KR20210151798A - 콘드로이틴 설페이트 다당류, 이의 반합성 제조방법 및 이의 용도 - Google Patents
콘드로이틴 설페이트 다당류, 이의 반합성 제조방법 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 의약의 기술 분야, 특히 콘드로이틴 설페이트 다당류, 이의 반합성 제조 방법 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명에서 제공하는 콘드로이틴 설페이트 다당류의 금속염은 항염 효과가 있고, 염증성 질환에 대한 약물을 제조하는 데 사용될 수 있다. 특히, 본 발명에서 제공하는 콘드로이틴 설페이트 다당류의 금속염은 항염 및 골 보호 효과를 나타내고, 류마티스 관절염에 대한 약물 및 골관절염에 대한 약물을 제조하는 데 사용될 수 있다. 본 발명은 콘드로이틴 설페이트 다당류의 금속염의 제조 방법을 제공하며, 본 발명에서 반합성 수단에 의해 황산화 정도가 다른 콘드로이틴 설페이트 다당류의 금속염을 수득할 수 있다. 본 방법은 조작이 간단하고 대규모 생산에 적합하다.
Description
본 개시는 의약 기술 분야에 관한 것이며, 특히 콘드로이틴 설페이트 글리칸의 금속염, 이의 제조 방법 및 용도에 관한 것이다.
콘드로이틴 설페이트 글리칸(CS)은 직쇄 황산화 글리코사미노글리칸(GAG)으로서, β(1→3) 및 β(1→4) 글루코시드 결합을 통해 교대로 연결되는 글루코스와 갈락토사민으로부터 형성되며, 이는 글루쿠론산의 2번과 3번 위치와 갈락토사민의 4번과 6번 위치에서 다양한 정도까지 황산화되어, 하기와 같이 나타내는 특정의 구조를 갖는, 11개의 천연 서브타입을 생성한다:
콘드로이틴 설페이트 글리칸은 동물에 널리 존재하며 인간의 내인성 물질이기도 하며, 다양한 효소 및 인자의 발현량을 조절하여 신경계, 암, 염증 등의 생리적, 병리학적 과정에서 중요한 역할을 한다.
현재, 시판중인 콘드로이틴 설페이트 글리칸 약물 및 건강 제품은 모두, A 타입과 소량의 C 타입을 포함하는, 육상 동물의 연골 조직 추출물로부터 유래된다. 해양 동물에서 유래한 콘드로이틴 설페이트 글리칸은 육상 동물에서 유래한 것과 다르며, 주로 C 타입(상어 연골 추출물) 및 E 타입(대왕오징어 연골 추출물)과 같은 서브타입을 포함한다. 연구에 따르면 상이한 조성의 콘드로이틴 설페이트 글리칸은 일반적으로 상당히 상이한 약리학적 활성을 나타내는 것으로 나타났다. 높은 약리 활성을 갖는 콘드로이틴 설페이트 글리칸 약물의 개발에는 여전히 큰 격차가 남아있다.
본 개시가 해결하고자 하는 기술적 과제는 콘드로이틴 설페이트 글리칸의 금속염, 이의 제조방법 및 용도를 제공하는 것이다. 본 개시에서 제공하는 콘드로이틴 설페이트 글리칸의 금속염은 우수한 약리 활성을 갖는다.
본 개시의 기술적 과제를 해결하기 위해, 본 개시는 다음과 같은 기술적 해결수단을 제공한다.
본 개시는, 전반적으로 전기적으로 중성이며 콘드로이틴 설페이트 글리칸 음이온 및 금속 양이온을 포함하는 콘드로이틴 설페이트 글리칸의 금속염(화학식 I)을 제공한다.
콘드로이틴 설페이트 글리칸 음이온은 1,000 Da 내지 15,000 Da의 평균 분자량을 가질 수 있다.
콘드로이틴 설페이트 글리칸 음이온은 -SO3 - 대 -COO-의 몰비가 1.46 내지 2.73일 수 있다. 바람직하게는, 콘드로이틴 설페이트 글리칸 음이온은 -SO3 - 대 -COO-의 몰비가 1.9 내지 2.5일 수 있다.
콘드로이틴 설페이트 글리칸 음이온에 대한 n은 2 ≤ n≤ 45의 범위 내일 수 있다.
바람직하게는, 콘드로이틴 설페이트 글리칸 음이온은 평균 분자량이 4,000 Da 내지 15,000 Da일 수 있다.
바람직하게는, 금속 양이온은 나트륨 이온 및/또는 칼슘 이온 또는 칼륨 이온을 포함할 수 있다.
바람직하게는, 콘드로이틴 설페이트 글리칸 음이온에 대한 n은 6 ≤ n≤ 20의 범위 내일 수 있다.
본 개시에서, 콘드로이틴 설페이트 글리칸 음이온에 해당하는 콘드로이틴 설페이트 글리칸은 주로 콘드로이틴 설페이트 글리칸 C, 콘드로이틴 설페이트 글리칸 E, 콘드로이틴 설페이트 글리칸 A, 및 잔량의 서브타입의 콘드로이틴 설페이트 글리칸을 포함할 수 있다. 콘드로이틴 설페이트 글리칸 100 중량%를 기준으로, 콘드로이틴 설페이트 글리칸 C, 콘드로이틴 설페이트 글리칸 E, 및 콘드로이틴 설페이트 글리칸 A의 총 함량은 바람직하게는 60 중량% 내지 92 중량%일 수 있다. 콘드로이틴 설페이트 글리칸 C는 바람직하게는 0 중량% 내지 30 중량%, 보다 바람직하게는 10 중량% 내지 25 중량%의 함량을 가질 수 있다. 콘드로이틴 설페이트 글리칸 E는 바람직하게는 0 중량% 내지 80 중량%, 보다 바람직하게는 10 중량% 내지 60 중량%의 함량을 가질 수 있다. 콘드로이틴 설페이트 글리칸 A는 바람직하게는 0 중량% 내지 90 중량%, 보다 바람직하게는 0 중량% 내지 70 중량%의 함량을 가질 수 있다.
본 개시에서, 콘드로이틴 설페이트 글리칸 음이온은 바람직하게는 -SO3 -를 14 중량% 내지 27 중량%의 함량으로 함유할 수 있다.
본 개시에서, 콘드로이틴 설페이트 글리칸 음이온은 알두론산을 바람직하게는 20 내지 35중량%의 함량으로, 헥소사민을 22 내지 32중량%의 함량으로 함유할 수 있다.
본 개시에서, 상기 금속 양이온은 바람직하게는 나트륨 이온 및/또는 칼슘 이온 및/또는 칼륨 이온을 포함할 수 있고, 보다 바람직하게는 나트륨 이온 또는 칼슘 이온을 포함할 수 있다.
제2 양태에서, 본 개시는 제1 양태에 기재된 바와 같은 콘드로이틴 설페이트 글리칸의 금속염의 제조 방법으로서,
콘드로이틴 설페이트 글리칸의 원료, 황산화 시약, 및 황산화용 유기 용매를 혼합하여 황산화 생성물 시스템을 제공하는 단계; 및
상기 황산화 생성물 시스템에 대해 제1 침전 처리, 염화(salification) 처리, 투석, 제2 침전 처리, 및 겔 컬럼 정제를 순차 수행하여 콘드로이틴 설페이트 글리칸의 금속염을 제공하는 단계을 포함하며,
상기 염화 처리에 사용되는 염화 시약이 금속 수산화물 수용액인,제조방법을 제공한다.
콘드로이틴 설페이트 글리칸의 원료는 콘드로이틴 설페이트 글리칸 A 및 콘드로이틴 설페이트 글리칸 C를 포함하며, 콘드로이틴 설페이트 글리칸 A의 함량은 70 중량% 내지 90 중량%일 수 있고, 콘드로이틴 설페이트 글리칸 C의 함량은 10 중량% 내지 30중량%일 수 있다. 본 개시에서, 사용된 콘드로이틴 설페이트 글리칸의 원료는 양타이 옌타이 둥청 파마슈티칼 그룹 회사(Yantai Dongcheng pharmaceutical group Co., Ltd.)로부터 구입하였다. 콘드로이틴 설페이트 글리칸 원료는 평균 분자량이 20,000 Da 내지 23,000 Da이고, -SO3 - 대지 -COO- 의 몰비가 1이며, 콘드로이틴 설페이트 글리칸 A의 함량은 70 내지 90 중량%이고, 콘드로이틴 설페이트 글리칸 C의 함량은 10 내지 30 중량%이다. 콘드로이틴 설페이트 글리칸의 원료는 중국 약전(버전 2015)의 표준 관련 요건에 부합한다.
콘드로이틴 설페이트 글리칸의 원료는 평균 분자량이 20,000 Da 내지 23,000 Da일 수 있다.
콘드로이틴 설페이트 글리칸의 원료는 -SO3 - 대 -COO-의 몰비가 0.9 내지 1.1일 수 있다.
상기 황산화 시약은 삼산화황 트리메틸아민 착물, 삼산화황 피리딘 착물 및 삼산화황 트리에틸아민 착물로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 포함할 수 있다.
상기 황산화 시약 대 콘드로이틴 설페이트 글리칸의 원료 중의 반복 이당류 단위의 당량비는 (1-10):1일 수 있고, 보다 바람직하게는 (3-8):1일 수 있다.
상기 황산화는 40℃ 내지 120℃의 온도에서 2시간 내지 36시간 동안, 보다 바람직하게는 6시간 내지 24시간 동안 수행될 수 있다. 본 개시에서, 상기 황산화는 바람직하게는 교반 하에 수행될 수 있다. 본 개시에서, 교반 속도는 당업자에게 잘 알려진 교반 속도가 사용될 수 있는 한 특별히 제한되지 않는다.
염화 시약은 수산화나트륨 수용액 및/또는 수산화칼륨 수용액일 수 있다. 상기 염화 시약의 농도는 1 mol/L 내지 4 mol/L일 수 있다.
상기 제1 침전 처리에 사용되는 제1 침전 시약은 부피 분율이 90% 내지 95%인 에탄올 수용액일 수 있다.
상기 제2 침전 처리에 사용되는 제2 침전 시약은 에탄올일 수 있다.
투석에 사용되는 투석 백(dialysis bag)은 3,000 Da 내지 12,000 Da의 분자량 컷오프를 가질 수 있다.
본 개시에서, 제1 침전 시약을 첨가하는 방식, 첨가 속도 및 양은, 황산화 생성물 시스템 내의 황산화 생성물이 완전히 침전될 수 있는 한, 특별히 제한되지 않는다. 본 개시에서, 상기 제1 침전 처리는 25분 내지 35분 동안 수행하는 것이 바람직하고, 상기 제1 침전 처리는 상온에서 교반하면서 수행하는 것이 바람직하다.
본 개시에서, 제1 침전 처리가 완료된 후, 생성된 시스템은 바람직하게는 여과될 수 있다. 얻어진 필터 케이크는 물에 용해될 수 있다. 그 다음, 생성된 용액을 염화 처리용 염화 시약과 혼합할 수 있다. 본 발명에 있어서, 용해에 사용되는 물의 양과 여과 케이크의 양의 비는 바람직하게는 (0.8-1.2) mL : 1 g, 보다 바람직하게는 1 mL : 1 g일 수 있다. 본 개시에서, 상기 염화 시약은 바람직하게는 수산화나트륨 수용액 및/또는 수산화칼륨 수용액일 수 있고, 보다 바람직하게는 수산화나트륨 수용액 또는 수산화칼륨 수용액일 수 있다. 염화 시약은 바람직하게는 1 mol/L 내지 4 mol/L, 보다 바람직하게는 2 mol/L 내지 3 mol/L의 농도를 가질 수 있다. 염화 시약이 수산화나트륨 수용액과 수산화칼륨 수용액인 경우, 염화 시약의 농도는 수산화나트륨과 수산화칼륨의 총 농도를 의미한다. 본 개시에서, 염화 시약의 첨가량은 특별히 제한되지 않으며, 바람직하게는 상응하는 나트륨 염 및/또는 칼륨 염이 얻어질 수 있는 한, 용해 필터 케이크를 염화 시약과 혼합하여 얻어지는 시스템에 대한 중성 pH가 보장될 수 있다.
본 개시에서, 염화 처리가 완료된 후, 생성된 용액을 투석할 수 있다. 투석에 사용되는 투석백은 바람직하게는 3,000 Da 내지 12,000 Da, 더 바람직하게는, 8,000 Da 내지 12,000 Da의 분자량 컷오프를 가질 수 있다. 본 개시에서, 상기 투석은 바람직하게는 2일 내지 3일, 보다 바람직하게는 2일 동안 수행될 수 있다. 투석 과정에서, 물은 12시간마다 한번씩 교환될 수 있다.
본 개시에서, 투석이 완료된 후, 생성된 시스템은 바람직하게는 로터리식 증발에 적용될 수 있다. 잔류물은 아세트산나트륨 수용액(NaOAc 수용액)으로 용해될 수 있다. 이어서, 얻어진 용액을 제2 침전 처리를 위해 에탄올과 혼합할 수 있다. 본 개시에서, NaOAc 수용액의 농도는 바람직하게는 2 내지 5 질량%, 보다 바람직하게는 2 내지 3 질량%일 수 있다. 본 개시에서, 상기 잔류물은 NaOAc 수용액에 용해되어 잔류물이 에탄올에 더 잘 용해되도록 보장할 수 있으며, 그로 인해 후속 제2 침전 처리를 용이하게 할 수 있다. 본 개시에서, 상기 잔사, NaOAc 수용액 및 에탄올의 양비(amount ratio)는 바람직하게는 1 g : (8-12) mL : (3.5-4.5) mL일 수 있고, 보다 바람직하게는 1 g : 10 mL : 4 mL일 수 있다.
본 개시에서, 제2 침전 처리가 완료된 후, 생성된 시스템을 바람직하게는 원심분리하여 콘드로이틴 설페이트 글리칸의 금속염의 조 생성물을 고체로 제공할 수 있다. 본 개시에서, 최종적으로 얻어지는 콘드로이틴 설페이트 글리칸의 금속염이 높은 순도를 갖는 것을 보장하기 위하여, 콘드로이틴 설페이트 글리칸의 금속염의 조 생성물은 바람직하게는 제1 침전 처리, 염화 처리, 투석 단계, 및 제2 침전 처리에 반복적으로 적용하고, 생성된 조 생성물은 후속 겔 컬럼 정제에 적용된다. 본 개시에서, 겔 컬럼 정제에 사용되는 겔 컬럼은 바람직하게는 G25 겔 컬럼일 수 있다. 겔 컬럼 정제에 사용되는 용리액은 바람직하게는 물일 수 있다.
본 개시에서, 겔 컬럼 정제가 완료된 후, 바람직하게는 생성된 용출액을 건조시켜 콘드로이틴 설페이트 글리칸의 금속염을 제공할 수 있다. 본 개시에서, 건조는 바람직하게는 동결건조일 수 있다. 본 개시에서, 동결건조를 위한 온도 및 기간은, 재료가 완전히 건조될 수 있는 한, 특별히 제한되지 않는다.
제3 양태에서, 본 개시의 기술적 해결책은, 제1 양태에 기재된 바와 같은 콘드로이틴 설페이트 글리칸의 금속염 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 약제학적 조성물은 해당 기술 분야에 잘 알려진 방법으로 제조될 수 있다. 인간 또는 동물에 적합한 임의의 제형은 본 개시의 화합물을 1종 이상의 약제학적으로 허용가능한 고체 또는 액체 부형제 및/또는 아주번트와 조합함으로써 제형화될 수 있다. 본 개시의 화합물은 일반적으로 본 발명의 약제학적 조성물 중 0.1 중량% 내지 95 중량%의 함량을 가질 수 있다.
본 개시의 화합물 또는 이를 포함하는 약제학적 조성물은 단위 투여량으로 장내 또는 비경구로 투여될 수 있다. 투여 경로는 경구 투여, 정맥내 주사, 근육내 주사, 피하 주사, 비강 투여, 경구 점막 투여, 안구 투여, 폐 투여, 호흡기 투여, 경피 투여, 질 투여, 직장 투여 등을 포함할 수 있다.
투여를 위한 제형은 액체 제형, 고체 제형, 또는 반고형 제형일 수 있다. 액체 제형은 용액(순용액 및 콜로이드 용액 포함), 에멀젼(o/w 타입, w/o 타입, 및 다중 에멀젼 포함), 현탁액, 주사제(물 주사, 분말 주사, 및 주입 포함), 점안액, 점비액, 로션, 도포제 등을 포함한다. 고형 제형은 정제(통상정, 장용-코팅정, 로젠지, 분산정, 저작정, 발포정 및 구강내 붕괴정 포함), 캡슐제(경질 캡슐, 연질 캡슐, 및 장용-코팅 캡슐), 과립, 분말, 펠렛, 점적 환제, 좌약, 필름, 패치, 가스(분말) 에어로졸, 스프레이 등을 들 수 있다. 반고체 제형은 연고, 겔, 페이스트 등일 수 있다.
본 개시의 화합물은 일반 제제(normal preparation), 서방성 제제, 제어-방출 제제, 표적화 제제, 및 다양한 미립자 약물 전달 시스템으로 제형화될 수 있다.
본 개시의 화합물을 정제로 제형화하기 위해, 희석제, 접착제, 습윤제, 붕해제, 활택제(lubricant), 윤활제(glidant)를 포함하는, 해당 기술 분야에 잘 알려진 다양한 부형제를 폭넓게 사용할 수 있다. 희석제는 전분, 덱스트린, 수크로스, 글루코스, 락토스, 만니톨, 소르비톨, 자일리톨, 미정질 셀룰로오스, 황산칼슘, 인산수소칼슘, 탄산칼슘 등일 수 있다. 습윤제는 물, 에탄올, 이소프로판올 등일 수 있다. 접착제는 전분 페이스트, 덱스트린, 시럽, 꿀, 글루코스액(glucose water), 미정질 셀룰로오스, 아카시아 점액질, 젤라틴 페이스트, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 히드록시프로필 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 아크릴 수지, 카보머, 폴리비닐피롤리돈, 폴리에틸렌 글리콜 등일 수 있다. 붕해제는 건조 전분, 미정질 셀룰로오스, 저-치환 히드록시프로필셀룰로오스, 가교 폴리비닐피롤리돈, 가교 소듐 카르복시메틸셀룰로오스, 소듐 카르복시메틸 전분, 소듐 바이카보네이트 및 시트르산, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 지방산 에스테르, 소듐 도데실 설페이트 등일 수 있다. 활택제 및 윤활제는 활석 분말, 이산화규소, 스테아르산염, 타르타르산, 유동 파라핀, 폴리에틸렌 글리콜 등일 수 있다.
상기 정제는 추가로 코팅정, 예컨대, 당의정, 필름코팅정, 장용코팅정, 또는 이중층정 및 다중층정으로 제형화될 수 있다.
투여 단위를 캡슐로 제형화하기 위해, 유효성분인 본 개시의 화합물을 희석제 및 윤활제와 혼합한 다음, 생성된 혼합물을 경질 캡슐 또는 연질 캡슐에 직접 투입할 수 있다. 또한, 본 개시의 화합물을 유효성분으로 먼저 희석제, 접착제 및 붕해제와 함께 과립 또는 펠렛으로 제형화한 다음, 경질 캡슐 또는 연질 캡슐에 투입할 수 있다. 본 개시의 화합물의 정제 제조에 사용되는 다양한 희석제, 접착제, 습윤제, 붕해제 및 윤활제는 또한 본 개시의 화합물의 캡슐을 제조하는 데 사용될 수 있다.
본 개시의 화합물을 주사제로 제형화하기 위해, 물, 에탄올, 이소프로판올, 프로필렌글리콜 또는 이들의 혼합물을 용매로 사용할 수 있으며, 해당 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 가용화제, 공용매, pH 조절제, 및 삼투압 조절제를 적절한 양으로 첨가할 수 있다. 가용화제 또는 공용매는 폴록사머, 레시틴, 히드록시프로필-β-사이클로덱스트린 등일 수 있다. pH 조절제는 포스페이트, 아세테이트, 염산, 수산화나트륨 등일 수 있다. 삼투압 조절제는 염화나트륨, 만니톨, 글루코스, 포스페이트, 아세테이트 등일 수 있다. 동결건조 분말 주사제를 제조하기 위해, 만니톨, 글루코스 등을 프로판트(proppant)로 첨가할 수도 있다.
더욱이, 필요에 따라, 착색제, 방부제, 향료, 착향제(corrigent) 또는 기타 첨가제를 약제학적 제제에 첨가할 수도 있다.
투약 목적을 달성하고 치료 효과를 향상시키기 위해, 본 개시의 약물 또는 약제학적 조성물은 널리 알려진 임의의 투여 경로에 의해 투여될 수 있다.
본 개시의 화합물 또는 약제학적 조성물의 투여량은 예방 또는 치료하고자 하는 질병의 성질 및 중증도, 환자 또는 동물의 개별적 특성, 투여 경로 및 투여량 형태 등에 따라 폭넓게 달라질 수 있다. 일반적으로, 본 개시의 화합물은 0.001 내지 150 mg/Kg 체중, 바람직하게는 0.1 내지 100 mg/Kg 체중, 더욱 바람직하게는 1 내지 60 mg/Kg 체중, 가장 바람직하게는 2 내지 30 mg/Kg 체중 범위 내에서 적절한 1일 투여량을 가질 수 있다. 상기 투여량은 일회 투여량 단위 또는 수회 투여량 단위로 분할될 수 있으며, 이는 의사의 임상 경험 및 다른 치료 수단의 사용을 포함하는 투여 요법에 따라 달라질 수 있다.
본 개시의 화합물 또는 조성물은 단독으로, 또는 다른 치료 약물 또는 대증 약물과 조합하여 투여될 수 있다. 본 개시의 화합물과 다른 치료 약물 사이에 시너지 효과가 있는 상황에서, 화합물의 투여량은 실제 상황에 따라 조절되어야 한다.
제4 양태에서, 본 개시는 염증성 질환 치료용 약제의 제조에 있어서 본 개시의 제1 양태에 기재된 바와 같은 콘드로이틴 설페이트 글리칸의 금속염의 용도를 제공한다. 염증성 질환은 골관절염 및 류마티스 관절염을 포함할 수 있다.
본 개시는 NF-κB 신호전달 경로와 염증-관련 인자 및 효소의 발현 및 기능을 모두 억제하여 항염 작용을 하는, 콘드로이틴 설페이트 글리칸의 금속염을 제공한다. 실시예의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 개시에서 제공하는 콘드로이틴 설페이트 글리칸 금속염은 항염 효과가 있으며, 그에 따라 염증성 질환 치료를 위한 약제의 제조에 사용될 수 있다.
본 개시는 항염 작용을 나타낼 뿐만 아니라 골밀도 개선 효과도 나타내는 콘드로이틴 설페이트 글리칸의 금속염을 제공한다. 실시예의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 개시에서 제공하는 콘드로이틴 설페이트 글리칸 금속염은 항염 및 골 보호 효과를 가지며, 그에 따라 류마티스 관절염을 치료하기 위한 의약의 제조에 사용될 수 있다.
본 개시는 연골의 수분 함량을 증가시킬 수 있고 연골 보호 효과가 있는 콘드로이틴 설페이트 글리칸의 금속염을 제공한다. 실시예의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에서 제공하는 콘드로이틴 설페이트 글리칸 금속염은 항염 및 연골 보호 효과를 가지며, 그에 따라 골관절염 질환을 치료하기 위한 의약의 제조에 사용될 수 있다.
본 개시의 화합물은 높은 황산화도(설페이트 대 카르복실레이트의 비율이 특정 범위 이내임)를 나타내므로, 천연 유래 CS-E를 능가하는 탁월한 생체내(in vivo) 항염 활성을 갖는다. 본 개시에서 화합물의 황산화도는 생체내(in vivo) 항염 활성과 현저한 구조-활성 관계(structure-activity relationship; SAR)를 갖는다. 급성 궤양성 직장염의 동물 모델에서, 본 개시의 화합물은 또한 뛰어난 생물학적 활성 및 상당한 치료 효과를 나타낸다. 천연 유래 CS-A 및 CS-E와 비교하여, 본 개시의 화합물은 항-타입 I 콜라겐-유도 발가락 부종(RA) 동물 모델 및 파파인 유도 관절염(OA) 래트 모델 둘 모두에서 현저한 생물학적 활성 및 유의한 치료 효과를 나타낸다.
본 개시는 콘드로이틴 설페이트 글리칸의 금속염의 제조 방법을 제공한다. 본 개시에서, 다양한 황산화도를 갖는 콘드로이틴 설페이트 글리칸의 금속염은 반합성 과정을 통해 얻을 수 있으며, 이는 간단하고 대규모 생산에 적합하다.
도 1은 실시예 1에서 제조한 글리칸 1의 고성능 액체 크로마토그램이다;
도 2는 실시예 2에서 제조한 글리칸 2의 고성능 액체 크로마토그램이다;
도 3은 실시예 3에서 제조한 글리칸 3의 고성능 액체 크로마토그램이다;
도 4는 실시예 4에서 제조한 글리칸 4의 고성능 액체 크로마토그램이다;
도 5는 실험예 3에서의 UC 마우스의 체중 변화 비교도이다. 참고: ##p < 0.01 대(vs.) Con; 및 *p < 0.05 대 Mod;
도 6은 실험예 3에서의 UC 마우스의 결장 길이 비교도이다. Note: ##p < 0.01 대 Con; 및 *p < 0.05 대 Mod;
도 7은 실험예 3에서의 그룹별 마우스의 질병활성지수(disease activity index; DAI) 점수 비교도이다. 참고: ##p < 0.01 대 Con; 및 **p < 0.01, *p < 0.05 대 Mod;
도 8은 실험예 5에서의 상이한 그룹의 래트의 무릎 관절에 대한 자기공명영상(MRI) 영상을 제시한다. 참고: 도 8에서, CON 그룹은 정상적인 관절 공간, 온전하고 손상되지 않은 관절 연골 표면, 정상적인 연골하골(subchondral bone), 정상적인 연골 두께, 적절한 양의 무릎아래 지방(subpatellar fat), 활막 및 약간의 활액을 나타내고; MOD 그룹은 좁아진 관절 공간, 손상되거나 심지어 손실된 관절 연골 표면, 불완전한 외부 연골 가장자리, 불명확한 연골 형태 및 감소된 연골 두께를 나타내며; 5H 그룹은 명확한 관절 형태, 회복된 관절 공간, 및 약간의 활액을 보여준다.
도 9는 실험예 5에서의 상이한 그룹의 래트의 무릎 관절에 대한 컴퓨터 단층촬영(CT) 사진이다. 참고: 도 9에서, CON 그룹은 정상 래트의 무릎 관절 형태를 나타내며; MOD 모델 그룹은 무릎 관절의 연골하골에서 골 파괴 및 심각한 부식, 관절에서 명백한 공동 형성, 및 골 관절의 변형을 나타내며; POS 양성 약물 및 5L 그룹은 모델 그룹에 비해 더 적은 골 파괴 및 부식을 나타내며; 5M 및 5H 그룹은 모델 그룹과 비교하여 현저하게 개선된 골 파괴 및 부식을 나타낸다.
도 2는 실시예 2에서 제조한 글리칸 2의 고성능 액체 크로마토그램이다;
도 3은 실시예 3에서 제조한 글리칸 3의 고성능 액체 크로마토그램이다;
도 4는 실시예 4에서 제조한 글리칸 4의 고성능 액체 크로마토그램이다;
도 5는 실험예 3에서의 UC 마우스의 체중 변화 비교도이다. 참고: ##p < 0.01 대(vs.) Con; 및 *p < 0.05 대 Mod;
도 6은 실험예 3에서의 UC 마우스의 결장 길이 비교도이다. Note: ##p < 0.01 대 Con; 및 *p < 0.05 대 Mod;
도 7은 실험예 3에서의 그룹별 마우스의 질병활성지수(disease activity index; DAI) 점수 비교도이다. 참고: ##p < 0.01 대 Con; 및 **p < 0.01, *p < 0.05 대 Mod;
도 8은 실험예 5에서의 상이한 그룹의 래트의 무릎 관절에 대한 자기공명영상(MRI) 영상을 제시한다. 참고: 도 8에서, CON 그룹은 정상적인 관절 공간, 온전하고 손상되지 않은 관절 연골 표면, 정상적인 연골하골(subchondral bone), 정상적인 연골 두께, 적절한 양의 무릎아래 지방(subpatellar fat), 활막 및 약간의 활액을 나타내고; MOD 그룹은 좁아진 관절 공간, 손상되거나 심지어 손실된 관절 연골 표면, 불완전한 외부 연골 가장자리, 불명확한 연골 형태 및 감소된 연골 두께를 나타내며; 5H 그룹은 명확한 관절 형태, 회복된 관절 공간, 및 약간의 활액을 보여준다.
도 9는 실험예 5에서의 상이한 그룹의 래트의 무릎 관절에 대한 컴퓨터 단층촬영(CT) 사진이다. 참고: 도 9에서, CON 그룹은 정상 래트의 무릎 관절 형태를 나타내며; MOD 모델 그룹은 무릎 관절의 연골하골에서 골 파괴 및 심각한 부식, 관절에서 명백한 공동 형성, 및 골 관절의 변형을 나타내며; POS 양성 약물 및 5L 그룹은 모델 그룹에 비해 더 적은 골 파괴 및 부식을 나타내며; 5M 및 5H 그룹은 모델 그룹과 비교하여 현저하게 개선된 골 파괴 및 부식을 나타낸다.
실시예 1
(1) 시판중인 글리칸 콘드로이틴 설페이트 A(옌타이 둥청 파마슈티칼 그룹 회사, NO. CSJ1170701) 26.8 g을 디메틸 설폭사이드 360 mL에 용해시켰다. 그런 다음, 24 g의 삼산화황 트리메틸아민 착물(3당량)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 50℃에서 교반하면서 6시간 동안 반응시켰다.
(2) 생성된 반응 시스템을 실온으로 냉각시켰다. 그런 다음, 부피 분율이 95%인 에탄올 수용액 400 mL를 첨가했다. 생성된 혼합물을 30분 동안 교반한 다음, 여과시켰다. 생성된 필터 케이크를 물에 용해시켰다(물의 양 대 필터 케이크의 양의 비는 1 mL : 1 g이었음). 2 mol/L NaOH 수용액을 사용하여 pH 값을 7.0으로 조정했다. 생성된 용액을 2일 투석을 위해 투석백(분자량 컷오프가 12,000 Da임)에 넣었다. 그런 다음, 고체를 제공하기 위해 생성된 투석액을 로터리식 증발에 적용했다.
(3) 얻어진 고체를 NaOAc 수용액에 2 질량% 농도로 용해시켰다. 그런 다음, 무수 에탄올을 첨가했다. 생성된 혼합물을 충분히 침전시킨 다음 원심분리하여 조 생성물을 수득하였으며; 이때, 고체의 양, NaOAc 수용액의 양, 및 무수 에탄올의 양의 비율은 1 g : 10 mL : 40 mL이었다.
(4) 수득된 조 생성물을 다시 한 번 단계 (2) 및 단계 (3)에 적용했다. 그런 다음, 생성된 생성물을 G25 겔 컬럼(용리액으로 H2O 사용)에서 정제했다. 마지막으로, 생성된 용출액을 동결건조하여 콘드로이틴 설페이트 글리칸의 나트륨 염(글리칸 1로 지칭함) 21.3g을 얻었다.
실시예 2
단계 (1)에서 시판중인 글리칸 콘드로이틴 설페이트 A 6.7 g을 디메틸설폭사이드 90 mL에 용해시킨 다음, 삼산화황 트리메틸아민 착물(4 당량) 8 g을 첨가하고; 생성된 혼합물을 60℃에서 교반하면서 24시간 동안 반응시킨 것을 제외하고는, 실시예 1의 단계들에 따라 콘드로이틴 설페이트 글리칸 나트륨염 4.4 g(글리칸 2)을 제조했다.
실시예 3
단계 (1)에서 시판중인 글리칸 콘드로이틴 설페이트 A 6.7 g을 디메틸설폭사이드 90 mL에 용해시킨 다음, 삼산화황 트리메틸아민 착물(5 당량) 10 g을 첨가하고; 생성된 혼합물을 60℃에서 교반하면서 24시간 반응시키며; 투석백의 분자량 컷오프가 7,000 Da인 것을 제외하고는, 실시예 1의 단계들에 따라 콘드로이틴 설페이트 글리칸 나트륨염 4.1 g(글리칸 3으로 지칭함)을 제조했다.
실시예 4
단계 (1)에서 시판중인 글리칸 콘드로이틴 설페이트 A 6.7 g을 디메틸설폭사이드 90 mL에 용해시킨 다음, 삼산화황 트리메틸아민 착물(6 당량) 12 g을 첨가하고, 생성된 혼합물을 70℃에서 교반하면서 20시간 반응시키며; 투석백의 분자량 컷오프가 5,000 Da인 것을 제외하고는, 실시예 1의 단계들에 따라 콘드로이틴 설페이트 글리칸 나트륨염 3.9 g(글리칸 4로 지칭함)을 제조했다.
실시예 5
단계 (1)에서 시판중인 글리칸 콘드로이틴 설페이트 A 1.0g을 디메틸설폭사이드 13 mL에 용해시킨 다음, 삼산화황 트리메틸아민 착물(8 당량) 2.4 g을 첨가하고, 생성된 혼합물을 100℃에서 교반하면서 36시간 반응시키며; 투석백의 분자량 컷오프가 3,500 Da인 것을 제외하고는, 실시예 1의 단계들에 따라 콘드로이틴 설페이트 글리칸 나트륨염 1.0 g(글리칸 5로 지칭함)을 제조했다.
약리학적 실험
실험예 1
상기 실시예 1 내지 5에서 제조된 글리칸 1 내지 5의 조성을 분석하였으며, 이에는 평균 분자량(Da), -SO3 -/-COO-(몰비), -SO3 -, 알두론산 및 헥소사민의 함량, 항응고 역가(IU), 분해성 글리칸 함량, 및 각 서브타입별 성분 비율(구체적으로 콘드로이틴 설페이트 A, 콘드로이틴 설페이트 C, 및 콘드로이틴 설페이트 E의 비율을 지칭하며, 실시예 1 내지 5에서 제조한 글리칸 1 내지 5를 콘드로이틴 설페이트 ABC 효소로 분해시켰고, 각 서브타입의 성분을 고성능 액체 크로마토그래피로 테스트했으며, 이때 글리칸 1 내지 5는, 본 명세서에 추가로 명시되지 않은, 다른 서브타입의 나머지 콘드로이틴 설페이트 글리칸을 추가로 함유하였음)이 포함되었다.
글리칸 1 내지 4의 고성능 액체 크로마토그램을 도 1 내지 도 4에 도시했다. 구체적인 결과를 표 1에 나타내었다.
실험예 2
실시예 1 내지 5에서 제조한 글리칸 1 내지 5의 항염 효과를, 구체적으로 다음과 같이 평가했다:
(1) 테스트 방법: 크로톤 오일로 유발한 마우스 귀 급성 부종 염증 모델에서 CS 화합물의 약력학적 활성 평가 실험
동물: Balb/c 마우스, 수컷(20 g 내지 22 g); 그룹당 8마리의 마우스.
그룹: 모델 그룹, 양성 약물(인도메타신) 그룹(5 mg/kg), 천연 추출물(CS-E) 그룹(200 mg/kg), 글리칸 그룹(200 mg/kg, 100 mg/kg, 50mg/kg). 양성 약물 및 CS 시리즈의 화합물을 각각 소듐 카르복시메틸셀룰로오스 0.5 질량%의 농도로 제형화하고, 4℃의 냉장고에서 보관했다.
투여 및 테스트: 마우스에게 1일 1회 3일 동안 투여했다. 마지막 투여 후, 화합물에 의한 마우스 귀 부종 유도율(%) 및 귀 부종 억제율(%)을 계산했다.
통계 분석: 실험 결과를 모두 "평균 ± 표준 편차"로 나타냈다. 두 그룹 간의 통계적 차이를 t-테스트 방법으로 계산하고 분석했다. *는 p < 0.05를 나타내고, **는 p < 0.01을 나타낸다.
(2) 글리칸의 항염 효과를 표 2 내지 4에 나타내었다.
표 2 내지 4로부터 글리칸 1 내지 5의 황산화도와 항염 활성 사이에 구조-활성 관계가 있음을 알 수 있다. 글리칸 2 내지 5는 마우스 귀 부종 모델에서 현저한 항염증 효과를 나타내었으며, 이는 천연 유래 CS-E 글리칸보다 우수했다. 특히, 글리칸 3은 유의한 용량 의존적 관계로, 50 mg/kg 내지 200 mg/kg 범위의 농도 전체에서 유의한 항염 효과를 나타냈다.
실험예 3
실시예 3에서 제조한 글리칸 3(SEMI5로 지칭함)의 약력학을 항-DSS 모델에서 평가했으며, 구체적으로 다음과 같이 평가했다:
Ⅰ. 재료 및 방법
1. 실험동물
베이징 화푸캉 생명공학 주식회사(Beijing Huafukang Biotechnology Co., Ltd)에서 라이선스 번호: SCXK(Beijing) 2014-0004로 구입한, C57BL/6J 마우스, 수컷(18 g 내지 20 g), 그룹당 6마리 마우스.
2. 실험 그룹
(1) 정상 대조 그룹(대조 그룹): 소듐 카르복시메틸셀룰로오스를 0.5 질량% 농도로 위내 투여했음.
(2) UC(궤양성 대장염) 모델 그룹(모델 그룹): 소듐 카르복시메틸셀룰로오스를 0.5 질량% 농도로 위내 투여했음.
(3) SASP(양성 약물 살라조설파피리딘)군: 상하이 진니 제약 주식회사(Shanghai Xinyi Pharmaceutical Co., Ltd.)(배치 번호: 036151102), 500 mg/kg, 소듐 카르복시메틸셀룰로오스로 0.5 질량% 농도로 제형화하여 4℃에서 보관하였고, 1일 1회 위내 투여했음.
(4) SEMI5-50 그룹: 50 mg/kg, 증류수로 제형화하여 4℃에서 보관하고, 1일 1회 위내 투여하였음.
(5) SEMI5-150 그룹: 150 mg/kg, 증류수로 제형화하여 4℃에서 보관하고, 1일 1회 위내 투여하였음.
3. 실험방법
SPF 동물 사육장(실험 동물 사용 허가 번호: SYXK(베이징) 2014-0023)에서 일주일 동안 적응사육한 후, C57BL/6J 마우스를 위의 프로토콜에 따라 무작위로 5개 그룹으로 나누었다. UC 모델 그룹 및 투여 그룹 마우스를 실험실에서 확립된 궤양성 대장염에 대한 모델링 방법에 따라 매일 DSS(MP, CA9011-18-1, US)로 모델링했다. 정상 대조 그룹(대조 그룹) 및 UC 모델 그룹(모델 그룹)에 1일 1회 0.5질량% 농도의 소듐 카르복시메틸셀룰로오스를 위내 투여했다. SASP 그룹, SEMI5-50 그룹 및 SEMI5-150 그룹에는 "실험 그룹" 섹션의 실험 프로토콜에 따라 1일 1회 위내 투여했다. 모델링 후 7일째, 명백한 나른함, 활동 감소, 체중 감소, 묽은 변(watery stool), 및 혈변과 같은 전형적인 UC 병리학적 변화가 UC 모델 그룹의 동물에서 발생했다. 실험을 종료하고 각 그룹의 동물을 희생시켰다. 대장염과 관련된 각각의 평가 지표를 검출했다(아래 실험 결과 섹션 참조). 각 화합물의 항-UC 약력학적 활성을 종합적으로 평가했다.
Ⅱ. 실험 결과
1. DSS-유도 UC 모델 마우스의 체중에 대한 각 농도에서의 SEMI5의 효과(표 5 및 도 5).
표 5 및 도 5로부터 알 수 있는 바와 같이, 정상 대조 그룹의 마우스와 비교하여 UC 모델 그룹의 마우스는 통계적으로 유의한 차이로, 체중이 유의하게 감소하였으며, 이는 UC 모델링의 성공을 제시한다. SASP 그룹과 SEMI5-150 그룹은 DSS 유도 급성 UC C57 BL/6J 마우스의 체중 감소를 효과적으로 완화시키지 못한 반면, SEMI5-50 그룹은 UC 모델 그룹과 비교하여, 통계적으로 유의한 차이로, 체중 감소를 효과적으로 완화했다.
2. UC 마우스의 결장 구축(colon contracture)에 대한 각 농도에서의 SEMI5의 효과(표 6 및 도 6).
표 6 및 도 6에서 알 수 있는 바와 같이, DSS 유도 C57 BL/6J 급성 UC 동물 모델에서 정상 대조군과 비교하여 UC 모델 그룹은, 통계적으로 유의적인 차이로, 유의하게 감소된 결장 구축을 나타냈다. SASP 그룹은 모델 동물의 결장 구축을 효과적으로 완화하지 못했다. 그러나, SEMI5-50 그룹과 SEMI5-150 그룹은 UC 모델 그룹과 비교하여 통계적으로 유의적인 차이로 결장 구축을 효과적으로 완화할 수 있었다.
3. UC 마우스의 질병 복합 지수 DAI 점수에 대한 각 농도에서의 SEMI5의 효과(표 7 및 도 7).
표 7 및 도 7에서 알 수 있는 바와 같이, 정상 대조 그룹의 마우스와 비교하여, UC 모델 그룹의 마우스는, 통계적으로 유의한 차이로, 질병 복합 지수 DAI가 유의하게 증가했으며, 이는 모델링의 성공을 제시한다. SEMI5-50 그룹과 SEMI5-150 그룹은 UC 모델 그룹과 비교하여 실험 동물의 질병 복합 지수 DAI 점수를, 통계적으로 유의적인 차이로, 유의하게 감소시킬 수 있었다. SASP 그룹은 통계적으로 유의적인 차이로 어느 정도까지 개선되었다. 동물의 체중 감소, 대변 특성, 혈변 등과 같은 지표 측면에서 DAI 점수로 동물을 평가했다. DAI 점수가 낮을수록 동물의 상태가 정상적인 생리적 상태에 더 가까웠다. DAI 채점 기준은 표 8과 같았다.
실험예 4
실시예 3에서 제조한 글리칸 3(SEMI5)를 항-타입 I 콜라겐 유발 발가락 부종 마우스 모델에서 평가하였으며, 구체적으로 다음과 같이 평가했다:
Ⅰ. 재료 및 방법
1. 동물: DBAI 마우스, 수컷(20 g에서 22 g); 그룹당 7마리의 마우스.
2. 그룹: 블랭크 대조 그룹, 모델 그룹, 양성 약물 인도메타신 그룹(5 mg/kg), CSA 그룹(200 mg/kg), CSE 그룹(200 mg/kg), CS-E-semi3 그룹(200 mg/kg) kg) 및 CS-Semi-5 그룹(200 mg/kg). CS 시리즈의 양성 약물 및 화합물을 각각 0.5% 소듐 카르복시메틸셀룰로오스로 제형화하여 4℃의 냉장고에 보관했다.
3. 투여빈도: 1일 1회 3일간 마우스에 투여했다.
4. 실험 방법: 실험실에서 확립된 방법에 따라, 1차 면역접종 후, 매주 각 그룹의 마우스에 대해 체중을 측정했다. 실험 21일째에 2차 충격 면역접종 후, 매주 각 군 마우스에 대해 관절 부종 정도를 관찰하여 관절 부종 지수 점수를 채점했다.
5. 통계 분석: 실험 결과는 모두 "평균 ± 표준 편차"로 나타냈다. 두 그룹 간의 통계적 차이를 t-test 방법으로 계산하고 분석했다. *는 p < 0.05를 나타내고 **는 p < 0.01을 나타낸다.
Ⅱ. 실험 결과
*SEMI5 약물이 마우스의 체중 감소에 현저한 회복 효과를 나타냈음을 표 9의 마지막에 나타나 있는 마우스의 체중 비교 결과로부터 알 수 있다. 표 10으로부터 마우스의 관절은 대개 4주(w)째에 부풀어 오르기 시작하여, 발가락에서 발바닥, 심지어 발목 관절까지 발달하였고, 5주(w) 내지 6주(w)째에 병변 최고치(lesion peak)를 겪게됨을 확인할 수 있었으며, 이는 100% 모델링률이다. SEMI5 약물은 관절 부종을 유의하게 개선했다. 표 11에서 SEMI5 약물이 양성 약물에 비해 우수한 골밀도 개선 효과를 나타냄을 알 수 있다. 상기 결과는 반합성 SEMI5 약물이 항-RA 활성을 갖는다는 것을 나타낸다.
실험예 5
실시예 3에서 제조된 글리칸 3(SEMI5로 지칭함)를 항파파인 유발 OA 모델에서 구체적으로 다음과 같이 평가했다:
Ⅰ. 재료 및 방법:
1. 동물:
SD 래트, 수컷(180 g 내지 220 g); 그룹당 6마리 마우스, 베이징 바이탈리버 레보러터리 애니멀 테크로로지 회사(Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.)에서 라이센스 번호: SCXK(Beijing) 2012-0001로 구입했다.
2. 그룹:
(1) 정상 대조 그룹(Con 그룹): DDW를 위내 투여했음.
(2) 모델 그룹(Mod 그룹): DDW를 위내 투여했음.
(3) 양성 약물 셀레콕시브군(Pos 그룹): 화이자(W47055)로부터 약물을 구입하여 DDW로 제형화하여 4℃에서 보관하고 1일 1회 위내 투여했다.
(4) 화합물 SEMI5의 저용량 그룹(5L 그룹): 50 mg/kg, DDW로 제형화하여 4℃에서 보관하고 1일 1회 위내 투여했다.
(5) 화합물 SEMI5의 중용량 그룹(5M 그룹): 100 mg/kg, DDW로 제형화하여 4℃에서 보관하고 1일 1회 위내 투여했다.
(6) 화합물 SEMI5의 고용량 그룹(5H 그룹): 200 mg/kg, DDW로 제형화하여 4℃에서 보관하고 1일 1회 위내 투여했다.
II. 실험 결과
1. 무릎 관절의 순 너비
버니어 캘리퍼스를 사용하여 무피부 및 무지방 무릎 관절의 너비를 측정했다. 관절의 부종 정도를 육안으로 측정할 수 있었다.
참고: 정상 대조 그룹(Con)에 속한 동물과 비교하여, 모델 그룹(Mod)에 속한 동물은 무릎 관절의 순 너비가 유의하게 증가하여 통계적으로 유의한 차이가 있었다. 이는 모델 그룹에 속한 동물들의 관절이 분명히 부었다는 것을 나타낸다. 양성 약물 그룹(Pos)과 모델 그룹 간에는 통계적으로 유의한 차이가 없었다. 무릎 관절의 순 너비 측면에서, 각 투여 그룹의 동물은 모델 그룹(Mod)과 통계적으로 유의한 차이를 나타내었다. 이는 화합물이 현저한 항염증 활성을 나타냄을 시사한다. ** p < 0.01 대 Con; ## p < 0.01 대 Mod.2.
2. 자기 공명 영상 결과
래트 무릎 관절 연골의 손상 정도를 자기 공명 영상을 통해 확인했다(도 8 참조). 각 그룹의 관절 연골 수분 함량을 나타내는 각각의 조건에서 측정한 연골회색도 값(cartilage gray value)의 변화 데이터를 계산했다. 수분 함량이 높을수록, 관절 연골의 상태가 정상 생리학적 상태에 가까웠다(표 13 참조).
표 13에서 회색도 값의 측면에서 모델군 그룹(Mod)의 동물이 정상 대조 그룹(Con)과 통계적으로 유의한 차이를 나타냄을 알 수 있다. 이것은 명백한 연골 파괴와 성공적인 모델링을 시사한다. 회색도 값의 측면에서, 고용량 투여 그룹의 동물은 모델 그룹(Mod)과 통계적으로 유의한 차이를 나타냈다. 이상의 결과는 모델 그룹에서 연골 손상이 심한 반면, 투여 그룹에서는 유의한 개선 효과를 나타냈음을 시사한다. ** p < 0.01 대 Con; ## p < 0.01 대 Mod.
3. CT 검사 결과
쥐 무릎 관절의 연골아래 뼈는 CT로 검출하여 연골아래 뼈의 리모델링을 결정할 수 있다.
Ⅰ. 실험적 결론
1. 항-DSS-유발 급성 궤양성 대장염 모델에 대한 약력학적 평가
1) UC 모델 그룹의 동물은 상당한 체중 감소, 혈변, 묽은 변, 결장 구축 및 DAI 복합 지수 점수 및 결장 조직병리학적 점수의 증가를 나타냈으며, 이는 DSS 유도 궤양성 대장염 마우스 모델의 성공적인 모델링을 제시한다. 이 시스템은 신뢰할 수 있고 항 UC 화합물의 활성을 평가하는 데 적합하다.
2) SASP 그룹은 이 실험에서 UC 모델 동물의 체중 감소를 효과적으로 완화하는 못했으나, UC 모델 동물에서 묽은 변, 혈변, 결장 구축과 같은 현상을 개선했다. 이는 SASP가 특정 항-UC 활성을 나타냄을 제시한다.
3) SEMI5-50 그룹은 모델 동물의 체중 감소를 효과적으로 완화할 수 있었고, UC 모델 동물에서 묽은 변, 혈변, DAI 점수 감소 등과 같은 측면에서 특정 항-UC 활성을 통계적으로 유의한 차이로 나타냈다. 상기 결과는, 실험 시스템에서, SEMI5-50이 DSS 유도 UC 동물 모델에서 유의한 치료 효과를 나타냈음을 보여준다.
4) SEMI5-150 그룹은 임의의 통계적으로 유의한 차이로 UC 모델 동물의 체중 감소를 완화시키지는 못했으나, 통계적으로 유의한 차이로 UC 모델 동물에서 묽은 변, 혈변, DAI 및 조직학적 점수 감소와 같은 측면에서 항-UC 활성을 나타냈다. 위의 결과는, 테스트 시스템에서, SEMI5-150이 DSS 유도 UC 동물 모델에 대해 특정 치료 효과를 나타냈음을을 보여준다.
2. 항 I형 단백질 유도 발가락 부종 마우스 모델에 대한 약력학적 평가
1) SEMI5가 관절염 마우스의 체중 감소에 유의한 회복 효과를 나타냈음을 마우스의 말기 체중 비교 결과로부터 알 수 있다.
2) SEMI5는 관절 부종에 유의한 개선 효과를 보였다.
3) SEMI5는 관절 골밀도에 유의한 개선 효과를 나타냈으며, 이는 약성 약물의 개선 효과보다 월등했다. 상기 결과는 반합성 SEMI5가 항-RA 활성을 갖는다는 것을 나타낸다.
3. 항-파파인-유도 골관절염 래트 모델에 대한 약력학적 평가
1) 정상 대조 그룹(Con)의 동물과 비교하여, 모델 그룹(Mod)의 동물은, 통계적으로 유의한 차이로, 순 너비가 유의하게 증가된 무릎 관절을 가졌다. 이는 모델 그룹에 속한 동물의 관절이 분명히 부어 있었음을 시사한다. 양성 약물 그룹(Pos)과 모델 그룹 사이에는 통계적으로 유의한 차이가 없었다. 무릎 관절의 순 너비는 각 투여 그룹의 동물이 모델 그룹(Mod)과 통계적으로 유의한 차이를 보여주었으며, 이는 SEMI5가 우수한 항염 활성을 나타냈음을 시사한다.
2) CON 그룹은 정상 관절 공간, 손상되지 않은 관절 연골 표면, 정상 연골하골, 정상 연골 두께, 적절한 양의 무릎아래 지방, 윤활막 및 약간의 활액을 보여주었다. MOD 그룹은 좁은 관절 공간, 손상되거나 심지어 손실된 관절 연골 표면, 불완전한 외부 연골 가장자리, 불분명한 연골 형태 및 감소된 연골 두께를 보여주었다. SEMI5H 그룹은 관절 형태가 뚜렷하고 관절 공간이 회복되었으며 활액이 약간 있었다.
3) 회색도 값의 측면에서, 모델 그룹(Mod)의 동물은 정상 대조 그룹(Con)의 동물과 통계적으로 유의한 차이를 보였으며, 이는 명백한 연골 파괴와 성공적인 모델링을 시사한다. 회색도 값의 측면에서, 고용량 SEMI5 그룹의 동물이 모델 그룹(Mod)의 동물과 통계적으로 유의한 차이를 보였다. 이상의 결과는 모델 그룹과 투여 그룹에서 연골이 심하게 손상되었으며 유의한 개선 효과를 나타냈음을 제시한다.
4) CON 그룹의 정상적인 래트의 무릎 관절 형태와 비교하여 MOD 모델 그룹은 무릎 관절의 연골하골에서 골 파괴 및 심각한 부식, 관절에 명백한 공동 형성, 및 골 관절 변형을 나타냈다. POS 양성 약물 그룹과 SEMI5L 그룹은 모델 그룹보다 골파괴와 부식이 더 적게 나타냈다. SEMI5M 및 SEMI5H 그룹은 모델 그룹과 비교하여 유의하게 개선된 골 파괴 및 부식을 나타냈다.
위의 결과는 반합성 SEMI5가 항 OA 활성을 가지고 있음을 나타낸다.
위의 설명은 단지 본 개시의 바람직한 실시형태일 뿐이다. 통상의 기술자는 본 개시의 원리를 벗어나지 않고 특정 개선 및 수정을 할 수 있음을 주목해야 한다. 이러한 개선 및 수정은 본 개시의 보호 범위에 속하는 것으로 간주되어야 한다.
Claims (12)
- 하기 화학식 I로 표시되는 콘드로이틴 설페이트 글리칸의 금속염:
상기 화학식에서, 전반적으로 전기적으로 중성이고 콘드로이틴 설페이트 글리칸 음이온 및 금속 양이온을 포함하고;
상기 콘드로이틴 설페이트 글리칸 음이온은 1,000 Da 내지 15,000 Da의 평균 분자량을 가지며;
상기 콘드로이틴 설페이트 글리칸 음이온은 -SO3 - 대 -COO-의 몰비가 1.46 내지 2.73이며;
상기 콘드로이틴 설페이트 글리칸 음이온에 대한 n은 2≤n≤ 45의 범위이다. - 청구항 1에 있어서, 상기 콘드로이틴 설페이트 글리칸 음이온은 평균 분자량이 4,000 Da 내지 15,000 Da이고; 상기 콘드로이틴 설페이트 글리칸 음이온은 -SO3- 대 -COO-의 몰비가 1.9 내지 2.5인 것을 특징으로 하는, 콘드로이틴 설페이트 글리칸의 금속염.
- 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 상기 금속 양이온이 나트륨 이온 및/또는 칼슘 이온 및/또는 칼륨 이온을 포함하는 것을 특징으로 하는, 콘드로이틴 설페이트 글리칸의 금속염.
- 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 따른 콘드로이틴 설페이트 글리칸의 금속염의 제조 방법으로서,
콘드로이틴 설페이트 글리칸의 원료, 황산화 시약 및 황산화용 유기 용매를 혼합하여 황산화 생성물 시스템을 제공하는 단계; 및
상기 황산화 생성물 시스템에 대해 제1 침전 처리, 염화 처리, 투석, 제2 침전 처리 및 겔 컬럼 정제를 순차 수행하여 콘드로이틴 설페이트 글리칸의 금속염을 제공하는 단계를 포함하며,
상기 염화 처리에 사용되는 염화 시약이 금속 수산화물 수용액인, 제조 방법. - 청구항 4에 있어서, 상기 콘드로이틴 설페이트 글리칸의 원료가 콘드로이틴 설페이트 글리칸 A 및 콘드로이틴 설페이트 글리칸 C를 포함하고; 상기 콘드로이틴 설페이트 글리칸 A는 70 중량% 내지 90 중량%의 함량을 갖고, 상기 콘드로이틴 설페이트 글리칸 C는 10 중량% 내지 30 중량%의 함량을 갖고;
상기 콘드로이틴 설페이트 글리칸의 원료가 20,000 Da 내지 23,000 Da의 평균 분자량을 갖고,
상기 콘드로이틴 설페이트 글리칸의 원료가 0.9 내지 1.1의 -SO3 - 대 -COO-의 몰비를 갖는 것을 특징으로 하는, 방법. - 청구항 4 또는 청구항 5에 있어서,
상기 황산화 시약이 삼산화황 트리메틸아민 착물, 삼산화황 피리딘 착물, 및 삼산화황 트리에틸아민 착물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하고;
상기 황산화 시약 대 상기 콘드로이틴 설페이트 글리칸의 원료 중의 반복 이당류 단위의 당량비가 (1-10):1인 것을 특징으로 하는, 방법. - 청구항 6에 있어서, 상기 황산화가 40℃ 내지 120℃의 온도에서 2시간 내지 36시간 동안 수행되고; 상기 황산화 시약 대 상기 콘드로이틴 설페이트 글리칸의 원료 중의 반복 이당류 단위의 당량비가 (3-8):1인 것을 특징으로 하는, 방법.
- 청구항 4에 있어서, 상기 염화 시약이 수산화나트륨 수용액 및/또는 수산화칼륨 수용액이고; 상기 염화 시약이 1 mol/L 내지 4 mol/L의 농도를 갖는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 청구항 4에 있어서, 상기 제1 침전 처리에 사용되는 제1 침전 시약은 부피 분율이 90% 내지 95%인 에탄올 수용액이고;
상기 제2 침전 처리에 사용되는 제2 침전 시약은 에탄올이고;
상기 투석에 사용되는 투석 백은 3,000 Da 내지 12,000 Da의 분자량 컷오프를 갖는 것을 특징으로 하는, 방법. - 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 따른 콘드로이틴 설페이트 글리칸의 금속염 및 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
- 염증성 질환 치료용 약제의 제조에 있어서, 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 따른 콘드로이틴 설페이트 글리칸의 금속염의 용도.
- 청구항 11에 있어서, 상기 염증성 질환이 궤양성 대장염, 골관절염, 및 류마티스 관절염을 포함하는 것을 특징으로 하는, 용도.
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