパク質をコードする領域の他、プロモーター、イントロンまたはターミネーターをも含む。遺伝子自体の欠失、遺伝子内部の欠失、置換または挿入の有無は、対象としている遺伝子の塩基配列を基に、例えば遺伝子全長または一部分を増幅するようなプライマーを設計し、調査対象のタバコのＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行うことにより判別することが可能である。例えば、産物が増幅されなければ遺伝子自体が欠失していると判別でき、産物が増幅された場合には、その塩基配列を解読することによって、容易に塩基の欠失、置換または挿入の有無を判別することが可能である。
葉たばこ生産において、複数のウイルスに同時に抵抗性となるような遺伝資源は極めて重要であるが、これまで、ＰＶＹ、ＰＶＹ−ＢおよびＴＢＴＶ全てに抵抗性であるタバコは知られていなかった。本実施形態におけるウイルス抵抗性タバコの一態様では、ＰＶＹ、ＰＶＹ−ＢおよびＴＢＴＶ全てに抵抗性を有するウイルス抵抗性タバコを提供できる。
〔２．ウイルス抵抗性タバコの育種後代の作出方法〕
本発明はまた、ウイルス抵抗性タバコの育種後代の作出方法を提供する。
当該方法の一態様では、上述のウイルス抵抗性タバコ作出方法において作出されたウイルス抵抗性タバコまたはその後代を、自家受粉または他家受粉させる。ここで受粉は自然状態で行われてもよいし、人為的に行われてもよい。一実施形態において、当該後代は、上述のウイルス抵抗性タバコ作出方法において作出された当代のウイルス抵抗性タバコを自家受粉または他家受粉させる、あるいはそのようにして得られた後代からさらに繰り返し自家受粉または他家受粉させて得ることができる。
他家受粉において上述のウイルス抵抗性タバコまたはその後代と掛け合わせるのは、各遺伝子に同じ変異を有しているウイルス抵抗性タバコであってもよいし、各遺伝子に異なる変異を有しているウイルス抵抗性タバコであってもよいし、各遺伝子に変異を有していないタバコであってもよいし、各遺伝子に変異を有しているがウイルス抵抗性ではないタバコであってもよい。
当該方法の一態様では、雑種世代（Ｆ１、Ｆ２、・・・）、変異体の自殖世代（Ｍ１、Ｍ２、・・・）、戻し交配（ＢＣ１、ＢＣ２、・・・）世代等の育種後代のタバコが得られうる。なお、これらのタバコは雄性不稔（ＭＳ）形質を有していてもよい。
本発明はまた、上述のウイルス抵抗性タバコ作出方法において作出されたウイルス抵抗性タバコまたはその後代を自家受粉または他家受粉させる、ウイルス抵抗性タバコ育種方法を提供する。当該方法の一態様として、例えば、これに限定されるわけではないが、上述のウイルス抵抗性タバコ作出方法において作出された、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子およびｅＩＦ４Ｅ２遺伝子上に変異が生じたウイルス抵抗性タバコ個体を得た後、タバコ品種あるいはタバコ系統と交配し、雑種第一代Ｆ１を作出する。ここに当該品種あるいは系統をさらに戻し交配し、ＢＣ１Ｆ１を作出する。当該変異を有する個体を選抜しながら、当該品種あるいは系統との交配（戻し交配）をさらに繰り返し、ＢＣＸＦ１（Ｘは例えば３〜８）を作出する。その後、当該ＢＣＸＦ１を自殖し、ＢＣＸＦ２世代において、当該変異をホモで有する個体を選抜し、遺伝的背景を固定するためにさらに自殖を繰り返し（ＢＣＸＦ３、ＢＣＸＦ４、・・・）、新しいウイルス抵抗性タバコを育種する。なお、各世代における個体の選抜は後述のＤＮＡマーカーを利用してもよい。
〔３．ＤＮＡマーカーおよびその利用〕
本発明では、ｅＩＦ４Ｅ２遺伝子（ｅＩＦ４Ｅ２−Ｓ遺伝子またはｅＩＦ４Ｅ２−Ｔ遺伝子）上に生じた変異を利用してＤＮＡマーカーを開発することができ、それをマーカー育種に活用することができる。「ＤＮＡマーカー」とは、品種間または個体間におけるＤＮＡの塩基配列の違い（変異または多型）、またはその違いを検出するためのツールであり、品種または個体を識別するための目印となる塩基配列の違い（変異または多型）、またはその違いを検出するためのツールのことを指す。ｅＩＦ４Ｅ２遺伝子における変異が確定し、その変異によってウイルスに抵抗性となることが確認された場合、その変異が生じたタバコ変異体を、当該ウイルス抵抗性の育種母本として利用することができる。その際、既に抵抗性に係る原因変異が分っているため、原因変異の識別に利用可能なマーカーをｅＩＦ４Ｅ２遺伝子上に設計することができる。当該変異とウイルス抵抗性との関係が遺伝的分離によって切れることがないため、精密なマーカー育種が可能となる。この変異の有無を検出すれば、交配等を繰り返した際に、一回一回ウイルス抵抗性を確認する必要がない。
また、ｅＩＦ４Ｅ２遺伝子に関するＤＮＡマーカーは、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子に関する同様のＤＮＡマーカーとともに利用されてもよい。両遺伝子のマーカーを組み合わせて利用することにより、育種における時間および労力を削減することができる。
タバコからのゲノムＤＮＡの抽出は、常法に基づけばよく、市販の抽出キットを用いてもよいが、特に限定されない。また、ゲノムＤＮＡは、粗精製物であってもよいし、いくつかの精製工程を経た精製品であってもよい。変異の有無を検出する技術としては、例えばＲＦＬＰまたは一本鎖ＤＮＡをプローブに用いた核酸（「ポリヌクレオチド」ともいう）のハイブリダイゼーションを応用した技術、およびＰＣＲ等のようにポリヌクレオチドの増幅を伴う技術等があるが、変異を検出できるものであれば、特に限定されない。
ポリヌクレオチドを増幅する場合、例えばＰＣＲ法によって行うことができるが、他の公知の遺伝子増幅方法、例えば、ＬＣＲ法、ＳＤＡ（Strand Displacement Amplification）法、またはＬＡＭＰ法等によって行ってもよい。増幅する各ポリヌクレオチドの長さは、後述する各種検出方法が利用可能な長さであれば特に限定されないが、例えば、４０塩基〜５０００塩基であることが好ましく、１００塩基〜１０００塩基であることがより好ましく、１００塩基〜７００塩基であることがさらに好ましく、１００塩基〜５００塩基であることがよりさらに好ましい。
各ポリヌクレオチドを増幅するためのプライマー配列は、変異箇所を挟むか、もしくは含むように設計することが好ましいが、プライマー配列を設計する位置は特に限定されない。変異箇所を挟むようにプライマー配列を設計する場合、例えば、ｅＩＦ４Ｅ２遺伝子内に位置するように設計してもよい。プライマーの長さは、好ましくは１５塩基〜３０塩基、特に好ましくは１７塩基〜２５塩基である。また、変異箇所を含む所定塩基数の配列を増幅するためのプライマーとして機能し得る限り、その配列において１またはそれ以上の置換、欠失、および／または付加を含んでいてもよい。また、プライマーは必要に応じて蛍光物質または放射性物質等で標識されていてもよい。
検出される変異は、ウイルスに対して非機能的なｅＩＦ４Ｅ２タンパク質を生産させるか、またはｅＩＦ４Ｅ２遺伝子の発現を抑制する変異である。その具体例は、〔１．ウイルス抵抗性タバコ〕欄に記載のとおりである。
以下、変異を検出する方法として代表的なものを挙げるが、こられに限定されない。
（１）市販のシーケンサー等を利用し、増幅したポリヌクレオチドの塩基配列を直接読み取ることによって変異の有無を検出する方法。
（２）ＳＳＣＰ（Single Strand Conformation Polymorphism）法を用いて、増幅したポリヌクレオチド上の変異の有無を検出する方法。
（３）増幅したポリヌクレオチドに対して、変異箇所の配列（変異前の配列または変異後の配列）を特異的に認識する制限酵素による処理後に、切断の有無により判定する方法（ＣＡＰＳ（Cleaved Amplified Polymorphic Sequence）法）。その他、意図的に設計したミスマッチプライマーを含むプライマーセットによって制限酵素認識部位を作製するｄＣＡＰＳ（derived CAPS）法を用いてもよい。なお、当業者であれば多大な労力を要することなく、プライマー配列を設計し、ＰＣＲを行い、所望の変異を検出することが可能である。例えば、プライマー配列の設計はウェブを介して行うことができる（文献：Neff et al. (2002) Web-based primer design for single nucleotide polymorphism analysis. TRENDS in Genetics 18: 613-615）。
なお、プライマーの３’末端付近にミスマッチを入れた場合、proofreading活性を持つＤＮＡポリメラーゼを使用してＰＣＲを行うと、ミスマッチが修正され、制限酵素で切断されなくなる可能性がある。したがって、ｄＣＡＰＳ法において、ミスマッチプライマーを用いる場合、proofreading活性を持たないＤＮＡポリメラーゼが好ましい。限定されるわけではないが、そのようなＤＮＡポリメラーゼとしてTaKaRa TaqTM（タカラバイオ社）が挙げられる。またプライマーの３’末端付近に制限酵素切断部位を入れた場合、切断の有無は、プライマーの長さ分の違いとして検出される。
（４）変異部分に特異的にハイブリダイズするプローブを設計し、ハイブリダイズさせることで変異の有無を確認する方法。
解析手法は、特に限定はされないが、例えば、TaqMan（登録商標）プローブ法を用いたＰＣＲ、またはＴＯＦ−ＭＳを利用した測定技術であるMassARRAY（登録商標）解析等を用いることができる。
（５）変異箇所の配列（変異前の配列および／または変異後の配列）を一部に含ませてプライマー配列を設計し、ＰＣＲ法等によって増幅させることにより、増幅の有無によって変異の有無を検出する方法（アリル特異的ＰＣＲ法）。コントロールとして、例えば変異前の塩基配列に特異的な塩基配列からなる核酸プライマーを用いることができる。
なお、プライマーの３’末端付近に目的変異の塩基を入れる場合、その位置は、末端、もしくは末端から数塩基の間が好ましい。また、プライマーの３’末端付近に目的の変異を入れた場合においても、変異型の配列に加え、変異のない野生型の配列も併せて増幅することがある。このような場合、目的のミスマッチ以外のミスマッチを、変異型検出用プライマーと野生型検出用プライマーとで同じ位置に導入して、ＰＣＲを行い、変異型または野生型特異的な増幅を得てもよい。
また、必要に応じて、目的とする遺伝子用のプライマーの他に、ＰＣＲの内部標準となる遺伝子用のプライマーを、ＰＣＲ反応液に加えてもよい。
なお、上記に例示した変異以外の変異を検出する場合においても、当業者であれば多大な労力を要することなく、プライマー配列を設計し、ＰＣＲを行い、所望の変異を検出することが可能である。
なお、遺伝子変異の検出技術は、以下の文献に詳細に記載されている：日本特許庁のウェブサイト<http://www.jpo.go.jp/shiryou/s_sonota/hyoujun_gijutsu/kakusan/0025.html>。また、遺伝子変異の検出および解析手法は、以下の文献に詳細に記載されている：日本特許庁のウェブサイト<http://www.jpo.go.jp/shiryou/s_sonota/hyoujun_gijutsu/kakusan/0028.html>。あるいは、文献：Agarwal et al. (2008) Advances in molecular marker techniques and their applications in plant sciences. Plant Cell Rep. 27:617-631.、Neff et al. (1998) dCAPS, a simple technique for the genetic analysis ofsingle nucleotide polymorphisms: experimental applications in Arabidopsis thaliana genetics. Plant J. 14: 387-392.を参照してもよい。
したがって、本発明は、ｅＩＦ４Ｅ２遺伝子における変異を検出するためポリヌクレオチドを提供する。当該変異は、ウイルスに対して非機能的なｅＩＦ４Ｅ２タンパク質を生産させるか、またはｅＩＦ４Ｅ２遺伝子の発現を抑制する変異である。その具体例は、〔１．ウイルス抵抗性タバコ〕欄に記載のとおりである。
また、上記検出用ポリヌクレオチドの一形態は、核酸プライマーまたは核酸プライマーのセットである。核酸プライマーのセットは、上記変異を挟む核酸プライマーのセットであってもよいし、上記変異を含む連続した塩基配列またはその相補配列からなるポリヌクレオチドを含む核酸プライマーのセットであってもよい。上記検出用ポリヌクレオチドの別の一形態は、上記変異を含む連続した塩基配列またはその相補配列にハイブリダイズする核酸プローブである。
また、ｅＩＦ４Ｅ２遺伝子に関する上述の検出用ポリヌクレオチドは、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子に関する同様の検出用ポリヌクレオチドと組み合わせて用いることができる。ｅＩＦ４Ｅ２遺伝子に関する検出用ポリヌクレオチドと、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子に関する検出用ポリヌクレオチドとを組み合わせて用いることにより、両遺伝子の変異の検出を同時に行うことができ、育種における時間および労力を削減することができる。なお、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子に関する検出用ポリヌクレオチドとしては、特許文献５に記載の検出用ポリヌクレオチドを用いればよい。
なお、組み合わせ物の形態は特に制限されず、予め混合された状態で提供されるものであってもよく、または互いに別々の容器にて提供され、使用者が直前に組み合わせて用いるキットの形態であってもよい。
本発明はまた、タバコのゲノムＤＮＡにおいて、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子およびｅＩＦ４Ｅ２遺伝子に上記変異が生じていることを、ウイルス抵抗性の指標とすることを特徴とする、ウイルスに対するタバコの抵抗性の判定方法を提供する。
本発明はまた、上記判定方法を用いて、ウイルスに対して抵抗性のタバコを選抜する選抜工程を包含することを特徴とする、ウイルス抵抗性タバコの育種方法を提供する。
本発明はまた、タバコにおいて、ゲノムＤＮＡにおける上記変異の有無を、上記検出用ポリヌクレオチドを利用して検査する検査工程と、当該検査工程において上記変異が検出されたタバコをウイルス抵抗性タバコとして選抜する選抜工程とを含むことを特徴とする、ウイルス抵抗性タバコ選抜方法を提供する。検出用ポリヌクレオチドを利用した検査方法の詳細は、上述のとおりである。
本発明はまた、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子における上記変異を含む連続した塩基配列またはその相補配列からなるポリヌクレオチド、およびｅＩＦ４Ｅ２遺伝子における上記変異を含む連続した塩基配列またはその相補配列からなるポリヌクレオチド、を含むことを特徴とする、ウイルスに対するタバコの抵抗性の判定用ＤＮＡマーカーを提供する。
〔４．葉たばこおよびたばこ製品〕
本発明のウイルス抵抗性タバコを栽培して生産される葉たばこは、当該ウイルス（例えば、Virgin A mutantのウイルス抵抗性を打破するPVY系統）が引き起こす病気に罹患しない。そのため、特に当該病気が発生する環境下で栽培された場合において、ウイルス抵抗性でないタバコを栽培して生産される葉たばこと比較して、品質低下が軽減され高品質である。その結果、より高品質のたばこ製品を生産することができる。
「葉たばこ」とは、タバコ植物の生葉を収穫後乾燥させたもので、たばこ製品の製造のための原料となるものを指す。「たばこ製品」とは、紙巻たばこ（フィルタ付、フィルタなし）（CIGARETTE）、シガー（CIGAR）、シガリロ（CIGARILLO）、スヌース（SNUS）、嗅ぎタバコ（SNUFF）、チューイングたばこ、および電子タバコ等を指す。
したがって、本発明は、上記ウイルス抵抗性タバコから生産される葉たばこを提供する。また、本発明は、上記ウイルス抵抗性タバコの収穫後の生葉を乾燥させる工程を含む葉たばこの生産方法を提供する。
本発明はまた、上記葉たばこを原料として含むたばこ製品を提供する。
〔５．まとめ〕
以上のように、本発明に係るウイルス抵抗性タバコの一態様は、ウイルスに対して非機能的な翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質を生産するか、または翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の発現が抑制されており、さらに、ウイルスに対して非機能的な翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２タンパク質を生産するか、または翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２遺伝子の発現が抑制されており、上記翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅは、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−ＳおよびｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｔの少なくとも一方であり、上記翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２は、ｅＩＦ４Ｅ２−ＳおよびｅＩＦ４Ｅ２−Ｔの少なくとも一方である。
また、本発明に係るウイルス抵抗性タバコの一態様では、上記翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子に変異を有しており、それによって、ウイルスに対して非機能的な上記翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質を生産するか、または上記翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の発現が抑制されていてもよい。
また、本発明に係るウイルス抵抗性タバコの一態様では、上記翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２遺伝子に変異を有しており、それによって、ウイルスに対して非機能的な上記翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２タンパク質を生産するか、または上記翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２遺伝子の発現が抑制されていてもよい。
また、本発明に係るウイルス抵抗性タバコの一態様では、上記変異はナンセンス変異であることが好ましい。
また、本発明に係るウイルス抵抗性タバコの一態様では、上記翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子における上記変異は、
（ａ１）配列番号８に示すアミノ酸配列からなる翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｓタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｓ遺伝子のエキソン、もしくは
（ａ２）配列番号８に示すアミノ酸配列と９２％以上の配列同一性を有する機能的な翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｓタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｓ遺伝子のエキソン、
におけるナンセンス変異である、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｓ遺伝子における変異；または
（ｂ１）配列番号１１に示すアミノ酸配列からなる翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｔタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｔ遺伝子のエキソン、もしくは
（ｂ２）配列番号１１に示すアミノ酸配列と９２％以上の配列同一性を有する機能的な翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｔタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｔ遺伝子のエキソン、
におけるナンセンス変異である、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｔ遺伝子における変異；または
ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｓ遺伝子における上記変異およびｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｔ遺伝子における上記変異の両方；
であってもよい。
また、本発明に係るウイルス抵抗性タバコの一態様では、翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２遺伝子における上記変異は、
（ｃ１）配列番号２に示すアミノ酸配列からなる翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２−Ｓタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２−Ｓ遺伝子のエキソン、もしくは
（ｃ２）配列番号２に示すアミノ酸配列と８８％以上の配列同一性を有する機能的な翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２−Ｓタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２−Ｓ遺伝子のエキソン、
におけるナンセンス変異である、ｅＩＦ４Ｅ２−Ｓ遺伝子における変異；または
（ｄ１）配列番号５に示すアミノ酸配列からなる翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２−Ｔタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２−Ｔ遺伝子のエキソン、もしくは
（ｄ２）配列番号５に示すアミノ酸配列と８８％以上の配列同一性を有する機能的な翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２−Ｔタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２−Ｔ遺伝子のエキソン、
におけるナンセンス変異である、ｅＩＦ４Ｅ２−Ｔ遺伝子における変異；または
ｅＩＦ４Ｅ２−Ｓ遺伝子における上記変異およびｅＩＦ４Ｅ２−Ｔ遺伝子における上記変異の両方；
であってもよい。
また、本発明に係るウイルス抵抗性タバコの一態様では、上記ナンセンス変異が、下記（１）〜（４）に示す１つ以上の変異であることが好ましい：（１）コドンＣＡＡのＣがＴに置換、（２）コドンＣＧＡのＣがＴに置換、（３）コドンＣＡＧのＣがＴに置換、（４）コドンＴＧＧのＧ（２つのＧのうちの何れか一方または両方）がＡに置換。
また、本発明に係るウイルス抵抗性タバコの一態様では、翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２遺伝子における上記変異は、ｅＩＦ４Ｅ２−Ｓ遺伝子における変異を含むことが好ましい。
また、本発明に係るウイルス抵抗性タバコの一態様では、翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子における上記変異は、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｔ遺伝子における変異を含むことが好ましい。
また、本発明に係るウイルス抵抗性タバコの一態様では、上記ウイルスは、Potyvirus属のウイルスであってもよい。
また、本発明に係るウイルス抵抗性タバコの一態様では、上記Potyvirus属のウイルスは、Potato virus Yの一系統であって、タバコのVirgin A mutantのウイルス抵抗性を打破する系統、およびPotato virus Yの少なくとも一方であってもよい。
また、本発明に係るウイルス抵抗性タバコの一態様では、さらにUmbravirus属のウイルスに対して抵抗性を有していてもよい。
また、本発明に係るウイルス抵抗性タバコの一態様では、上記Umbravirus属のウイルスは、Tobacco bushy top virusであってもよい。
本発明に係るウイルス抵抗性タバコ作出方法の一態様は、ウイルスに対して非機能的な翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質を生産するか、またはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の発現を抑制する変異をｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子に導入すること、および
ウイルスに対して非機能的な翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２タンパク質を生産するか、またはｅＩＦ４Ｅ２遺伝子の発現を抑制する変異をｅＩＦ４Ｅ２遺伝子に導入することによって、ウイルスに対して抵抗性を有するタバコを作出することを含み、
上記翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅは、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−ＳおよびｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｔの少なくとも一方であり、
上記翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２は、ｅＩＦ４Ｅ２−ＳおよびｅＩＦ４Ｅ２−Ｔの少なくとも一方である。
また、本発明に係るウイルス抵抗性タバコ作出方法の一態様では、上記変異はナンセンス変異であってもよい。
また、本発明に係るウイルス抵抗性タバコ作出方法の一態様では、エチルメタンスルホン酸によって上記変異を生じさせるものであってもよい。
また、本発明に係るウイルス抵抗性タバコ作出方法の一態様では、上記翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子における変異は、
（ａ１）配列番号８に示すアミノ酸配列からなる翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｓタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｓ遺伝子のエキソン、もしくは
（ａ２）配列番号８に示すアミノ酸配列と９２％以上の配列同一性を有する機能的な翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｓタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｓ遺伝子のエキソン、
におけるナンセンス変異である、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｓ遺伝子における変異；または
（ｂ１）配列番号１１に示すアミノ酸配列からなる翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｔタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｔ遺伝子のエキソン、もしくは
（ｂ２）配列番号１１に示すアミノ酸配列と９２％以上の配列同一性を有する機能的な翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｔタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｔ遺伝子のエキソン、
におけるナンセンス変異である、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｔ遺伝子における変異；または
ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｓ遺伝子における上記変異およびｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｔ遺伝子における上記変異の両方；
であってもよい。
また、本発明に係るウイルス抵抗性タバコ作出方法の一態様では、上記翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２遺伝子における変異は、
（ｃ１）配列番号２に示すアミノ酸配列からなる翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２−Ｓタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２−Ｓ遺伝子のエキソン、もしくは
（ｃ２）配列番号２に示すアミノ酸配列と８８％以上の配列同一性を有する機能的な翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２−Ｓタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２−Ｓ遺伝子のエキソン、
におけるナンセンス変異である、ｅＩＦ４Ｅ２−Ｓ遺伝子における変異；または
（ｄ１）配列番号５に示すアミノ酸配列からなる翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２−Ｔタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２−Ｔ遺伝子のエキソン、もしくは
（ｄ２）配列番号５に示すアミノ酸配列と８８％以上の配列同一性を有する機能的な翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２−Ｔタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２−Ｔ遺伝子のエキソン、
におけるナンセンス変異である、ｅＩＦ４Ｅ２−Ｔ遺伝子における変異；または
ｅＩＦ４Ｅ２−Ｓ遺伝子における上記変異およびｅＩＦ４Ｅ２−Ｔ遺伝子における上記変異の両方；
であってもよい。
また、本発明に係るウイルス抵抗性タバコ作出方法の一態様では、上記ナンセンス変異が、下記（１）〜（４）に示す１つ以上の変異であってもよい：（１）コドンＣＡＡのＣがＴに置換、（２）コドンＣＧＡのＣがＴに置換、（３）コドンＣＡＧのＣがＴに置換、（４）コドンＴＧＧのＧ（２つのＧのうちの何れか一方または両方）がＡに置換。
本発明に係るウイルス抵抗性タバコ作出方法の別の一態様は、翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の発現量を野生型と比較して少なくさせる因子を導入すること、および
翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２遺伝子の発現量を野生型と比較して少なくさせる因子を導入することによって、ウイルスに対して抵抗性を有するタバコを作出することを含み、
上記翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅは、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−ＳおよびｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｔの少なくとも一方であり、
上記翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２は、ｅＩＦ４Ｅ２−ＳおよびｅＩＦ４Ｅ２−Ｔの少なくとも一方である。
また、本発明に係るウイルス抵抗性タバコ作出方法の一態様では、上記ウイルスは、Potyvirus属のウイルスであってもよい。
また、本発明に係るウイルス抵抗性タバコ作出方法の一態様では、上記Potyvirus属のウイルスは、Potato virus Yの一系統であって、タバコのVirgin A mutantのウイルス抵抗性を打破する系統、およびPotato virus Yの少なくとも一方であってもよい。
本発明に係るウイルス抵抗性タバコの育種後代の作出方法の一態様は、上述のウイルス抵抗性タバコ作出方法において作出されたウイルス抵抗性タバコまたはその後代を自家受粉または他家受粉させるものである。
本発明に係る検出用ポリヌクレオチドの組み合わせ物の一態様は、タバコの翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２遺伝子における変異を検出するためのポリヌクレオチドであって、当該変異は、ウイルスに対して非機能的なｅＩＦ４Ｅ２タンパク質を生産するか、またはｅＩＦ４Ｅ２遺伝子の発現を抑制する変異である、第一の検出用ポリヌクレオチドと、タバコの翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子における変異を検出するためのポリヌクレオチドであって、当該変異は、ウイルスに対して非機能的なｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質を生産するか、またはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の発現を抑制する変異である、第二の検出用ポリヌクレオチドと、を含む。
本発明に係るウイルス抵抗性タバコ選抜方法の一態様は、タバコにおいて、ゲノムＤＮＡにおける上記変異の有無を、上述の検出用ポリヌクレオチドの組み合わせ物を利用して検査する検査工程と、上記検査工程において上記変異が検出されたタバコをウイルス抵抗性タバコとして選抜する選抜工程とを含む。
本発明に係る判定用ＤＮＡマーカーの組み合わせ物の一態様は、翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２遺伝子における変異を含む連続した塩基配列またはその相補配列からなるポリヌクレオチドを含んでおり、当該変異は、ウイルスに対して非機能的なｅＩＦ４Ｅ２タンパク質を生産するか、またはｅＩＦ４Ｅ２遺伝子の発現を抑制する変異である、第一の判定用ＤＮＡマーカーと、
翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子における変異を含む連続した塩基配列またはその相補配列からなるポリヌクレオチドを含んでおり、当該変異は、ウイルスに対して非機能的なｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質を生産するか、またはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の発現を抑制する変異である、第二の判定用ＤＮＡマーカーと、を含む、ウイルスに対するタバコの抵抗性の判定用ＤＮＡマーカーである。
本発明に係る葉たばこの一態様は、上記ウイルス抵抗性タバコの葉たばこである。
本発明に係るたばこ製品の一態様は、上記葉たばこを原料として含むものである。
以下に実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された文献の全てが参考として援用される。
〔実施例１〕
（遺伝子配列の取得）
［ｅＩＦ４Ｅ２遺伝子］
ＧｅｎＢａｎｋデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed）で検索を行い、タバコ（N. tabacum）の翻訳開始因子として、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号がＥＢ４５１７１７であるｅＩＦ４ＥのｍＲＮＡ塩基配列、ＫＦ１５５６９６であるｅＩＦ４ＥのｍＲＮＡ塩基配列、およびＫＭ２０２０６８であるｅＩＦ４ＥのｍＲＮＡ塩基配列を取得した。これらｅＩＦ４ＥをｅＩＦ４Ｅ２と命名した。これらとｅＩＦ４Ｅ１（アクセッション番号：ＡＹ７０２６５３、非特許文献１９）との相同性は７０％から７４％であった。ＧｅｎＢａｎｋデータベースのN. tomentosiformisおよびN. sylvestrisのＷＧＳ（Whole-genome shotgun contigs）を用いたＢＬＡＳＴ解析から、アクセッション番号がＥＢ４５１７１７のｅＩＦ４Ｅ２およびＫＦ１５５６９６のｅＩＦ４Ｅ２はN. sylvestris由来であり、ＫＭ２０２０６８のｅＩＦ４Ｅ２はN. tomentosiformis由来であることを確認した。ＥＢ４５１７１７（タンパク質コード領域の配列は第８７番目から７４６番目の塩基）とＫＦ１５５６９６（タンパク質コード領域の配列は第１１２番目から７７１番目の塩基）とのタンパク質コード領域におけるＤＮＡ配列の同一性は９９．８％（６６０塩基中６５９塩基の一致）であり、コードされるタンパク質のアミノ酸配列の同一性は１００％であった。ＤＮＡ配列における一塩基の違いは、それぞれのＤＮＡの由来となる品種の違いによるものと考えられる。これらの配列をそれぞれ、ｅＩＦ４Ｅ２−Ｓ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＥＢ４５１７１７、ＫＦ１５５６９６）およびｅＩＦ４Ｅ２−Ｔ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＫＭ２０２０６８）と命名した。ｅＩＦ４Ｅ２−Ｓ遺伝子の機能を破壊したタバコは、ＰＶＹに抵抗性になることが示されている（非特許文献２２）。
ｅＩＦ４Ｅ２−Ｓ（ＫＦ１５５６９６）の塩基配列を配列番号１に示し、コードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２に示し、さらにｅＩＦ４Ｅ２−Ｓ遺伝子のゲノム配列を配列番号３に示した。ゲノム配列は品種Ｋ３２６由来の配列で、アクセション番号ＡＷＯＪ０１２２２２７１の第７００１番目の塩基から第１３０００番目の塩基からなる。また、ｅＩＦ４Ｅ２−Ｔの塩基配列を配列番号４に示し、コードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号５に示し、さらにｅＩＦ４Ｅ２−Ｔ遺伝子のゲノム配列を配列番号６に示した。配列番号６は、ＫＭ２０２０６８の配列をクエリに、ＧｅｎＢａｎｋデータベースのN. tabacumのＷＧＳに対してＢＬＡＳＴ解析を行うことによって取得した。具体的には、アクセッション番号ＡＷＯＪ０１１８２７８１（品種Ｋ３２６由来のゲノムＤＮＡ配列）の相補配列のうち３０００１番目から３８０３９番目の配列である。このゲノム配列におけるエキソン配列とＫＭ２０２０６８のタンパク質コード領域のＤＮＡ配列との同一性は９９．２％（６５７塩基中６５２塩基が一致）であった。ＫＭ２０２０６８は系統Ｔ０２１６５８由来であり、ＡＷＯＪ０１１８２７８１は品種Ｋ３２６由来であるので、この約１％の違い（６５７塩基中５塩基の違い）はタバコ系統／品種間の差異によるものと考えられた。ｅＩＦ４Ｅ２−Ｓ遺伝子とｅＩＦ４Ｅ２−Ｔ遺伝子のタンパク質コード領域におけるＤＮＡの配列同一性は９３．２％（６５７塩基中６１２塩基が一致）であった。またアミノ酸配列の同一性は８７．７％（２１９アミノ酸中１９２アミノ酸が一致）、類似性は９７．３％（２１９アミノ酸中２１３アミノ酸が一致または類似）であった。配列同一性等の解析には、核酸・アミノ酸配列解析ソフトGENETYX（登録商標）(ver.12)（ゼネティックス社）を用いた。
［ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子］
ＧｅｎｅＢａｎｋデータベースで検索を行い、アクセッション番号がＡＹ６９９６０９であるタバコ（N. tabacum）の翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４ＥのｍＲＮＡ塩基配列を取得し、配列番号７に示した。またこの遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号８に示した。ＧｅｎＢａｎｋデータベースのＷＧＳを用いたＢＬＡＳＴ解析から、このｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅは、N. sylvestris由来であることが判明したので、この遺伝子をｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｓと命名した。この配列をクエリにして、ＧｅｎＢａｎｋデータベースのN. tabacumのＷＧＳコンティグを検索した結果、タンパク質コード領域において１００％の配列同一性を示す、タバコ品種Ｋ３２６由来のゲノム配列が取得された（アクセッション番号はＡＷＯＪ０１４１２２８８）。この配列のうち、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｓ遺伝子部分の配列（ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｓ遺伝子のゲノム配列）を、配列番号９に示した。
また、N. tomentosiformis由来のゲノムにコードされているN. tabacumのｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｔとして、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号がＥＢ６８３５７６（配列番号１０に示した）、およびＦＮ６６６４３４の２つを同定した。前者はタバコ品種Ｋ３２６由来のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｔ遺伝子の配列、後者はタバコ品種Samsun NN由来のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｔ遺伝子の配列であり、両者の配列同一性は９７％であった。これら２つの遺伝子のコードするタンパク質のアミノ酸配列の同一性は９７％、類似性は９９％であった。この配列の違いは由来する品種間の差異によるものと考えられた。また、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｓ（ＡＹ６９９６０９）とｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｔ（ＥＢ６８３５７６）とのＤＮＡの配列同一性は９１％であった。さらに、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｓのアミノ酸配列（配列番号８）とｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｔのアミノ酸配列（配列番号１１）との同一性は９１％、類似性は９６％であった。ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｔ（ＥＢ６８３５７６）のｍＲＮＡ配列を用いて、ＧｅｎＢａｎｋデータベースのN. tabacumのＷＧＳコンティグを検索した結果、タンパク質コード領域において１００％の配列同一性を示す、タバコ品種Ｋ３２６由来のゲノム配列が取得された（アクセッション番号はＡＷＯＪ０１０５４５４２）。この配列のうち、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｔ遺伝子部分の配列（ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｔ遺伝子のゲノム配列）を、配列番号１２に示した。
（ＲＮＡｉコンストラクトの構築）
ｅＩＦ４Ｅ２ならびにｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの発現抑制タバコを作出するため、これら遺伝子の内部配列をトリガーとするＲＮＡｉコンストラクトを構築した。
ｅＩＦ４Ｅ２のトリガー配列（ＥＢ４５１７１７由来の３３９塩基、配列番号１３）ならびにｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅのトリガー配列（ＡＹ６９９６０９由来の３１３塩基、配列番号１４）を特異的に増幅するプライマーを作製した（表１）。それぞれの遺伝子のＦＷプライマーの５’末端には後述のクローニングに使用するためのＣＡＣＣ配列が付加されている。なおｅＩＦ４Ｅ２用のトリガーおよびｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ用のトリガーは共にＳ型の遺伝子の配列を基に設計したが、これらのトリガー配列はそれぞれの遺伝子のＴ型に対して９０％以上の配列同一性を有しているので、Ｓ型の遺伝子およびＴ型の遺伝子両方の遺伝子の転写物の量を減少させる効果があることと考えた。
Figure 2018038249
ＭａｇＤＥＡ（登録商標）ＲＮＡ１００（ＧＣ）（Precision System Science社）を使用して、タバコ幼苗からＲＮＡを抽出し、精製した。次いで、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社）を使用して、精製したＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡを鋳型にして、表１に示す遺伝子特異的プライマーを用いて、ｅＩＦ４Ｅ２およびｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの遺伝子断片を増幅した。具体的には、２０μＬの反応液の中に鋳型ＤＮＡを１０ｎｇ、プライマーを各５ｐｍｏｌｅｓ含み、酵素はＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社）を使用し、１サイクル：９８℃ １０秒、５５℃ １５秒、７２℃ １５秒の反応を３５回行った。ＰＣＲ産物（ｅＩＦ４Ｅ２は約３２０ｂｐ、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅは約３１０ｂｐ）を、ＭｉｎｉＥｌｕｔｅ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Qiagen社）を用いて精製した後、ベクターｐＥＮＴＲＴＭ／Ｄ−ＴＯＰＯ（登録商標）（LifeTechnologies社）にクローニングした。インサートの塩基配列を確認した後、Ｇａｔｅ
Ｗａｙ（登録商標） ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ（登録商標）ＩＩ Ｅｎｚｙｍｅ ｍｉｘ（Life Technologies社）を用いて、ＲＮＡｉベクターｐＳＰ２３１（文献：国際公開第２０１１／１０２３９４号公報を参照）にインサートをクローニングした。ｐＳＰ２３１は、ｐＨｅｌｌｓｇａｔｅ １２（文献：Wesley et al., 2001, Plant J., 27, 581-590参照）のＳａｃＩ部位にＧＦＰ（Green-fluorescent protein遺伝子）発現カセットを挿入したベクターであり、トリガー配列の逆位反復配列がｐｄｋ／ｃａｔイントロンを挟む型のＲＮＡｉ配列を、カリフラワーモザイクウイルス３５ＳＲＮＡ遺伝子プロモーターでドライブする形のバイナリーベクターである。ｐＳＰ２３１へのクローニング後、ＲＮＡｉトリガー配列とその向きを確認し、最終的なＲＮＡｉコンストラクトとした。
作製したＲＮＡｉコンストラクトを、アグロバクテリウムＬＢＡ４４０４株にエレクトロポレーション法により導入した。
（タバコ形質転換）
タバコの形質転換は常法（リーフディスク法）で行った。タバコ品種として、Petit HavanaＳＲ１、およびＴＮ９０を用いた。ＳＲ１はＰＶＹおよびＰＶＹ−Ｂ感受性の品種であり、ＴＮ９０はｅＩＦ４Ｅ２−Ｓ遺伝子が欠失したＰＶＹ抵抗性（ＰＶＹ−Ｂ感受性）の品種である。
タバコ子葉の四隅をカットし、カットされた葉をアグロバクテリウム溶液に１０分間浸漬させた。余分な液を拭ってから葉をＬＳ固形培地（３％ショ糖、０．８％寒天を含む）上に置いた。２５℃、３日間、暗黒下で培養することで、組換えアグロバクテリムをタバコに感染させ、各翻訳開始因子のＲＮＡｉコンストラクトをＳＲ１に導入した。また翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４ＥのＲＮＡｉコンストラクトをＴＮ９０に導入した。葉切片を、２５０ｍｇ／ＬのＣｅｆｏｔａｘｉｍｅと、植物ホルモンである２−イソペンテニルアデニン（２ｉＰ）（１０ｍｇ／Ｌ）およびＩＡＡ（０．３ｍｇ／Ｌ）とを含むＬＳ固形培地上に４日間置いて、アグロバクテリウムを除菌した。組換え体の選抜は、上記の濃度でＣｅｆｏｔａｘｉｍｅおよび植物ホルモンを含むＬＳ培地にさらに５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含んだ培地上で行った。選抜された組換え体から再分化したシュートを発根培地（１．５％ショ糖、０．３％ゲランガム、ならびに上記濃度のＣｅｆｏｔａｘｉｍｅおよびカナマイシンを含むＬＳ固形培地）に置いて発根させた。得られた組換えタバコを温室で育成した。
（形質転換当代の組換えタバコにおける翻訳開始因子の転写解析）
組換えタバコについて、ｅＩＦ４Ｅ２またはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の発現を調査するため、各遺伝子の塩基配列に基づき、リアルタイムＰＣＲ用のプライマー／プローブを設計した（表２）。また各組換えタバコの葉よりＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（QIAGEN社）を用いて総ＲＮＡを抽出した。得られたＲＮＡからＰｒｉｍｅ Ｓｃｒｉｐｔ ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社）を用いてｃＤＮＡを合成し、リアルタイムＰＣＲの鋳型とした。リアルタイムＰＣＲではＴａｑＭａｎ Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（Life technologies社）を用いて増幅反応を行った。反応条件は５０℃ ２分間、９５℃ ２０秒間の後、９５℃ １秒、６０℃２０秒のサイクルを４０回とした。発現解析はＳｔｅｐＯｎｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ２．２（Life technologies社）を用いた。ＰＣＲの内部標準としてelongation factor1-alpha（ＥＦ１−α）遺伝子を使用し、この遺伝子の発現量との比較で、標的遺伝子の相対的な遺伝子発現量を算出した。対照として非組換えタバコ（ＳＲ１およびＴＮ９０）を用いた。
Figure 2018038249
タバコ品種ＳＲ１にｅＩＦ４Ｅ２のＲＮＡｉコンストラクトを導入した組換えタバコのｅＩＦ４Ｅ２遺伝子の転写物の量、およびｅＩＦ（ｉｓｏ）４ＥのＲＮＡｉコンストラクトを導入した組換えタバコのｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の転写物の量を測定した。ｅＩＦ４Ｅ２においては、対照品種ＳＲ１の１０％以下の発現量を示した３系統：４Ｅ２＃３、４Ｅ２＃４、および４Ｅ２＃５を得た。またｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅにおいては、対照品種ＳＲ１の５％程度の発現量を示した３系統：ｉｓｏ４Ｅ＃１、ｉｓｏ４Ｅ＃７、およびｉｓｏ４Ｅ＃１５を得た。また、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４ＥのＲＮＡｉコンストラクトを導入したＴＮ９０のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の転写物の量を測定した結果を図１に示した。形質転換当代で転写抑制度合が高かった系統として、＃８（対照品種ＴＮ９０の６％の発現量）を選び、転写抑制されていなかった対照系統として、＃２７（ＴＮ９０と同等の発現量）を選んだ。
（形質転換次世代の組換えタバコの分離）
形質転換当代で転写抑制度合が高かった形質転換ＳＲ１タバコ、すなわちｅＩＦ４Ｅ２発現抑制の３系統、およびｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ発現抑制の３系統の自殖種子、また形質転換当代でｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの転写抑制度合が高かった形質転換ＴＮ９０の＃８、および転写抑制がなかった＃２７の自殖種子を、ＬＳ固形培地（３％ショ糖、０．８％寒天を含む）上に無菌的に播種した。発芽、生育した幼植物体のＧＦＰ蛍光をＦｌｕｏｒ Ｉｍａｇｅｒ ５９５（Molecular Dynamics社）を用いて測定した。上述の通り、コンストラクト導入に用いているｐＳＰ２３１には、Ｔ−ＤＮＡ領域上のＲＮＡｉ発現カセットの隣に、３５Ｓプロモーター−ＧＦＰ発現カセットが配置されている。幼植物体において、強いＧＦＰ蛍光を発するものをＲＮＡｉコンストラクトについてホモ接合系統、全く蛍光を発しないものをＲＮＡｉコンストラクトについてヌル分離系統（ＲＮＡｉコンストラクトが存在しない）、弱い蛍光を発するものをＲＮＡｉコンストラクトについてヘミ接合系統と判断した。こうして、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ発現抑制系統ＴＮ９０＃８のホモ接合系統を得た。なおＴＮ９０＃２７は蛍光が検出されなかったためヌル系統と判断された。播種後３週の植物を温室に移し、培土に植え替え、育成した。
（形質転換次世代の組換えタバコにおける翻訳開始因子の転写解析）
各組換えタバコ系統の次世代におけるｅＩＦ４Ｅ２ならびにｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の発現を調査するため、上述のようにして組換えタバコの葉よりＲＮＡを抽出してｃＤＮＡを合成し、リアルタイムＰＣＲの鋳型とした。リアルタイムＰＣＲも上述の通り実施し、内部標準としてＥＦ１−α遺伝子を用い、対照植物として非組換えタバコを用いた。なおプライマーおよびプローブは、ｅＩＦ４Ｅ２、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４ＥともにＳ型遺伝子用のものを用いた。
リアルタイムＰＣＲによるｅＩＦ４Ｅ２およびｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの遺伝子発現解析の結果を図２に示した。ＳＲ１の場合、ｅＩＦ４Ｅ２発現抑制系統＃３、＃４、および＃５は、それぞれ非組換え系統（ＳＲ１）の１５％、５％、７％程度にまで発現が抑制されていたことが確認された。一方、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ発現抑制系統＃１、＃７、および＃１５は、それぞれ非組換え系統（ＳＲ１）の９％、５％、６％程度にまで発現が抑制されていたことが確認された。
ｅＩＦ４Ｅ２遺伝子についてホモ接合体と判断されたＲＮＡｉ組換えタバコ（ＳＲ１）と、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子についてホモ接合体と判断されたＲＮＡｉ組換えタバコ（ＳＲ１）とを交配し、ｅＩＦ４Ｅ２遺伝子のＲＮＡｉコンストラクトおよびｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子のＲＮＡｉコンストラクトの両方を有する組み換えタバコ（ＳＲ１）を作出した。
（複数の翻訳開始因子の転写が抑制された組換えタバコ植物のウイルス接種試験）
ウイルス接種試験には、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子のＲＮＡｉコンストラクトを有するタバコＴＮ９０＃８ホモ接合系統を用いた。なお、上記した通り、ＴＮ９０は元々ｅＩＦ４Ｅ２−Ｓ遺伝子が欠失している品種である。また、対照として、栽培品種ＴＮ９０、つくば１号、ならびにｅＩＦ（ｉｓｏ）４ＥのＳ型およびＴ型遺伝子の両方の機能が破壊された変異体（以下、「ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ変異体」と称する）を用いた。ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ変異体はタバコ種子をＥＭＳ処理することで得られた変異体であり、配列番号９に示すｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｓ遺伝子の３３０番目のＣがＴに変異しており、さらに、配列番号１２に示すｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｔ遺伝子の２９９番目のＧがＡに変異している。これらの変異は何れもナンセンス変異である（当該変異体の詳細は特許文献５に記載）。
培土への移植後１０日の植物体に、ＰＶＹ（ＰＶＹ−Ｎ）、ＰＶＹ−Ｂ、またはＴＢＴＶを接種した。ＰＶＹ−Ｂは日本たばこ産業株式会社葉たばこ研究所で分離されたウイルス系統で、ＰＶＹ抵抗性であるタバコ既存品種Ｖｉｒｇｉｎ Ａ ｍｕｔａｎｔ（ＶＡＭ）に壊疽症状を発生させるVAM breaking系統である。ＴＢＴＶは、Umbravirus属のウイルスで、タバコの葉にモットリング症状を引き起こす。接種源には、各ウイルスが感染し発病した黄色種品種つくば１号（ＰＶＹおよびＴＢＴＶの場合）もしくはＶＡＭ（ＰＶＹ−Ｂの場合）の罹病葉を使用した。つくば１号は、ＰＶＹ、ＰＶＹ−Ｂ、およびＴＢＴＶに罹病性の品種であり、接種により明瞭な病徴を示す。採種した罹病葉を乳鉢中で０．０１Ｎリン酸緩衝液とともに磨砕した。その磨砕液を移植１週間後のタバコ苗の最大葉（下から４枚目または５枚目）の半葉にカーボランダムを用いて塗抹接種した。その後、温室内で栽培し、病徴を観察した。
ＰＶＹの接種結果、ＰＶＹ−Ｂの接種結果およびＴＢＴＶの接種結果を、それぞれ表３、４および５に示す。なお、各表中、遺伝子のＳ型およびＴ型を示す「Ｓ」および「Ｔ」において、大文字は変異なしを表しており、小文字は変異（または発現抑制）ありを表している。
表３に示す通り、ＰＶＹの接種試験において、対照のつくば１号、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ変異体では、それぞれ接種８日後、１５日後には全ての個体で、発病が見られた。また従来のＰＶＹ抵抗性品種ＴＮ９０においても、接種１５日後には１/４以上の個体で、接種３０日後では半数以上の個体で病徴が観察された。一方、ｅＩＦ４Ｅ２−ＳおよびｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの機能が抑制されたタバコＴＮ９０＃８では、接種１５日後では病徴は全く観察されず、接種３０日後でも病徴は１５個体中１個体のみで観察されるに留まった。このことから、ｅＩＦ４Ｅ２−ＳおよびｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの機能が抑制されたタバコＴＮ９０＃８では、従来のＰＶＹ抵抗性品種よりも強い抵抗性を発現することが明らかとなった。
また、表４に示す通り、ＰＶＹ−Ｂの接種試験において、対照のＴＮ９０およびつくば１号では、それぞれ接種８日後、１５日後にはほぼ全ての個体で、発病が見られた。また従来のＰＶＹ−Ｂ抵抗性タバコであるｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ変異体においても、接種１５日後には１４個体中２個体で、接種３０日後では８割近くの個体で病徴が観察された。一方、ｅＩＦ４Ｅ２−ＳおよびｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの機能が抑制されたタバコＴＮ９０＃８では、１５個体中、接種８日後で１個体、接種１５日後で２個体において病徴が見られたが、接種３０日後でも病徴は２個体（１３．３％）のままだった。このことから、ｅＩＦ４Ｅ２−ＳおよびｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの機能が抑制されたタバコＴＮ９０＃８では、従来のＰＶＹ−Ｂ抵抗性系統よりも強い抵抗性を発現することが明らかとなった。
また、表５に示す通り、ＴＢＴＶの接種試験において、ｅＩＦ４Ｅ２−ＳおよびｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの機能が抑制されたタバコＴＮ９０＃８では、対照のＴＮ９０およびつくば１号に比べて明らかに発病程度が低かった。
Figure 2018038249
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以上のことから、ｅＩＦ４Ｅ２−Ｓ遺伝子に加え、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｓ遺伝子およびｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｔ遺伝子両方の転写を抑制することで、ＰＶＹ、ＰＶＹ−Ｂ、およびＴＢＴＶの３つのウイルス全てに対して抵抗性となることが明らかとなった。さらに、驚くべきことにＰＶＹおよびＰＶＹ−Ｂについては、従来の抵抗性系統よりも抵抗性が増強されることが明らかとなった。
〔実施例２〕
（ｅＩＦ４Ｅ２−Ｓ遺伝子、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｓ遺伝子およびｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｔ遺伝子に変異のあるタバコ変異体の選抜）
ｅＩＦ４Ｅ２−Ｓ遺伝子の機能が抑制されたタバコとして、品種ＴＮ９０を用いた。また、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｓ遺伝子およびｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｔの遺伝子の両方の機能が抑制されたタバコとして、実施例１におけるｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ変異体を用いた。本変異体は、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｓ遺伝子およびｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｔ遺伝子の両遺伝子についてホモ接合で変異（ナンセンス変異）が入っており、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｓ遺伝子およびｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｔ遺伝子の両遺伝子の転写が抑制されている（特許文献５）。なお、各個体におけるｅＩＦ４Ｅ２遺伝子およびｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の遺伝子型について、eIF4E2-SSTT/eIF（iso）4E-SSTTのように表記する。例えば、ＴＮ９０の遺伝子型はeIF4E2-ssTT/eIF（iso）4E-SSTTであり、上記のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ変異体はeIF4E2-SSTT/eIF（iso）4E-ssttである。
eIF4E2-ssTT/eIF（iso）4E-ssttおよび対照となるeIF4E2-ssTT/eIF（iso）4E-SSTT系統は以下の通り育成した。まず、ＴＮ９０とｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ変異体を交配してＦ１を得た後、Ｆ１に再度ＴＮ９０を交配してＢＣ１Ｆ１を得た。ＢＣ１Ｆ１の播種後、各個体からＤＮＡを抽出し、ｅＩＦ４Ｅ２−Ｓ遺伝子の欠失の有無を判別する優性のSCARマーカー（表６）およびｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｓ遺伝子およびｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｔ遺伝子における多型を判別するdCAPSマーカー（詳細は特許文献５に記載、配列は下記表７に記載）を用いて、遺伝子型がeIF4E2-ssTT/eIF（iso）4E-SsTtの個体を選抜した。続いて、選抜個体の自殖種子（ＢＣ１Ｆ２）を播種し、ＢＣ１Ｆ１と同様のdCAPSマーカー解析により遺伝子型がeIF4E2-ssTT/eIF（iso）4E-ssttの個体およびeIF4E2-ssTT/eIF（iso）4E-SSTTの個体を選抜した。選抜個体を自殖させ、当該遺伝子型を示す系統の種子を増殖した。
Figure 2018038249
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個体選抜を行う際のＤＮＡ抽出は以下のように行った。タバコ葉サンプル（１ｃｍ×１ｃｍ）を２ｍＬチューブに入れ、４００μＬの抽出液（組成は、２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），２５０ｍＭ ＮａＣｌ，２５ｍＭ ＥＤＴＡ，０．５％ ＳＤＳ）および２００μＬのＰｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を加えた後、メタルコーンを加えて破砕し、１３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清３００μＬを新しい１．５ｍＬチューブに移し、８００μＬの１００％エタノールを加えて転倒混和した。１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、上清を完全に取り除いた。ペレットが乾燥したことを確認した後、ＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１ｍＭ ＥＤＴＡ）を５０μＬ加えた。
ｅＩＦ４Ｅ２−Ｓ遺伝子の多型は、当該遺伝子内に設計したプライマー（表６）を用いてＰＣＲを行い、増幅の有無を電気泳動で確認することで判別した。タバコゲノムＤＮＡ５ｎｇを使用し、1０μＬの反応系でＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応に必要な酵素および試薬類は、ＱＩＡＧＥＮ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いた。反応は、９４℃を３０秒、５８℃を３０秒および７２℃を４５秒のサイクルを、９５℃で１５分の後に３８回行い、最後に７２℃で９０秒伸長させた。電気泳動の結果、正常なｅＩＦ４Ｅ２−Ｓ遺伝子を有するサンプルでは、４７５ｂｐの断片に相当するバンドが確認された一方で、ＴＮ９０のようにｅＩＦ４Ｅ２−Ｓ遺伝子が欠失しているサンプルではバンドが確認されなかったことから、バンドの有無によってｅＩＦ４Ｅ２−Ｓ遺伝子の欠失を判別できることが確認された。
ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｓ遺伝子およびｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｔ遺伝子における多型を判別するために、dCAPSマーカーを用いた。Tks GflexTM DNA Polymeraseを用いて１ｓｔ ＰＣＲを行った。ゲノムＤＮＡ約５ｎｇを鋳型とし、プライマー濃度は１μＭとなるように調製し、バッファーは酵素に添付されたものを用いた。ＰＣＲは、９４℃ １分を１回、９８℃ １０秒、６０℃ １５秒、および６８℃ ３０秒のサイクルを３０回、６８℃ ９０秒を１回行った。その後、１ｓｔ ＰＣＲの産物を１００倍に希釈し、１μＬを鋳型としてTaKaRa TaqTMで２ｎｄＰＣＲを行った。１ｓｔ ＰＣＲと同様に、プライマー濃度は１μＭとなるように調製し、バッファーは酵素に添付されたものを用いた。ＰＣＲは、９４℃ ２分を１回、９４℃ ３０秒、５２℃ ３０秒、および７２℃ ３０秒のサイクルを４０回、７２℃ ９０秒を１回行った。ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｓ遺伝子の２ｎｄＰＣＲ産物は、Nla III（New England Biolabs社）で処理した。ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｔ遺伝子の２ｎｄＰＣＲ産物は、Mbo I（タカラバイオ社）で処理した。ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ＿Ｓプライマーで増幅した産物を制限酵素処理した場合に、切断が見られないサンプルの遺伝子型はｓｓと判断でき、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ＿Ｔプライマーで増幅した産物を制限酵素処理した場合に、切断が見られないサンプルの遺伝子型はｔｔと判断できた。例えば、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ＿Ｓプライマーで増幅した産物に切断が生じず且つｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ＿Ｔプライマーで増幅した産物に切断が生じたサンプルの遺伝子型はｓｓＴＴであり、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ＿Ｓプライマーで増幅した産物に切断が生じ且つｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ＿Ｔプライマーで増幅した産物に切断が生じないサンプルの遺伝子型はＳＳｔｔであり、両プライマーで増幅した産物でともに切断が生じたサンプルの遺伝子型はＳＳＴＴであり、両プライマーで増幅した産物でともに切断が生じないサンプルの遺伝子型はｓｓｔｔであり、両プライマーで増幅した産物でともに切断が生じたものと生じないものとが現れるサンプルの遺伝子型はＳｓＴｔであると容易に判断が可能であった。
続いて、eIF4E2-ssTT/eIF（iso）4E-SSttおよびeIF4E2-ssTT/eIF（iso）4E-ssTTの育成および選抜方法を以下に示す。上述のＢＣ１Ｆ１世代において選抜したeIF4E2-ssTT/eIF（iso）4E-SsTtに対してＴＮ９０を交配し、ＢＣ２Ｆ１を得た。ＢＣ２Ｆ１世代を播種し、ＢＣ１Ｆ１と同様のdCAPSマーカー解析により、遺伝子型がeIF4E2-ssTT/eIF（iso）4E-SsTtの個体を選抜した。選抜したＢＣ２Ｆ１個体を自殖し、ＢＣ２Ｆ２を得た。このＢＣ２Ｆ２系統において、遺伝子型がeIF4E2-ssTT/eIF（iso）4E-SSttおよびeIF4E2-ssTT/eIF（iso）4E-ssTTを示す個体を選抜した。
（ｅＩＦ４Ｅ２／ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタバコ二重変異体へのウイルス接種試験）
培土への移植後２週間の個体に、ＰＶＹ、またはＰＶＹ−Ｂを接種した。ウイルス接種源の作製およびタバコへの接種方法は、上述の実施例１と同様の方法で実施した。接種後、温室内で栽培し、適宜病徴を観察した。ｅＩＦ４Ｅ２とｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ二重機能欠損変異体タバコのウイルス接種試験結果を表８および表９に示す。
表８に示す通り、ＰＶＹの接種試験において、対照のつくば１号、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４ＥのＳおよびＴの両方に変異を有する変異体（eIF(iso)4E-S&T変異体）、およびｅＩＦ（ｉｓｏ）４ＥのＴに変異を有する変異体（eIF(iso)4E-T変異体）では、接種１０日後には全ての個体で、壊疽症状が見られた。また従来のＰＶＹ抵抗性品種ＴＮ９０においては、接種１９日後には半数以上の個体で病徴が観察され、eIF4E2-S変異体（二重変異体の対照）においても接種２８日後では４０％の個体で病徴が見られた。一方、ｅＩＦ４Ｅ２−Ｓおよび少なくともｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｔの両方の機能が抑制された二重変異体（eIF4E2-S/eIF(iso)4E-S&T二重変異体およびeIF4E2-S/eIF(iso)4E-T二重変異体）では、接種２８日後でも病徴は全く観察されなかった。このことから、ｅＩＦ４Ｅ２−Ｓおよび少なくともｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｔの二重変異体は、従来のＰＶＹ抵抗性品種よりも強い抵抗性を発現することが明らかとなった。
また、表９に示す通り、ＰＶＹ−Ｂの接種試験において、対照のＴＮ９０、つくば１号およびｅＩＦ４Ｅ２のＳに変異を有する変異体（eIF4E2-S変異体：二重変異体の対照）では、それぞれ接種７日後には全ての個体で発病が見られた。また、ＰＶＹ−Ｂ抵抗性タバコであるｅＩＦ（ｉｓｏ）４ＥのＳおよびＴの両方に変異を有する変異体（eIF(iso)4E-S&T変異体）では、接種１９日後には１５個体中３個体で、接種２８日後では１５個体中５個体で病徴が観察された。ｅＩＦ（ｉｓｏ）４ＥのＴに変異を有する変異体（eIF(iso)4E-T変異体）では、接種７日後には１０個体中２個体でのみ病徴が観察されるに留まったが、接種１０日後には１０個体中５個体で、接種１９日後では全個体で病徴が観察された。一方、ｅＩＦ４Ｅ２−Ｓおよび少なくともｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｔの両方の機能が抑制された二重変異体（eIF4E2-S/eIF(iso)4E-S&T二重変異体およびeIF4E2-S/eIF(iso)4E-T二重変異体）では、接種２８日後でも病徴は全く観察されなかった。またｅＩＦ４Ｅ２とｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の転写がともにＲＮＡｉによって抑制された組換え体においても、接種２８日後でも病徴は全く観察されなかった。これらのことから、ｅＩＦ４Ｅ２およびｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの異なる２種類の遺伝子の機能を抑制することで、従来のＰＶＹ-Ｂ抵抗性品種よりも強い抵抗性を発現することが明らかとなった。
Figure 2018038249
Figure 2018038249
以上のことから、ｅＩＦ４Ｅ２−Ｓ遺伝子に加え、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｔ遺伝子の転写を抑制することで、また、ｅＩＦ４Ｅ２−Ｓ遺伝子に加え、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｓ遺伝子およびｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｔ遺伝子両方の転写を抑制することで、ＰＶＹおよびＰＶＹ−Ｂに対する抵抗性程度が、従来の抵抗性系統よりも増強されることが明らかとなった。
本発明は、タバコの育種に利用することができる。

Claims (28)

  1. ウイルスに対して非機能的な翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質を生産するか、または翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の発現が抑制されており、
    さらに、ウイルスに対して非機能的な翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２タンパク質を生産するか、または翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２遺伝子の発現が抑制されており、
    上記翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅは、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−ＳおよびｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｔの少なくとも一方であり、
    上記翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２は、ｅＩＦ４Ｅ２−ＳおよびｅＩＦ４Ｅ２−Ｔの少なくとも一方であることを特徴とする、ウイルス抵抗性タバコ。
  2. 上記翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子に変異を有しており、それによって、ウイルスに対して非機能的な上記翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質を生産するか、または上記翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の発現が抑制されていることを特徴とする、請求項１に記載のウイルス抵抗性タバコ。
  3. 上記翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２遺伝子に変異を有しており、それによって、ウイルスに対して非機能的な上記翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２タンパク質を生産するか、または上記翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２遺伝子の発現が抑制されていることを特徴とする、請求項１または２に記載のウイルス抵抗性タバコ。
  4. 上記変異はナンセンス変異であることを特徴とする、請求項２または３に記載のウイルス抵抗性タバコ。
  5. 上記翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子における上記変異は、
    （ａ１）配列番号８に示すアミノ酸配列からなる翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｓタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｓ遺伝子のエキソン、もしくは
    （ａ２）配列番号８に示すアミノ酸配列と９２％以上の配列同一性を有する機能的な翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｓタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｓ遺伝子のエキソン、
    におけるナンセンス変異である、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｓ遺伝子における変異；または
    （ｂ１）配列番号１１に示すアミノ酸配列からなる翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｔタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｔ遺伝子のエキソン、もしくは
    （ｂ２）配列番号１１に示すアミノ酸配列と９２％以上の配列同一性を有する機能的な翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｔタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｔ遺伝子のエキソン、
    におけるナンセンス変異である、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｔ遺伝子における変異；または
    ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｓ遺伝子における上記変異およびｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｔ遺伝子における上記変異の両方；
    であることを特徴とする、請求項２に記載のウイルス抵抗性タバコ。
  6. 上記翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２遺伝子における上記変異は、
    （ｃ１）配列番号２に示すアミノ酸配列からなる翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２−Ｓタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２−Ｓ遺伝子のエキソン、もしくは
    （ｃ２）配列番号２に示すアミノ酸配列と８８％以上の配列同一性を有する機能的な翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２−Ｓタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２−Ｓ遺伝子のエキソン、
    におけるナンセンス変異である、ｅＩＦ４Ｅ２−Ｓ遺伝子における変異；または
    （ｄ１）配列番号５に示すアミノ酸配列からなる翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２−Ｔタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２−Ｔ遺伝子のエキソン、もしくは
    （ｄ２）配列番号５に示すアミノ酸配列と８８％以上の配列同一性を有する機能的な翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２−Ｔタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２−Ｔ遺伝子のエキソン、
    におけるナンセンス変異である、ｅＩＦ４Ｅ２−Ｔ遺伝子における変異；または
    ｅＩＦ４Ｅ２−Ｓ遺伝子における上記変異およびｅＩＦ４Ｅ２−Ｔ遺伝子における上記変異の両方；
    であることを特徴とする、請求項３に記載のウイルス抵抗性タバコ。
  7. 上記ナンセンス変異が、下記（１）〜（４）に示す１つ以上の変異であることを特徴とする、請求項４〜６の何れか一項に記載のウイルス抵抗性タバコ：
    （１）コドンＣＡＡのＣがＴに置換、（２）コドンＣＧＡのＣがＴに置換、（３）コドンＣＡＧのＣがＴに置換、（４）コドンＴＧＧのＧ（２つのＧのうちの何れか一方または両方）がＡに置換。
  8. 上記翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２遺伝子における上記変異は、ｅＩＦ４Ｅ２−Ｓ遺伝子における変異を含むことを特徴とする、請求項３または６に記載のウイルス抵抗性タバコ。
  9. 上記翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子における上記変異は、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｔ遺伝子における変異を含むことを特徴とする、請求項２または５に記載のウイルス抵抗性タバコ。
  10. 上記ウイルスは、Potyvirus属のウイルスであることを特徴とする、請求項１〜９の何れか一項に記載のウイルス抵抗性タバコ。
  11. 上記Potyvirus属のウイルスは、Potato virus Yの一系統であって、タバコのVirgin A mutantのウイルス抵抗性を打破する系統、およびPotato virus Yの少なくとも一方であることを特徴とする、請求項１０に記載のウイルス抵抗性タバコ。
  12. さらにUmbravirus属のウイルスに対して抵抗性を有することを特徴とする、請求項１０または１１に記載のウイルス抵抗性タバコ。
  13. 上記Umbravirus属のウイルスは、Tobacco bushy top virusであることを特徴とする、請求項１２に記載のウイルス抵抗性タバコ。
  14. ウイルスに対して非機能的な翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質を生産するか、またはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の発現を抑制する変異をｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子に導入すること、および
    ウイルスに対して非機能的な翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２タンパク質を生産するか、またはｅＩＦ４Ｅ２遺伝子の発現を抑制する変異をｅＩＦ４Ｅ２遺伝子に導入することによって、ウイルスに対して抵抗性を有するタバコを作出することを含み、
    上記翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅは、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−ＳおよびｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｔの少なくとも一方であり、
    上記翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２は、ｅＩＦ４Ｅ２−ＳおよびｅＩＦ４Ｅ２−Ｔの少なくとも一方であることを特徴とする、ウイルス抵抗性タバコ作出方法。
  15. 上記変異はナンセンス変異であることを特徴とする、請求項１４に記載のウイルス抵抗性タバコ作出方法。
  16. エチルメタンスルホン酸によって上記変異を生じさせることを特徴とする、請求項１４または１５に記載のウイルス抵抗性タバコ作出方法。
  17. 上記翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子における変異は、
    （ａ１）配列番号８に示すアミノ酸配列からなる翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｓタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｓ遺伝子のエキソン、もしくは
    （ａ２）配列番号８に示すアミノ酸配列と９２％以上の配列同一性を有する機能的な翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｓタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｓ遺伝子のエキソン、
    におけるナンセンス変異である、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｓ遺伝子における変異；または
    （ｂ１）配列番号１１に示すアミノ酸配列からなる翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｔタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｔ遺伝子のエキソン、もしくは
    （ｂ２）配列番号１１に示すアミノ酸配列と９２％以上の配列同一性を有する機能的な翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｔタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｔ遺伝子のエキソン、
    におけるナンセンス変異である、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｔ遺伝子における変異；または
    ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｓ遺伝子における上記変異およびｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｔ遺伝子における上記変異の両方；
    であることを特徴とする、請求項１４〜１６の何れか一項に記載のウイルス抵抗性タバコ作出方法。
  18. 上記翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２遺伝子における変異は、
    （ｃ１）配列番号２に示すアミノ酸配列からなる翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２−Ｓタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２−Ｓ遺伝子のエキソン、もしくは
    （ｃ２）配列番号２に示すアミノ酸配列と８８％以上の配列同一性を有する機能的な翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２−Ｓタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２−Ｓ遺伝子のエキソン、
    におけるナンセンス変異である、ｅＩＦ４Ｅ２−Ｓ遺伝子における変異；または
    （ｄ１）配列番号５に示すアミノ酸配列からなる翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２−Ｔタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２−Ｔ遺伝子のエキソン、もしくは
    （ｄ２）配列番号５に示すアミノ酸配列と８８％以上の配列同一性を有する機能的な翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２−Ｔタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２−Ｔ遺伝子のエキソン、
    におけるナンセンス変異である、ｅＩＦ４Ｅ２−Ｔ遺伝子における変異；または
    ｅＩＦ４Ｅ２−Ｓ遺伝子における上記変異およびｅＩＦ４Ｅ２−Ｔ遺伝子における上記変異の両方；
    であることを特徴とする、請求項１４〜１７の何れか一項に記載のウイルス抵抗性タバコ作出方法。
  19. 上記ナンセンス変異が、下記（１）〜（４）に示す１つ以上の変異であることを特徴とする、請求項１７または１８に記載のウイルス抵抗性タバコ作出方法：
    （１）コドンＣＡＡのＣがＴに置換、（２）コドンＣＧＡのＣがＴに置換、（３）コドンＣＡＧのＣがＴに置換、（４）コドンＴＧＧのＧ（２つのＧのうちの何れか一方または両方）がＡに置換。
  20. 翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の発現量を野生型と比較して少なくさせる因子を導入すること、および
    翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２遺伝子の発現量を野生型と比較して少なくさせる因子を導入することによって、ウイルスに対して抵抗性を有するタバコを作出することを含み、
    上記翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅは、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−ＳおよびｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ−Ｔの少なくとも一方であり、
    上記翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２は、ｅＩＦ４Ｅ２−ＳおよびｅＩＦ４Ｅ２−Ｔの少なくとも一方であることを特徴とする、ウイルス抵抗性タバコ作出方法。
  21. 上記ウイルスは、Potyvirus属のウイルスであることを特徴とする、請求項１４〜２０の何れか一項に記載のウイルス抵抗性タバコ作出方法。
  22. 上記Potyvirus属のウイルスは、Potato virus Yの一系統であって、タバコのVirgin A mutantのウイルス抵抗性を打破する系統、およびPotato virus Yの少なくとも一方であることを特徴とする、請求項２１に記載のウイルス抵抗性タバコ作出方法。
  23. 請求項１４〜２２の何れか一項に記載のウイルス抵抗性タバコ作出方法において作出されたウイルス抵抗性タバコまたはその後代を自家受粉または他家受粉させることを特徴とする、ウイルス抵抗性タバコの育種後代の作出方法。
  24. タバコの翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２遺伝子における変異を検出するためのポリヌクレオチドであって、当該変異は、ウイルスに対して非機能的なｅＩＦ４Ｅ２タンパク質を生産するか、またはｅＩＦ４Ｅ２遺伝子の発現を抑制する変異である、第一の検出用ポリヌクレオチドと、
    タバコの翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子における変異を検出するためのポリヌクレオチドであって、当該変異は、ウイルスに対して非機能的なｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質を生産するか、またはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の発現を抑制する変異である、第二の検出用ポリヌクレオチドと、を含む、検出用ポリヌクレオチドの組み合わせ物。
  25. タバコにおいて、ゲノムＤＮＡにおける上記変異の有無を、請求項２４に記載の検出用ポリヌクレオチドの組み合わせ物を利用して検査する検査工程と、
    上記検査工程において上記変異が検出されたタバコをウイルス抵抗性タバコとして選抜する選抜工程とを含むことを特徴とする、ウイルス抵抗性タバコ選抜方法。
  26. 翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅ２遺伝子における変異を含む連続した塩基配列またはその相補配列からなるポリヌクレオチドを含んでおり、当該変異は、ウイルスに対して非機能的なｅＩＦ４Ｅ２タンパク質を生産するか、またはｅＩＦ４Ｅ２遺伝子の発現を抑制する変異である、第一の判定用ＤＮＡマーカーと、
    翻訳開始因子ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子における変異を含む連続した塩基配列またはその相補配列からなるポリヌクレオチドを含んでおり、当該変異は、ウイルスに対して非機能的なｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質を生産するか、またはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の発現を抑制する変異である、第二の判定用ＤＮＡマーカーと、を含む、ウイルスに対するタバコの抵抗性の判定用ＤＮＡマーカー。
  27. 請求項１〜１３の何れか一項に記載のウイルス抵抗性タバコの葉たばこ。
  28. 請求項２７に記載の葉たばこを原料として含むことを特徴とする、たばこ製品。
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