PT99898A

PT99898A - Processo para a preparacao de novos derivados da heparina e de composicoes farmaceuticas que os contem

Info

Publication number: PT99898A
Application number: PT99898A
Authority: PT
Inventors: Francesco Della Valle; Aurelio Romeo; Gunter Kirschner
Original assignee: Fidia Spa
Priority date: 1990-12-20
Filing date: 1991-12-20
Publication date: 1992-12-31
Also published as: FI923762A0; CA2075970A1; FI923762A; AU658594B2; WO1992011294A1; JPH05504785A; IT1243300B; NO923240L; NO923240D0; EP0516792A1; IT9041752A1; CN1062537A; KR920703644A; HUT62917A; IT9041752A0; BR9106234A; AU9096491A

Description

Descrição referente à patente de invenção de FIDIA S.p.A., italiana, industrial e comercial, com sede em Via Ponte delia Fabbrica 3/A, 35031 Abano Terme, Itália, (inventores: Francesco Delia Valle, Aurélio Romeo e Giinter Kirschner, residentes na Itália) para “PROCESSO PARA_A_ER£^ PARAçÃO DE TOVOS DERIVADOS DA HEPA-RIHA E DE COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS anE-QS-msifeir.

DESCRIÇÃO

Antecedentes e resumo da,invenção A presente invenção refere—se a novos derivados da heparina dotados de propriedades farmacológicas que apresentam diferenças com respeito às das preparações de haparina disponíveis normalmente no mercado e usadas em terapias anticoagulantes, A relação entre a actividade an-ti-trombina e a actividade sobre o factor Xa e sobre o factor 4 das plaquetas <PF4) dos novos derivadas é diferente da da heparina. Por outras palavras, a respectiva afinidade considerável para com a PF4 é acompanhada por uma actividade reduzida sobre a reacção entre a anti-trombina III e a trombina, cata- 1

lisada pela heparina.

Em paralelo, a reacção entre a anti- trombina III e o factor Xa, catalisada pela própria heparina, é ainda mais sensível aos novos derivados. Em virtude da sua diferente proporção entre a actividade, em relação á da sua heparina, sobre o PF4 e sobre as reacções activadas pela trom-bina e pelo factor Xa, os derivados da presente invenção possuem a capacidade de evitar tromboses sem o risco de provocar hemorragias que acompanha a acção anti—trombótica da heparina. Deverá notar-se que a actividade hemorrógica pode ser causada por uma acção excessiva da inibição da trombina. A capacidade dos novos derivados da presente invenção para promover a ligação do PF4, para catalisar a baixas concentrações a reacção activada pelo factor Xa e a altas concentrações apenas reacções catalisadas pela trombina torna estes compostos activos como fármacos para a trombose arterial e venosa.

Os novos derivados da heparina e os seus sais são obtidos por (1> tratamento prolongado de um agente de alquilação Ceterificação) derivado de um hidrocarboneto com mais de 6 átomos de carbono, á temperatura ambiente ou a uma temperatura ligeiramente superior, sobre um sal de amónio quaternário de uma heparina, dissolvido num solvente orgânico heterociclico seleccionado do grupo formado por E-alquil-pirrolidina-2-ona ou E-alquil-piperidina-2-ona não substituído ou substituido por grupos alquilo inferiores, e os seus derivados interrompidas no anel heterociclico por um heteroátomo ou por um he-terogrupo seleccionado de -O-, -S- ou -EH- ou numa solução concentrada de um destes compostos num solvente aprótico. <2> tratamento do produto de reacção a uma temperatura elevada com uma base orgânica ou inorgânica numa solução aquosoa, (3) isolamento dos derivados da heparina obtidos sob - 2 -

forma livre ou dos seus sais de metais alcalinos e, se pretendido, <4) conversão dos compostos resultantes uns nos outros, na forma livre ou na forma de sais de metais alcalinos ou de sais de outros metais ou de bases orgânicas.

Os novos derivados da heparina, cujas propriedades farmacológicas anteriormente referidas são diferentes das da heparina, possuem também uma estrutura química modificada e um peso molecular diferente; a respectiva estrutura quimica não foi ainda completamente definida. Veri-focou-se no entanto que: a) constituem uma mistura de produtos não despolimeri- zados na sua maior parte, por conseguinte com um peso molecular médio abaixo em comparação com os dos compostos de partida, que são ricos em fragmentos semelhantes entre si e com pesos moleculares compreendidos numa gama estreita, e com um minimo de fragmentos que se desviam dessa média. b> Em comparação com os respectivos compostos de parti da, os novos derivados apresentam uma proporção notavelmente reduzida entre a unidade de sacários do tipo idurónico e a unidade do tipo glucorónico.

Outras modificações da estrutura quimica, com respeito â da heparina, que podem ser encontradas nos novos derivados são em parte também as que já foram descritas para alguns fragmentos de heparina obtidos por tratamento alcalino de estéres de heparina, por exemplo por dessulfuração e a presença de unidades monósicas não saturadas. A identificação dos novos derivados pode ser completada, para além dos ensaias químicos referidos por espectroscopia, especialmente por ressonância magnética nuclear <5T1ílR) , que permite em particular diferenciar os novos derivados dos fragmentos de heparina já descritos na 1itera- 3 ί

tura, Ο tratamento de um sal de amónio quaternário da heparina com um agente de alquilação seleccionado de entre os normalmente usados, isto é, um derivado de um hi-drocarboneto inferior, como seja um halogeneto de um alquilo inferior, por exemplo brometo de etilo, num solvente normalmente usado, como dimetilsulfóxido ou dimetilformamida, da origem a ésteres de heparina, como os descritos na Patente Britânica H2. 1501095. Se estes ésteres são submetidos a um tratamento alcalino, como por exemplo o incluído na segunda fase do procedimento da presente invenção, obtêm-se diferentes fragmentos de heparina, conforme se pode demonstrar por análise de SOER. A nova heparina de baixo peso molecular descrita nos exemplos constitui um produto original que pode ser caracterizado principalmente com base nos dados de espectroscopia de NMR a alta frequência <400 a 500 MHz para o protão, 100 a 125 MHz para o C-13), utilizando espectros unidimensionais tradicionais em FT (Transformação de Fourier) corroborados com as últimas técnicas bidimensionais (correlação H-H e C-H), opcionalmente com recurso a métodos mais recentes (por exemplo T0CSY = espectroscopia de correlação total), quando necessário para o estudo destes produtos complexos.

Por meio de um exame integral dos resultados obteníveis pelos métodos citados, é possível extrair as conclusões apresentadas em seguida: 1) A nova "heparina de baixo peso molecular” da presente invenção é uma mistura complexa de oligossacáridos, sulfatados tanto em H como em 0, reflectindo a heterogeneidade da heparina de partida. Os seus constituintes fundamentais IdoA e GlcnAc, sulfatados de modo diferente, e constituintes secundários (essencialmente GlcA) ligam-se em conjunto dando origem a diferentes combinações sequen- 4

ciais, 2) Com respeita à heparina de partida, α produto que é o objecto da presente invenção apresenta um decréscimo considerável na proporção IdoA/GlcN, sendo este decréscimo detectável por HS, De facto os sinais dos locais anomé-ricos da sequência típica de IdoA (2SQ3)-GlcNSQ3) (6SQ3) ¢102 e 99,5 para o carbono; 5,18 e 5,32 para o protão) provam que houve uma redução drástica. Estas transformações não podem ser detectadas nas heparinas conhecidas de baixo peso molecular, ou, mesmo que possam, é num grau muito menor. De modo concomitante, aparecem sinais marca-damente intensos de uma nova unidade de um monossacárido insaturado tver ponto 4), 3) Outro facto característico é o aparecimento de novos sinais (a 54,2 e 53,2 ppm para o carbono, correlacionáveis com os protões a 3,73 e 3,68 ppm, respectivamente) que é compatível, no presente contexto, apenas com a posição 2 de um resíduo de GlcN, sem grupos S03H no azoto). Esta caracterí st ica, detectável por 3JMR 2-D, está praticamente ausente em amostras de heparinas conhecidas de baixo peso molecular, 4) Normalmente a maioria dos oligossacáridos mencionados an-teriormente termina com uma unidade de um monossacárido não saturado, com uma tripla substituição nas posições 1 e 2, conforme se pode verificar por NMR (sinais a 147 e 172 ppm em C-13: dubleto a 6 ppm para o protão). Estes sinais estão ausentes ou são muito reduzidas em outras heparinas conhecidas de baixo peso molecular,

Por conseguinte deverá chegar-se à conclusão que logo na primeira fase do procedimento da presente invenção, o que acontece não é apenas uma simples esterificação mas uma reac-ção química mais complexa.

Pode supor-se portanto a partir destes resultados que os produtos semelhantes a heparina da presente invenção são novos e diferentes dos fragmentos de heparina já descritos na literatura.

Por exemplo, estes produtos são diferentes dos fragmentos descritos na Patente Europeia 3J2, □ 302 034, obtidos por tratamento alcalino dos ésteres de heparina, sendo estes fragmentos adequados para a formação de complexos com iões de cobre que possuem uma acção angiogénica. Do mesmo modo, os fragmentos de heparina descritas na Patente US $Γ2. 4 440 926, obtidos partindo de ésteres de heparina bem definidos por tratamento com 5

HaQH <0,1 a 0,5 H) entre 20° e 60°C não podem ser identificados com os produtos da presente invenção.

As qualidades anteriormente referidas dos novos derivados de heparina da presente invenção podem ser demonstradas pelas seguintes experiências, realizadas sobre o produto descrito nos Exemplos ilustrativas e designada pela nome de código PE. Has experiências, usam-se heparina não fraccionada (UFH) e um derivado da heparina de baixo peso molecular <CY 216 = Fraxiparine R para produtos de comparação. Estes dois produtos encontram-se disponíveis no mercado para o tratamento da trombose.

Breve descrição dos desenhos

Ho que se refere às Figuras referenciadas nas experiências que se seguem: A Figura 1 mostra a actividade anti-coagulante in vitro do derivado PE em comparação com UFH e CY 216 em termos de tempo de trombina <s>. Os dados obtidos são valores médios de 7 a 10 repetições para cada produto em ensaio. A Figura 2 mostra a actividade anti-coagulante ex vivo do derivado PE, em comparação com UFH e CY 216, de acordo com o efeito sobre o tempo de trombina após administração i.v.. Os dados são valores médios de experiências sobre 5 coelhos para cada produto em ensaio. A Figura 3 ilustra a actividade anti-coagulante ex vivo do derivado PE, em comparação com UFH e CY 216, com base na actividade anti-FXa (cinética de desaparecimento após administração s.c.>, Os dados são valores médios de experiências sobre 5 coelhos para cada produto em ensaio. A Figura 4 mostra a actividade ex vivo para PF4 após administração i.v. do derivado PE, em comparação com UFH e CY 216. 6

1. ACTIVIDADE AMTICOAGULASTE IM VITRQ EM PLASMA HUKASFQ RECOHSTITDIDO

Materiais e métodos

Produtos em ensaio ísolubilização e concentrações) Ensaiaram-se os seguintes produtos; -derivado de heparina PE -heparina não fraccionada <UFH) -derivado de heparina de baixo peso molecular (CY 216 -Fraxiparine )

Os produtos a ensaiar foram dissolvidas em salina estéril e ensaiadas a concentrações entre 0,5 e 12,5 μg/ml,

Parâmetros. 1. Tempo de trombina (como indicador da actividade anticoagulante) 2. Actividade anti-FXa (como indicador da. actividade anticiagulante) 1. Tempo de trombina

Conforme se apresenta na figura 1, é nitido que: - Q derivado PE tem uma actividade anticoagulante que se inicia a concentrações de 1,25 pg/ml - A actividade anticoagulante de Pe é consideravelmente infe rior á da heparina não fraccionada UFH <o tempo de trombina aumenta a concentrações de cerca de 4 a 5 vezes superiores em comparação com UFH), Mão ê possível observar diferenças significativas em relação ao produto CY 216, 2, ActJ,.vida.de..-ant irEXa.

Conforme se apresenta no Quadro 1, os 7 1

dados preliminares indicam que: - 0 derivado PE tem uma actividade anti-FXa que se inicia a concentrações de 3 pgVrnl - A actividade anti-FXa de PE é distintamente inferior à da beparina.

Também se deve notar que esta actividade é também inferior á do produto CY 216j neste caso no entanto a diferença é menos evidente do que a observada em comparação com o produto UFH. qhapbo... l ACTIVIDADE AffTI-FXa IR VITRQ DE PE EM COMPARAÇÃO COM HEPARIBA MÃO FRACCIOBADA E COM CY 216 COBCEBTRAçõES <.)±g/ml) UFH CY 216 PE 0,5 0,336 - - 1 - 0,331 O, 342 1,5 0,281 - - 2,5 0,212 - - 3 - 0,261 0,296 3, 5 0, 179 - - 5 - 0.200 0,245 7 - 0, 158 0,201 8 ί

Os dados são médias de 3 experiências por cada concentração, uma para cada produto em ensaio,

2, ACTIVIDADE ΑΝΤΙCOAGULASTE EX-VIVQ SOBRE PLASMA DE COELHO APÓS ADMINISTRAÇÃO I.V. E S.C. Â actividade anticoagulante do novo derivado da heparina Pe foi determinada por métodos ex~ vivosobre plasma de coelho. Por "ex-vivo” pretende-se significar medidas in vitro de sangue recolhido de um animal a que se tinha administrado a substância quimica. Em particular examinaram-se os seguintes parâmetros: a) tempo de trombina, sobre sangue arterial após administração intravenosa <i.v.) aguda dos produtos em ensaio numa unica dose; b) actividade anti-FXa, sobre sangue arterial após administração subcutânea (s.c.) aguda. Este método é altamente sensível e indica a "biodisponibilidade" dos produtos em ensaio, uma vez que permite seguir a cinética do desaparecimento dos produtos em ensaio após administração subcutânea.

Os produtos em ensaio foram dissolvidos em solução salina estéril e a administração aguda foi efectuada a 0,86 mg/kg por via i.v. e a 1 a 2 mg/kg por via s. c. .

Descrição do ensaio a> Tempo de trombina

Este ensaio mede o tempo de trombina de amostras de sangue arterial de coelhos e vários intervalos de tempo C2, 5. IO, 20, 30 e 40 minutos) após administração por via i.v. de uma dose única do produto em ensaio. b) Actividade anti-FXa

Por medida de actividade anti-FXa 9

(por meio de um ensaio cromogénico que é sensível a concentrações muito baixas do composto) é possível monitorizar a presença dos produtos em ensaio na circulação durante um período de tempo muito longo. Recolheram-se amostras de sangue arterial (da artéria central da orelha) a várias intervalos de tempo (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 e 6 horas) após administração por via s,c,.

Resultados a) Tempo,de trombina

Conforme se apresenta na Fig, 2 é nitido que: - o derivado FE possui uma actividade anticoagulante baixa a 0,86 mg/kg i.v. confirmado os dados in vitro - a actividade anticoagulante do derivado PE é distintamente inferior á do produto UFH, mas não difere significativamente da do produto CY 216. b) Actividade anti-FXa A Fig, 3 mostra que: - o derivado FE (após administração s.c. a 1 mg/kg> continua presente na circulação durante mais tempo do que o produto UFH administrado a uma dose dupla, isto é a 2 mg/kg s.c. A cinética de desaparecimento do derivado da heparina PE é por conseguinte mais lenta que a do produto UFH, mas semelhante á do produto CY 216. 3. AFIFIDADE EX VIVO PARA O FACTOS 4 DE PLAQUETAS (PF4)

Por meio da experiência descrita em seguida, determinou-se a afinidade do novo derivado da heparina PE da presente invenção para o PF4 humano, isto é as” propriedades de ligação” destes produtos para com o PF4, A técnica ex vivo usada mediu a cinética de desaparecimento do PF4 da circulação na ausência e 10 -

na presença de heparina, è bem sabido que a heparina ou glico-saminoglicanos <GAGs>, administrados antes do PF4, intensificam marcadamente a sua cinética <G. Cella et al., "Human pla-telet factor 4 and protamine sulphate interaction with glyco- saminoglycans in the rabbit”. Eur. J. Clin._Invest.. , Vol. 17, pp, 548-554 <1987),

Os compostos com capacidade para se ligarem ao PF4 devem por conseguinte prolongar consideravelmente a sua presença na circulação. Este efeito é proporcional à quantidade de GAG injectada e à sua afinidade para com o PF4.

Os produtos em ensaio foram dissolvidos em solução salina estéril e foram administradas a 0,86 mg/kg i.v., I?ag-çri.ç-^o.,.dq-.,énsaii3·

Procedeu-se à administração aguda dos produtos a ensaiar (por via intravenosa) a uma dose de O,86 mg/kg. Colheram-se amostras do sangue arterial 2 a 3 minutos mais tarde a partir da artéria central da orelha (amostra de base). 5 minutos após a administração da primeira dose, deu-se uma segunda dose contendo PF4 humano purificado <30 pg/kg).

Colheram-se amostras 1,5, 2,5, 5, 10, 20 e 30 minutos após a administração do PF4. Estas amostras foram centrifugadas e armazenadas, sendo analisadas por meio de um ensaio de RIA <conjunto disponível comercialmente) para determinar o PF4.

Resultados

Conforme se apresenta na Fig. 4, os dados obtidos indicam que: - 0 derivado PE possui afinidade para o factor de plaquetas PF4 e desaparece gradualmente da circulação atingindo valores baixos cerca de 30 minutas após a administração. — A afinidade do derivado PE para o PF4 é muito inferior 11

<cerca de 60%) â do produto UFH e a cinética do desaparecimento do complexo com PF4 é muito mais rápida do que a do produto UFH, enquanto que é semelhante ao produto CY 216.

4. ACTIVIDADE AHTITROMBóTICA IR VIVO HUM MODELO DE TROMBOSE ARTERIAL RO COELHO A experiência descrita em seguida determina a actividade anti-trombótica in vivo do novo derivado da heparina PE, 0 objec-tivo era verificar a eficácia dos produtos para a prevenção da formação de um trombo arterial na carótida do coelho, a seguir a um dano endotelial e à redução do diâmetro vascular.

Os produtos em ensaio foram dissolvidos em salina estéril e foram administrados por via i.v, a concentrações situadas entre 1,2 e 6 mg/kg.

Descrição do modelo

As experiências foram efectuadas com coelhos anestesiados com Rembutal <30 mg/kg i.v, numa dose única) e foi-lhes praticada traqueotomia para respiração forçada. Inseriu-se um tubo na veia e na artéria femurais para administração contínua do anestésico e do fármaco. Mediu-se continua— mente a pressão sanguínea sistémica e fixou-se a carótida com um caudalímetro e uma mola. Quando o sistema é estável, efec-tua-se estenose. Após intervalos adequados <não menos de 20 minutos), induz-se uma lesão mecânica com um fórceps cirúrgico e efectua-se estenose sobre o vaso sanguíneo afectado. Mede-se de forma contínua o decréscimo de caudal até atingir o valor zero <0), correspondente a oclusão do vaso.

Prepara-se a carótida contralateral do mesmo modo. Efectua-se então uma perfusão dos produtos em ensaio por via i.v. durante oito minutos no total, efectuando uma lesão mecânica após dois minutos de perfusão. Mede-se o caudal constantemente até pelo menos uma hora depois do fim do tratamento. Sacrifica-se o 12

animal par meia de uma sabredose de anestésico no fim da experiência.

Resultadas

Conforme se apresenta no Quadro 2, os dados obtidos indicam que: - 0 derivado PE é eficaz para evitar completamente a formação de um trombo oclusivo. Q efeito é evidente a uma dose de 6 mg/kg i. v. ; - A eficácia antitrombótica do derivado PE é inferior (cerca de 5x) à da heparina não fraccionada UFH (que inibe a formação de trombos oclusivos logo a uma dose de 1,2 mg/kg, conforme se pode verificar); a eficácia farmacológica do derivado PE é semelhante â do produto CY 216.

Quadro 2

Actividade antitrombótica do derivado PB em comparação com heparina não fraccionada <UFH> e com CY 216 num modela de estenose arterial na coelho

Produtos dose i.v. NS de animais com oclusão UFH 1,2 mg/kg m de animais tratados 2/12 PE 6 mg/kg 2/12 3 mg/kg 6/8 CY 216 6 mg/kg 2/12 3 mg/kg 5/9

5. ACTIVIDADE AHTITRQMBóTICA RUM MODELO DE TROMBOSE VENOSA TN ma. A experiência descrita em seguida destina-se a medir a eficácia antitrombótica in vivo do derivado PE num modelo de trombose venosa na ratazana.

Usou-se a técnica da estase venosa por oclusão 13

da veia cava inferior, uma vez que este método causa a formação de trombos principalmente fibrinicos devidos à variação do caudal sanguíneo ao nível da bifurcação da veia cava com a veia renal esquerda. O modelo em exame mostrou por conseguinte ser sensível à actividade de fármacos anticaagolantes e em particular ao potencial antitrombótico da heparina (após administração e estase).

Os produtos em ensaio foram dissolvidos em salina estéril e administrados por via intravenosa a doses entre os limites de 1 e 3 mg/kg i.v, (15 minutos antes da indução da estase >,

RfissEls&q.. do ensaio_

Efectuaram-se as experiências com ratazanas machos CD-COBS com pesos de 175 a 200 gramas. Anestesiaram-se os animais com pen-tobarbital sódico <40 mg/kg i.p.) e desinfectaram-se os ventres com álcool. Praticou-se uma incisão de 4 cm ao longo da linha central do abdómen com início nas costelas. Isolou-se a veia cava da aorta até à artéria ilíaca comum e ligou-se com uma linha de algodão imediatamente por debaixo da bifurcação com a veia renal esquerda. A dupla oclusão deve exercer uma pressão constante e continua durante 5 segundos. Fecha-se em seguida a parede abdominal. Duas horas mais tarde reabre-se o abdómen a fim de verificar a formação do trombo. Após cerrar a veia cava, em correspondência com as artérias ilíacas comuns e a circulação colateral com um hemostático, corta—se longitudinal mente com uma agulha a secção vascular por debaixo da oclusão. Retira-se o trombo e imerge-se em água destilada, seca-se com papel de filtro e em seguida coloca-se num excita-dor durante 24 horas a fim de determinar o residuo seco que é expresso em mg.

Resultados

Os dados relativos ao peso <mg> dos trombos (Quadro 3) 14 e á incidência (%) de trombas (Quadro 4) duas horas após esta-ss venosa mostram que: - 0 derivado PE possui eficácia antitrombótica; o seu efeito protector (pré-tratamento) é significativo a uma dose de 1,5 mg/kg i.v,; - A eficácia antitrombótica do derivado PE é inferior á de heparina não fraccionada UFH (que já tinha um efeito si gnificativo a 0,5 mg/kg i.v,).

Quadro 3

Efeito antitrombótico in vivo do derivado PE em comparação com o produto UFH num modelo de estase venosa: peso <mg) dos trombos obtido© duas hora© após estase venosa (efectuada 15 minutos depois de administração i.v, dos produtos em ensaio)

Doses (mg/kg i.v.)

Produtos O 0,5 1,0 1,8 2,0 3,0 n = 15 n = 14 n = 24 n = 20 n = 14 n =14 PE 2,2 1,4 1,5 0, 8# 0, O## 0, 0** UFH 2,2 0, 7* 0, 5·*·# 0,02## * F < 0, 05 j **P < 0,01 no teste de Dunnett n = número de animais 15

Quadro 4

Efeito antitrombotico in vivo do derivado PE em comparação com o produto UFH num modelo de estase venosa; incidência <%) de trombos obtidos duas horas após estase venosa (efectuada 15 minutos depois da administração i.v. dos produtos em ensaio)

Doses <mg/Kg i.v.)

Produtos 0 0, 5 1,0 1,8 2,0 3,0 n = 15 n = 14 n = 24 n = 20 n = 14 n = 14 PE 93,3 85,7 62,5 60,0 O, O O, 0 UFH 93,3 57, 1* 50,0 14,3 — — n = número de animais

6. EFEITO DO TEMPO DE HEMORRAGIA MA RATAZAUA A experiência descrita em seguida mostra 0 efeito do derivada PE na tempo de hemorragia 15 minutos após a administração intravenosa dos produtos em ensaio. Os produtos em ensaio foram dissolvido© em salina estéril e foram administrados por via ,i.v. a concentrações entre os limites de 1 a 3 xog/kg.

Descrição da experiência

As experiências foram realizadas com

ratazanas CD-CGBS machos <175 a 200 gramas) a que se tinham administrado as substâncias em ensaio por via subcutânea aguda. O tempo de hemorragia (em segundos) foi medido 15 minutos mais tarde pelo método normal de corte da cauda (Dejana et al., "Bleeding time in rats: A comparison of different experimental conditions”, Tromb. Haemostat. , Vol 48, pp. 108-111 <1982).

Resultados

Os dados obtidos (Quadro 5) mostram que: - 0 efeito do derivado PB sobre o "tempo de hemorragia" é significativamente aumentado a uma dose de 2,0 mg/kg i.v. - 0 efeito do derivado PE é notavelmente inferior ao obtido com heparina não fraccionada UFH (com a qual o tempo de hemorragia já era significativamente aumentado a uma dose de 1 mg/kg i.v.), mas é comparável ao do produto CY 216 (dados não apresentados). è interessante notar que a fim de obter os mesmos valores para o tempo de hemorragia é necessário administrar uma dose de derivado PE que 6e pelo menos 3 v3zes superior á do produto UFH.

Quadro ,_5.

Efeitos comparados do derivado PE com o produto UFH no que se refere ao tempo de hemorragia (s) 15 minutos depois de administração i.v. dos produtos em ensaio

Doses (mg/kg i.v, > Produtos 0 1,0 1,5 2,0 3,0 n = 14 n = 14 n = 14 n = 14 n = 14 PE 130 146 147 2501 3892 UFH 130 4132 4872 - - 18 1 Ρ < 0,05; #1 Ρ < 0,01 ηα teste de Dunnett η = número de animais

7. TOLERABILIDADE Ι1Γ VIVO APÓS ADMINISTRAÇÃO I.V. E S. C. NO RATO A presente experiência mede a dose máxima tolerável do composto PE após administração por via intravenosa e subcutânea no rato

Os produtos em ensaio foram dissolvidos em salina estéril e ensaiadas a concentrações entre os limites de 125 a 2000 mg/kg i.v. e s.c. . 2

Descrição do ensaio A experiência foi realizada com ratos

CD-I machos e fêmeas (C. Siver) (25 a 35 gramas) e compreendia duas fases. 1) Selecção das condições. Trataram-se grupos de um rato macho e um rato fêmea com uma das seguintes doses: 125, 250, 500, 1000 e 2000 mg/kg. Registou-se a mortalidade no período de 7 dias de tratamento. 2) Trataram-se grupos de cinco ratos machas e cinco fêmeas (para cada composto e cada via de administração) com a dose mais elevada tolerada determinada na selecção das condições.

Os animais foram observados durante 14 dias, registando-se durante esse período a mortalidade e a presença de alterações no comportamento e os sintomas gerais de toxicidade. Ufo caso da mortalidade usou—se uma dose mais baixa até se encontrar a dose máxima tolerada. Quando passível efectuou-se a autópsia dos animais mortos.

Resu1tados 1. Tolerabilidade intravenosa

Conforme se apresenta nos Quadros 6 e 7, verificou-se que a dose máxima tolerada dos compostos em ensaio era a seguinte: - PE: 1000 rag/kg i.v. - heparina não fraccionada UFH: 125 mg/kg i.v, - CY 216: 1000 mg/kg i.v.

Deve notar-se que o derivado PE apresenta maior tolerabilidade do que a heparina não fraccionada UFH. A autópsia dos animais mortos após o tratamento com heparina não fraccionada UFH a 500 e 250 mg/kg não revelou alterações macroscópicas, excepto, em alguns animais, a presença provável de hemorragias internas nos intestinos. 2. Tolerabilidade subcutânea

Os resultados obtidos, conforme se apresentam nos Quadros 8 e 9, mostram que as doses máximas toleradas dos produtos em ensaio eram as seguintes: 19 - PE: 2000 mg/kg s.c, - heparina não fraccionada UFH: 125 mg/kg s.c. - CY 216: 2000 mg/kg s,c.

Como com via intravenosa, a tolera-bilidade do derivado PE é muito superior à da heparina não fraccionada (UFH), sendo semelhante à do produto CY 216. Io entanto é iuqportante sublinhar que: - Em todos os animais <10/10) tratados com CY 216 <2000 mg/kg s.c.) observou-se uma área circular de pele no dorso afectada por necrose, em correspondência com o local da injecção, cuja dimensão variava de animal para animal (diâmetro máximo de cerca de 1 cm).

Por autópsia verificou—se que a necrose se limitava à pele; não afectava por conseguinte o músculo subjacente. - Wão se observaram anomalias em animais tratados com o derivado PE (2000 Mg/kg s.c.>. - Os animais que morreram após o tratamento com UFH (25Qmg/kg) apresentavam equimoses extensas na região dorsal subcutânea onde se tinha efectuado o tratamento.

Os dados de tolerabilidade subcutânea mostram por conseguinte uma diferença entre os compostos PE e CY 216. De facto, se bem que as doses de tolerabi1idade máxima sejam iguais, no caso do produto CY 216 está presente uma área de necrose nítida na pele do local da injecção, o que indica que o produto CY 216 possui menor tolerabilidade local do que o derivado PE (que não apresenta anomalias).

Qu.adr.o_e.....

Letalidade dos compostos PE e CY 216 e da heparina não fraccionada UFH depois de uma única administração intravenosa (selecção das condições) 20 -

Tratamento (mg/kg i. v. )

Animais falecidos/animais tratados machos fêmeas PB 2000 0/1 0/1 PE 1000 0/1 0/1 PE 500 0/1 0/1 PE 250 0/1 0/1 PE 125 0/1 0/1 CY216 2000 1/1 0/1 CY216 1000 0/1 0/1 CY216 500 0/1 0/1

Heparina UFH 2000 1/1 1/1 Heparina UFH 1000 1/1 1/1 Heparina UFH 500 0/1 0/1 Heparina UFH 250 0/1 0/1 Heparina UFH 125 0/1 0/1

auMnq-Ji

Letalidade dos compostos PE e CY 216 e lieparina não fraccionada UFH depois de uma única administração subcutânea (selecção das condições)

Tratamento <i»g/kg s. c, ) Animais falecidos machas /animais tratados fêmeas PE 2000 0/1 0/1 PE 1000 0/1 0/1 PE 500 0/1 0/1 PE 250 0/1 0/1 PE 125 0/1 0/1 CY216 2000 0/1 0/1 CY216 1000 0/1 0/1 CY216 500 0/1 0/1 Heparina UFH 2000 1/1 1/1 Heparina UFH 1000 1/1 0/1 Heparina UFH 500 1/1 0/1 Heparina UFH 250 0/1 0/1 Heparina UFH 125 0/1 0/1 23

Quadro 9

Letalidade dos compostos PE, CY 216 e heparina não fraccionada <UFH> depois de uma única administração subcutânea

Tratamento Animais falecidos/animais tratados fomento da machas fêmeas *aarte após o tratamento imediata 1 2 3 4 PE 2000 0/5 0/5 - - - CY216 1000 0/5 0/5 - - - Heparina 500 1/5 2/5 - 2 1 UFH 125 0/5 0/5 - - - Os resultados in vitro e JLn vivo ante- riormente descritos salientam um perfil farmacologicamente interessante do derivado de heparina PE que o distingue da hepa- riria não fraccionada (UFH) e que o torna farmacologicamente maia valioso. A actividade do derivado PE difere ligeiramente da do produto CY 216, que é uma das melhores hepa-rinas de baixo peso molecular no mercado corrente francês, e apresenta em particular uma melhor tolerabilidade local após administração subcutânea no rato. De facto, se bem que as 24

doses máximas toleradas sejam as mesmas, todos os animais tratados com o produtoCY 216 <2000 mg/kg s.c.) apresentaram necrose evidente na pele do local da injecção, enquanto que a pele dos animais tratados com o derivado PE não foi afectada. Έα caso da actividade farmacológica in vitro e in vivo é interessante notar que o derivado PE possui: - actividade anticoagulante muito inferior á da UFH; - biodisponibilidade, após administração s.c., muito superior á da UFH, permitindo deste modo menos administrações diárias para o mesmo efeito farmacológico} - menos efeitos secundários, em comparação á UFH, como se mostra pelo tempo de hemorragia reduzido e pela ausência de necrose dérmica no local da injecção, em comparação com o produto CY 216 < a melhor heparina de baixo peso molecular no mercado francês) que deu origem a fenómenos de intolerância local (necrose) em todos os animais tratados com este produto; - actividade antitrombótica in vivo, como se mostra tanto num modelo de estase venosa na ratazana como num modelo de trombose arterial no coelho. 0 produto é por conseguinte eficaz para evitar estas patologias em dosagens de 1,5 e 6 mg/kg i. v. , respectivamente, que não induzem quaisquer variações significativas em efeitos secundários.

Em particular, no que se refere á actividade antitrombótica no local venoso, o derivada PE, a uma dose de 1,5 rag/kg i.v., não induz quaisquer alterações no tempo de hemorragia, ao contrária do produto UFH.

Os novos derivados de baixo peso molecular de acordo com a presente invenção podem por conseguinte ser usados em vez de heaparina não fraccionada em todas as 25

indicações, como anticoagulante e inibidor da agregação trom-bótica. A dose deve ser adaptada para cada caso particular, e é normalmente de cerca de 1 a 7 mg/kg por dia, por via intravenosa. f

As heparinas a usar no procedimento anteriormente descrito da presente invenção podem ser de qualquer tipo e de várias origens, por exemplo heparinas extraídas do intestino de suinos, de bovinos e de ovinos e do coração de boi, especialmente qualquer dos produtos que se encontram disponíveis no mercado ou descritos na literatura. Estes produtos possuem pesos moleculares que variam amplamente, por exemplo entre 2 000 e 30 000 Daltons, especialmente a heparina não fraccionada UFH e também heparinas de baixo peso molecular obtidas por fraccionamento de heparinas normais <2 000 a 10 000 Daltons) e fragmentas de heparina com um peso molecular de 500 a 10 OOO Daltons obtidos por despolimerização parcial de heparinas normais por via quimica ou enzimática. Os sais de amónio quaternários a usar como matéria prima para o referido procedimento podem ser preparados de modo conhecido, por exemplo por permuta iónica da heparina em solução aquosa sob a forma de um sal de sódio ou de potássio com resinas baseadas em sais de amónio quaternário, por exemplo uma resina sulfónica qualificada com uma base de amónio quaternário. 0 sal de amónio quaternário pode ser isolado por liofilização do eluido.

De entre os sais de amónio quaternário, podem ser usados com vantagem os sais de tetra-alquila-mónio derivados de alquilos inferiores, especialmente os sais de tetra-alquilamónio com grupos alquilo com um máximo de 6 átomos de carbono, Opcionalmente, podem também usar-se sais de alquil-aril-amónio em que os grupos alquilo são de cadeia longa. De entre os sais de tetra-alquilamónio, usam-se de preferência os sais de tetrabutilamónio. Os sais de amónio quatei— 26

nário a usar como matérias primas para o procedimento da presente invenção são os sais obteníveis por permuta iónica do modo anteriormente referido usando sais alcalinos, por exemplo sais de sódio ou de potássio, de heparina do tipo usado co-mercialmente, isto é, sais neutros. Estes sais são feitos reagir com um excesso de iões de amónio quaternário de modo a obter também os sais neutros correspondentes.

Os sais de amónio quaternário são solúveis tanto nos solventes heterociclicos anteriormente referidos como em solventes orgânicos apróticos, como dimetilsul-fóxido e dimetilformamida. A reacção com o agente de alquila-ção, de acordo com a primeira fase do procedimento, pode ser realizada nos solventes heterociclicos anteriormente referidos ou numa solução dos mesmos num dos solventes orgânicos apróticos anteriormente referidos, de preferência numa solução concentrada.

Dos solventes heterociclicos anteriormente referidos, os preferidos são principalmente os que não possuem substituintes na sua estrutura ciclica, isto é, F-al-quil-o-aril-2-pirrolidona, ou os seus derivados contendo um átomo heterociclico na sua estrutura ciclica, como os feriva— dos correspondentes da imidazolina, da piperazina ou da morfo-lina. Os grupos U-alquilo dos solventes heterociclicos são de preferência derivados de um alquilo inferior com um máximo de 6 átomos de carbono, e o grupo arilo é de preferência um grupo fenilo, opcionalmente substituído por 1 a 3 grupos alquilo inferiores, especialmente grupos metilo. De preferência usa-se F-me t i1-2-pi rrolidona.

Um agente de alquilação derivado de um hidrocarbanetc com 6 a 30 átomos de carbono, de preferência com 8 a 18 átomos de carbono, é um composto que dá origem com facilidade aos grupos alquilo correspondentes, como seja um reagente com um grupo éster de um ácido com um álcool com o 27

número de átomos de carbono correspondente, o qual pade ser um álcool alifático ou aralifático de preferência com um máxima de IS átomos de carbono, por exemplo um álcool hexilico, hep-tilico, octolico ou nonilico.

Os ésteres reagentes podem ser derivados de ácidos inorgânicos ou orgânicos, como sejam hidráci-dos, ácido sulfúrico ou sulfuroso, ou ácidos alquilsulfónicos ou arilsulfónicos, por exemplo ácido metanossulfónica ou ácido p-taluenossulfónico, Os ésteres dos hidrácidos são em particular cloretos, brometos e iodetos. A reacção entre o sal de amónio quaternário do agente de alquilação anteriormente referido é realizada á temperatura ambiente <20° C) ou a uma temperatura ligeiramente superior, por exemplo a uma temperatura entre 30 e 35° C, mas que não exceda 6Qe* C, e é mantida durante um periodo prolongado de tempo desde cerca de 5 Horas até cerca de 20 toras, de modo tipico de cerca de 16 horas. 0 produto da reacção pode ser isolado e submetido subsequentemente à segunda fase do procedimento, isto é, a um tratamento alcalina, ou pode ser convertido di-rectamente no produto final, efectuando o tratamento alcalino directamente com a solução, opcionalmente concentrada, do produto da reacção da primeira fase, ê também possível evaporar o solvente sob condições suaves depois da primeira fase do procedimento e fectuar o tratamento alcalino sobre o resíduo, è por conseguinte possível efectuar o procedimento da invenção segundo um processo num único reactor. 0 tratamento básico do produto da reacção entre o sal de amónio quaternário de hepa-rina com o agente de alquilação é efectuaddo a uma temperatura de desde de cerca de 5 até cerca de 120° C, de preferência a uma temperatura de cerca de 70° C, durante cerca de duas horas. Usam-se hidróxidos alcalinos, como por exemplo HaOH ou K0H, ou outras bases inorgânicas e/ou orgânicas, de preferência a uma concentração desde de cerca de 0,1 até cerca de 1 M. As bases são usadas em soluções aquosas ou alcoólicas, mas 28

podem estar presentes outros solventes que sejam misciveis, como por exemplo os solventes do resíduo usados na primeira fase do procedimento no caso do processo referido num único reactor.

Se se pretende isolar o produto da reacção da primeira fase do procedimento, este pode ser precipitado pela adição de um solvente orgânico polar, de preferência um álcool alifático como por exemplo álcool metílico ou etilico, ao qual se tivesse adicionado de preferência an-teriormente um tampãm básico, especialmente um sal básico ou um ácido carboxílico, por exemplo um acetato ou propionato de sódio ou de potássio.Podem ser usados outros tampões básicos, como por exemplo bicabornatos ou fosfatos alcalinos. 0 produto precipitado é de preferência lavado com o solvente polar usado na precipitação, por exemplo metanol, è aconselhável purificar o produto precipitado mais a fundo por repreci-pitação numa vez ou em várias vezes, isto é, por dissolução do produto em água e precipitação deste com um álcool. 0 produto da reacção, constituido pelo derivado da heparina de baixo peso molecular e que possui as propriedades anteriormente descritas, pode ser libertado sob a forma livre a partir de um sal metálica ou a partir de uma base orgânica de modo convencional. O sal alcalino que corresponde ao hidroxido alcalino usado na segunda fase do procedimento pode ser obtido por neutralização da solução com um ácido, por exemplo com um ácido clorídrico 2 M, purificação da solução, extracção desta com um solvente orgânico que não seja miscivel com a água, por exemplo cloreto de metileno, e repetição desta operação várias vezes. O sal é em seguida dia-lisado com água destilada e cloreto de sódio e é liofilizado.

Os produtos da presente invenção são usados principalmente sob a forma dos seus sais metálicos ou dos seus sais com bases orgânicas. Se se pretender obter sais 2©

metálicos que não sejam sais alcalinos correspondentes a iões dos hidróxidos alcalinos usados no tratamento alcalino ante-riormente referido, é possível usar métodos de permuta ionica por meio de técnicas conhecidas. Em alternativa, é possivel isolar o derivado da heparina na sua forma ácida, adicionando o sal alcalino obtido com a quantidade calculada de um ácido forte diluido, como seja ácido clorídrico ou ácido sulfurico, extraindo o produto com um solvente orgânico adequado, isolando o composta de heparina sob a sua forma livre e convertendo-o em seguida no sal desejado.

De entre os sais metálicos ou sais de bases orgânicas que podem ser usados de acordo com a presente invenção, são de importância particular os que são terapeuti— camente aceitáveis, como por exemplo os sais de sódio, potássio, amónio, cálcio e magnésio, ou os sais de metais pesados, como por exemplo de cobre e de ferro. Os sais de bases orgânicas podem ser derivados de aminas primárias, secundárias ou terciárias alifáticas, aromáticas ou heterociclicas, como por exemplo metilamina, etilamina, propilamina, piperadina, morfolina, efedrina, furfurilaminocolina, etilenodiamina e aminoetanol.

Os sais que não podem ser usados di-rectamente em terapia, que também se encontram abrangidos pela presente invenção, são por exemplo os que podem ser usados para a purificação dos novos derivados de heparina da presente invenção, como por exemplo alguns dos sais de metais pesados. A presente invenção também inclui composições farmacêuticas que contêm como substância activa um novo derivado da heparina de baixo peso molecular obtenível pelo procedimento descrito na presente memória descritiva, especialmente sob a forma dos seus sais terapeuticamente aceitáveis. Estas composições podem ser destinadas a uso pa 30 -

renteral, por exemplo para administração subcutânea ou intravenosa, ou para uso tópico, por exemplo sob a forma de cremes ou de pomadas, ou como supusitórios ou pulverizações nasais. As composições farmacêuticas da presente invenção podem por conseguinte ser formuladas sob a forma de soluções dos produtos activos ou de pós liofilizados dos compostos activos destinados a ser misturados com um mais excipientes ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis que sejam convenientes para as utilizações anteriormente mencionadas e com uma asmolaridade que seja compativel com os fluidos fisiológicos. A presente invenção inclui, para além dos novos derivados de heparina de í baixo peso molecular, o procedimento anteriormente referido para a sua preparação. Considera-se incluido na presente invenção também a realização de cada uma das fases do procedimento de preparação, isto é, a reacção do sal de amónio quaternário da heparina com um agente de alquilação conforme definido anteriormente num dos solventes referidos e o tratamento alcalino do produto da reacção. A presente invenção é ilustrada por meio dos exemplos que se seguem, os quais, no entantoi, não devem ser considerados como limitando o âmbito da invenç-ao, 1> ?-QRWLAçpES- PAM-IJJBÇçãO. 1. 1 '“'PB mg 10 20 30 40 água para injecção até ml 0,1 0,2 0,3 0,4 embalagem com seringa pronta a usar contendo solução estéril para administração subcutânea. 1.2

PE mg 150 300 outros componentes: água para injecção até ml 1 4 8 31 embalagem com ampola contendo solução estéril para administração intravenosa PE mg 10 20 30 40 outros componentes: cloreto de sódio mg 0,3 0,6 0,9 1,2 água para injecção até ml 0,1 0,2 0,3 0,4 embalagem com seringa pronta a usar contendo solução estéril para administração subscutânea. 1. 4 PE mg 150 300 outros componentes: cloreto de sódio mg 35 70 água para injecção até ml 5 10 embalagem com ampola contendo solução estéril para administração intravenosa. 1.5 PE mg 150 300 Outros componentes: cloreto de sódio mg 35 70 metabissulfito de sódio mg 5 10 clorobutanol <*) mg 25 50 água para injecção até ml 5 104 embalagem com ampola contendo solução estéril para administração intravenosa multidose. 32

<*) no Exemplo 1.5 o conservante clorobutanol pode ser substituído por: 50 100 álcool bensilico mg ou por: clorocresol mg 2) PQRHULACÕBS PARA ADIIJOSTRACSOOSAL 5 10 2, 1 (comprimido ou cápsula) PE mg 30 60 120 outros componentes: fosfatidilcolina + fosfatidilserina (*) mg 80 160 320 lactose mg 50 100 200 celulose microcristalina mg 10 20 40 talco mg 3 6 12 silica coloidal mg 3 6 12 <#) as proporções entre a fa sfatidilcolina e a fosfatidilserina presentes nas formulações ; pode ser var: das. 2.2 (comprimido ou cápsula) PE mg 30 60 120 outros componentes: fosfatidilcolinat fosfatidilserina (*) mg 80 160 320 colesterol mg 2 4 8 33 lactose mg 50 100 200 celulose microcristalina mg 10 20 40 talco mg 3 6 12 silica coloidal mg 3 6 12 <*) as proporções entre a fosfatidilserina presentes fosfatidilcolina e a nas formulações pode ser variadas. 2.3 (saqueta de pó) PE mg 60 120 180 outros componentes: fosfatidilcolina + fosfatidilserina <*) mg 250 500 750 colesterol mg 5 10 15 lactose mg 100 200 300 aromatizante e edulcorante q. b. sacarose <#·*) até mg 2000 4000 6000 <#) as proporções entre a fosfatidiloolina e a fosfatidilserina presentes nas formulações pode ser variadas. (##> a sacarose pode ser substituída por frutose, 2.4 <comprimido de efeito retardado) PE mg 30 60 120 outros componentes: - 34 -

fosfatidilcolina + fosfatidilserina (*) mg 80 160 320 lactose mg 30 60 120 celulose microcristalina mg 5 IO 20 hidroxipropi1- meticelulose mg 10 20 40 talco mg 3 6 12 silica coloidal mg 3 6 12 <#) as proporções entre a fosfatidilcolina e a fosfatidilserina presentes nas formulações pode ser varia- das. (comprimido gastrorresistente) PE mg 30 60 120 outros componentes: fosfatidilcolina + fosfatidilserina (#) mg 80 160 320 lactose mg 50 100 200 celulose microcristalina mg 10 20 40 talco mg 30 60 120 silica coloidal mg 3 6 12 copolimero de ácido metacrilico mg 15 30 60 (·*> as proporções entre a fosfatidilcolina e a fosfatidilserina presentes nas formulações pode ser 35 Λ variadas, 2.6 (comprimido gastrorresistente de efeito retardado) PE mg 30 60 120 outros componentes; fosfatidilcolina + fosfatidílserina (#) mg 80 160 320 lactose mg 50 100 200 celulose microcristalina mg 10 20 40 bidroxipropil- metilcelulose mg 5 IO 20 talco mg 30 60 120 silica coloidal mg 3 6 12 copolimero de ácido metacrilico rag 15 30 60 as proporções entre a fosfatidilcolina e a fosfatidilserina presentes nas formulaç Ses pode ser varia· das . (solução para admini stração oral sob a forma de gotas) PE mg 30 60 120 outros componentes ácido citrico mg 7,5 15 30 água purificada até ml 0,25 0,5 1 (grânulos #> PE mg 30 60 120 outros componentes; 36

ácido cítrico mg 7,5 15 30 sacarose mg 30 60 60 amido de milho mg 12,5 25 25 talco mg 5 10 10 polivinilpirrolidona mg 4 8 8 (*> 3 grânulos administrados numa cápsula de gelati na dura 2,9 (grânulos gastrorresistentes *) PE mg 30 60 120 outras componentes: ácido citrico mg 7,5 15 30 sacarose mg 30 60 60 amido de milho mg 12,5 25 25 talco mg 5 10 10 polivinilpirrolidona mg 4 8 8 copalimera de ác i do metacr i1ico mg IO 15 15 <*) 3 grânulos administrados numa cápsula de gelatina dura 3> FORMULAÇÕES PARA ADMINISTRAÇÃO BASAL· mi PULMQMAR 3. 1 PE pó micronizado mg 20 40 0 principio activo, sob a forma de um pó branco micronizado, encontra—se contido numa cápsula de gelatina que deve ser quebrada quando se pretende usar a carregada num aparelho adequado para inalação, 3,2 <pó para inalação? PE pó micronizado mg 20 40 fosfatidilcolina + 37

fosfatidilserina <*>m mg 30 60 O principio activo, sob a forma de um pó branco micronizado, encontra-se contido numa cápsula de gelatina que deve ser quebrada quando se pretende usar e carregada num aparelho adequado para inalação. <#> as proporções entre a fosfatidilcolina e a fosfatidilserina presentes nas formulações pode ser variadas.

4) FORMULAÇÕES PARA ADMINISTRAÇÃO RECTAL 4, 1 PE glicérido semi—sintético mg 30 120 1Õ40 1880 4. 2 fosfatidilcolina 4- fosfatidilserina <·*·) mg ÍOQ 200 glicérido semi-sintético mg 1840 1680

Resumidamente, os derivados da hepari-na de baixo peso molecular e o seus sais de acordo com a presente invenção podem ser obtidos por tratamento de um sal de amónio quaternário da heparina dissolvido num solvente orgânico heterociclico seleccionado do grupo formado por M-alquil--pirrolidina-2-ona, F-alquil-piperidina-2-ona, não substituída ou substituída por grupos alquilo inferiores, e os seus derivados interrompidos no anel heterociclico por outro heteroáto-mo ou heterogrupo seleccionados de -0-, -S-, e -ΉΉ-, ou numa solução concentrada do referido composto nul solvente apróti-co, com um agente de alquilação <de eterificação) derivado de um hidrocarboneto com desde 6 até 30 átomos de carbono, de 38

Claims

preferência desde 8 até 18 átomos de carbono, a uma temperatura desde cerca de 20° (temperatura ambiente) até cerca de 60°C durante um periodo de tempo prolongado, por exemplo de 5 a 20 horas, 0 produto resultante da reacção é em seguida tratado a uma temperatura de 5* a 120° C, de preferência de cerca de 70° C, com uma base inorgânica ou orgânica numa solução aquosa. O produto resultante deste tratamento alcalino é em seguida isolado sob a forma livre ou sob a forma de um sal alcalino ou de um metal alcalino-terroso. Podem obter-se sais de outros metais ou de bases orgânicas por conversão a partir de outros sais. De preferência, na segunda fase do procedimento, o produto da reacção é tratado com um hidróxido alcalino em solução aquosa. Os derivados de beparina de baixo peso molecular resultantes e os seus sais são úteis em terapia, por exemplo como agentes--trobóticos, KEIVIffDICACÕBS - 11 - Processo para a preparação de novos derivados da heparina de baixo peso molecular e/ou dos seus sais caracteristicos por (1) tratar-se um sal de amónio quaternária de uma heparina dissolvido num solvente orgânico he-terociclico seleccionado do grupo formado por JI-alquil-pirrolidina-2-ona, U-alqil-piperadina-2-ona, não substituído ou substituído por grupos alquilo inferior ou os respectivos derivados interrompidos no anel heterociclico por outro heteroátomo ou hetero-grupo seleccionado do grupo formado por -O-, -S- e -HH-, ou uma solução concentrada do referido composto num solvente aprótico, com um agente de alquilação derivado de um hidrocar-boneto com mais de 6 átomos de carbono á temperatura ambiente ou a uma temperatura ligeiramente superior (2) tratar-se em 39

seguida o produto da reacção a uma temperatura de 5o a 120° C com uma base inorgânica ou orgânica numa solução aquosa, e <3) isolai—se os derivados da heparina obtidos na sua forma livre ou sob a forma dos seus sais de metais alcalinos ou alcalino--terrosos. - 2S - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender adicionalmente a conver— ão dos referidos derivados de heparina ou os seus sais em sais de outros metais ou em sais de bases orgânicas, - 3â - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender adicionalmente a conversão dos derivados de heparina obtidos na sua forma livre em sais farmaceuticamente aceitáveis ou a conversão dos referidos sais em derivados de heparina sob forma livre. - 4ft - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por na fase (2) o referido produto de reacção ser tratado com um hidróxido alcalino em solução aquosa. - 5ã - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 ou 4, caracterizado por o produto resultante da reacção do agente de alquilação com o sal de amónio quaternário da heparina ser isolado antes de ser submetido ao tratamento com a base inorgânica ou orgânica. - 6ã - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 ou 4, caracterizado por se usarem como matérias primas sais de amónio quaternário da heparina como pesos 40 -

moleculares que variam entre 2 000 e 30 000 D. — 7ã - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 ou 4, caracterizado por se usarem como matérias primas sais de amónio quaternário da heparina não frac-cionada. - Sã - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 ou 4, caracterizado por se usarem como matérias primas sais de amónio quaternário de heparina de baixo peso molecular obtidos por fraccionamento de heparina com um peso molecular de 2 000 a 10 000 D e fragmentos de heparina com um peso molecular entre 500 e 10 000 D obtidos por despo-limerização parcial química ou enzimática de heparina. - 9â - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 ou 4, caracterizado por se usarem sais de tetraalquilamónio cujos grupos alquilo possuem de 1 a 6 átomos de carbono. - 10ã - Processo de acorda com qualquer das reivindicações 1 ou 4, caracterizado por o referido sal de amónio quaternário ser o sal de tetrabutilamónio. - 111 - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 ou 4, caracterizado por o grupo N-alquilo no referido solvente orgânico heterociclico ser um alquilo inferior com 1 a 6 átomos de carbono. - 121 - Processo de acordo com qualquer das 41

reivindicações 1 ou 4, caracterizado por se usar como solvente orgânico heterociclico I-metil-pirrolidona. - 131 - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 ou 4, caracterizado por se usar como agente de alquilação um éster de um ácido com um álcool alifático ou aralifático com 6 a 30 átomos de carbono. - I4ã - Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por o referido agente de alquilação possuir de 8 a 18 átomos de carbono. - 153 - Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por o referido agente de alquilação ser um iodeto, um brometo, um cloreto de alquilo ou um éster de um ácido alquil-ou arilssulfónico. - 161 - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 ou 4, caracterizado por o agente de alquilação ser feito reagir com o sal de amónio quaternário de hépa-rina no referido solvente heterociclico a uma temperatura ambiente entre 20° e 60° C. - 171 - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 ou 4,caracterizado por o produto resultante da reacção do agente de alquilação com o sal de amónio quaternário de heparina ser isolado por precipitação pela adição de um solvente orgânico polar. 42

- 181 - Processo de acordo caia a reivindicação 17, caracterizado por se usar para precipitação um álcool ali-fático. - 191 - Processo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por se adicionar ao álcool um tampão básico. - 201 - Processo de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por se usar como tampão básico um sal básico de um ácido carboxílico - 211 - Processa de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por o produto precipitado ser reprecipitado várias vezes com o mesmo solvente orgânico. - 221 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por na fase <2) o referido produto da reacção ser tratado com um hidróxido alcalino ou com outra base inorgânica ou orgânica com uma concentração entre 0,1 e 1 K em solução aquosa ou em solução álcoolica-aquosa a uma temperatura entre 5o e 120°C. - 231 - Processo de acordo com a reivindicação22 caracterizado por o tratamento alcalino ser realizado sobre o produto da reacção isolado da fase <1) com hidróxido de sódio aquoso O, 1 a 1 M a uma temperatura de cerca de 70^ C durante um período de tempo suficiente para que se obtenham derivados de heparina de baixo peso molecular e/ou os seus sais. 43

24ã Processo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado por produto da reação da fase <2) ser isolado por neutralização da solução alcalina, extracção com ura solvente orgânico que não seja misci-vel coxn água e diálise com água destilada e cloreto de sódio, - 255 - Processo para a preparação de um derivado da heparina de baixo peso molecular e/ou dos seus sais, caracterizado por <1) tratar-se o sal de tetrabutilamónio de heparina com um peso molecular de 15 000 D dissolvido em H--metil-pirrolidona com 1-iodooctano á temperatura ambiente durante cerca de 16 horas, <2> precipitar-se o produto da reacção vertendo a solução resultante sobre metanol a que se adicionou acetato de sódio, <3) purificar-se o produto várias vezes por reprecipitação a partir de metanol a que se adicionou acetato de sódio, (4) tratar-se o produto seco com hidróxido aquoso 0,5 Έ durante cerca de duas horas a 70° ©, <5) neutralizar-se a solução com ácido clorídrico 2M, (6) extrair—se as soluções várias vezes com cloreto de metileno, <7> dialisar-se a solução com água destilada e com cloreto de sódio 0,1 M e <8> liofilizar-se a solução obtida, - 265 - Processo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado por o derivado da heparina obtido ser um sal de um metal alcalino, ou de um metal alcolino-terroso. - 275 - Processo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado por o derivado da heparina obtido ser um sal de sódio, de potássio ou de cálcio. 44 281 Processo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado por o derivado da heparina obtido ser um sal de uma base terapêutica aceitável, - 291 - Processo de acordo com a reivindicação 25, caracterizado por o derivada da heparina obtido ser um sal de sódio, de potássio ou de cálcio, - 301 - Processo para a preparação de uma composição famaceutica, caracterizado por se incorporar como ingrediente activo um derivado de heparina de baixo peso molecular obtido de acordo com qualquer das reivindicações anteriores em conjunto com veículos, diluentes ou excipientes farma-ceuticamente aceitáveis, A requerente reivindica a prioridade do pedido de patente italiano apresentado em 20 de Dezembro de 1990, sob o nS. 41752 A/90, Lisboa, 20 de Dezembro de 1991

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