KR20050107435A - 개선된 특성의 인터페론 알파 뮤테인의 융합 단백질 - Google Patents

개선된 특성의 인터페론 알파 뮤테인의 융합 단백질 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인간 인터페론 알파 및 특히 개선된 특성의 인터페론 알파 2의 개질된 형태에 관한 것이다. 상기 개선된 단백질은 생물학적 분석에서 증가된 상대 활성을 주는 특이적 위치에 아미노산 치환을 포함한다. 본 발명은 또한 상기 단백질은 감소된 면역원성 잠재력을 수반하는 개선된 생물학적 활성을 가진 개질된 인터페론을 제공한다. 상기 개선된 단백질은 인체의 질병치료에 치료학적 사용하기 위한 목적이다.

Description

개선된 특성의 인터페론 알파 뮤테인의 융합 단백질{FUSION PROTEINS OF INTERFERON ALPHA MUTEINS WITH IMPROVED PROPERTIES}
본 발명은 인간 인터페론 알파 및 특히 개선된 특성을 가진 인터페론 알파 2의 개질된 형태에 관한 것이다. 상기 개선된 단백질은 생물학적 분석으로 증가된 상대 활성을 부여하는 특이적 위치에서 아미노산 치환체를 함유한다. 본 발명은 또한 상기 단백질 내에서 감소된 면역원성 잠재력을 수반하는 개선된 생물학적 활성을 가진 개질된 인터페론 알파를 제공한다. 상기 개선된 단백질은 인체내 질환의 치료에 있어서, 치료적 용도를 목적으로 한다.
인터페론 알파 2 (IFNα2)는 활성화된 마크로파지에 의해 발현되는 중요한 당단백질 사이토카인이다. 상기 단백질은 광범위 항바이러스제, 항증식제 및 면역조절제로서 상당히 임상학적 중요성을 가진다. 재조합 및 기타 INFα2 제제는 인간에서 다양한 암 및 항바이러스 징후에 치료적으로 사용되어 왔다[리뷰 Sen, G. G. 및 Lengyel P, (1992), J. Biol . Chem. 267: 5017-5020]. 최근 E. coli내에서 제조된 본래의 재조합 IFNα2s를 포함하는 IFNα 제제가 임상 사용중이며(IFNα2a, RoferonA®, Hoffman-La Roche; IFNα2b, IntronA®, Schering-Plough; IFNα2c, Berofor®, Basotherm) 더욱 최근에 모든 아형의 공통 서열에 기초로 하는(Infergen®, InterMune), 또한 E. coli에서 제조된 합성 IFNα가 임상 사용중이다 .
IFNα2 의 주요 사용은 만성 C형 간염바이러스(HCV) 감염의 치료법이다.
IFNα만을 사용한 치료는 환자의 약 10%에서 지속된 바이러스 제거를 초래하지만, 더욱 최근에는 리바비린(ribavirin)과 IFNα2의 조합으로 40%의 지속된 바이러스 반응이 달성되었다[Davis GL, 등 (1998) N. Engl . J. Med. ; 339: 1493-1499; McHutchison JG 등 (1998) N. Engl . J. Med . ; 339: 1485-1492; Richard O, 등 (1998) Lancet. 351: 83-87]. IFNα 치료는 집중적이고 20% 이하의 경우에는 투여중단에 이르는 심각한 부작용과 관련된다. 집중치료에 대한 근본적인 이유는 IFNα2b 가 상대적으로 짧은 혈청 반감기를 가지고 있기 때문인데 항바이러스 효능을 위해 하루에 한번 또는 일주일에 3번의 피하주사 투여를 필요로 한다[Glue P, 등 (2000) Clin . Pharmacol . Ther .; 68: 556-567].
상기 짧은 반감기 및 잦은 투여는 장기간 치료에서 문제점으로 인식되고 있다. RoferonA® 및 IntronA®(Pegasys® 및 Peg-Intron®)의 '페길화(pegylate)' 버젼을 언급한 것이 도입되고 Infergen®의 유사 버젼은 제 II 상 임상실험에 있다. 상기 개질된 인터페론은 혈청 반감기가 10 내지 20배 증가하는 폴리에틸렌 글리콜 부분(6,7)에 컨쥬게이트되어, 임상적 효능에 역효과없이 투여 빈도를 일주일에 한번으로 감소되었다(Peg-Intron™ 및 Pegasys™에 대해 각각 180 ㎍ 또는 1.4 ㎍/Kg)[Glue P. 등 (2000) ibid ; Perry CM, 등 (2001) Drugs; 61: 2263-2288; Glue P, 등 (2000) Hepatology; 32: 647-653]. 상기 연구에서, 부작용 수준은 개질되지 않은 인터페론과 유사하다.
혈청 반감기 증가를 위한 또 다른 방법은 IFNα를 인간 혈청 알부민에 연결하는 것이다[Osborn BL, 등 (2002) J Pharmacol . Exp . Ther.; 303: 540-548]. Albuferon® 는 인간 혈청 알부민의 C-말단에 연결된 IFNα로 이루어져 있고, 키노몰구스 원숭이(cynomolgus monkeys)에서는, 페길화된 IFNα의 것 보다 3배, 개질된 IFNα보다 18배 큰 반감기를 가지고 있다. 인간에 대한 연구의 데이타는 상기 분자에 대해 아주 이용가능하지 않다. 그러나 페길화되고 알부민 연결된 IFNα둘다, 생체외에서 개질된 단백질의 특이적 활성이 본래의 단백질에 비해 Peg-Intron®사용으로 28% 감소되고[Grace M, 등. (2001) Cytokine Res.; 21: 1103-1115] Pegasys® 및 Albuferon®사용으로 10% 이하로 감소된다[Osborn BL, 등 (2002) ibid; Bailon P, 등 (2001) Bioconjug Chem. 1 2: 195-202].
IFNα를 사용에 발견된 치료학적 중요 이점에도 불구하고, 임의 환자의 치료에 대한 내성은 문서화되어있고 내성의 하나의 중요한 매카니즘의 하나는 처리된 환자의 혈청에서 중화 항체의 생성이 검출되는 것을 보여준다[Quesada, J. R. 등 (1985) J. Clin . Oncology 3 : 1522-1528; Stein R. G. 등 (1988) ibid; Russo, D. 등 (1996) Br. J. Haematol . ; 94: 300-305 ; Brooks M. G. 등 (1989) Gut 30: 1116-1122]. 상기 환자의 면역 반응은 적어도 동일한 일차구조의 분자가 인체내에 내생적으로 생산되는 사실에도 불구하고 치료적 인터페론을 갖추게 된다. 수개월이상 반복 투여는 7% 내지 60% 의 범위의 만성 HCV 감염을 위해 보고된 빈도수[Schellekens H, 등 (1997) ibid]의 상기 지시에 따라 80% 이하의 환자에서 항-IFNα 중화 항체를 유도하였다[Schellekens H, 등 (1997) J Interferon Cytokine Res. 17 Suppl 1 : S5-8]. 유효한 증거는, 중화 항체를 생성하는 환자가 치료에 반응하는데 실패하기 쉽고, 항체를 생성하지 않는 환자 보다 더 악화되어 고통받음을 제안하지만[Ross C, 등 (2002) J Interferon Cytokine Res.; 22: 421-426 ; McKenna R. M, 등 (1997) J Interferon Cytokine Res.; 17: 141-143; Russo D, 등 (1996) ibid; Milella M, 등 (1993) Liver; 13: 146-150; Primmer O.(1993) Cancer; 71: 1828-1834], 일부 경우 치료는 정제된 백혈구 인터페론의 연속 사용으로 해결될 수 있다[Russo D, 등 (1996) ibid ; Oberg K, & Alm G. (1997) Biotherapy ; 10: 1-5; Tefferi A, & Grendahl D. C. (1996) Am. J. Hematol. ; 52: 231-233 ; Milella M, 등 (1995) Hepatogastroenterology ; 42: 201-204].
재조합 IFNα에 대한 항체의 생성의 이유는 상기 단백질이 자연상에 존재하고 발현은 바이러스 감염과 같은 징후에 대한 반응으로 산발적으로 증가하기 때문에 명확하지 않다. 상기 투여의 경로 및 횟수, IFNα의 면역 조정 효과, 및 약학적 제제내의 단백질 응집의 존재는 면역 내성의 파괴에 모든 역할을 할 수있다. 그러나, 임의 촉진 요소에 관계 없이, 면역반응의 유도에 이르는 중추의 특징은 MHC 클래스 II 분자(MHC class II molecules)에 나타나는 T-세포의 활성을 자극할 수 있는 단백질의 펩티드내에 존재한다. 상기 펩티드 서열은 "T-세포 에피토프(epitope)"이고 일반적으로 MHC 클래스 II 분자에 결합될 수 있는 임의 아미노산 잔기 서열로 정의된다. 함축적으로, "T-세포 에피토프"는 MHC 분자에 연결될 때, T-세포 수용체 (TCR)에 의해 인식될 수 있고, 적어도 원리상, T-세포 반응을 촉진하기 위해 TCR을 관여시킴로써 상기 T-세포의 활성화를 야기할 수 있는 에피토프를 의미한다.
상기로부터, 증강된 특성의 INFα2 유사체에 대한 지속적인 요구가 명백히 존재한다. 바람직한 증강은 상기 치료적인 단백질의 발현 및 정제를 위해서 다른 방안의 도식 및 양상뿐만아니라 특히 상기 단백질의 생물학적 특성에 개선을 포함한다. 인간 피실험자에 투여될 때, 생체내 특성의 증강을 위해 특히 필요하다. 이런 관점에서, 잠재력이 없거나 감소한 INFα2를 제공하여 상기 인간 피실험자의 증강된 생물학적 잠재력 및 면역반응을 유도하는 것이 아주 바람직하다.
본 발명자는 이전에 상기 자가단백질에 대한 면역반응 하는 T-세포 에피토프를 포함하는 IFNα2 분자의 결정적 부위에 대해 개시하고 상기 효과를 감소하거나 T-세포 에피토프로서 작용할 수 있는 것으로부터 상기 서열을 완전히 제거하는 조성물을 제공한다[WO 02/085941]. 상기 조성물은 IFNα2 단백질의 아미노산 서열의 변성, 예를 들어, 치환체에 의해 달성되고, 본 발명은 또한 아미노산 치환체 및/또는 치환체의 조합이 수행되는 IFNα2 분자에 관한 것이다. 그러나 본 발명에서, 제조된 새로운 치환체 및 치환체의 조합은 상기 분자의 생물학적 활성을 상당히 증강하는 놀라운 특성을 주고 상기 단백질에 대한 감소된 면역원성 프로필을 달성하는 치환체의 조합의 증강은 개선된 IFNα2 분자에 제공한다.
다른 것은 개질된 INFα2와 사용 방법을 제공하고 예를 들어 US, 4,496, 537; US, 5,972,331 ; US, 5,480,640 ; US, 5,190,751 ; US, 4,959,210 ; US, 5,609,868 ; US, 5,028,422 및 기타에 포함된다.
US, 5,723,125는 인간 면역글로불린 Fc 단편에 연결된 펩티드 링커를 통해 연결된 야생형 인간 IFNα을 포함하는 융합 단백질을 기재한다. 상기 IFNα 도메인은 청구된 융합 단백질에서 N-말단을 Fc도메인으로 향하게 되었다.
US, 6,204,022는 WT로부터, 특히, 19, 20, 22, 24 및 27 위치에 치환체를 가지고 생물학적 분석으로 감소된 세포독성으로 특성화된 IFNα 유사체을 기재한다.
"인간 Fc 융합 단백질"의 일반적인 카테고리 및 이의 제조용 적합한 벡터는 이전에 [US, 5,541,087; US, 5,726,044 Lo 등 (1998), Protein Engineering 11: 495-500]에 기재되어 있다.
[도면의 설명]
도 1은 본 발명의 바람직한 IFNα 뮤테인 각각의 상대 생물학적 활성을 설명한다. 상기 클론 ID 번호 및 각 클론내에서 수행된 치환은 지시된 바와 같다. 상기 도는 실시예에서 설명된 생물학적 분석을 사용하여 IFN 수용체 매개 세포 활성화(= 시그널링 분석), 항바이러스 활성 및 항-증식 활성에 대해 측정된 상대 활성을 나타낸다. 모든 활성은 N-말단 Fc 도메인에 직접 융합된 WT IFNα부분을 가진 Fc-IFNα 단백질 IFN5에 대해 나타내었다 .
도 2는 세포-배양 상등액의 수용체 시그널링 분석의 결과를 보여준다. HEK293 세포는 일시적으로 IFN5, IFN120, IFN316 및 IFN311을 코딩하는 플라즈미드로 트랜스펙션된다. 상기 상층액의 단백질 농도는 Fc ELISA로 정량하고 200ng/ml로 희석하였다. 상기 활성은 3배 연속 희석하여 적정하였다.
도 3은 Peprotech IFNα2a와 정제한 IFN311 및 IFN316의 활성의 비교를 보여준다.
(a) 수용체 시그널링 분석. 적정은 200ng/ml로 시작되어 3배 연속 희석하였다.
(b) Daudi 세포 항-증식 분석. 적정은 200ng/ml로 시작되어 4배 연속 희석하였다.
(c) 항바이러스 분석. IFN311의 초기 농도는 250pg/ml이고 IFN316는 62. 5pg/ml이고 IFNα2a는 6.25pg/ml이고, 적정은 2 배 연속 희석하여 수행되었다. 각각 그래프는 3번 실험한 평균치를 나타낸다.
도 4 는 합성 펩티드를 이용한 시간 경과 면역원성 분석의 결과를 보여준다. (NB: 표 3에 주어진 펩티드 서열). 20명의 건강한 사람 및 20명의 HCV 환자 (IntronA®로 처치된)가 야생형 및 개질된 IFNα 펩티드의 면역원성을 평가하는데 사용되었다. PBMC의 증식은 자극 후 6, 7, 8 및 9일에 삼중수소 티미딘 혼입에 의해 평가되었다.
(a) 펩티드 스패닝 부위 1, 2, 및 3으로 자극한 후에 건강한 사람으로부터 양성반응 (SI>2).
(b) 펩티드 스패닝 부위 1, 2, 및 3으로 자극한 후에 HCV 환자로부터 양성반응 (SI>2).
(c) 20명의 건강한 공여자 및 20명의 HCV 환자 풀(pool)로부터 면역원성 부위 1, 2, 및 3을 스패닝 하는 펩티드까지의 임의 시간점에서 SI>2로 관찰된 반응의 빈도수
도 5.1 내지 5.12는 본 발명의 바람직한 분자의 단백질 서열을 보여준다.
서열은 단일 문자 코드로 나타냈다. 각 융합단백질의 Fc 및 Fc-링커 부분은 밑줄되어있다. 상기 IFNα 도메인은 밑줄 되어있지 않다. 상기 클론 ID번호는 각 서열을 나타낸다.
[발명의 개요]
본 발명은 아미노산 치환체를 함유하는 인간 인터페론 알파 2 분자를 제공한다. 아미노산 치환체는 단백질에 개선된 특성을 부여한다. 개선된 특성은 단백질의 특이적 생물학적 활성 및 또한 단백질의 면역원성 특성에 관한 것이다.
본 발명의 분자는 인간 IFNα 뮤테인과 연결된 인간 면역글로불린 불변부위 부분을 포함하는 융합 단백질이다.
본 발명의 분자는 신규하고 독창적인 특성을 가지고 있다. 상기 분자는 특히 만성 C형 간염바이러스 감염으로 고통받는, 질병으로 고통받는 환자에 이로움을 줄 수 있다.
본 발명의 분자는 서열 번호 2-22와 같이 본 발명에서 정의된 단백질 서열에 의해 특징화된다.
본 발명의 분자는 추가로 시그널링 분석에서 1.3 내지 10배 초과의 상대 활성에 의해 특징화된다. 일부 구현에서, 시그널링 분석에서 상대 활성은 2배 또는 3배 또는 5배 또는 7배 또는 10배 또는 17배이다.
본 발명의 분자는 항바이러스 분석에서 2 내지 36 배의 상대 활성에 의해 특징화되었다. 일부 구현에서, 항-바이러스 분석에서 상대 활성은 2배 이상이거나, 3배 이상이거나, 4배 이상이거나 7배 이상이거나 약 36배 이상이다.
본 발명의 가장 바람직한 분자는 단백질 서열 번호 2에 의해 특징화되고 추가로 시그널링 분석에서 9배 초과 및 항바이러스 분석에서 약 36배 및 항증식 분석에서 약 1 인 상대 활성에 의해 특징화된다.
본 발명의 추가의 바람직한 분자는 단백질 서열, 서열 번호 3 에 의해 특징화 되고 추가로 시그널링 분석에서 1.3 배 초과 및 항바이러스 분석에서 약 7.4 배 및 항증식 분석에서 약 1 인 상대 활성에 의해 특징화된다.
본 발명의 분자는 추가의 항증식 분석에서 ml (밀리리터) 당 13 내지 16 pg (피코그램) 인터페론-α의 활성에 의해 특징화될 수 있다.
본 발명의 가장 바람직한 분자는 추가로 인간 세포에서 감소된 면역원성을 나타내는 것으로 입증된 서열을 포함함으로써 특징화된다.
요컨대, 본 발명은 하기의 문제들에 관한 것이다:
ㆍ하나 이상의 아미노산 치환체를 함유하는 인간 인터페론 알파 2의 생물학적 활성을 가진, 개질된 인터페론 알파 2 분자;
ㆍ 인간 인터페론 알파 2의 생물학적 활성을 가지고 인간 면역글로불린 불변부위 (Fc) 도메인을 포함하고 상기 또는 하기에 명시된 바와 같은 인터페론 알파 2 도메인 내에 하나 이상의 아미노산 치환체를 함유하는, 개질된 인터페론 알파 2 분자;
ㆍ 인간 인터페론 알파 2의 생물학적 활성을 가지고 인간 Fc 도메인을 함유하고 인터페론 알파 도메인 내에 하나 이상의 아미노산 치환체를 함유하며, 추가로 본 발명의 아미노산 치환체를 함유하지 않은 인터페론 알파 분자에 비해 특히 인간에 대한 감소된 면역원성을 검증함으로써 특징화된, 개질된 인터페론 알파 2 분자;
ㆍ 하기를 포함하는 개선된 특성을 가진 IFNα 뮤테인의 일반적인 회수 방법;
a) T-세포 에피토프의 동정;
b) T-세포 에피토프 부위내에 단일 아미노산 치환을 수행하고 기능적 활성인 뮤테인을 선택함;
c) 임의로, T-세포 활성화에 관여된 중요한 잔기에 대한 정밀 맵핑(mapping) 연구를 수행하고 면역원성에 대한 이중 또는 삼중 이상의 치환을 시험함;
d) 가장 선호하는 기능 및 다중 치환된 뮤테인으로서 구성하기 위한 면역원성 프로필 및 상기 동일한 신규 단백질을 시험하는 기능을 갖는 개개의 뮤테인을 선택함;
e) 시간 경과(time-course) 면역원성 분석을 이용하여 감소된 면역원성에 대한 기능적으로 활성인 다중 치환된 뮤테인 서열을 시험함;
ㆍ 하기 구조의 개질된 인터페론 알파 2 분자:
[식중,
X0는 Fc 또는 Fc-링커,
Fc 는 항체의 Fc 도메인
링커는 6 내지 25 개의 아미노산으로 이루어진 링커 펩티드
Xl = I, Q
X2 = H, Y
X3 = I, T;
X4 = F, T, A
X5 = W, H;
X6 = Y, D;
X7 = I, N, T, P, R
X8 = L, T, H, D, S, N 및
X9 = N, S;
단, 동시에 X1=I, X2=H, X3=I, X4=F, X5=W, X6=Y, X7=I, X8=L 및 X9=N인 IFNα 분자는 제외된다].
특히 본 발명은 하기에 관한 것이다:
ㆍ IFNα2 뮤테인(여기서 X5=H 및 X8=N이다),
ㆍ IFNα2 뮤테인(여기서 X3=T 및 X4=A),
ㆍ 하기 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 IFNα2 뮤테인:
(i) X1=Q, X2=H, X3=T, X4=A, X5=H, X6=Y, X7=R, X8=N 및 X9=N
(ii) X1=Q, X2=H, X3=I, X4=F, X5=H, X6=Y, X7=I, X8=L 및 X9=N
(iii) X1=I, X2=H, X3=T, X4=A, X5=H, X6=Y, X7=T, R 또는 N, X8=N 및 X9=N
(iv) X1=I, X2=H, X3=T, X4=A, X5=H, X6=Y, X7=I, X8=L 및 X9=N
(v) X1=I, X2=Y, X3=I, X4=T, X5=H, X6=Y, X7=I, X8=L 및 X9=N
(vi) X1=I, X2=H, X3=I, X4=F, X5=H, X6=Y, X7=P, T 또는 N, X8=L 및 X9=N
(vii) X1=I, X2=H, X3=I, X4=F, X5=H, X6=Y, X7=I, X8=T 및 X9=S
(viii) X1=I, X2=H, X3=T, X4=F, X5=H, X6=Y, X7=I, X8=T 및 X9=S
(ix) X1=I, X2=H, X3=T, X4=F, X5=W, X6=Y, X7=I, X8=T 및 X9=S
(x) X1=I, X2=H, X3=I, X4=F, X5=W, X6=Y, X7=I, X8= T, S, N, H 또는 D 및 X9=N
(xi) X1=I, X2=H, X3=I, X4=F, X5=H, X6=Y, X7=I, X8=L 및 X9=N
(xii) X1=I, X2=H, X3=I, X4=F, X5=W, X6=D, X7=I, X8=L 및 X9=N
ㆍ Fc 가 인간 면역글로불린 중쇄 불변부위 도메인인 IFNα2 뮤테인(여기서,이의 C-말단에 의해 상기 뮤테인에 연결됨).
ㆍ Fc 도메인이 단량체인 IFNα2 뮤테인.
ㆍ 12 내지 20 개의 아미노산으로 이루어진 링커 펩티드인 IFNα2 뮤테인.
ㆍ 상기 링커 펩티드가 (G)4S(G4)S(G4)SG인 IFNα2 뮤테인.
의혹을 방지하기 위해서, 본 발명의 각 구현인 IFNα2의 특히 유리한 뮤테인은 도 1의 설명에 따라 특징화된다.
본 발명의 변이 단백질은 종래기술에 잘 알려진 재조합 DNA 기술을 사용함으로써 쉽게 제조되고 본 발명은 상기 분자의 재조합 제조 방법을 제공한다.
본 발명이 개질된 INFα2에 관한 것인 한, 상기 개질된 INFα2 단백질 또는 개질된 INFα2 단백질의 단편을 함유하는 조성물 및 관련된 조성물은 본 발명의 범위내인 것으로 되어야 한다. 다른 측면에서, 본 발명은 개질된 INFα2 실체를 암호화하는 핵산에 관한 것이다. 추가의 측면에서, 본 발명은 개질된 단백질을 사용하는 인간의 치료적 처치방법에 관한 것이다.
[본 발명의 상세한 설명]
실제, 성숙한 INFα2 단백질은 165 개의 아미노산의 단일 폴리펩티드이다. 각각 일차 아미노산 서열간에 작은 차이를 보이는 인간 INFα2의 몇가지 상이한 아형이 공지되어 있다. 그리하여, INFα2a 및 INFα2b는 INFα2a 내의 리신 및 INFα2b 내의 아르기닌인 성숙한 단백질 사슬의 23번 위치의 하나의 잔기만 다르다.
본 발명의 명세서는 INFα2b의 서열에 관한 것인 반면에, 모든 실용적 목적을 위해서 본 발명의 대상체 INFα2b 아형과 호환가능하게 여겨질 수 있는 것으로 볼 수 있다.
상기 INFα2b의 아미노산 서열(단일 문자코드로 나타냄)은 하기와 같다:
용어 "IFNα" 는 본 발명에서 인간 인터페론 알파 2를 나타내기 위해 사용된다. 일부 예에서, 상기 용어는 또한 더욱 넓게 인터페론 알파 부분 및 더욱 특히 인터페론 알파 뮤테인을 포함하는 융합 단백질 (하기 참고)를 포함하여 사용된다.
용어 "뮤테인" 은 본 발명에서 상기 본래 서열과 상이한 하나 이상의 아미노산 치환체를 함유하도록 조작된 IFNα 단백질을 나타내기 위해 사용된다.
본 발명에서 사용되는 용어 "펩티드"는 2종 이상의 아미노산을 포함하는 화합물이다. 상기 아미노산은 펩티드 결합에 의해 같이 연결된다.
펩티드 결합은 모든 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 선형 골격 구조내에 아미노산 간의 유일한 공유 결합이다. 상기 펩티드 결합은 공유결합이고, 구조내에서 평면적이며 화학적으로 치환된 아미드를 구성한다. 상기 "아미드"는 -CONH-기를 함유하는 임의의 유기 화합물 군이다.
펩티드의 생물학적 제조에 관여하는 20개의 상이한 자연 발생 아미노산이 있고, 이들중 몇몇이 연결되어 펩티드 사슬 또는 고리를 형성한다. 펩티드의 생물학적 제조에서 사용된 자연 발생 아미노산은 모두 L-입체배치를 가진다. L-아미노산, D-아미노산, 또는 두개 입체 배치의 아미노산의 다양한 조합을 이용하는 통상의 합성법을 사용하여 제조할 수 있다. 일부 펩티드는 오직 몇개의 아미노산 단위만을 함유한다. 짧은 펩티드, 예를 들어, 10개 미만의 아미노산 단위를 가지는 펩티드는 때때로 "올리고펩티드"라고 한다. 기타 펩티드는 다수의 아미노산 잔기, 예를 들어, 100개 이상까지를 팜유하며 이는 "폴리펩티드"라고 한다. 통상, "폴리펩티드" 는 3개 이상 아미노산을 함유하는 임의 펩티드로 여겨질 수 있는 반면, "올리고펩티드"는 통상적으로 "짧은" 폴리펩티드의 특정 유형으로서 여겨진다. 그리하여, 본 발명에서 사용된 바와 같이, "폴리펩티드"에 대한 임의의 언급은 또한 올리고펩티드를 함유하는 것을 이해된다. 추가로, "펩티드"에 대한 임의 언급은 폴리펩티드, 올리고펩티드, 및 단백질을 포함한다. 각 상이한 아미노산의 배열은 상이한 폴리펩티드 또는 단백질을 형성한다. 형성될 수 있는 폴리펩티드의 수- 및 따라서, 상이한 단백질의 수-는 실질적으로 제한되지 않는다.
펩티드 결합이 아미노산 간의 유일한 연결이기 때문에, 모든 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질은 "N-말단" 또는 "N-말단 잔기" 및 상기 "C-말단" 또는 "C-말단 잔기"로 통상 언급되는 말단으로 정의된다. 상기 N-말단 잔기는 유리 아미노기를 가지는 반면에, C-말단 잔기는 유리 카르복실기를 가진다.
따라서, 모든 연속적인 아미노산의 서열은 N-말단에서 C-말단의 배향을 갖는다. 융합 단백질이 구성되거나 상이한 도메인이 단백질 종내에 연결될 때, 이의 관련 방향은 단백질 "N-말단" 또는 "C- 말단"으로 기재될 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "융합 단백질"은 단일 폴리펩티드 사슬내에 2종 이상의 기능적으로 다른 단백질 도메인을 포함하는 단백질 분자를 말한다. 상기 융합 단백질내의 단백질 부분은 직접적으로 결합될 수 있거나 링커 펩티드를 통해 연결될 수 있다.
본 발명에 사용된 "링커" 또는 "링커 펩티드"는 융합 단백질의 두 부분을 연결하는 펩티드 단편을 말한다. 본 발명에 적합한 링커 펩티드는 5 내지 25 아미노산, 바람직하게 10 내지 20 개의 아미노산, 더욱 바람직하게 15-20 개의 아미노산을 가지는 펩티드를 포함한다. 링커 펩티드의 예는 화학식 ((G)4S)XG) 식중, x 는 1, 2, 3 또는 4이다)에 의해 제공된다. 본 발명에 따른 바람직한 링커 펩티드는 (G)4S(G)4S(G)4SG이다. 그러나 또한, 10 개 이상의 아미노산을 가지는 종래 기술의 기타 링커 펩티드가 바람직하게 적합하다.
US,5,723,125는 링커 서열이 GGSGGSGGGGSGGGGS인 IFN-L-Fc(식중, L=링커)형의 하이브리드 인터페론 분자를 청구한다. 상기 링커는 16 개 잔기이고 "비교적 긴"것으로 여겨진다. 상기 링커는 Huston 등 [(1988) Proc Natl . Acad. Sci . USA 85: 5879]에 의해 기재된 잘 알려진 펩티드 링커 (GGGGS)3의 변형체이다. 추가로, 상기 링커의 더 짧아진 서열 변형체, 예컨대 (GGGGS)n (식중, n = 1, 2 또는 3으로 5,10 또는 15 잔기의 링커를 제조한다)이 또한 공지되어있다[Holliger, P. 등 (1993) Proc Natl . Acad . Sci. USA 90 : 6444]. 4 잔기(GGGG)를 포함하는 상기 링커의 특히 짧은 버젼은 US, 6,686,179에 사용되고 있다. 당업계에 인지된 펩티드 링커의 기타 예로는 하기 모두가 포함된다: (A)3, (A)4, (A)5, GG, GS, GGG, (G)7, GPG, GGPGG, EFGGGGGTA.
융합 단백질은 일반적으로 재조합 DNA 기술에 의해 제조되고, 그 자체는 자연상에 직접적 대응물을 가지고 있지 않은 인공 단백질로 간주될 수 있다(천연 융합 단백질은 예를 들어, 염색체 전위를 통해 발생될 수 있지만 본 발명에서는 고려하지 않는다). 융합 단백질의 예는 면역글로불린 Fc 부위가 또다른 단백질, 예컨대 IFNα의 N-말단에 위치하는 융합이다. 상기 융합은 "Fc-X" 융합, [여기서, X 는 리간드(예컨대 IFNα)임] 이고 Fc-X 단백질은 수많은 특이하고 이로운 생물학적 특성을 가진다. 특히, 상기 융합 단백질은 여전히 세포 표면상에 관련 Fc수용체에 결합할 수 있는 반면에, 리간드가 이의 수용체에 결합할 때, Fc 부위의 배향이 변경되어 항체-의존성 세포-매개 세포독성 및 보체 고정이 Fc 도메인내에 존재하는 서열에 의해 활성화된다. Fc-X 융합은 본 발명에 따라 바람직하다.
본 발명에서 사용된 "면역글로불린"은 실질적으로 면역글로불린 유전자로 암호화된 1종 이상의 폴리펩티드로 이루어진 단백질을 말한다. 인지된 면역글로불린 유전자는 κ, λ, α, γ(IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), σ, ε, 및 μ 불변부위 유전자 및 자연적으로 다수의 면역글로불린 가변부위유전자를 포함한다.
용어 Fc는 면역글로불린 중쇄 불변부위 도메인을 언급하기 위해 사용되고 항체의 Fc부분의 단량체 형태 뿐만 아니라 이량체 형태를 포함한다. 바람직하게 단쇄 Fc 융합 (단량체) 형태가 바람직하다.
용어 "T-세포 에피토프"는 본 발명의 견지에 따라 MHC 클래스 II 분자에 결합될 수 있고, T-세포를 자극하고/하거나 MHC 클래스 II 분자와 복합체를 이룬 T-세포에 결합(반드시 측정가능하게 활성화하지 않음)할 수 있는 아미노산 서열을 의미한다.
"실질적으로 비-면역원성" 또는 "감소된 면역원성 잠재력"에 대한 언급은 모 단백질 또는 시험 부분의 야생형 또는 본래의 아미노산 서열을 함유하는 융합 단백질에 비해 감소된 면역원성을 포함한다.
용어 "면역원성"은 숙주 동물에서 체액 및/또는 T-세포 매개성 반응을 유발, 유도, 그렇지 않으면 촉진할 수 있는 능력을 포함하고, 특히 여기서, "숙주 동물"은 인간이다.
용어 "T-세포 분석" 및 "면역원성 분석"은 생체외 면역반응성(immune reactivity)의 측정에 관한 것이다. 상기는 시험 면역원, 예를 들어, 살아있는 인간 면역 세포와 접촉하게 되는 단백질 또는 펩티드 및 이의 측정된 반응성을 포함한다. 유도된 반응성의 통상적인 척도는 증식이다. 분석에 있어서, 적합한 대조구 측정은 중요하고 이에 포함되어 있다.
"시간 경과 분석"은 생물학적 분석 예컨대, 활성 측정이 시간의 경과에 따라 순차적으로 이루어진 증식 분석을 말한다. 본 발명에서, "시간 경과 T-세포 분석"은 시험 면역원에 노출시킨 후 시험 면역원 (펩티드)에 여러번 반응시키는 중의 T-세포 증식의 측정을 말한다. 용어 "시간 경과 T-세포 분석" 및 "시간 경과 면역원성 분석"은 본 발명에서 호환하여 사용된다.
T-세포 분석이 표현하는 통상적인 방법의 하나는 "자극 지수(stimulation index)" 또는 "SI"의 사용에 의한다. 상기 자극 지수(SI)는 통상적으로 실험 면역원과 접촉하지 않은 세포내에 측정된 스코어에 의한 펩티드와 같은, 실험 면역원에 측정된 증식 스코어로 나누어서 유도된다(예를 들어 3H-티미딘 혼입을 사용할 때, 시간당 방사능 측정). 비록 실제 SI 값이 0.8-1.2의 범위에 있을지라도 SI=1.0을 제공하는 반응없는 실험 면역원(펩티드)은 놀랄만하지 않다. 본 발명자는 상기 면역원성 분석의 작용에서, 2.0 이상인 자극 지수가 현저하게 유도된 증식의 측정시 유용한 것을 확립하였다.
PBMC는 특히 혈액제공자의 혈액 샘플로부터 수득된 말초혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell)를 의미한다. PBMC는 종래기술에 잘 알려진 밀도구배 원심분리를 이용하여 혈액 전체 샘플로부터 쉽게 단리하고 우세하게 림프구 (B 및 T 세포) 및 단핵구를 포함한다. 기타 세포 유형 또한 나타내었다.
"상대 활성"은 본 발명에 따라 동일한 분석 및 통상 병행하여 수행되는 분석에서 양성 대조 단백질의 측정된 활성에 대해 나타내는 임의 단일 분석의 실험 단백질의 측정된 활성을 의미한다. 그리하여 실험 단백질 및 대조 단백질이 동일한 측정 활성을 가질 때, 상기 상대 활성은 1로 나타낸다.
항-바이러스 분석은 중요한 실험 단백질이 적합한 숙주 세포에서 바이러스성 물질의 억제 기능에 대한 임의 능력이 측정되는 생물학적 분석이다. 상기 분석은 일반적으로 항바이러스 활성이 연장된 세포생존 또는 바이러스의 세포변성량의 존재에서 증식과 동등한 것으로 형성된다. 유용한 측정이 되기 위해서, 대조 실험이 병행하여 수행된다. 적합한 대조 측정의 존재는 상기 분석에서 중요하고 함축적이다. 특히 적합한 항 바이러스 분석은 Rubinstein 등 [Rubinstein S, 등 (1981) J Virol . 37: 755-758]에 의해 기재되고 여기에 예시적으로 설명되었다. 기타 분석 유형은 ED50 측정을 가능케 하기 위해 상기 실험 분자의 특이적 활성의 정량적 추정치를 계획할 수 있고 또한 제공할 수 있다.
본 발명에 따른 "시그널링 분석"은 실험 단백질이 살아있는 세포내에서 측정할수 있는 특이적 반응을 유발하는 능력을 판독하는 것을 제공할 수 있는 생물학적 분석을 의미한다. 특히 상기 실험 단백질은 세포의 외부 표면에 접촉하고 측정된 반응은 하나 이상의 특이적 수용체 단백질 및 상기 세포내의 다수의 세포질 인자, 예컨대 전사 인자를 포함하여 발생할 수 있는 현상이다. 총괄하여 상기 수용체 및 기타 다수의 세포질 인자는 "시그널링 경로"를 구성하고 상기 경로는 기능적으로 활성 IFN 단백질에 의하여 활성화되는 것이 공지되었다[Williams, B. R. (1991) Eur . J. Biochem. 15: 1-11 ; David, M. (1995) Pharmacol . Ther . 65: 149-161].
"항-증식"분석은 중요한 실험 단백질이 지시 세포 배양의 성장을 억제하는 임의 능력에 대해 측정되는 생물학적 분석이다. 유용한 측정이 되기 위해서, 적합한 대조 실험은 병행하여 수행되엇다. 특히 적합한 항-증식 분석은 Mark 등 [Mark, D. F. (1984) Proc . Natl . Acad . Sci. USA 81: 5662-5666]에 의해 기재되고 개질된 형태로 본 발명에서 예시적으로 설명되었다. 기타 분석 유형은 ED50 측정을 가능케 하기 위해 상기 실험 분자의 특이적 활성의 정량적 추정치를 계획할 수 있고 또한 제공할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 개질된 IFNα 체를 암호화하는 핵산에 관한 것이다. 상기 핵산은 바람직하게 발현 벡터내에 포함된다. 상기 원핵생물에 적합한 조절 서열은 예를 들어, 프로모터, 임의 오퍼레이터 서열, 및 리보좀 결합부위를 포함한다. 진핵세포는 프로모터, 인핸서 및 폴리아데닐 시그널을 이용하는 것으로 공지되어있다. 일반적으로 상기 핵산은 선택이 통상적으로 숙주 세포의 생존을 위해 제공할 수 있는 단백질을 암호화하는 부가적인 유전자를 의미하는것을 포함한다. 상기 선택 유전자의 예는 일부 E. coli 숙수 세포에 적합한 베타 락타메이스이고 상기 및 기타는 종래기술에 잘 공지되어있다["Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2판 (Sambrook 등, 1989) ; "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (J. M. Miller & M. P. Calos, eds., 1987) ;"Current Protocols in Molecular Biology" (F. M. Ausubel 등 , eds., 1987)].
핵산은 또 다른 핵산과 기능적인 관계에 놓여있을 때, "작동 가능하게 연결(operably linked)"이다. 예를 들어, 폴리펩티드의 분비에 참여하는 프레단백질로서 발현될 때, 예비 서열 또는 분비 선도를 위한 DNA는 폴리펩티드에 대한 DNA에 실시가능하게 연결된다; 상기 서열의 전사에 영향을 줄 때, 코딩하는 서열에 프로모터 또는 인핸서가 작동가능하게 연결된다; 또는 번역을 촉진하기 위해 배치될 때, 리보좀 결합 부위는 코팅하는 서열에 작동가능하게 연결된다.
일반적으로,"작동가능하게 연결된"은 연결되는 DNA서열이 인접해 있고 분비 선도자의 경우 인접해 있으며 동일한 판독틀내에 존재함을 의미한다.
그러나, 인핸서가 근접해야할 필요는 없다. 연결은 적절한 제한 부위에서의 연결에 의해 달성된다. 상기 부위가 존재하지 않을 때, 상기 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터 또는 링커는 통상적인 기술에 따라 사용되었다.
일부 구현예에서, 발현 벡터는 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결된 IFNα 변형체를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 다양한 구현에서 상기 발현 벡터는 서열 번호 2 내지 서열 번호 22를 모두 포함하는 군으로부터 선택된 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 상기 발현 벡터는 적합한 발현 조절 및 선택 서열과 작동가능하게 연결된 상기 단백질중 하나의 도메인을 암호화하는 하나 이상의 IFNα을 포함할 것이다. 상기 발현 벡터는, 폴리뉴클레오타이드에 관한 변성이 유전자 코드에서 많은 아미노산이 하나 이상의 코돈에 의해 한정되는 것으로 잘 인지된 사실에 관한 것인 상기 핵산의 변성 버젼을 포함한다. 상기 코드의 변성은 DNA를 포함하는 4개의 상이한 염기의 64의 가능한 삼중 서열에 의해 암호화된 20개 상이한 아미노산을 설명한다.
본 발명의 또다른 관점은 상기에 언급한 벡터를 하나 이상 포함하는 배양된 세포이다.
본 발명의 추가의 측면은 상기 발현 벡터로부터 IFNα의 발현을 허용하는 조건하에서 상기 언급된 세포 배양 및 상기 세포로부터의 IFNα정제를 포함하는, 개질된 IFNα의 제조 방법이다.
또다른 측면에서, 본 발명은 IFNα 조성물을 사용한 인간의 치료적 처치 방법에 관한 것이다. 개개인에 투여를 위해, 임의의 개질된 조성물은 바람직하게 80% 이상의 순도를 가지며 발열물질 및 기타 불순물없이 제조될 것이다. 추가로, IFNα 단백질의 치료학적 조성물이 약학적 허용가능한 부형제와 결합하여 사용될 수 있는 것이 이해된다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 통상 사용되는 물질을 포함하여 부형제, 담체, 보조제 및 완충액을 포함하여 통상적으로 제조된다(예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, (Alfonso R. Gennaro ed. 18th edition 1990). 상기 조성물은 예를 들어, 비경구적, 장내, 근육내, 피하, 정맥내 또는 효과를 달성하는대 유용한 기타 경로로 투여될 수 있다. 통상적인 부형제는 상기 제제와 해롭게 반응하지 않는 비경구, 장내 및 기타 경로의 투여용으로 적합한 약학적으로 허용가능한 유기 또는 무기 담체 물질을 포함한다. 비경구 투여용으로 좌제를 포함하여, 멸균 주사액, 바람직하게는 오일 또는 수용액, 및 현탁액, 에멀젼 또는 임플란트가 특히 적합하다. 앰플은 적절한 단위 조제이다. 상기 약학적 제제는 멸균될 수 있고, 필요하다면, 안정화제, 습윤제, 유화제, 삼투압 조절 염, 완충액 또는 활성 화합물과 해롭게 반응하지 않는 기타 물질과 혼합될 수 있다.
본 발명의 주요 구현예는 단백질 서열 번호 2-22에 의해 포함된다. 상기 단백질은 "Fc-X" 유형(식중, 본 발명에서, X는 IFNα 뮤테인을 포함한다)의 융합 단백질이다. 여기서 상기 융합 단백질은 야생형(WT) IFNα 부분을 함유하는 융합 단백질과 비교하여 증가된 활성을 보인다. 본 발명자에 의해 수행된 "WT" 또는 "본래의" 융합 단백질은 IFN120 (서열 번호 23) 및 IFN5 (서열 번호 1)로 나타내었고, 구조 (G)4S(G)4S(G)4SG의 링커 펩티드의 존재 또는 부재에 대해서만 상이하다. 명확성을 위해, IFN5는 상기 링커를 함유하지 않는다.
시그널링 분석을 이용하여, 상기 링커가 있거나 없는 본래의 융합 단백질은 본 발명에서 4.5 및 5ng/ml의 아주 유사한 ED50값을 가지는 것을 발견하였다. 상기 발견은 본래의 IFNα에 대해, Fc 와 IFNα 분자 사이의 링커의 존재는 활성에 아무 영향을 주지 않는다는 것을 입증하였다.
대조적으로, 다소 놀랍게도 본 발명의 가장 바람직한 분자는 시그널링 분석에서 3.4 및 0.5 ng/ml의 ED50 값을 갖는 IFN311(서열 번호 3) 및 IFN316(서열 번호 2)이므로, 대조군보다 >1.3× 및 >9× 초과로 더 활성이다. 상기 분자가 INFα 뮤테인인 경우, 상기 결과는 상기 서열에 대한 변화가 활성에 이로운 영향을 주는 것으로 나타난다.
2 또는 3 또는 4 또는 5 개의 아미노산 치환체를 함유하는 기타 IFNα 뮤테인은 또한 시그널링 분석에 의해 개선된 상대 활성이 발견된다. 2개 치환체를 가진 각각의 예들은 2, 7, 5 및 4 배의 활성의 개선을 보이는 IFNα 단백질 IFN197(서열 번호 12), IFN201(서열 번호 11), IFN202(서열 번호 10), IFN306(서열 번호 4)를 포함한다. 또한 3개의 치환체를 가진 각각의 단백질 IFN173(서열 번호 15), IFN176(서열 번호 13), IFN219(서열 번호 9)은 각각 10, 5, 및 17 배의 개선된 활성을 보인다. 4개의 치환체를 가진 INFα 단백질 IFN174(서열 번호 14)는 시그널링 활성에서 5배의 개선을 보였다.
시그널링 분석에서 활성에 대한 상기 이로운 효과는 다수의 치환체를 함유하는 뮤테인에 제한되지 않는다. 그리하여 예를 들어, 단일 변이 IFNα 단백질 IFN28(서열 번호 22)는 10배 증가된 상대 활성을 나타낸다. 유사하게 시그널링 분석에 대해 단백질 IFN64 (서열 번호 21)는 3배 이상의 증가된 활성을 보이고, IFN164(서열 번호 20)는 3배의 증가된 활성을 보이고, 단백질 IFN167(서열 번호 19) 및 IFN168(서열 번호 18) 둘다 2배의 개선을 보이고, 단백질 IFN171(서열 번호 17)는 4 배의 개선 및 단백질 IFN172(서열 번호 16)는 7배의 개선을 보인다.
시그널링 활성이 IFNα 단백질 기능성의 유용한 지표이고 IFNα 뮤테인의 빠른 스크리닝 분석으로서 발명자에 의해 사용된 반면, 항바이러스 활성은 IFNα유효성 및 더욱 실제적인 대용약의 가능한 임상 활성의 정도를 측정하기 위한 인지된 국제 표준이다. 따라서, 항바이러스 활성은 상이한 IFNα 분자의 활성과 비교하여 사용되고 본 발명자는 본 발명의 가장 바람직한 분자가 임상적으로 유효성 검증된 IFNα 제제의 범위내에 활성을 보여주는 것을 확인하는 경우에서 사용된다. 더욱 특히, 융합 단백질 IFN316은 13% 표준 활성을 가지는 반면, Peg-Intron®, Pegasys® 및 Albuferon®은 개별적으로 28%, 10% 및 7% 를 가진다고 보고되고있다[Osborn BL, 등. (2002); J Pharmacol. Exp. Ther . 303: 540-548; Grace M, 등 (2001) J Interferon Cytokine Res. 21: 1103-1115 ; Bailon P, 등 (2001) Bioconjug Chem. 12: 195-2029,10,11].
단백질의 항바이러스 인터페론 수용체로부터 세포의 핵 내의 새로운 유전자 발현에까지 연장되는 것과 같이, 세포내 신호전달 경로를 유발할 수 있는 단백질의 기능이다. 시그널링 활성 및 항바이러스 활성 사이의 개선의 일치는 예상되는 결과이고 본 발명의 IFNα 뮤테인에 대해 해당되는 것을 보여주었다. 그리하여, 각각 5개의 치환체를 가지는 IFNα 단백질, IFN270(서열 번호 7), IFN273(서열 번호 6) 및 IFN276(서열 번호 5)는 각각, 상대적 항바이러스 활성에서 6배 초과, 4배 초과 및 추가로 4배 초과의 개선을 보이는 반면, 상대적 시그널링 활성에서 각각 2배, 3배 및 추가로 3배의 개선을 보였다. 하나의 IFNα 뮤테인 상기 측면에서 대조군과 동일한 시그널링 활성에서 개선을 보여주지 않았지만 항 바이러스 활성의 개선은 2배 초과(약 2.8)를 나타냈다. 상기 뮤테인은 단백질 IFN248(서열 번호 8)이고 3개 치환체를 함유한다.
본 발명의 IFNα 뮤테인은 모 분자보다 낮은 면역원성을 갖도록 구성되었다. 개개의 뮤테인의 디자인은 기능적 활성 데이타뿐만 아니라 면역 고려사항으로부터 정해졌다. 분자내의 면역학적으로 중요한 세가지 부위는 건강한 공여자 대상체 및 이전에 치료적 IFNα(IntronA®)의 처치를 받은 개체로부터 PBMC 제제를 포함하는 스크리닝 분석을 이용하여 정의되었다. 광범위하게, IFNα 뮤테인은 3개의 확인된 면역원성 부위내에 변이를 함유하며 구성되었다. 잔기는 포켓 1내에 소수성 아미노산에 대해 거의 배타적인 선호성을 가지며 이것은 펩티드 결합의 가장 중요한 측정자인 HLA-DR 분자의 공지된 결합성을 기초로 하여 표적화된다[Jardetzky, T. S. 등 (1990), EMBO J. 9 : 1797-1803; Hill, C. M. 등 (1994) J ; Immunol. 152: 2890-2898]. 철저한 돌연변이 분석은 융합 단백질의 상기 활성에 역효과없이 변화할 수 있는 상기 부위내에서 상기 잔기를 증명하였다(표 2). 교체 잔기의 선택은 해결된 NMR 구조에서 표적의 위치[Klaus, W. 등 (1997), J. Mol . Biol . 274: 661-675] 및 인간 IFNα 단백질 및 기타 종으로부터 비교에 의해 좌우된다. 숨겨진 잔기는 알라닌 또는 유사한 크기의 비-소수성 잔기로 대체되는 반면, 노출된 잔기는 모든 가능한 비-소수성 대체물로 스캔된다.
T-세포 분석은 또한 인간 T-세포의 기능적 활성화를 포함하는 중요한 잔기의 정밀 맵핑 작성할 수 있는 형태로 적용된다. 본 발명은 다양한 합성 펩티드를 사용함으로써 중요한 부위의 스캔 및 공지된 민감한 공여 샘플을 이용하여 수행하였다. 돌연변이 스캐닝 T-세포 분석은 상기 스캐닝 아미노산으로서 알라닌을 이용하여 수행되었고, 활성 데이터가 이미 사용가능하여 선택에 영향을 주는 것을 제외하였다. 상기 접근은 이의 위치를 포함하는 T-세포 에피토프의 면역원성에 개개의 아미노산 잔기의 제공을 강조할 수 있다. 상기 면역원성에 포함된 중요한 잔기의 변형이 가장 요구되면서, 이는 단백질 기능을 유지하는 것은 언제나 양립할 수 없다. 다수의 치환체는 면역원성을 제거할 수 있는 단리된 어느 것은 사용될 수 없지만, 그럼에도 불구하고 조합으로는 다른 면역원성 부위의 면역원성 잠재력의 감소에 효과적이다. 본 발명의 경우, 에피토프 정밀 맵핑 연구(표 4) 이후에 조합 돌연변이체의 T-세포 분석은 가장 좋은 치환체의 조합으로 중요한 부위의 감소된 면역원성을 증명하고 기능을 유지할 수 있게 정의할 수 있다.
추가로 확증적인 T-세포 분석은 가장 바람직한 치환체 세트로 감소된 면역원성을 증명하기 위해 다수 돌연변이 세트(표 3)의 모든 조합을 함유하는 합성 펩티드를 사용하여 수행되었다. 상기 후자 분석은 상기 분자의 3 면역원성 부위의 각각을 스패닝하는 합성 펩티드를 이용하여 수행하였고 IntronA®로 치료되었었던 환자 및 건강한 공여자 둘 모두의 PBMS를 사용하여 시간-경과 T-세포 분석으로 작동하였다;. 이는 항-증식 특성에 기인하는 T-세포 분석으로 정제된 단백질을 실험할 수 없는 것을 인지할 것이다.
개선된 특성의 IFNα 뮤테인의 일반적인 회수 방법은 하기를 포함한다;
a) T-세포 에피토프의 동정;
b) T-세포 에피토프 부위내에 단일 아미노산 치환을 수행하고 기능적 활성인 뮤테인을 선택함;
c) 임의로, T-세포 활성화에 관여된 중요한 잔기에 대한 정밀 맵핑 연구를 수행하고 면역원성에 대해 이중 또는 삼중 이상의 치환을 시험함;
d) 가장 선호하는 기능 및 다중 치환된 뮤테인으로서 구성하기 위한 면역원성 프로필 및 상기 동일한 신규 단백질을 시험하는 기능을 갖는 개개의 뮤테인을 선택함;
e) 시험 경과 면역원성 분석을 이용하여 감소된 면역원성에 대해 기능적으로 활성인 다중 치환된 뮤테인 서열을 시험함;
ㆍ 이와 함께, 본 발명자들은 하기 구조로 나타낼 수 있는 개선된 IFNα 단백질을 정의 할 수 있었다:
[식중,
X0는 Fc 또는 Fc-링커,
Fc 는 항체의 Fc 도메인
링커는 6 내지 25 개의 아미노산으로 이루어진 링커 펩티드
Xl = I, Q
X2 = H, Y
X3 = I, T;
X4 = F, T, A
X5 = W, H;
X6 = Y, D;
X7 = I, N, T, P, R
X8 = L, T, H, D, S, N 및
X9 = N, S;
단, 동시에 X1=I, X2=H, X3=I, X4=F, X5=W, X6=Y, X7=I, X8=L 및 X9=N인 IFNα분자는 제외된다].
하기의, 도면, 서열 목록, 실시예들은 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공되었다.
본 발명의 범위를 벗어나지 않고 진술한 절차에서 변형이 이루어질 수 있는 것으로 이해된다.
[서열의 설명]
본 발명의 이해를 돕기 위해, 하기 표 1은 융합 단백질 IFNα뮤테인의 설명에 대해 진술한다. 상기 단백질의 유도체 및 특성은 또한 실시예에 더욱 완전히 개시된다:
*IFN 치환체의 잔기 넘버링은 IFN 리딩프레임의 잔기 1로부터 시작되고 임의 Fc 구성성분과 관계없다.
실시예 1
IFNα 2b의 클로닝 및 돌연변이
본 발명의 개질된 IFNα 단백질은 통상적인 재조합 DNA 기술을 이용하여 제조되었다. 상기 성숙한 IFNα2b를 코딩하는 서열을 PCR을 이용하여 인간 태반의 DNA (Sigma, Poole, UK)로부터 클로닝하였다. 야생형 유전자를, 특정위치 돌연변이(site directed mutagenesis)에 의해 개질된 IFN 단백질이 유도되는 것으로 주형 및 대조 반응물로서 사용하였다. WT 및 개질된 유전자를 발현 벡터 pdC-huFc로 삽입시켜[Lo K-M 등 (1998) Protein Eng 11: 495-500], IFNα2b 서열은 인간 IgG1의 hinge/CH2/CH3 Fc 부위의 C-말단에 직접 융합하였다. 상기 벡터내 WT IFN 단백질은 IFN5로 나타내었다.
상기 직접 융합 이외에, 상기 벡터를, CH3의 C-말단 및 IFNα 2b의 N-말단 사이에 유동적인 링커가 함유되도록 변형시켰다. 상기 링커의 아미노산 서열은 (G)4S(G)4S(G)3SG이고 링커를 가진 WT IFN 단백질은 IFN120로 나타내었다. 일부 변이 IFN 단백질은 양 벡터 유형에서 발현되므로, 예컨대, 변형체 IFN311 (서열 번호 3) 및 IFN316 (서열 번호 2)은, 이의 IFN 도메인내 동일한 치환체 세트를 포함하기는 하나 (G)4S(G)4S(G)3SG 링커에 있어서는 상이하다. IFN316 가 상기 링커를 포함하는 반면 IFN311는 직접적인 융합이다.
DNA 서열분석은 모든 구성체에서 수행되었다. 상기는 목적하는 치환체의 도입을 확인하기 위해 애써 수행되었고 이질적인(목적하지 않은) 치환체가 예를 들어, PCR 에러에 의해 도입되는 것이 없음을 확증하기 위해 수행되었다.
WT 및 변형 IFN 단백질에 대한 기술 및 클로닝 방법의 자세한 내용은 [WO 02/085941]에 설명되어있고, 일반적으로 종래 기술에 알려져있다.
실시예 2
IFNα 뮤테인 디자인
인간 IgG1의 Fc 부분에 연결된 IFNα2b의 변형체는 상기 단백질의 3개 면역원성 부위내에 변이를 함유하여 수행하였다. 구조 및 기능 실험을 포함하는 돌연변의 분석의 반복으로 Fc-연결 단백질의 활성에 역효과를 주지않고 변형될 수 있는 상기 부위내에 상기 잔기를 확인하였다. 본 발명에 기재된(실시예 5 참고) 시그널링 분석은 상기 측면에서 주요 스크리닝 수단이었다. 돌연변이 분석의 결과는 표 2 에 나타내었다.
대체 잔기의 선택은 해명된 NMR 구조에서의 표적의 위치[Klaus, W. 등 (1997), J. Mol . Biol . 274: 661-675] 및 인간 IFNα 단백질 및 기타 종의 것과의 비교에 의해 결정되었다. 숨겨진 잔기는 알라닌 또는 유사한 크기의 비-소수성 잔기로 대체된 반면, 노출된 잔기는 모든 가능한 비-소수성 대체물에 의해 스캐닝되었다.
부위 1에서, 현저하게 활성이 개선되면서 성공적으로 대체될 수 있는 유일한 소수성 잔기는 I24. L26, F27 및 L30이었으나, 잘 노출된 것은, 세포간 기능을 가진 명확한 소수성 패치(patch)를 형성하기 때문에 변화할 수 없었을 것으로 추정된다.
부위 2에서, 잘 노출된 잔기는 유일한 활성이 약간 떨어진 A로 변화된 F64였다. 잔기 I60 및 I63은, 비록 가장 숨겨져 있지만, 성공적으로 상기 잔기가 놓인 알파-헬릭스에 수소 결합을 첨가 할 수 있는 유사 크기의 잔기인 T로 변화되었다. 비록 실질적으로 숨겨져있지만, 상기 분자의 끝쪽으로 놓인, 잔기 W76는 활성에 중요한 이점을 가진 H로 변화되었다.
부위 3에서, 성공적으로 변화할 수 있는 유일한 잔기는 잘 노출된 것이다. I116 및 L128로의 변화는 활성에 중요한 이점을 주고 L117의 변경은 약간 감소된 활성을 야기하였다.
면역원성 부위 3 에서 수행된 스캐닝 T-세포 분석의 데이타는 또한 추가로 디자인 방법을 다듬도록 포함되었다(표 4 및 5, 실시예 9 참고). 반면, 면역적으로, 가장 바람직한 단일 치환체는 F123일 수 있고, 이는 임의의 유용한 시그널링 활성과 양립할 수 없었다. 대조적으로, 잔기 I116 및 L128에서의 치환체의 조합은 상기 부위에 T-세포 반응을 조정하는 것이 확인되었다. 각각 위치에서의 추가 치환을 시험한 결과 좋은 활성을 보이는 측쇄 크기의 범위를 포함하였다. 상기 치환체는 T, N 및 R에 대해 I116, 및 N, H 및 R에 대해 L128이었다. 9개 돌연변이체는 허용가능한 활성을 주는 부위 1 및 2 에서의 상기 변이와 함께 상기 각 잔기의 조합을 포함하도록 제조되었다(I24Q, I60T, F64A, W76H).
I24Q, I60T, F64A, 및 W76H와 함께 I116R 및 L128N을 함유하는 조합된 뮤테인은 Fc 및 IFNα 융합 파트너(개별적으로 IFN316 및 IFN311) 사이에 유동적인 링커를 함유하거나 함유하지 않는 유형으로 제조되었다.
실시예 3
융합 단백질의 트랜스펙션 및 정제
일시적인 트랜스펙션은 제조업자에 의해 기재된 바와같이, HEK293 (ATCC# CRL-1573) 세포 및 Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Paisley, UK)를 사용하여 수행하였다. 안정적 트랜스펙턴트는 이전에 기재된 전기천공법(electroporation)을 이용하여 NSO 세포 (ECACC# 85110503)에서 제조하였고[Baum C, 등 (1994) Biotechniques 17: 1058-106224] lOOnM 메토트렉세이트를 함유하는 배지에서 선택하였다. 모든 세포주는 항생제 및 항진균제를 포함한 10% FBS와 DMED내에서 유지시켰다. 융합 단백질은 Prosep-A 크로마토그래피 다음에 크기배제크로마토그래피(SEC)를 통해 정제시켰다. 간단하게, 1ml Prosep®-A 컬럼(Millipore, Watford, UK)은 1/20 부피 1M Tris-HCl pH 7.4로 pH를 조정한 여과된 세포-배양 상층액(500ml이하) 0.2㎛μM를 로딩하기 전에 PBS pH 7.4로 평형시켰다. 상기 컬럼은 50ml PBS pH 7.4로 세척시키고 융합 단백질 O.1M 시트르산 완충액 pH 3.0로 용출시키고 0.9ml 분획을 수획하였다. 상기 분획을 즉시 0.1 ml 1M Tris-HCl pH 8.0로 중화시켰다.
SEC는 평형된 3.2/30 컬럼으로 Superdex 200(Amersham Pharmacia, Amersham, UK)을 이용하여 수행시켰고 0.1% 트윈(Tween) 80를 함유하는 PBS pH 7.4에서 작동시켰다. 주요 피크를 스패닝하는 분획을 모으고 융합 단백질은 Lasergene™ software (Dnastar, Madison, WI, USA)를 이용하여 측정된 280nm에서의 몰 흡광계수(molar extinction coefficient)를 사용하여 정량하였다. 상기 농도는 BCA 단백질 분석 (Pierce, Chester, UK)을 이용하여 확인하였다. 상기 IFNα 구성성분은 융합 단백질의 분자량의 42%를 나타내므로 상기 농도를 상기 요소에 의해 조정하였다.
실시예 4
세포 배양 상층액내의 융합 단백질의 정량
융합 단백질을 하기와 같은 ELISA 포맷에서 인간 IgG1 Fc의 양을 검출하여 정량하였다: ELISA 플레이트(Dynex Immulon4)는 100 ㎕ℓ/웰, 37℃에서 2시간동안 PBS pH 7.4으로 1/1500로 희석으로 마우스 단일클론 항-인간 IgG Fc 특이적 항체로 코팅시켰다. 상기 플레이트는 100㎕/웰 PBS/0.05% 트윈 20으로 4번 세척시켰다. 인간 IgG 표준(결합부위(The Binding Site), Birmingham, UK)를PBS/2% BSA의 2g/ml에 용해시키고 상기 플레이트에 수직으로 부어 2배 희석을 2회시켰다. 실험 샘플은 PBS/2% BSA로 1/100 및 1/500 희석시키고 두번 분석시켰다. 상기 플레이트는 1 시간 동안 실온에서 항온처리시키고 상기와 같이 세척시켰다. 검출은 100㎕/웰 염소 항-인간 IgG Fc-특이적 과산화효소 컨주게이트(The Binding Site, Birmingham, UK)를 PBS로 1/1000의 희석으로, 사용하여 수행하였다. 상기와 같이 플레이트를 세척시키고 SigmaFast OPD, 100㎕/웰 (Sigma, Poole, UK)을 이용하여 발색시킨다. 상기 발색반응은 50㎕ 2M 황산의 첨가로 중단시키고 흡광도는 Anthos HTII 플레이트 판독기로 492nm에서 측정하였다.
실시예 5
Fc -IFNα 2b 활성 분석 (시그널링 분석)
변형체를 코딩하는 플라즈미드 및 WT IFN 융합 단백질은 HEK293 세포로 일시적으로 트랜스펙션시키고 3일 후에, 세포 배양 상층액을 상기 융합의 Fc 부분에 대해 정량시켰다. 상기 상층액을 시그널링 분석을 이용하여 활성에 대한 분석을 하였다.
상기 분석의 활성 측정은 상기 세포 표면에서 발현되는 인터페론 수용체 I 유형의 유발(활성)을 요구하였다. 상기 활성화된 수용체는 상기 세포 내에 Jak/STAT1 시그널링 경로의 활성화를 이끌었다. 상기 경로는 인터페론 자극 반응 원소(Stimulated Response Element (ISRE))를 결합할 수 있는 단백질 STAT1의 인산화를 시켰다. 상기 ISRE는 이의 하부에 연결된 유전자(예를 들어. 정보제공유전자(reporter gene))의 전사를 촉진할 수 있는 시스-작동 DNA 단편이다.
본 발명의 융합 단백질이 인터페론 수용체 I 유형으로부터 신호전달(시그널링)을 유도하는 능력을 상용되는 신호전달 수용체 벡터, pISRE-TA-luc(Clonetech Europe, Brussels, Belgium)를 이용하여 분석하였다. 상기 벡터는 인터페론 자극 반응 원소(ISRE)의 조절 하에서 반딧불 루시페레이스 유전자를 포함하였다. ISRE/루시페레이스 카세트(NotI/BamHI 단편 상의)는 RSV 프로모터/MCS/SV40 polyA (SalI 분해를 통해 제거)대신에 에피좀 포유동물 발현 벡터 pREP4 (Invitrogen, Paisley, UK)에 트랜스펙트되어 pREP-ISRE를 만들었다. 상기 벡터는 HEK293 세포 및 100㎍/ml 히그로마이신(hygromycin)으로 선택된 안정적 발현세포로 트랜스펙션시켜 HEK-ISRE 세포를 만들었다. Fc-IFNα2b 활성의 분석은 HEK-ISRE 세포를 4×105 세포수/ml의 밀도로 흑색 벽면, 투명한 바닥의 96 웰화학발광측정기(luminometer) 플레이트(Greiner, Stonehouse, Glouc., UK)의 웰(100㎕/웰)에 평판배양시키고 항생제 없는 일반적인 조건에서 24시간 동안 배양시킴으로써 수행시켰다.
표준 IFNα2a 2×108 IU/mg (Peprotech, London, UK)의 이중의 연속 희석 및 항생제 없는 배지의 융합 단백질은 상기 플레이트에서 붓고 하룻밤동안 배양시켰다. 루시페레이스 활성은 상기 공급처에 의해 지시된 바와같이 제조된 100㎕ Steady-Glo 시약(Promega, Southampton, UK)의 첨가에 의해 검출시키고 나서 Wallac Microbeta Trilux 화학발광측정기를 이용하여 발광 측정하였다.
도 1 각각의 IFNα 뮤테인의 상대 활성을 표로 만들었다. 도 2는 융합 단백질 IFN5, IFN120, IFN311 및 IFN316에 대한 시그널링 활성 곡선을 보여준다. 상기 결과는 상기 변형체 융합 단백질이 본래의 융합 단백질 (개별적으로 상기 링커가 있거나 없는 IFN120 및 IFN5)와 비교하여 증가된 활성을 보여준다. 링커가 있거나 없는 본래의 융합 단백질은 개별적으로 4.5 및 5 ng/ml의 ED50값과 매우 유사하고, Fc 및 IFNα 분자 사이에 링커의 존재시에 본래의 IFNα는 활성에 효과가 없는 것을 증명하였다. 상기 서열의 변화가 활성상에 이로운 효과를 갖는 것을 증명하며 IFN311 및 IFN316은 3.4 및 0.5 ng/ml ED50값을 가져서 대조군보다 >1.3 × 및 >9 × 이상이다. 상기 분석의 놀라운 결과는 본래의 IFNα 구조물과 비교하여, Fc 및 IFNα 사이의 링커의 존재는 융합단백질의 활성을 증가시켰다.
융합 단백질 IFN311 및 IFN316의 시그널링 활성은 또한 본래의 IFNα 제제(Peprotech, London, UK)와 비교하였고, 상기 활성 곡선은 도 3a 에 나타내었다.
실시예 6
개질된 Fc-IFNα2b 융합 단백질의 활성(항 증식):
융합 단백질의 항-증식 특성을 Daudi 세포 증식의 억제에 의해 평가하였고 하기에 의해 수행시켰다: Daudi 세포 (ATCC#; CCL-213)을 RPMI1640 + 10% FBS + 항생제 (Daudi 배지)에서 배양시켰다. 대수증식기 중간에 있는 세포를 2 ×105 세포/ml로 희석시키고 75㎕/웰에서 96웰 마이크로티트레로 평판배양시켰다. 표준 IFNα2a (Peprotech)의 희석 및 융합 단백질은 75㎕ Daudi 배지에서 세번 제조하였고 상기 세포를 첨가시켰다. 연속 ¼ 희석은 상기 플레이트를 통해 제조시켰다; 그러므로 1 표준 및 하나의 시험 샘플을 플레이트당 분석하였다. 상기 플레이트는 3일동안 배양시켰다. 검출은 발명자에 의해 기재된 바와 같이 제조된 Aqueous One 시약(Promega)를 사용하여 수행하였다. 30㎕ 시약을 각각의 웰에 첨가시켰고, 상기 플레이트를 4시간동안 배양시키고 상기 Anthos HTII 플레이트 판독기를 사용하여 492nm의 흡광도를 판독하였다.
도 3b은 본래의 (비융합 단백질) INFa 제제 (Peprotech)에 대해 융합 단백질 IFN311 및 IFN316의 도면화된 항-증식 특성을 나타내었다.
실시예 7
개질된 Fc-IFNα2b 융합 단백질의 활성 (항바이러스):
융합 단백질의 항 바이러스 특성은 이전에 [Rubinstein S, 등 (1981) J Virol . 37: 755- 758]에 기재된 바와 같이 인간 폐 암종 A549 세포 (ATCC# CC1-185)상의 뇌심근염 바이러스(encephalomyocarditis virus (EMCV))의 세포변성효과의 저해에 의해 분석하였다.
도 1은 상기 분석에서 일부 IFNα 뮤테인의 상대 활성에 대해 표로 만들었다. 최대 상대 활성은 융합 단백질 IFN316에 의해 나타났으며, 여기서 계산된 대조구에 대한 배수 증가는 36이었다. 놀라운 결과는 IFN316내 링커의 존재는 링커 없는 대응물 IFN311(상대 활성 = 7.4)과 비교하여 이의 항바이러스 활성에 뚜렷한 이로운 효과를 가지는 것이었다. 상기 뚜렷한 차이는 링커가 있거나 없는 WT IFNα 융합 단백질(IFN5 대 IFN120)의 비교시에는 보여지지 않았다. 도 3c는 본래의 (비융합 단백질) INFa 제제(Peprotech)에 대한 융합 단백질 IFN311 및 IFN316의해 도시된 항바이러스 활성을 나타내었다.
실시예 8
인간 IFNα의 T-세포 에피토프 맵핑 및 시간-경과 T-세포 분석에 의한 면역원성 부위의 분석:
인간 IFNα의 T-세포 에피토프 초기 맵핑은 합성 펩티드 및 건강한 공여자의 PBMC를 이용하여 수행하였고 상기 분석의 결과 및 설명은 다른 문헌 [WO 02/085941]에 설명되어있다. 추가로 IFNα내에서 확인된 Rl, R2 및 R3로 불리는 3개의 면역원성 부위의 분석을 시간-경과 T-세포 분석으로 수행하였다. 상기 분석은 NICE 가이드라인(환자 연구는 Dr G. Alexander, Addenbrooke's Hospital, Cambridge, UK와 공동연구하였다)에 따라(20명의 건강한 사람(일반 HLA-DR 대립유전자의 >80% 를 포함하도록 선택된)및 또한 IFNα2b (IntronA®)로 이전에 치료된 만성 HCV 감염 환자 20 명으로부터 얻은 혈액으로부터 단리시킨 PBMC를 이용하여 수행시하였다.
면역원성 에피토프 R1, R2 및 R3를 손상되지 않은 IFNα 단백질의 면역활성 특성이 상기 분석과 양립하지 않기 때문에, 합성 펩티드로서 실험하였다.
상기 분석에서, 24 웰의 플레이트의 웰 당 2-4×106 PBMC의 벌크 배양액을, 면역원성 부위를 스패닝하는 펩티드로 6 내지 9일 동안 배양시켰다(표 3 참조). 증식은 벌크 배양액을 가볍게 재현탁함으로써 다양한 시점에서 평가되었고 PBMC의 샘플을 제거하고 나서 Tomtec Mach III 플레이트 수확기를 이용하여 유리섬유 필터 매트상에서 수확하기 전에 18시간 동안 U자형 바닥 96 웰 플레이트의 3중 웰에서 삼중소 티미딘을 웰 당 1μCi로 사용하여 배양하고 Wallac Microplate Beta 계수기를 이용하여 섬광계수하여 cpm 값을 측정하였다.
*개질된 서열을 구성하는 아미노산 치환체는 밑줄로 나타낸다.
도 4a는, 면역원성 부위 1, 2 및 3을 스패닝하는 펩티드로 자극에 대해 건강한 개인이 모든 양성 반응 (SI>2)을 보였다. 6명의 공여자에서 야생형 펩티드에 양성 반응을 보인 반면, 개질된 펩티드는 임의 건강한 사람에서 증식을 유도하지 못했다(도 4a). HCV 환자는 또한 개질된 펩티드에 대해 이들이 부위 3에만 반응한 반면, 모든 3 가지 부위의 야생형 펩티드에 반응하는 것으로 확인되었다(도 4b). 펩티드에 대한 반응의 빈도수의 분석은 HCV 환자에서는, 부위 3이 반응의 가장 높은 빈도수(25%), 다음으로 부위 1(10%) 및 그 다음으로 부위 2 (5%)를 유도한 반면, 부위 2 및 3은 시험된 건강한 공여자의 15%에서 가장 빈번하게 증식을 유도하는 것으로 나타났음을 보여주었다(도 4c).
상기 및 기타 데이타로부터, T-세포 에피토프 맵핑의 결과는 펩티드가 건강한 공여자의 가장 높은 빈도수로 증식을 유도하는 부위 3으로부터 되는 것을 보여주기 때문에 부위 3은 면역우성 T-세포 에피토프를 함유한다고 여겨졌다[WO 02/085941]. 건강한 사람은, 부위 1 펩티드에 반응이 7일째 나타나지만(도 4a, 공여자 11 및 공여자 13), 반면, 증식은 오직 6일째 HCV 환자 T-세포 반응에서만 검출되었다. 부위 2 펩티드는 건강한 공여자(도 4a, 공여자 6 및 공여자 18)에서 9일 째 증식을 유도하는 경향이 있는 반면, 오직 HCV 환자 T-세포 반응은 8일째에 관찰되었다(도 4c, 공여자 13). 부위 1 및 2 반응과 다르게, 상기 부위 3 펩티드는 건강한 사람이 HCV 환자보다 더 빠르게 증식이 각각 7일 및 8일 째 유도된다.
실시예 9
IFNα 면역원성 부위 3의 스캐닝 T 세포 분석
면역원성 부위 3에서 수행된 스캐닝 T-세포 분석의 데이타는 또한 뮤테인 고안 방법을 추가로 정제하는 것을 포함하였다. T-세포 분석은 13명의 공여자 샘플로부터 PBMC를 사용하여 수행되었다. (적어도 중요한 WT 펩티드서열에 반응하는 것이 예측되는 것의 대다수) 8 개의 합성 펩티드 류는 IFNα의 T108-W140 잔기를 스패닝하며 제조되었다. 펩티드과는 표 4에 확인된 바와 같이 WT 서열 및 7 상이한 치환된 서열을 함유하였다.
모든 분석은 3번씩 수행하였다. 13 공여자 샘플의 평균 SI를 측정하였다.
* T-세포 분석은 IFNα잔기 T108-W140를 스패닝하는 펩티드로 수행되었다.
15%의 반응 빈도수를 가진 평균 SI 2.12를 생성하는 야생형 펩티드.
알라닌은 활성 데이타가 이미 선택을 가이드 할 수 있는 것을 제외하고 스캐닝 아미노산으로서 사용되었다(Y122은 변이가 활성이 없기 때문에 스캐닝하지 않는다). F123H는 13 공여자의 패널의 야생형보다 낮은 SI를 갖는 총 T 세포 반응을 감소하는 가장 효율적인 단일 변이를 발견하였다. 그러나 F123는 중요한 활성을 회수하기 위한 변이가 될 수 없다. 일부 변화는 WT에 양성 반응의 동일한 빈도수를 주지만 이는 비록 일부 겹치지만, 동일한 공여자의 부분집합에 반응하지 않았다. 상기 변이체의 평균 SI는 일반적으로 WT 펩티드, 심지어 증가된 양성 반응의 빈도수를 주는 L128A 보다 일반적으로 낮았다. 비록 Vl19A 가 지속적으로 공여자 세트에 높은 SI를 제공하지만 양성 반응의 빈도수는 WT와 유사하였다.
뮤테인의 다른 조합은 면역원성 분석을 이용하여 실험되었다. 9 펩티드는 각 아미노산의 조합을 함유하며 부위 3을 스패닝 하면서 합성하고 T-세포 증식 분석으로 재시험하였다(표 5).
# T-세포 분석은 왼쪽 컬럼에 나타난 부위 3 변이를 함유하는, IFNα잔기 T108-W140를 스패닝하는 펩티드로 수행되었다.
<110> Merck Patent GmbH <120> FUSION PROTEINS OF INTERFERON ALPHA MUTEINS WITH IMPROVED PROPERTIES <130> P03-024-bz <140> PCT/EP/2004/001524 <141> 2004-02-18 <160> 31 <170> KopatetIn 1.71 <210> 1 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a modified interferon alpha 2 molecule <220> <221> SITE <222> (1) <223> Xaa at position 1 is Fc or Fc-Linker <220> <221> SITE <222> (25) <223> Xaa at position 25 is Ile and Gln <220> <221> SITE <222> (58) <223> Xaa at position 58 is His and Tyr <220> <221> SITE <222> (61) <223> Xaa at position 61 is Ile and Thr <220> <221> SITE <222> (65) <223> Xaa at position 65 is Phe, Thr and Ala <220> <221> SITE <222> (77) <223> Xaa at position 77 is Trp and His <220> <221> SITE <222> (90) <223> Xaa at position 90 is Tyr and Asp <220> <221> SITE <222> (117) <223> Xaa at position 117 is Ile, Asn, Thr, Pro and Arg <220> <221> SITE <222> (129) <223> Xaa at position 129 is Leu, Thr, His, Asp, Ser and Asn <220> <221> SITE <222> (157) <223> Xaa at position 157 is Asn and Ser <400> 1 Xaa Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu 1 5 10 15 Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Xaa Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys 20 25 30 Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe 35 40 45 Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu Xaa Glu Met Xaa Gln Gln Ile 50 55 60 Xaa Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Xaa Asp Glu Thr 65 70 75 80 Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Xaa Gln Gln Leu Asn Asp Leu 85 90 95 Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met 100 105 110 Lys Glu Asp Ser Xaa Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr 115 120 125 Xaa Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val 130 135 140 Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Xaa Leu Gln Glu 145 150 155 160 Ser Leu Arg Ser Lys Glu 165 <210> 2 <211> 165 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 15 Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30 Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln 35 40 45 Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe 50 55 60 Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu 65 70 75 80 Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu 85 90 95 Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys 100 105 110 Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu 115 120 125 Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg 130 135 140 Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser 145 150 155 160 Leu Arg Ser Lys Glu 165 <210> 3 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Wild type sequence; 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247-411= modified IFNalpha2 <400> 31 Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 35 40 45 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 50 55 60 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 65 70 75 80 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 85 90 95 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 100 105 110 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 115 120 125 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr 130 135 140 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 145 150 155 160 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 165 170 175 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Tyr Ser 180 185 190 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 195 200 205 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 210 215 220 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 225 230 235 240 Ser Gly Gly Gly Ser Gly Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly 245 250 255 Ser Arg Arg Thr Leu Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu 260 265 270 Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu 275 280 285 Phe Gly Asn Gln Phe Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu 290 295 300 Met Ile Gln Gln Ile Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala 305 310 315 320 Ala Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln 325 330 335 Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr 340 345 350 Glu Thr Pro Leu Met Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr 355 360 365 Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys 370 375 380 Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser 385 390 395 400 Thr Asn Leu Gln Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu 405 410

Claims (13)

  1. 하기 아미노산 서열을 갖는 개선된 생물학적 및 면역원성 특성을 갖는 개질된 인간 인터페론 알파 2(IFNα2) 분자:
    [식중,
    X0= Fc 또는 Fc-링커,
    Fc = 항체의 Fc 도메인,
    링커= 6 내지 25 개의 아미노산으로 이루어진 링커 펩티드,
    Xl = I, Q
    X2 = H, Y
    X3 = I, T;
    X4 = F, T, A
    X5 = W, H;
    X6 = Y, D;
    X7 = I, N, T, P, R
    X8 = L, T, H, D, S, N 및
    X9 = N, S;
    단, 동시에 X1=I, X2=H, X3=I, X4=F, X5=W, X6=Y, X7=I, X8=L 및 X9=N인 IFNα분자는 제외된다].
  2. 제 1 항에 있어서, X5 = H, X8 = N인 IFNα2 뮤테인.
  3. 제 2 항에 있어서, X3 = T, X4 = A인 IFNα2 뮤테인.
  4. 제 1 항 내지 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 IFNα2 뮤테인:
    (i) X1=Q, X2=H, X3=T, X4=A, X5=H, X6=Y, X7=R, X8=N 및 X9=N
    (ii) X1=Q, X2=H, X3=I, X4=F, X5=H, X6=Y, X7=I, X8=L 및 X9=N
    (iii) X1=I, X2=H, X3=T, X4=A, X5=H, X6=Y, X7=T, R 또는 N, X8=N 및 X9=N
    (iv) X1=I, X2=H, X3=T, X4=A, X5=H, X6=Y, X7=I, X8=L 및 X9=N
    (v) X1=I, X2=Y, X3=I, X4=T, X5=H, X6=Y, X7=I, X8=L 및 X9=N
    (vi) X1=I, X2=H, X3=I, X4=F, X5=H, X6=Y, X7=P, T 또는 N, X8=L 및 X9=N
    (vii) X1=I, X2=H, X3=I, X4=F, X5=H, X6=Y, X7=I, X8=T 및 X9=S
    (viii) X1=I, X2=H, X3=T, X4=F, X5=H, X6=Y, X7=I, X8=T 및 X9=S
    (ix) X1=I, X2=H, X3=T, X4=F, X5=W, X6=Y, X7=I, X8=T 및 X9=S
    (x) X1=I, X2=H, X3=I, X4=F, X5=W, X6=Y, X7=I, X8= T, S, N, H 또는 D 및 X9=N
    (xi) X1=I, X2=H, X3=I, X4=F, X5=H, X6=Y, X7=I, X8=L 및 X9=N
    (xii) X1=I, X2=H, X3=I, X4=F, X5=W, X6=D, X7=I, X8=L 및 X9=N.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 가 인간 면역글로불린 중쇄 불변 부위 도메인이고, 이것은 상기 뮤테인에 이의 C-말단에 의해 연결되어있는 IFNα2 뮤테인.
  6. 제 5 항에 있어서, Fc 도메인이 단량체인 IFNα2 뮤테인.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 링커 펩티드가 12 내지 20 개의 아미노산으로 이루어진 IFNα2 뮤테인.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 링커 펩티드가 (G)4S(G4)S(G4)SG인 IFNα2 뮤테인.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 증강된 면역원성 특성이 면역원성을 손실시키고, 상기 면역원성의 손실은 본래의 비개질된 분자상에 제시된 MHC 클래스 II-결합 T-세포 에피토프를 결실시킴으로써 달성되는 IFNα2 뮤테인.
  10. 제 9 항에 있어서, 생물학적 T-세포 증식 분석에서, 전체 단백질로서 시험되는 경우, 모체(parental) 비-개질된 IFN 분자보다 작고 2 보다 작은 자극 지수(SI)를 나타내는 IFNα2 뮤테인.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 따른 IFNα2 뮤테인을 코딩하는 DNA서열.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 IFNα2 뮤테인을, 임으로 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 포함하는 약학적 조성물.
  13. C형 간염바이러스 감염으로 고통받는 환자의 치료용 약제 제조를 위한, 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 IFNα2 뮤테인의 용도.
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