JPWO2018038249A1 - ウイルス抵抗性タバコおよびその作出方法 - Google Patents
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Abstract
Description
ウイルスに対して非機能的な翻訳開始因子eIF4E2タンパク質を生産するか、またはeIF4E2遺伝子の発現を抑制する変異をeIF4E2遺伝子に導入することによって、ウイルスに対して抵抗性を有するタバコを作出することを含み、
上記翻訳開始因子eIF(iso)4Eは、eIF(iso)4E−SおよびeIF(iso)4E−Tの少なくとも一方であり、
上記翻訳開始因子eIF4E2は、eIF4E2−SおよびeIF4E2−Tの少なくとも一方である。
翻訳開始因子eIF4E2遺伝子の発現量を野生型と比較して少なくさせる因子を導入することによって、ウイルスに対して抵抗性を有するタバコを作出することを含み、
上記翻訳開始因子eIF(iso)4Eは、eIF(iso)4E−SおよびeIF(iso)4E−Tの少なくとも一方であり、
上記翻訳開始因子eIF4E2は、eIF4E2−SおよびeIF4E2−Tの少なくとも一方である。
翻訳開始因子eIF(iso)4E遺伝子における変異を含む連続した塩基配列またはその相補配列からなるポリヌクレオチドを含んでおり、当該変異は、ウイルスに対して非機能的なeIF(iso)4Eタンパク質を生産するか、またはeIF(iso)4E遺伝子の発現を抑制する変異である、第二の判定用DNAマーカーと、を含む、ウイルスに対するタバコの抵抗性の判定用DNAマーカーである。
本実施形態におけるウイルス抵抗性タバコは、ウイルスに対して非機能的な翻訳開始因子eIF(iso)4Eタンパク質を生産するか、または翻訳開始因子eIF(iso)4E遺伝子の発現が抑制されており、さらに、ウイルスに対して非機能的な翻訳開始因子eIF4E2タンパク質を生産するか、または翻訳開始因子eIF4E2遺伝子の発現が抑制されている、ウイルス抵抗性タバコである。
(1)eIF4E2-ssTT/eIF(iso)4E-ssTT
(2)eIF4E2-ssTT/eIF(iso)4E-SStt
(3)eIF4E2-ssTT/eIF(iso)4E-sstt
(4)eIF4E2-SStt/eIF(iso)4E-ssTT
(5)eIF4E2-SStt/eIF(iso)4E-SStt
(6)eIF4E2-SStt/eIF(iso)4E-sstt
(7)eIF4E2-sstt/eIF(iso)4E-ssTT
(8)eIF4E2-sstt/eIF(iso)4E-SStt
(9)eIF4E2-sstt/eIF(iso)4E-sstt
の9通りの組み合わせが存在するが、いずれも本発明の範疇に含まれる。
野生型のeIF4E2−S遺伝子のcDNA配列の一例を配列番号1(GenBankアクセッション番号:KF155696)に示す。配列番号1において、オープンリーディングフレームは、112番目から771番目の塩基である。また、野生型のeIF4E2−Sタンパク質のアミノ酸配列およびゲノムの塩基配列のそれぞれの一例を、配列番号2および3に示す。配列番号3において、翻訳開始コドンは第241番目から243番目の塩基であり、翻訳終止コドンは第5307番目から5309番目の塩基である。また、エキソンは、131番目から491番目の塩基(第1エキソン)、3031番目から3196番目の塩基(第2エキソン)、3309番目から3434番目の塩基(第3エキソン)、5106番目から5171番目の塩基(第4エキソン)、および5259番目から5540番目の塩基(第5エキソン)である。
野生型のeIF(iso)4E−S遺伝子のcDNA配列の一例を配列番号7(GenBankアクセッション番号:AY699609)に示す。配列番号7において、オープンリーディングフレームは、70番目から672番目の塩基である。また、野生型のeIF(iso)4E−Sタンパク質のアミノ酸配列およびゲノムの塩基配列のそれぞれの一例を、配列番号8および9に示す。配列番号9において、翻訳開始コドンは第201番目から203番目の塩基であり、翻訳終止コドンは第4938番目から4940番目の塩基である。また、エキソンは、132番目から397番目の塩基(第1エキソン)、1730番目から1898番目の塩基(第2エキソン)、2029番目から2154番目の塩基(第3エキソン)、4723番目から4785番目の塩基(第4エキソン)、および4893番目から5096番目の塩基(第5エキソン)である。
ウイルス抵抗性タバコの一態様では、翻訳開始因子eIF(iso)4E遺伝子に変異を有していることにより、ウイルスに対して非機能的な翻訳開始因子eIF(iso)4Eタンパク質を生産するか、または翻訳開始因子eIF(iso)4E遺伝子の発現が抑制されている。
(1)市販のシーケンサー等を利用し、各ポリヌクレオチドの塩基配列を直接読み取ることによって変異の有無を検出する方法。
(2)SSCP(Single Strand Conformation Polymorphism:一本鎖高次構造多型)法を用いて変異の有無を検出する方法。
ウイルス抵抗性タバコの一態様では、翻訳開始因子eIF(iso)4E遺伝子の発現量を野生型と比較して少なくさせる因子がタバコに導入されていることにより、翻訳開始因子eIF(iso)4E遺伝子の発現が抑制されている。
本発明はまた、ウイルス抵抗性タバコの育種後代の作出方法を提供する。
本発明では、eIF4E2遺伝子(eIF4E2−S遺伝子またはeIF4E2−T遺伝子)上に生じた変異を利用してDNAマーカーを開発することができ、それをマーカー育種に活用することができる。「DNAマーカー」とは、品種間または個体間におけるDNAの塩基配列の違い(変異または多型)、またはその違いを検出するためのツールであり、品種または個体を識別するための目印となる塩基配列の違い(変異または多型)、またはその違いを検出するためのツールのことを指す。eIF4E2遺伝子における変異が確定し、その変異によってウイルスに抵抗性となることが確認された場合、その変異が生じたタバコ変異体を、当該ウイルス抵抗性の育種母本として利用することができる。その際、既に抵抗性に係る原因変異が分っているため、原因変異の識別に利用可能なマーカーをeIF4E2遺伝子上に設計することができる。当該変異とウイルス抵抗性との関係が遺伝的分離によって切れることがないため、精密なマーカー育種が可能となる。この変異の有無を検出すれば、交配等を繰り返した際に、一回一回ウイルス抵抗性を確認する必要がない。
本発明のウイルス抵抗性タバコを栽培して生産される葉たばこは、当該ウイルス(例えば、Virgin A mutantのウイルス抵抗性を打破するPVY系統)が引き起こす病気に罹患しない。そのため、特に当該病気が発生する環境下で栽培された場合において、ウイルス抵抗性でないタバコを栽培して生産される葉たばこと比較して、品質低下が軽減され高品質である。その結果、より高品質のたばこ製品を生産することができる。
以上のように、本発明に係るウイルス抵抗性タバコの一態様は、ウイルスに対して非機能的な翻訳開始因子eIF(iso)4Eタンパク質を生産するか、または翻訳開始因子eIF(iso)4E遺伝子の発現が抑制されており、さらに、ウイルスに対して非機能的な翻訳開始因子eIF4E2タンパク質を生産するか、または翻訳開始因子eIF4E2遺伝子の発現が抑制されており、上記翻訳開始因子eIF(iso)4Eは、eIF(iso)4E−SおよびeIF(iso)4E−Tの少なくとも一方であり、上記翻訳開始因子eIF4E2は、eIF4E2−SおよびeIF4E2−Tの少なくとも一方である。
(a1)配列番号8に示すアミノ酸配列からなる翻訳開始因子eIF(iso)4E−Sタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子eIF(iso)4E−S遺伝子のエキソン、もしくは
(a2)配列番号8に示すアミノ酸配列と92%以上の配列同一性を有する機能的な翻訳開始因子eIF(iso)4E−Sタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子eIF(iso)4E−S遺伝子のエキソン、
におけるナンセンス変異である、eIF(iso)4E−S遺伝子における変異;または
(b1)配列番号11に示すアミノ酸配列からなる翻訳開始因子eIF(iso)4E−Tタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子eIF(iso)4E−T遺伝子のエキソン、もしくは
(b2)配列番号11に示すアミノ酸配列と92%以上の配列同一性を有する機能的な翻訳開始因子eIF(iso)4E−Tタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子eIF(iso)4E−T遺伝子のエキソン、
におけるナンセンス変異である、eIF(iso)4E−T遺伝子における変異;または
eIF(iso)4E−S遺伝子における上記変異およびeIF(iso)4E−T遺伝子における上記変異の両方;
であってもよい。
(c1)配列番号2に示すアミノ酸配列からなる翻訳開始因子eIF4E2−Sタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子eIF4E2−S遺伝子のエキソン、もしくは
(c2)配列番号2に示すアミノ酸配列と88%以上の配列同一性を有する機能的な翻訳開始因子eIF4E2−Sタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子eIF4E2−S遺伝子のエキソン、
におけるナンセンス変異である、eIF4E2−S遺伝子における変異;または
(d1)配列番号5に示すアミノ酸配列からなる翻訳開始因子eIF4E2−Tタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子eIF4E2−T遺伝子のエキソン、もしくは
(d2)配列番号5に示すアミノ酸配列と88%以上の配列同一性を有する機能的な翻訳開始因子eIF4E2−Tタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子eIF4E2−T遺伝子のエキソン、
におけるナンセンス変異である、eIF4E2−T遺伝子における変異;または
eIF4E2−S遺伝子における上記変異およびeIF4E2−T遺伝子における上記変異の両方;
であってもよい。
ウイルスに対して非機能的な翻訳開始因子eIF4E2タンパク質を生産するか、またはeIF4E2遺伝子の発現を抑制する変異をeIF4E2遺伝子に導入することによって、ウイルスに対して抵抗性を有するタバコを作出することを含み、
上記翻訳開始因子eIF(iso)4Eは、eIF(iso)4E−SおよびeIF(iso)4E−Tの少なくとも一方であり、
上記翻訳開始因子eIF4E2は、eIF4E2−SおよびeIF4E2−Tの少なくとも一方である。
(a1)配列番号8に示すアミノ酸配列からなる翻訳開始因子eIF(iso)4E−Sタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子eIF(iso)4E−S遺伝子のエキソン、もしくは
(a2)配列番号8に示すアミノ酸配列と92%以上の配列同一性を有する機能的な翻訳開始因子eIF(iso)4E−Sタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子eIF(iso)4E−S遺伝子のエキソン、
におけるナンセンス変異である、eIF(iso)4E−S遺伝子における変異;または
(b1)配列番号11に示すアミノ酸配列からなる翻訳開始因子eIF(iso)4E−Tタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子eIF(iso)4E−T遺伝子のエキソン、もしくは
(b2)配列番号11に示すアミノ酸配列と92%以上の配列同一性を有する機能的な翻訳開始因子eIF(iso)4E−Tタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子eIF(iso)4E−T遺伝子のエキソン、
におけるナンセンス変異である、eIF(iso)4E−T遺伝子における変異;または
eIF(iso)4E−S遺伝子における上記変異およびeIF(iso)4E−T遺伝子における上記変異の両方;
であってもよい。
(c1)配列番号2に示すアミノ酸配列からなる翻訳開始因子eIF4E2−Sタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子eIF4E2−S遺伝子のエキソン、もしくは
(c2)配列番号2に示すアミノ酸配列と88%以上の配列同一性を有する機能的な翻訳開始因子eIF4E2−Sタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子eIF4E2−S遺伝子のエキソン、
におけるナンセンス変異である、eIF4E2−S遺伝子における変異;または
(d1)配列番号5に示すアミノ酸配列からなる翻訳開始因子eIF4E2−Tタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子eIF4E2−T遺伝子のエキソン、もしくは
(d2)配列番号5に示すアミノ酸配列と88%以上の配列同一性を有する機能的な翻訳開始因子eIF4E2−Tタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子eIF4E2−T遺伝子のエキソン、
におけるナンセンス変異である、eIF4E2−T遺伝子における変異;または
eIF4E2−S遺伝子における上記変異およびeIF4E2−T遺伝子における上記変異の両方;
であってもよい。
翻訳開始因子eIF4E2遺伝子の発現量を野生型と比較して少なくさせる因子を導入することによって、ウイルスに対して抵抗性を有するタバコを作出することを含み、
上記翻訳開始因子eIF(iso)4Eは、eIF(iso)4E−SおよびeIF(iso)4E−Tの少なくとも一方であり、
上記翻訳開始因子eIF4E2は、eIF4E2−SおよびeIF4E2−Tの少なくとも一方である。
翻訳開始因子eIF(iso)4E遺伝子における変異を含む連続した塩基配列またはその相補配列からなるポリヌクレオチドを含んでおり、当該変異は、ウイルスに対して非機能的なeIF(iso)4Eタンパク質を生産するか、またはeIF(iso)4E遺伝子の発現を抑制する変異である、第二の判定用DNAマーカーと、を含む、ウイルスに対するタバコの抵抗性の判定用DNAマーカーである。
(遺伝子配列の取得)
[eIF4E2遺伝子]
GenBankデータベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed)で検索を行い、タバコ(N. tabacum)の翻訳開始因子として、GenBankアクセッション番号がEB451717であるeIF4EのmRNA塩基配列、KF155696であるeIF4EのmRNA塩基配列、およびKM202068であるeIF4EのmRNA塩基配列を取得した。これらeIF4EをeIF4E2と命名した。これらとeIF4E1(アクセッション番号:AY702653、非特許文献19)との相同性は70%から74%であった。GenBankデータベースのN. tomentosiformisおよびN. sylvestrisのWGS(Whole-genome shotgun contigs)を用いたBLAST解析から、アクセッション番号がEB451717のeIF4E2およびKF155696のeIF4E2はN. sylvestris由来であり、KM202068のeIF4E2はN. tomentosiformis由来であることを確認した。EB451717(タンパク質コード領域の配列は第87番目から746番目の塩基)とKF155696(タンパク質コード領域の配列は第112番目から771番目の塩基)とのタンパク質コード領域におけるDNA配列の同一性は99.8%(660塩基中659塩基の一致)であり、コードされるタンパク質のアミノ酸配列の同一性は100%であった。DNA配列における一塩基の違いは、それぞれのDNAの由来となる品種の違いによるものと考えられる。これらの配列をそれぞれ、eIF4E2−S(GenBankアクセッション番号:EB451717、KF155696)およびeIF4E2−T(GenBankアクセッション番号:KM202068)と命名した。eIF4E2−S遺伝子の機能を破壊したタバコは、PVYに抵抗性になることが示されている(非特許文献22)。
GeneBankデータベースで検索を行い、アクセッション番号がAY699609であるタバコ(N. tabacum)の翻訳開始因子eIF(iso)4EのmRNA塩基配列を取得し、配列番号7に示した。またこの遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号8に示した。GenBankデータベースのWGSを用いたBLAST解析から、このeIF(iso)4Eは、N. sylvestris由来であることが判明したので、この遺伝子をeIF(iso)4E−Sと命名した。この配列をクエリにして、GenBankデータベースのN. tabacumのWGSコンティグを検索した結果、タンパク質コード領域において100%の配列同一性を示す、タバコ品種K326由来のゲノム配列が取得された(アクセッション番号はAWOJ01412288)。この配列のうち、eIF(iso)4E−S遺伝子部分の配列(eIF(iso)4E−S遺伝子のゲノム配列)を、配列番号9に示した。
eIF4E2ならびにeIF(iso)4Eの発現抑制タバコを作出するため、これら遺伝子の内部配列をトリガーとするRNAiコンストラクトを構築した。
Way(登録商標) LR Clonase(登録商標)II Enzyme mix(Life Technologies社)を用いて、RNAiベクターpSP231(文献:国際公開第2011/102394号公報を参照)にインサートをクローニングした。pSP231は、pHellsgate 12(文献:Wesley et al., 2001, Plant J., 27, 581-590参照)のSacI部位にGFP(Green-fluorescent protein遺伝子)発現カセットを挿入したベクターであり、トリガー配列の逆位反復配列がpdk/catイントロンを挟む型のRNAi配列を、カリフラワーモザイクウイルス35SRNA遺伝子プロモーターでドライブする形のバイナリーベクターである。pSP231へのクローニング後、RNAiトリガー配列とその向きを確認し、最終的なRNAiコンストラクトとした。
タバコの形質転換は常法(リーフディスク法)で行った。タバコ品種として、Petit HavanaSR1、およびTN90を用いた。SR1はPVYおよびPVY−B感受性の品種であり、TN90はeIF4E2−S遺伝子が欠失したPVY抵抗性(PVY−B感受性)の品種である。
組換えタバコについて、eIF4E2またはeIF(iso)4E遺伝子の発現を調査するため、各遺伝子の塩基配列に基づき、リアルタイムPCR用のプライマー/プローブを設計した(表2)。また各組換えタバコの葉よりRNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN社)を用いて総RNAを抽出した。得られたRNAからPrime Script reagent Kit(タカラバイオ株式会社)を用いてcDNAを合成し、リアルタイムPCRの鋳型とした。リアルタイムPCRではTaqMan Fast Advanced Master mix(Life technologies社)を用いて増幅反応を行った。反応条件は50℃ 2分間、95℃ 20秒間の後、95℃ 1秒、60℃20秒のサイクルを40回とした。発現解析はStepOne Software v2.2(Life technologies社)を用いた。PCRの内部標準としてelongation factor1-alpha(EF1−α)遺伝子を使用し、この遺伝子の発現量との比較で、標的遺伝子の相対的な遺伝子発現量を算出した。対照として非組換えタバコ(SR1およびTN90)を用いた。
形質転換当代で転写抑制度合が高かった形質転換SR1タバコ、すなわちeIF4E2発現抑制の3系統、およびeIF(iso)4E発現抑制の3系統の自殖種子、また形質転換当代でeIF(iso)4Eの転写抑制度合が高かった形質転換TN90の#8、および転写抑制がなかった#27の自殖種子を、LS固形培地(3%ショ糖、0.8%寒天を含む)上に無菌的に播種した。発芽、生育した幼植物体のGFP蛍光をFluor Imager 595(Molecular Dynamics社)を用いて測定した。上述の通り、コンストラクト導入に用いているpSP231には、T−DNA領域上のRNAi発現カセットの隣に、35Sプロモーター−GFP発現カセットが配置されている。幼植物体において、強いGFP蛍光を発するものをRNAiコンストラクトについてホモ接合系統、全く蛍光を発しないものをRNAiコンストラクトについてヌル分離系統(RNAiコンストラクトが存在しない)、弱い蛍光を発するものをRNAiコンストラクトについてヘミ接合系統と判断した。こうして、eIF(iso)4E発現抑制系統TN90#8のホモ接合系統を得た。なおTN90#27は蛍光が検出されなかったためヌル系統と判断された。播種後3週の植物を温室に移し、培土に植え替え、育成した。
各組換えタバコ系統の次世代におけるeIF4E2ならびにeIF(iso)4E遺伝子の発現を調査するため、上述のようにして組換えタバコの葉よりRNAを抽出してcDNAを合成し、リアルタイムPCRの鋳型とした。リアルタイムPCRも上述の通り実施し、内部標準としてEF1−α遺伝子を用い、対照植物として非組換えタバコを用いた。なおプライマーおよびプローブは、eIF4E2、eIF(iso)4EともにS型遺伝子用のものを用いた。
ウイルス接種試験には、eIF(iso)4E遺伝子のRNAiコンストラクトを有するタバコTN90#8ホモ接合系統を用いた。なお、上記した通り、TN90は元々eIF4E2−S遺伝子が欠失している品種である。また、対照として、栽培品種TN90、つくば1号、ならびにeIF(iso)4EのS型およびT型遺伝子の両方の機能が破壊された変異体(以下、「eIF(iso)4E変異体」と称する)を用いた。eIF(iso)4E変異体はタバコ種子をEMS処理することで得られた変異体であり、配列番号9に示すeIF(iso)4E−S遺伝子の330番目のCがTに変異しており、さらに、配列番号12に示すeIF(iso)4E−T遺伝子の299番目のGがAに変異している。これらの変異は何れもナンセンス変異である(当該変異体の詳細は特許文献5に記載)。
(eIF4E2−S遺伝子、eIF(iso)4E−S遺伝子およびeIF(iso)4E−T遺伝子に変異のあるタバコ変異体の選抜)
eIF4E2−S遺伝子の機能が抑制されたタバコとして、品種TN90を用いた。また、eIF(iso)4E−S遺伝子およびeIF(iso)4E−Tの遺伝子の両方の機能が抑制されたタバコとして、実施例1におけるeIF(iso)4E変異体を用いた。本変異体は、eIF(iso)4E−S遺伝子およびeIF(iso)4E−T遺伝子の両遺伝子についてホモ接合で変異(ナンセンス変異)が入っており、eIF(iso)4E−S遺伝子およびeIF(iso)4E−T遺伝子の両遺伝子の転写が抑制されている(特許文献5)。なお、各個体におけるeIF4E2遺伝子およびeIF(iso)4E遺伝子の遺伝子型について、eIF4E2-SSTT/eIF(iso)4E-SSTTのように表記する。例えば、TN90の遺伝子型はeIF4E2-ssTT/eIF(iso)4E-SSTTであり、上記のeIF(iso)4E変異体はeIF4E2-SSTT/eIF(iso)4E-ssttである。
培土への移植後2週間の個体に、PVY、またはPVY−Bを接種した。ウイルス接種源の作製およびタバコへの接種方法は、上述の実施例1と同様の方法で実施した。接種後、温室内で栽培し、適宜病徴を観察した。eIF4E2とeIF(iso)4E二重機能欠損変異体タバコのウイルス接種試験結果を表8および表9に示す。
Claims (28)
- ウイルスに対して非機能的な翻訳開始因子eIF(iso)4Eタンパク質を生産するか、または翻訳開始因子eIF(iso)4E遺伝子の発現が抑制されており、
さらに、ウイルスに対して非機能的な翻訳開始因子eIF4E2タンパク質を生産するか、または翻訳開始因子eIF4E2遺伝子の発現が抑制されており、
上記翻訳開始因子eIF(iso)4Eは、eIF(iso)4E−SおよびeIF(iso)4E−Tの少なくとも一方であり、
上記翻訳開始因子eIF4E2は、eIF4E2−SおよびeIF4E2−Tの少なくとも一方であることを特徴とする、ウイルス抵抗性タバコ。 - 上記翻訳開始因子eIF(iso)4E遺伝子に変異を有しており、それによって、ウイルスに対して非機能的な上記翻訳開始因子eIF(iso)4Eタンパク質を生産するか、または上記翻訳開始因子eIF(iso)4E遺伝子の発現が抑制されていることを特徴とする、請求項1に記載のウイルス抵抗性タバコ。
- 上記翻訳開始因子eIF4E2遺伝子に変異を有しており、それによって、ウイルスに対して非機能的な上記翻訳開始因子eIF4E2タンパク質を生産するか、または上記翻訳開始因子eIF4E2遺伝子の発現が抑制されていることを特徴とする、請求項1または2に記載のウイルス抵抗性タバコ。
- 上記変異はナンセンス変異であることを特徴とする、請求項2または3に記載のウイルス抵抗性タバコ。
- 上記翻訳開始因子eIF(iso)4E遺伝子における上記変異は、
(a1)配列番号8に示すアミノ酸配列からなる翻訳開始因子eIF(iso)4E−Sタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子eIF(iso)4E−S遺伝子のエキソン、もしくは
(a2)配列番号8に示すアミノ酸配列と92%以上の配列同一性を有する機能的な翻訳開始因子eIF(iso)4E−Sタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子eIF(iso)4E−S遺伝子のエキソン、
におけるナンセンス変異である、eIF(iso)4E−S遺伝子における変異;または
(b1)配列番号11に示すアミノ酸配列からなる翻訳開始因子eIF(iso)4E−Tタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子eIF(iso)4E−T遺伝子のエキソン、もしくは
(b2)配列番号11に示すアミノ酸配列と92%以上の配列同一性を有する機能的な翻訳開始因子eIF(iso)4E−Tタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子eIF(iso)4E−T遺伝子のエキソン、
におけるナンセンス変異である、eIF(iso)4E−T遺伝子における変異;または
eIF(iso)4E−S遺伝子における上記変異およびeIF(iso)4E−T遺伝子における上記変異の両方;
であることを特徴とする、請求項2に記載のウイルス抵抗性タバコ。 - 上記翻訳開始因子eIF4E2遺伝子における上記変異は、
(c1)配列番号2に示すアミノ酸配列からなる翻訳開始因子eIF4E2−Sタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子eIF4E2−S遺伝子のエキソン、もしくは
(c2)配列番号2に示すアミノ酸配列と88%以上の配列同一性を有する機能的な翻訳開始因子eIF4E2−Sタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子eIF4E2−S遺伝子のエキソン、
におけるナンセンス変異である、eIF4E2−S遺伝子における変異;または
(d1)配列番号5に示すアミノ酸配列からなる翻訳開始因子eIF4E2−Tタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子eIF4E2−T遺伝子のエキソン、もしくは
(d2)配列番号5に示すアミノ酸配列と88%以上の配列同一性を有する機能的な翻訳開始因子eIF4E2−Tタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子eIF4E2−T遺伝子のエキソン、
におけるナンセンス変異である、eIF4E2−T遺伝子における変異;または
eIF4E2−S遺伝子における上記変異およびeIF4E2−T遺伝子における上記変異の両方;
であることを特徴とする、請求項3に記載のウイルス抵抗性タバコ。 - 上記ナンセンス変異が、下記(1)〜(4)に示す1つ以上の変異であることを特徴とする、請求項4〜6の何れか一項に記載のウイルス抵抗性タバコ:
(1)コドンCAAのCがTに置換、(2)コドンCGAのCがTに置換、(3)コドンCAGのCがTに置換、(4)コドンTGGのG(2つのGのうちの何れか一方または両方)がAに置換。 - 上記翻訳開始因子eIF4E2遺伝子における上記変異は、eIF4E2−S遺伝子における変異を含むことを特徴とする、請求項3または6に記載のウイルス抵抗性タバコ。
- 上記翻訳開始因子eIF(iso)4E遺伝子における上記変異は、eIF(iso)4E−T遺伝子における変異を含むことを特徴とする、請求項2または5に記載のウイルス抵抗性タバコ。
- 上記ウイルスは、Potyvirus属のウイルスであることを特徴とする、請求項1〜9の何れか一項に記載のウイルス抵抗性タバコ。
- 上記Potyvirus属のウイルスは、Potato virus Yの一系統であって、タバコのVirgin A mutantのウイルス抵抗性を打破する系統、およびPotato virus Yの少なくとも一方であることを特徴とする、請求項10に記載のウイルス抵抗性タバコ。
- さらにUmbravirus属のウイルスに対して抵抗性を有することを特徴とする、請求項10または11に記載のウイルス抵抗性タバコ。
- 上記Umbravirus属のウイルスは、Tobacco bushy top virusであることを特徴とする、請求項12に記載のウイルス抵抗性タバコ。
- ウイルスに対して非機能的な翻訳開始因子eIF(iso)4Eタンパク質を生産するか、またはeIF(iso)4E遺伝子の発現を抑制する変異をeIF(iso)4E遺伝子に導入すること、および
ウイルスに対して非機能的な翻訳開始因子eIF4E2タンパク質を生産するか、またはeIF4E2遺伝子の発現を抑制する変異をeIF4E2遺伝子に導入することによって、ウイルスに対して抵抗性を有するタバコを作出することを含み、
上記翻訳開始因子eIF(iso)4Eは、eIF(iso)4E−SおよびeIF(iso)4E−Tの少なくとも一方であり、
上記翻訳開始因子eIF4E2は、eIF4E2−SおよびeIF4E2−Tの少なくとも一方であることを特徴とする、ウイルス抵抗性タバコ作出方法。 - 上記変異はナンセンス変異であることを特徴とする、請求項14に記載のウイルス抵抗性タバコ作出方法。
- エチルメタンスルホン酸によって上記変異を生じさせることを特徴とする、請求項14または15に記載のウイルス抵抗性タバコ作出方法。
- 上記翻訳開始因子eIF(iso)4E遺伝子における変異は、
(a1)配列番号8に示すアミノ酸配列からなる翻訳開始因子eIF(iso)4E−Sタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子eIF(iso)4E−S遺伝子のエキソン、もしくは
(a2)配列番号8に示すアミノ酸配列と92%以上の配列同一性を有する機能的な翻訳開始因子eIF(iso)4E−Sタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子eIF(iso)4E−S遺伝子のエキソン、
におけるナンセンス変異である、eIF(iso)4E−S遺伝子における変異;または
(b1)配列番号11に示すアミノ酸配列からなる翻訳開始因子eIF(iso)4E−Tタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子eIF(iso)4E−T遺伝子のエキソン、もしくは
(b2)配列番号11に示すアミノ酸配列と92%以上の配列同一性を有する機能的な翻訳開始因子eIF(iso)4E−Tタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子eIF(iso)4E−T遺伝子のエキソン、
におけるナンセンス変異である、eIF(iso)4E−T遺伝子における変異;または
eIF(iso)4E−S遺伝子における上記変異およびeIF(iso)4E−T遺伝子における上記変異の両方;
であることを特徴とする、請求項14〜16の何れか一項に記載のウイルス抵抗性タバコ作出方法。 - 上記翻訳開始因子eIF4E2遺伝子における変異は、
(c1)配列番号2に示すアミノ酸配列からなる翻訳開始因子eIF4E2−Sタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子eIF4E2−S遺伝子のエキソン、もしくは
(c2)配列番号2に示すアミノ酸配列と88%以上の配列同一性を有する機能的な翻訳開始因子eIF4E2−Sタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子eIF4E2−S遺伝子のエキソン、
におけるナンセンス変異である、eIF4E2−S遺伝子における変異;または
(d1)配列番号5に示すアミノ酸配列からなる翻訳開始因子eIF4E2−Tタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子eIF4E2−T遺伝子のエキソン、もしくは
(d2)配列番号5に示すアミノ酸配列と88%以上の配列同一性を有する機能的な翻訳開始因子eIF4E2−Tタンパク質をコードする野生型の翻訳開始因子eIF4E2−T遺伝子のエキソン、
におけるナンセンス変異である、eIF4E2−T遺伝子における変異;または
eIF4E2−S遺伝子における上記変異およびeIF4E2−T遺伝子における上記変異の両方;
であることを特徴とする、請求項14〜17の何れか一項に記載のウイルス抵抗性タバコ作出方法。 - 上記ナンセンス変異が、下記(1)〜(4)に示す1つ以上の変異であることを特徴とする、請求項17または18に記載のウイルス抵抗性タバコ作出方法:
(1)コドンCAAのCがTに置換、(2)コドンCGAのCがTに置換、(3)コドンCAGのCがTに置換、(4)コドンTGGのG(2つのGのうちの何れか一方または両方)がAに置換。 - 翻訳開始因子eIF(iso)4E遺伝子の発現量を野生型と比較して少なくさせる因子を導入すること、および
翻訳開始因子eIF4E2遺伝子の発現量を野生型と比較して少なくさせる因子を導入することによって、ウイルスに対して抵抗性を有するタバコを作出することを含み、
上記翻訳開始因子eIF(iso)4Eは、eIF(iso)4E−SおよびeIF(iso)4E−Tの少なくとも一方であり、
上記翻訳開始因子eIF4E2は、eIF4E2−SおよびeIF4E2−Tの少なくとも一方であることを特徴とする、ウイルス抵抗性タバコ作出方法。 - 上記ウイルスは、Potyvirus属のウイルスであることを特徴とする、請求項14〜20の何れか一項に記載のウイルス抵抗性タバコ作出方法。
- 上記Potyvirus属のウイルスは、Potato virus Yの一系統であって、タバコのVirgin A mutantのウイルス抵抗性を打破する系統、およびPotato virus Yの少なくとも一方であることを特徴とする、請求項21に記載のウイルス抵抗性タバコ作出方法。
- 請求項14〜22の何れか一項に記載のウイルス抵抗性タバコ作出方法において作出されたウイルス抵抗性タバコまたはその後代を自家受粉または他家受粉させることを特徴とする、ウイルス抵抗性タバコの育種後代の作出方法。
- タバコの翻訳開始因子eIF4E2遺伝子における変異を検出するためのポリヌクレオチドであって、当該変異は、ウイルスに対して非機能的なeIF4E2タンパク質を生産するか、またはeIF4E2遺伝子の発現を抑制する変異である、第一の検出用ポリヌクレオチドと、
タバコの翻訳開始因子eIF(iso)4E遺伝子における変異を検出するためのポリヌクレオチドであって、当該変異は、ウイルスに対して非機能的なeIF(iso)4Eタンパク質を生産するか、またはeIF(iso)4E遺伝子の発現を抑制する変異である、第二の検出用ポリヌクレオチドと、を含む、検出用ポリヌクレオチドの組み合わせ物。 - タバコにおいて、ゲノムDNAにおける上記変異の有無を、請求項24に記載の検出用ポリヌクレオチドの組み合わせ物を利用して検査する検査工程と、
上記検査工程において上記変異が検出されたタバコをウイルス抵抗性タバコとして選抜する選抜工程とを含むことを特徴とする、ウイルス抵抗性タバコ選抜方法。 - 翻訳開始因子eIF4E2遺伝子における変異を含む連続した塩基配列またはその相補配列からなるポリヌクレオチドを含んでおり、当該変異は、ウイルスに対して非機能的なeIF4E2タンパク質を生産するか、またはeIF4E2遺伝子の発現を抑制する変異である、第一の判定用DNAマーカーと、
翻訳開始因子eIF(iso)4E遺伝子における変異を含む連続した塩基配列またはその相補配列からなるポリヌクレオチドを含んでおり、当該変異は、ウイルスに対して非機能的なeIF(iso)4Eタンパク質を生産するか、またはeIF(iso)4E遺伝子の発現を抑制する変異である、第二の判定用DNAマーカーと、を含む、ウイルスに対するタバコの抵抗性の判定用DNAマーカー。 - 請求項1〜13の何れか一項に記載のウイルス抵抗性タバコの葉たばこ。
- 請求項27に記載の葉たばこを原料として含むことを特徴とする、たばこ製品。
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