HUT62917A

HUT62917A - Process for producing hepqrin derivatives and pharmaceutical compositions comprising such active ingredient

Info

Publication number: HUT62917A
Application number: HU922685A
Authority: HU
Inventors: Valle Francesco Della; Aurelio Romeo; Guenter Kirschner
Original assignee: Fidia Spa
Priority date: 1990-12-20
Filing date: 1991-12-20
Publication date: 1993-06-28
Also published as: FI923762A0; CA2075970A1; FI923762A; AU658594B2; WO1992011294A1; JPH05504785A; IT1243300B; NO923240L; NO923240D0; EP0516792A1; IT9041752A1; CN1062537A; KR920703644A; IT9041752A0; BR9106234A; PT99898A; AU9096491A

Description

A jelen találmány olyan heparin-származékokra vonatkozik, amelyeknek a farmakológiai tulajdonágai a jelenleg forgalomban levő és az antikoaguláns terápiában használatos heparin készítményekétől eltérőek . Az uj származékok antitrombin aktivitása és az Xa faktorra és a vérlemezke faktor 4-re (PF^-re) gyakorolt hatása közötti viszony különbözik a heparin esetében tapasztalttól. Más szóval, a PF^gyel szemben affinitásuk jelentős, ugyanakkor a heparin által katalizált, az antitrombin III és trombin közötti reakcióra gyakorolt hatásuk mérsékelt .

Ezzel párhuzamosan, az antitrombin III és az Xa faktor közötti reakció, amelyet a heparin maga katalizál, még érzékenyebb az uj származékokra. Mivel a PF^-re és a trombin és Xa faktor által aktivált reakciókra a heparintól eltérő arányban hatnak, az uj vegyületek képesek a trombózis kialakulásának megakadályozására anélkül, hogy vérzést idéznének elő, ami a heparin trombózisellenes hatását kíséri. Megjegyzendő, hogy a vérzést okozó hatás felléphet a túlzott trombingátlás következményeként is. A találmány szerinti uj vegyületek PF^-hez való kötődési képessége, és az a tulajdonságuk, hogy az Xa faktor által aktivált reakciókra alcsony koncentrációban és a trombin által katalizált reakciókra csak magasabb koncentrációban fejtenek ki hatást, alkalmassá teszi ezen vegyületeket az artériás és vénás trombózisok kezelésére.

Az uj heparin-származékokat és sóikat úgy kapjuk, hogy (1 ) heparin kvaterner ammóniumsót heterogyürüs szerves oldószerben oldunk, az oldószer N-hidrokarbi1-pirro1idin-2 -3-

on vagy N-hidrokarbil-piperidin-2-on, amely helyettesítetlen vagy kevés szénatomos alkilcsoportokkal helyettesített, és ezek olyan származéka, amelyekben a heterogyürü egy heteroatommal vagy heteroatomot tartalmazó csoporttal, így oxigénvagy kénatommal vagy -NH-csoporttal van megszakítva, vagy valamely ilyen vegyület aprotikus oldószerben készült tömény oldata, és 6-nál több szénatomot tartalmazó szénhidrogénből származtatható alkilezőszerrel ( éterezőszerrel) hosszabb ideig kezelünk környezeti vagy annál egy kicsit magasabb hőmérsékleten , (2) a kapott terméket magas hőmérsékleten szerves vagy szervetlen bázis vizes oldatával kezeljük, (3) a szabad vagy alkálifémsó formájában kapott heparinszármazékot elkülönítjük, és kívánt esetben (4) a kapott vegyületet szabad formájúvá vagy alkálifémmel vagy más fémmel vagy szerves bázissal alkotott sóvá alakítjuk.

Az uj heparin-származékoknak nemcsak a fentebb említett farmakológiai tulajdonságaik különböznek a heparinétól, hanem kémiai szerkezetük és molekulatömegük is eltérő;

kémiai szerkezetüket még nem határoztuk meg teljesen.

Az azonban már bizonyos, hogy termékek keverékéből állnak, ezért molekulatömegük a kiindulási vagy közepes , a keverék egymáshoz anyagokhoz képest kicsi hasonló f rag ment uniókban gazdag és ezek molekulatömege ugyanazon szűk tartományba esik, és a fragmentumok csak kis részének molekulatömege téréi ettől a középértéktől,

-4b) a kiindulási anyagokhoz viszonyítva jelentősen csökkent bennük az iduron-tipusu szacharid-egység és a glükuron-tipusu egység aránya.

A heparint véve alapul, az uj származékokban fellelhető további változások részben azok, amelyeket a heparin észterek bázisos kezelése eredményeként kapott fragmentumokra vonatkozóan már leírtak, ilyen például a deszu1fatálás és a telítetlen mdnoÖZacharid egységek jelenléte.

Az uj ¹ fezabmazékok azonosítása a kémiai vizsgálatok mellett a spektroszkópia,elsősorban a magmágneses rezonancia spektrum Segítségével történhet, amely különösen az irodalomban már leírt heparin fragmentumok és az uj származékok megkülönböztetésére ad lehetőséget.

A heparin kvaterner ammóniumsójának a szokásosan alkalmazott alkilezőszerekkel, azaz a kevés szénatomos szénhidrogénekkel, például kevés szénatomos alkil-halogenidekkel, így etil-bromiddal, valamely szokásos oldószerben, például dimeti1-szulfoxidban, dimeti1-formamidban végzett kezelése olyan heparin-észterek keletkezéséhez vezet, mint amilyeneket a 1 501 095 számú nagy-britanniai szabadalmi leírásban ismertetnek. Ha ezeket az észtereket bázissal reagáltatják, ami megfelel a jelen találmány szerinti eljárás második lépésének, a találmány szerintiektől eltérő heparin fragmentumokat kapnak, ami az NMR-analízisse1 kimutatható .

Az uj, kis molekulatömegü heparin-származékok, amelyeket a példákban írunk le, uj termékek, és jellemzésük főként nagyfrekvenciánál végzett NMR-spektroszkópia (400-500 MHz a • · ··

-5protonanalizis és 100-125 MHz a C-13 analízis esetében) alapján, a hagyományos egydimenziós spektrumok Fourier transzformációs vizsgálatával, az utóbbi időben közismertté vált kétdimenziós (a H-H és C-H korrelációjára vonatkozóan információt adó) módszerekkel, adott esetben még újabb, az ilyen bonyolult termékek tanulmányozásához szükséges eljárások ( például TOSCY = totál correlation spectroscopv) alkalmazásával lehetséges.

Az előzőekben említett módszerekkel végzett vizsgálatok eredményeként a következőket állapíthatjuk meg:

1) A találmány szerinti kis molekulatömegü heparin olyan oligoszacharidők bonyolult keveréke, amelyek a nitrogén- és oxigénatomon szülfatáltak, a kiindulási heparin heterogenitását tükrözve. Alapvetően IdoA és GlcnAc összetevőkből áll, amelyek eltérő módon szül fatáltak, és másodlagos komponensek ( főként GlcA) kapcsolódnak hozzájuk különféle' szekvenciális kombinációkat hozva létre.

2) A kiindulási heparinhoz viszonyítva a jelen találmány tárgyát képező termékek az IdoA/GlcN arányban jelentős csökkenést mutatnak, amely csökkenés az NMR vizsgálattal kimutatható. Ennek megfelelően a tipikus IdoA szekvencia anomer helyeinek jelei (2δθθ)-GlcNSOg) (6SO3) (102 és 99,5 ppm a szénre; 5,18 és 5,32 ppm a protonra) drasztikusan lecsökkennek. Ilyen átalakulások nem észlelhetők az ismert, kis molekulatömegü heparinokban, vagy ha igen, akkor sokkal kisebb mértékben. Ezzel párhuzamosan egy uj monoszacharid egység igen intenzív csúcsai jelennek meg ( ld. a 1.pontot ).

3) Egy további jellemző tény , hogy olyan uj szignálok • « ·

-6jelentkeznek a spektrumban ( 54,2 és 53,3 ppm-nél a szén és 3,73 és 3,68 ppm-nél a kapcsolatba hozható protonok esetében), amelyek a jelen esetben csak a GlcN maradék 2helyzetével hozhatók összefüggésbe, ahol a nitrogénatomhoz nem kapcsolódik -SO3H csoport. Ez a 2-D NMR vizsgálattal kimutatható jellegzetesség az ismert kis molekulatömegü heparinok spektrumából gyakorlatilag hiányzik.

4) Jellemző módon, a fenti oligoszacharidok legtöbbje telítetlen monoszacharid egységgel végződik, amelynek 1-2 helyzetében három helyettesítő kapcsolódik, mint az az NMR spektrumból látható (a C-13 spektrumban 147 és 172 ppm; a proton esetében 6 ppm-nél egy dublett). Ezek a jelek más ismert, alacsony molekulatömegü heparinok spektrumából hiányoznak, vagy nagyon gyengék.

Ezért arra kell következtetnünk, hogy a jelen találmány szerinti eljárásnak már az első lépésében nem egy egyszerű észterezés történik, hanem egy bonyolultabb kémiai reakció megy végbe.

Ezen adatok alapján tehát feltételezhetjük, hogy a jelen találmány szerinti heparinszerü termékek újak, és különböznek az irodalomban eddig leírt heparin fragmentumoktól. Például, eltérnek a 0 302 034 számú európai szabadalmi leírásban ismertetett fragmentumoktól, amelyeket heparin-észterek bázissal való kezelésével kaptak, és amelyek rézionokkal angiogén hatású komplexeket képeznek. Ugyanígy, a 4,440,926 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetett, jól meghatározott heparin észterekből 0,1-0,5 N nátrium-hidroxiddal 20 és 60°C közötti • ·· . .·· . ·. : . · · :: .

-7hömérsékleten kapott heparin fragmentumok is különböznek a jelen találmány szerinti termékektől.

A jelen találmány szerinti uj heparin-származékok fenti tulajdonságait a következő példákban mutatjuk be a szemléltető példákban leírt terméken, amelyet a következőkben PE rövidítéssel jelölünk. A kísérletekben nem-frakciónált (unfractioned, UFH) heparint és egy kis móltömegü heparinszármazékot (CY 216 = Fraxiparine^) használunk összehasonlítási anyagként. Mindkét termék a kereskedelemben kapható és trombózis kezelésére alkalmazható.

A rajzok rövid ismertetése

Az l.ábra a PE UFH-hoz és CY 216-hoz viszonyított in vi t ro antikoaguláns hatását mutatja trombin időben (s) kifejezve. Az adatok minden vizsgált termékre vonatkozóan 7-10 ismétlés középértékei.

A 2.ábrán a PE UFH-hoz és CY 216-hoz viszonyított ex vivő antikoaguláns hatása látható a trombin időnek megfelelően, i.v. adagolást követően. Az adatok minden vizsgált anyag esetében 5 nyullal végzett kísérletből származó értékek átlagai.

A 3.ábra a PE UFH-hoz és CY 216-hoz viszonyított ex vivő antikoaguláns hatását szemlélteti az anti-FXa hatás alapján ( eltűnési kinetikák s.c. adagolás után). Az adatok vizsgálandó anyagonként 5 nyullal végzett kísérletből származó értékek átlagai.

A 4.ábra a PF^-re kifejtett ex vivő aktivitást mutat ja a PE i.v. adagolását követően, az UFH-hoz és CY 216-hoz viszonyítva.

• · • ♦ « · • ·

-8l.In vitro antikoaguláns hatás regenerált humán ρ ] a z ni á r a

Anyagok és módszerek

Vizsgálandó anyagok ( oldás és koncentrációk)

A következő anyagokat vizsgáltuk:

- heparinszármazék PE

- nem-frakcionált heparin (UFH) kis molekulatömegü heparinszármazék (CY 216

Fraxiparin**)

A vizsgálandó anyagokat steril nátrium-klorid-oldatban oldottuk és 0,5 és 12,5 mikrogramm/ml koncentrációkban vizsgáltuk.

Paraméterek

1. Trombin idő ( az antikoaguláns hatás indikátoraként)

2. Anti-FXa hatás ( az antikoaguláns hatás indikátoraként)

Eredmények

1.Trombin idő

Az 1. ábrából világosan látszik, hogy

- a PE 1,25 mikrogramm/ml koncentrációtól kezdve fejt ki antikoaguláns hatást;

a PE antikoaguláns hatása jelentősen gyengébb a nemfrakcionált heparinénál ( a trombin idő az UFH-hoz viszonyítva kb. 4-5-ször nagyobb koncentrációknál nő).

A CY 216-tal összehasonlítva nem figyeltünk meg lényeges különbségeket.

2. Anti-FXa hatás

Az 1.Táblázatban az előzetes adatok arra utalnak, hogy

- a PE 3 mikrogramm/ml koncentrációtól kezdve fejt ki anti-FXa hatást;

- az anti-FXa hatás a heparinénál határozottan gyengébb.

··«· • : · · · · • · ·.·.!··♦ ..... ·. ·..· ·..·

-9Ezzel kapcsolatban megjegyezzük, hogy ez a hatás a CY

216-énál is gyengébb, de a különbség kisebb annál, mint amit az UFH-val kapcsolatban megfigyeltünk.

1.Táblázat

A PE in vitro anti-FXa hatása a nem-frakcionált heparinéhoz
és a CY 216-éhoz viszonyítva	PE
Koncentrációk(pg/ml)	UFH	CY 216
0,5	0,336	-	-
1	-	0,331	0,342
1,5	0,281	-	-
2,5	0,212	-	-
3	-	0,261	0,296
3,5	0,179	-	-
5	-	0,200	0,245
7	-	0,158	0,201

Az adatok minden egyes vizsgált termékre vonatkozóan koncentrációnként három kísérlet átlagai.

2.Nyúl plazmára ex vivő gyakorolt antikoaguláns hatás i.v.

és s.c. adagolást követően

Az uj heparinszármazék (PE) antikoaguláns hatását nyúl plazmán ex vivő értékeltük. Az ex vivő kifejezés azt jelenti, hogy olyan állatból származó vérrel végzünk i n vitro méréseket, amelynek a kémiai anyagot beadtuk. Különösen a következőket vizsgáltuk:

a) trombin idő, artériás véren, a vizsgálandó anyagok akut • ·· · • ·

-10bólusz intravénás adagolását követően;

b) anti-FXa hatás , artériás véren, akut szubkután adagolást követően.

Ez az eljárás nagy érzékenysége következtében a vizsgálandó anyagok biológiai hozzáférhetőségét is megmutatja, mivel lehetővé teszi a szubkután beadott vizsgált anyag eltűnési kinetikájának követését.

A vizsgált anyagokat steril nátrium-klórid-ο1datbán oldottuk és 0,86 mg/kg koncentrációban intravénásán és 1-2 mg/kg koncentrációban szubkután gyorsan beadtuk.

A vizsgálat leírása

a) Trombin idő

E vizsgálat segítségével a vizsgált anyag bóluszának intravénás beadása után nyulak artériás vérmintáiban határozzuk meg a trombin időt különböző időközönként ( 2-5-1020-30-40 perc).

b) Anti-FXa hatás

Az anti-FXa hatásnak egy kromogén teszttel való mérésével, amely teszt a vegyület nagyon kis koncentrációira érzékeny, a vizsgált anyagokat a keringésben nagyon hosszú időn át követni tudjuk. Az artériás vérmintákat ( a fül központi artériájából) különböző időközönként ( 1-2-3-4-56-7-8 óránként) vesszük a szubkután adagolást követően.

Eredmények

a) Trombin idő

A 2.ábrából világosan látható, hogy

- a PE antikoaguláns hatása 0,86 mg/kg dózis intravénás beadása esetén kicsi,ami az in vitro adatokat támasztja alá;

-11« ·« · ·· ··· '·· ·· ·· • * · · * · · ·

a PE antikoaguláns hatása határozottan gyengébb az UFHénál, de nem tér el lényegesen a CY 216-étól.

b) Anti-FXa hatás

A 3.ábra azt mutatja, hogy

- a PE 1 mg/kg szubkután beadása után hosszab ideig megmarad a keringésben, mint a kétszeres, azaz 2 mg/kg dózisban szubkután beadott UFH.

A heparin-származék PE eltűnési kinetikája ezért lassúbb, mint az UFH-é, de hasonló a CY 216-éhoz.

3.A vérlemezke faktor 4-gyel (PF^-gyel) szembeni ex vivő af f initás

Az alábbi kísérletekben a jelen találmány szerinti uj heparin-származék (PE) affinitását humán határoztuk meg, azaz az ilyen anyagok tulajdonságát vizsgáltuk.

Az alkalmazott ex vivő módszer a PF4

PF4^-gyel szemben keringésből való eltűnésének kinetikáját követte heparin jelenlétében és tá vollétében.

Jól ismert, hogy a heparin vagy a glikozamino-glikánok (GAGs) a PF4 előtt beadva, jelentősen fokozzák annak kinetikáját [G. Cella és munkatársai, Humán platelet factor 4 and protamin sulphate interaction with glyeosaminog1ycans in the rabbit, Eur.J.Cl in.Invest. , Vol. 17 , 548-554 ( 1987)].

Következésképpen azok a vegyületek, amelyek képesek a PF4~et megkötni, jelentősen meg kell hogy hosszabbítsák a PF4 keringésben való jelenlétét. Ez a hatás arányos a be injektált GAG mennyiségével és a PF4~gyel szembeni affinitásával .

-12A vizsgálandó anyagokat steril nátrium-klorid-ol datban oldottuk és 0,86 mg/kg mennyiségben intravénásán adtuk be.

A vizsgálat leírása

A vizsgálandó anyagokat gyorsan intravénás bólusz formájában adtuk be 0,86 mg/kg dózisban. Ezután 2-3 perccel a fül központi artériájából vettünk artériás vérmintákat ( alap minta). Az első bólusz beadása után 5 perccel egy második, tisztított humán PF^ bóluszt adtunk be (30 mikrogramm/kg).

A PF4 beadását követően 1,5-1,5-5-10-20-30 perccel vettünk mintákat. Ezeket centrifugáltuk, tároltuk és RIA teszt segítségével ( a kereskedelemben kapható kit) vizsgáltuk a humán PF4 tartalmukat.

Eredmények

Amint az a 4.ábrából leolvasható, a kapott adatok arra utalnak, hogy

- a PE affinitást mutat a PF^-gyel szemben, és fokozatosan eltűnik a keringésből, a beadás után 30 perccel már alacsony koncentrációban van jelen.

- A PE PF^-gyel szembeni affinitása sokkal kisebb, mint az UFH-é (annak kb. 60%-a), és a PF^-gyel képezett komplex eltűnési kinetikája is sokkal gyorsabb, mint az UFH-é, míg a CY 216-éhoz hasonló.

4.In vivő antitrombotikus hatás artériás trombózis modellen, nyulban vizsgálva

A következőkben leírt kísérlet az uj heparin-származék (PE) in vivő antitrombotikus hatását vizsgálja. Azt kívántuk meghatározni, hogy az anyagok milyen mértékben gátolják az ··*

-13artériás trombuszok képződését a nyúl nyaki verőerében a. belhám felsértésével és az ér keresztmetszetének csökkentésével létrehozott akut modellben.

A vizsgálandó anyagokat steril nátrium-klorid-oldatban oldottuk és l,2mg/kg-tól 6 mg/kg-ig változó mennyiségben intravénásán adtuk be.

A modell leírása

A nyulakat 30 mg/kg Nembutal intravénásán beadott bóluszinjekciójával érzéstelenítettük, és a fokozott légzés érdekében légcsövüket felmetszettük. A femorális vénába és artériába csövet helyeztünk, ezen adagoltuk folyamatosan az érzéstelenítőt és a vizsgálandó anyagot. A szisztémás vérnyomást állandóan figyelemmel kísértük, és a nyaki artériát egy áramlásmérővel és egy kaccsal kötöttük össze. Amikor a rendszer stabilizálódott, az eret elszorítottuk. Megfelelő, de 20 percnél nem rövidebb időközönként sebészeti csipeszszel mechanikai sérülést idéztünk elő és az eret a sérülés felett elszórítottuk· Az áramlásban bekövetkező csökkenést addig követtük, amíg az ér elzáródásának megfelelő 0 értéket el nem érte. A kontroll artériát ugyanilyen módon készítettük elő. Ezután a vizsgálandó anyagokat intravénás infúzió utján összesen 8 percig adagoltuk, a mechanikai károsodást. 2 perces infúzió után hoztuk létre. Az áramlást folyamatosan figyeltük, legalább a kezelést követő első óra végéig. Az állatot a kísérlet végén az érzéstelenítő túladagolásával leöltük.

Eredmények

Mint a 2.táblázatból is látható, a kapott adatok arra ···

-14utalnak, hogy

- a PE teljes mértékben megakadályozza az eret elzáró troinbusz képződését. A hatás 6 mg/kg intravénás dózis esetében nyilvánvaló;

- A PE trombózisellenes hatása kb. ötször gyengébb a nemfrakcionált heparinénál (UFH-énál), amely már 1,2 mg/kg dózisban megakadályozza az eret elzáró trombusz képződését; a PE farmakológiái hatékonysága a CY 216-éhoz hasonló.

2.Táblázat

A PE trombózisellenes hatása a nem-frakcionált heparinéhoz (UFH ) és a CY 216-éhoz viszonyítva nyulban, elsziikített, artériás modellben vizsgálva

Anyagok	Intravénás dózis	Elzáródásos állatok száma/ kezelt állatok száma
UFH	1,2 mg/kg	2/12
PE	6 mg/kg	2/12
	3 mg/kg	6/8
CY 216	6 mg/kg	2/12
	3 mg/kg	5/9

5.In vivő trombózisellenes hatás vénás trombózisos modellben

Az alábbiakban leírt kísérletben a PE in vivő trombózisellens hatását vizsgáltuk meg patkányban, vénás trombózisos modellben.

A vénás pangásos technikát alkalmaztuk az alsó V.cava • * « ♦ • « · <·

-15elzárásával, mivel ez a módszer főként fibrinből álló Lrombuszok képződését idézi elő a V.cava és a bal renális véna elágazásának szintjén bekövetkező véráramlás-változás eredményeként. A vizsgált modell ezért érzékeny az antikoaguláns szerek hatására, és különösen a heparin trombózisellenes hatékonyságára ( beadás és elszorítás után).

A vizsgálandó vegyületeket steril nátrium-kloridoldatban oldottuk és intravénásán, a pangás előidézése előtt 15 perccel 0,5 és 3 mg/kg közötti dózisban intravénásán adagoltuk.

A vizsgálat leírása

A kísérletekhez 175-200 g testtömegü Ilim CD-COBS patkányokat használtunk. Az állatokat 40 mg/kg nátrium-pentobarbitál intravénás beadásával érzéstelenítettük, és az alsó részüket alkohollal fertőtlenítettük. Az alhasat középen, a bordáktól kezdve, 4 cm-es hosszúságban felmetszettük. A véna cavat az aortától a közös csípőartériáig elkülönítettük, és egy pamutszállal elkötöttük közvetlenül a bal renális véna elágazása alatt. A kétszeres elzárással állandó és folyamatos nyomást fejtettünk ki 5 másodpercen át. Az alhas falát aztán bezártuk. Két órával később ismét kinyitottuk, hogy a trombusz-képződést megvizsgáljuk. Miután a véna cavat és a közös csípőartériákat kizártuk és a cirkulácót hemosztáttal fenntartottuk, az érnek az elzáródás alatti részét egy tűvel hosszában felnyitottuk . A troinbuszt el távolítottuk és desztillált vízbe helyeztük, ezután papíron leitattuk róla a vizet, majd 24 órára szárítószekrénybe helyeztük, és· a száraz maradék tömegét mg-ban • · ·

-16mg-ban meghatároztuk.

Eredmények

A 3.Táblázatban látható, a trombusz tömegére (mg), és a

4.Táblázatban a trombózis gyakoriságára vonatkozó, a vénás elszorítás után 2 órával kapott adatok azt mutatják, hogy

- a PE trombózisellenes hatású; védohatása ( előkezelés) 1,5 mg/kg intravénás dózis esetén szignifikáns;

- a PE hatása a nem-frakcionált heparinénál (UFH-énál) rosszabb (az UFH már 0,5 mg/kg intravénás dózisban szignifikáns hatást fejt ki).

3.Táblázat

A PE in vivő trombózisellenes hatása az UFH-hoz viszonyítva véna-elszorításos modellben vizsgálva: a vizsgált anyagok i.v. beadása után 15 perccel létrehozott vénás elszorítás után 2 órával kapott trombusz tömegében (mg-ban) kifejezve

Dózisok (mg/kg i.v.)
Anyagok 0 η = 15	0,5 n = 14	1,0 n = 24	1,8 2,0 n = 20 n = 14	3,0 n = 14
PE 2,2	1,4	1,5	0,8* 0,0**	0,0**
UFH 2,2	0,7*	0,5**	0,02**	-

* p < 0,05; ** p < 0,01 Dunnett-féle teszt n = az állatok száma

4.Táblázat

A PE in vivő trombózisellenes hatása az UFH-éhoz viszonyítva véna-elszórításos modellben vizsgálva: a vizsgált anyagok i.v. beadása után 15 perccel létrehozott vénás elszorítás után 2 órával kapott trombusz gyakorisága %-ban kifejezve

		Dózisok (mg/kg	i.v. )
Anyagok	0	0,5	1,0	1,8	2,0	3,0
	η = 15	n = 14	n = 24	n = 20	n = 14	n = 14
PE	93,3	85,7	62,5	60,0	0,0	0,0
UFH	93,3	57,1	50,0	14,3	-	-

n = az állatok száma

6.A vérzés idejére gyakorolt hatás patkányban

A következőkben leírt kísérlettel a PE azon hatását vizsgáltuk meg, amelyet a vizsgálandó anyagok intravénás adagolása után 15 perccel a vérzési időre gyakorolnak. A vizsgálandó anyagokat steril nátrium-klorid-oldatban oldottuk, és intravénásán 1 és 3 mg/kg közötti mennyiségben adtuk be .

A vizsgálat leírása

A kísérletekhez 175-200 g tömegű him CD-COBS patkányokat használtunk, amelyeknek a vizsgálandó anyagokat intravénásán, gyorsan adtuk be. A vérzési időt ( másodpercekben)

perccel később, a standard farok-felmetszési módszerrel határoztuk meg [Dejana és munkatársai, Bleeding tinié in rats: A comparison of different experimental conditions, Vérzési idő patkányokban: A különböző kísérleti körülmények összehasonlítása, Thromb. Haemostat. 48 , 108-111 ( 1982)].

Eredmények

A kapott, és az 5.Táblázatban feltüntetett adatok azt mutatják, hogy

- a PE vérzési időre gyakorolt hatása 2,0 mg/kg intravénás dózis esetében szignifikánsan emelkedik;

a PE hatása jelentősen rosszabb a nem-frakcionált heparinénál (UFH-énál), amely a vérzési időt már 1 mg/kg intravénás dózisnál jelentősen növeli, de a CY 216-éval összemérhető ( adatok nincsenek megadva).

Érdekes megjegyezni, hogy ugyanolyan vérzési idő eléréséhez a PE-ből legalább háromszor akkora dózist kell beadni, mint az UFH-ból.

5.Táblázat

A PE és UFH hatása a vérzési időre a vizsgálandó anyagok intravénás beadása után 15 perccel

		Dózisok (mg/kg	i . v . )
Anyagok	0	1,0	1,5	2,0	3,0
	n = 14	n = 14	n = 14	n = 14	n = 14
PE	130	146	147	250*	389**
UFH	130	413**	487**	-	-

• ·

-19* ρ < 0,05; ** ρ < 0,01 Dunnett-féle teszt η = az állatok száma

7. In vivő elviselhetöség i.v. és s.c. adagolást követően, egérben

Ebben a kísérletben a PE vegyület maximálisan tolerált dózisát határoztuk meg egérben intravénás és szubkután adagolás után.

A vizsgálandó anyagokat steril nátrium-klorid-oldatban oldottuk és 125 és 2000 mg/kg közötti dózisokat adtunk be intravénásán és szubkután .

A vizsgálat leírása

A kísérletet 25-35 g tömegű him és nőstény CD-1 egerekkel (CV.River) végeztük, és a következő lépésekből állt.

1) Screenelés. Egy hím és egy nőstény egérnek a következő dózisok egyikét adtuk be: 125, 250, 500, 1000 és 2000 mg/kg. A mortalitást a kezelést követően 7 napig kísértük figyelemmel .

2) Minden vegyület és adagolási mód esetében 5 hím és 5 nőstény egérből álló csoportokat kezeltünk a screenelés során megállapított legmagasabb tolerált dózissal. Az állatokat 14 órán át figyeltük, ezalatt a mortalitást, a viselkedésben bekövetkező változást és az általános mérgezési tüneteket regisztráltuk. A mortalitás esetében kisebb dózist alkalmaztunk, amíg a maximális tolerált dózist megtaláltuk. Ahol lehetséges volt, a kimúlt állatokat felboncoltuk.

Eredmények

1.Intravénás elviselhetőségi dózis

-20Amint az a 6. és 7.Táblázatokból látható, a vizsgált vegyületek maximális elviselt dózisai a következők:

- PE: 1000 mg/kg i.v.

- nem-frakcionált heparin (UFH): 125 mg/kg i.v.

- CY 216: 1000 mg/kg i.v.

Meg kell tehát jegyeznünk, hogy a PE elviselhető dózisa nagyobb, mint a nem-frakcionált hepariné ( UFH-é).

Az 500 és 250 mg/kg nem-frakcionált heparinnal (UFHval ) való kezelés után elpusztult állatok boncolása során makroszkopikus elváltozásokat nem találtunk, néhány állatban azonban a bélben feltehetően belső vérzés nyomai voltak láthatók.

2.Szubkután elviselhetőségi dózis

A kapott, és a 8. és 9.Táblázatban összefoglalt eredmények azt mutatják, hogy a vizsgált anyagok maximális elviselt dózisai a következők:

- PE: 2000 mg/kg s.c.

- nem-frakcionált heparin (UFH): 125 mg(kg s.c.

- CY 216: 2000 mg/kg s.c.

Az intravénás adagolási módhoz hasonlóan, a PE elviselhetőségi dózisa sokkal nagyobb a nem-frakcionált heparinénál ( UFH-énál), míg a CY_216-éhoz hasonló. Azonban fontos kiemelnünk a következőket:

Minden állatnál (10/10), amelyet CY 216-tal kezeltünk (2000 mg/kg s.c.), a háton, az injekció helyén köralaku folt volt látható, amely a bőr elhalása következtében alakult ki, és amelynek mérete állatról állatra változott, a maximális átmérő kb. 1 cm volt. A boncolás során

-21megállapítottuk, hogy az elhalás csak a bőrre korlátozódott, nem érintette az alatta lévő izmokat.

A 2000 mg/kg (s.c.) PE-vel kezelt állatok esetében anomáliákat nem észleltünk.

A 250 mg/kg UFH-val való kezelés után elpusztult állatoknál a szubkután dorzális régióban, ahol a kezelés történt, kiterjedt sérülés mutatkozott.

A szubkután elviselhetőségi adatok ezért különbséget mutatnak a PE és CY 216 között. Az igaz, hogy a maximális elviselhető dózisok azonosak, azonban a CY 216 esetében az injekció helye körül a bőr elhal, ami arra utal, hogy a CY 216 lokálisan kevésbé tolerálható, mint a PE, amelynél anomáliák nem jelentkeznek.

6.Táblázat

A PE, CY 216 és a nem-frakcionált heparin (UFH) letalitása egyetlen intravénás dózis beadása után (screenelés)

Kezelés	Elpusztult	állatok/Kezelt állatok
(mg/kg i.v.)	him	nőstény
PE 2000	0/1	0/1
PE 1000	0/1	0/1
PE 500	0/1	0/1
PE 250	0/1	0/1
PE 125	0/1	0/1
CY 216 2000	1/1	0/1
CY 216 1000	0/1	0/1
CY 216 500	0/1	0/1

···· * · · · · · · ·· • · · · · · · • . · · · · ·

-22( a 6.Táblázat folytatása)

Heparin	UFH	2000	1/1	1/1
Heparin	UFH	1000	1/1	1/1
Heparin	UFH	500	0/1	0/1
Heparin	UFH	250	0/1	0/1
Heparin	UFH	125	0/1	0/1

7,Táblázat

A PE, CY 216 és a nem-frakcionált heparin (UFH) letalitása egyetlen intravénás dózis beadása után

Kezelés Elpusztult állatok/Kezelt állatok A halál ideje (mg/kg him nőstény a kezelés után

i.v.) (nap ) azonnal* 1234

PE 2000		3/7	1/5	2	- 1 - 1
PE 1000		0/5	0/5	-	_ _ _ _
CY 216 1000		0/5	0/5	-	_ _ _ _
Heparin UFH	500	0/5	2/5	-	2 - - -
Heparin UFH	250	3/5	0/5	-	3 - - -
Heparin UFH	125	0/5	0/5	-	- - - -

* a kezelés perceiben

. Táblázat

A PE,CY 216 és a nem-frakcionált heparin (UFH) letalitása egyetlen dózis szubkután beadása után (screenelés)

Kezelés Elpusztult állatok/Kezelt állatok (mg/kg s.c.) him nőstény

PE	2000	0/1	0/1
PE	1000			0/1	0/1
PE	500			0/1	0/1
PE	250			0/1	0/1
PE	125			0/1	0/1
CY	216 :	2000		1/1	0/1
CY	216	1000		0/1	0/1
CY	216	500		0/1	0/1
Heparin	UFH	2000	1/1	1/1
Heparin	UFH	1000	1/1	0/1
Heparin	UFH	500	1/1	0/1
Heparin	UFH	250	0/1	0/1
Heparin	UFH	125	0/1	0/1

···· « ···· ·« ·· • · · · · · · • * · · · · · « · · · ·· · · ·

-249.Táblázat

A PE, CY 216 és a nem-frakcionált heparin (UFH) letalitása egyetlen dózis szubkután beadása után

Kezelés Elpusztult állatok/Kezelt állatok A halál ideje

(mg/kg		him	nőstény	a kezelés után
i.v. )				( nap )
				azonnal 1234
PE 2000		0/5	0/5	_ _ _ _
CY 216 2000		0/5	0/5	_ _ _ _
Heparin UFH	250	1/5	2/5	2 1 - -
Heparin UFH	125	0/5	0/5	— _ _ _ _

Következtetések

Az előzőekben leírt módon kapott in vitro és in vivő eredmények a PE heparin-származék érdekes farmakológiai profilját körvonalazzák, ami különbözik a nem-frakóiónált heparinétól (UFH-étól) és a PE farmakológiai hatását még értékesebbé teszi.

A PE hatása csekély mértékben különbözik a CY 216-étól, amely egyike a Franciaországban forgalomban levő legjobb kis molekulatömegü heparinoknak, és egérben, szubkután adagolva sokkal jobb helyi elviselhetőséget mutat.Noha a maximális elviselhető dózisok azonosak, minden CY 216-tal (2000 mg/kg

s.c.) kezelt állat esetében az injekció helyén a bőr elhalt,

-25míg a PE-vel kezelt állatok bőre változatlan marad t.

Az in vitro és in v ivó farmakológiai hatás esetében érdekes megjegyezni, hogy a PE antikoaguláns hatása sokkal rosszabb, mint az UFH-é;

szubkután adagolást követően a biológiai hozzáférhetősége sokkal nagyobb, mint az UFH-é, ezáltal ugyanolyan gyógyászati hatás eléréséhez kisebb napi dózis szükséges;

- kevesebb a mellékhatás, ez az UFH-hoz viszonyítva a csökkent vérzési időből látható, és nem okoz bőrelhalást az injekció helyén, mint a CY 216 ( a Franciaországban forgalomban levő legjobb kis molekulatömegü heparin), amely helyi intoleranciás jelenséget (bőrelhalást) okoz minden kezelt állat esetében;

- in vivő trombózisellenes hatású, mint az patkányban a véna-szükítéses és nyulban az artériás trombózis modell kísérletben látható. A termék ezen patológiás elváltozásokat 1,5 illetve 6 mg/kg dózisban megakadályozza, amely dózisok nem okoznak semmilyen jelentős változást a mellékhatásokban. Különösen a vénás trombózis elleni hatást tekintve, a PE 1,5 mg/kg intravénás dózisban, az UFH-tól eltérően, nem okoz semmilyen változást a vérzési időben.

A jelen találmány szerinti uj, kis molekulatömegü heparin-származékok ezért minden indikáció esetében használ hatók a nem-frakcionált heparin helyett antikoagu 1 ánsként, és trombocita aggregáció gátlóként. Az egyes esetekben alkalmazható intravénás dózisok 1 és 7 mg/kg/nap között vannak.

Az előzőekben ismertetett találmány szerinti eljárásban különböző eredetű és tipusu heparinok, így a sertés, szar• · · ·

-26• V ·* · ·· ·· • · · · · · · • · » · · · · • a*····· vasmarha és birka beléből, ökörszívből extrakcióval kinyert, különösen a kereskedelemben kapható vagy az irodalomban leírt heparinok használhatók. Az ilyen termékek molekulatömege széles tartományban, például 2000 és 30 000 dalton között változik, különösen a nem-frakcionált hepariné (az UFH-é), és vannak a standard (2000 - 10000 dalton molekulatömegű) heparinok frakcionálásával kapható kis molekulatömegű heparinok, és a standard heparinok kémiai vagy enzimatikus utón való részleges depóiimerizálásával kapott 50010 000 dalton molekulatömegü heparin fragmentumok. Az említett eljárásban kiindulási anyagként használandó kvaterner ammóniumsókat ismert módon, például a heparin nátrium- vagy káliumsójának vizes oldatát kvaterner ammóniumsó formájában levő gyantán, például kvaterner ammónium-bázisokka1 sóvá alakított szulfonsavas gyantán, ioncseréléssel állíthatjuk elő. A kvaterner ammóniumsót az eluátum fagyasztva szárításával kaphatjuk. Kvaterner ammóniumsókként előnyösen kevés szénatomos alkilcsoportokat tartalmazó tetraalkil-aminóniumsókat, különösen a maximálisan 6 szénatomos alkilcsoportokat tartalmazó tetraalkil-ammónium-sókat használhatjuk. Adott esetben alkil-aril-ammónium-sókat is alkalmazhatunk, például olyanokat, amelyekben az alkilcsoport hosszú szénláncu. A tetraalkil-ammónium-sók közül a tetrabuti1-ammónium-sók előnyösek. A jelen találmány szerinti eljárásban kiindulási anyagként használandó kvaterner ammóniumsókat a fenti módon, az iparban használatos tipusu heparin alkálifémmel alkotott sóiból, például nátrium- vagy káliumsóiból , azaz semleges sóiból kapjuk ioncserével. Ezeket a kvaterner • «· ·

-27ammóniumionok feleslegével reagáltatjuk, úgy, hogy szintén a megfelelő semleges sók képződjenek.

A kvaterner ammóniumsók mind a korábban említett hete rogyürüs oldószerekben, mind az aprotikus szerves oldószerekben, így például dimetil-szulfoxidban és dimetil-formamidban oldódnak. Az alkilező szerrel való reakciót az e 1 járás első lépésének megfelelően például a fenti gyűrűs oldószerben vagy annak valamely aprotikus szerves oldószerben készült, előnyösen tömény oldatában végezzük. Az említett heterogyürüs oldószerek közül mindenekelőtt azok előnyösek, amelyek a gyűrűben nem tartalmaznak helyettesitőkét, ilyenek az

N-alkil-O-aril-2-pirrolidonok vagy ezek olyan származékai amelyek a gyűrűs szerkezetben heteroatomot tartalmaznak például az imidazolin, piperazin vagy morfolin megfelelő származékai. A heterogyürüs oldószerek

N-alki1-csoportjai előnyösen kevés, maximálisan 6 szénatomos alkilcsoportok, és az arilcsoport elsősorban fenilcsoport, amely adott esetben 1-3 kevés szénatomos alkilcsoporttal, különösen metilcsoporttal helyettesített.

Előnyösen az Nmetil-2-pirrolidont használjuk.

A 6-30 , előnyösen 8-18 szénatomos szénhidrogénből származó alkilező szer olyan vegyület, amely a megfelelő szénhidrogéncsoportot könnyen képes szolgáltatni, így például egy savnak megfelelő számú szénatommal rendelkező alkohollal képezett reakcióképes észtere, az alifás vagy aralifás, előnyösen maximáli san szénatomos, ilyen például a hexil-, heptil-, oktil- vagy

A reakcióképes észterek származhatnak szervetlen vagy szer• ···· ·· • · · V «

-28·· vés savakból, így hidrogénsavakból, kénsavból vagy kénessavból, vagy alkil- vagy ari1-szu1fonsavakbó1, például metánszulfonsavból vagy p-toluolszülfonsavból. A hidrogénsavak észterei különösen kloridok, bromidok és jodidok. A kvaterner ammóniumsó és a fenti alkilezőszer közötti reakciót környezeti (20°C) vagy kissé magasabb, például 30-35°C, de 60°C-ot meg nem haladó hőmérsékleten és hosszabb ideig, kb. 5-20, általában kb. 16 órán át végezzük.

A reakcióterméket elkülöníthetjük és aztán az eljárás második lépésének megfelelő lúgos kezelést elvégezzük, vagy úgy is eljárhatunk, hogy az első lépésben kapott reakciótermék oldatát közvetlenül, adott esetben betöményíLés után vetjük alá lúgos kezelésnek. További 1 ehetőség,hogy az eljárás első lépésben kapott oldatból az oldószert enyhe körülmények között eltávolítjuk, és a maradékot kezeljük bázissal. Ily módon a találmány szerinti eljárás egy-edényes eljárásként is elvégezhető. A heparin kvaterner aminóniumsójának és az alkilezőszernek a reakciójával kapott termék bázikus kezelése 5 és 120°C, megfelelően 50 és 120°C közötti hőmérsékleten, előnyösen kb.70°C-on, 2 órán át történik.

Alkálifém-hidroxidokat, például nátrium- vagy kálium-hidroxidot vagy más szervetlen és/vagy szerves bázist használunk, előnyösen 0,1 és 1 mól közötti koncentrációban. A bázisokat vizes vagy alkoholos oldataik formájában alkalmazzuk, de más, vízzel vagy víz-alkohol keverékkel elegyedő oldószerek, például a fenti egy-edényes eljárás első lépésében használt oldószerek maradékai is jelen lehetnek.

Ha az eljárás első lépésében a reakció terme két el ·· ♦ akarjuk különíteni, szerves poláros oldószer, előnyösen alifás alkohol, például metil-vagy etil-alkohol hozzáadásával kicsaphatjuk, amely alkoholhoz előzőleg valamely karbonsav bázissal képezett sóját, például ecetsav vagy propionsav nátrium- vagy káliumsóját adtuk. Más bázikus pufferek, így alkálifémvhidrogén-karbonátok vagy alkálifém-foszfátok is használhatók. A kicsapott terméket előnyösen a kicsapáshoz alkalmazott poláros oldószerrel, például metanollal mossuk.

Tanácsos a kicsapott terméket még egyszeri vagy többszöri átcsapással tisztítani, azaz a terméket vízben oldani és alkohollal kicsapni.

A kis molekulatömegü heparin-származékból álló és az előzőekben ismertetett tulajdonságú reakcióterméket fémmel vagy szerves bázissal alkotott sójából a szokásos módon felszabadíthatjuk

Az eljárás második lépésében használt alkálifém-hidroxidnak megfelelő alkálifémsót úgy kaphatjuk meg, hogy az oldatot savval, például 2 M hidrogén-kloriddal semlegesítjük, az oldatot vízzel nem elegyedő szerves oldószerrel, például metilén-kloriddal extrahálva tisztítjuk, és ezt a műveletet néhány alkalommal megismételjük. A sót aztán desztillált vízzel és nátrium-kloriddal dializáljuk és fagyasztva szárítjuk.

A találmány szerinti termékeket főként fémsóik vagy szerves bázissal képezett sóik formájában használjuk. Ha a fenti bázisos kezeléshez használt alkálifém-hidroxidnak megfelelő alkálifémtől eltérő fémmel alkotott sókat kívánunk előállítani, az ismert ioncserés eljárást alkalmazzuk. A heparin terméket sav formájában is elkülöníthetjük, ekkor a

-30kapott alkálifémsóhoz valamely híg erős sav, például hidrogén-klorid vagy kénsav számított menynyiségét adjuk, a terméket olyan alkalmas szerves oldószerrel extraháljuk, amely elkülöníti a szabad formában levő heparin vegyületet, és aztán azt a kívánt sóvá alakítjuk.

A jelen találmánnyal kapcsolatban használható fém- vagy szerves bázissal alkotott sók közül azok különösen fontosak, amelyek gyógyászatilag elfogadhatóak, ilyenek az alkálifémés alkáliföldfémsók, például a nátrium-, kálium-, ammónium-, kalcium- és magnéziumsók, vagy a nehéz fémek , például a réz és vas sói. A szerves bázisokkal alkotott sókat primer, szekunder vagy tercier alifás, aromás vagy heterogyüriis aminokból , például metil-aminból , eti1-aminból, propilaminból, piperidinből, morfolinból, efedrinből, furfurilaminból, kolinból, etilén-diaminból és amino-etanolból származtathatjuk .

A találmány körébe tartozó, de a gyógyászatban közvetlenül nem használható sók azok, amelyeket a találmány szerinti uj heparin-származékok tisztítására használhatunk, ilyen például néhány nehéz fém sója.

A találmány kiterjed hatóanyagként a fenti eljárással előállítható, kis molekulatömegü uj heparin-származékokat, különösen azok gyógyászatilag elfogadható sóit tartalmazó gyógyászati készítményekre is.

Ezek a készítmények készülhetnek parenterális , például szubku tán vagy ί n t raνóná s adagolásra vagy helyileg, például krémek vagy orrpermetek formájában alkalmazhatók got tartalmazó oldatok vagy fagyasztva ««*· • ·· * 9 9 · . · · · · · · ·· ·»· ·· ··

-31készíthetők, amelyek egy vagy több gyógyászatilag elfogadható segédanyaggal vagy hígítószerre1 keverve a fenti alkalmazásra megfelelők és ozmolalitásuk a fiziológiai folyadékokkal kompatibilis. A találmány az uj kis molekulatömegü heparin-származékok mellett kiterjed az előállításukra alkalmas eljárásra is. A találmány magábafoglalja az előállítási eljárás egy lépésben megvalósított formáját, azaz a heparin kvaterner ammóniumsójának valamely fentebb meghatározott alkilezőszerrel az előzőekben említett oldószerek valamelyikében való reakcióját , és a reakciótermék bázissal való kezelését is.

A következő példák a találmány szemléltetésére szolgálnak, azonban nem tekintendők korlátozó jellegüeknek. 1) Injekciós készítmények . 1

PE mg 10 20 3040 injekciós víz ml 0,1 0,2 0,30,4

Csomagolás: azonnal használható fecskendő, amely a szubkután adagolásra alkalmas steril oldatot tartalmazza. 1.2.

PE mg 150300 injekciós víz ml48

Csomagolás: fiola, amely az intravénásán adagolható steril oldatot tartalmazza.

1.3.

PE	mg	10	20	30	40
további komponensek:
nátrium-klorid	mg	0,3	0,6	0,9	1 , 2
injekciós víz	ml	0,1	0,2	0,3	0,4

-32Csomagolás: azonnal használható fecskendő, amely a szubkután adagolásra alkalmas steril oldatot tartalmazza. 1.4.

PE mg

150

300 további komponensek:

nátrium-klorid mg injekciós víz ml

Csomagolás:

fiola, amely az intravénásán adagolható steril oldatot tartalmazza.

1.5.

PE mg 150 további komponensek:

nátrium-klorid mg 35 nátrium-metabiszulfit mg 5 klór-butanol (*) mg 25 injekciós víz ml

300

Csomagolás viola, amely az intravénásán adagolható steril oldat többszörös dózisát tartalmazza.

( ) Az 1.5 példában konzerváló szerként használt klór-butanol az alábbi vegyületekkel helyettesíthető;

benzil-alkohol mg

100 klór-krezol mg 510

2) Orálisan adagolható készítmények

2.1. (pilula vagy kapszula)

PE mg 30 60120 további komponensek:

foszfatidil-kolin + foszfatidil-szerin (*) mg 80 160320

-33tejenkor mikrokristályos cellulóz t a 1 kinn kolloidál is kovasav ( ) a készítményekben a szerin aránya változhat.

2.2 (pilula vagy kapszula)

PE további komponensek:

főszfatidi1-ko1in + foszfatidil-szerin (*) kol eszterin tejcukor mikrokristályos cellulóz ta 1 kuni kolloidál is kovasav ( ) a készítményekben a szerin aránya változhat.

2.3 (porcsomag)

PE további komponensek:

foszfát, idil-kolin + foszfát i d i1-szer i n (*) k öles z t e r i n tejcukor ízesítő- és édesítőszer kívánság szerint.

szacharózzal (**) k i egész í Ive

mg	50	100	200
mg	10	20	40
mg	3	6	12
mg	3	6	12
foszfatidil	-kolin és	foszfatidil
mg	30	60	120
mg	80	160	320
mg	2	4	8
mg	50	100	200	•
mg	10	20	40
mg	3	6	12
mg	3	6	12
foszfatidil	-kolin	i és	foszfatidil
mg	60	120	180
mg	250	500	750
mg	5	10	15
mg	100	200	300
	2000	4000	6000	mg- ra

a készítményekben a főszfatidi1-kolin és foszfatidilszerin aránya változhat ( ) a szacharóz fruktozzal helyettesíthető.

2.4 (nyújtott hatású tabletta)

PE	mg	30	60	120
további komponensek:
fősz fátidi1-kolin +
f o s z f a t i d i 1 - s z e r i n ( * )	mg	80	160	320
tejcukor	mg	30	60	120
mikrokristályos cellulóz	mg	5	10	20
hi d rox i-propi1-me til-
cellulóz	mg	10	20	40
t a 1 k u in	mg	3	6	12
kolloidális kovasav	mg	3	6	12
( ) a készítményekben a	foszfatidil	-kolin és foszfatidil
zerin aránya változhat.
.5 (gyomorban nem oldódó	tabletta)
PE	mg	30	60	120
tovább i komponensek:
fősz fát id i 1-ko.l in +
foszfatidil-szerin ( )	mg	80	160	320
tejcukor	mg	50	100	200
mikrokristályos cellulóz	mg	10	20	40
tál kinn	mg	30	60	120
kolloidális kovasav	mg	3	6	12
metakrilsav kopolimer	mg	15	30	60

a készítményekben a főszfatidi1-kolin és

foszfatidilszerin aránya változhat.

-352.6 (gyomorban nem oldódó, nyújtott hatású tabletta)

PE	mg	30	60	120
további komponensek:
foszfatidil-kolin +
f ősz f a ti d i1-szerin (*)	mg	80	160	320
tejcukor	mg	50	100	200
ini krokr i s tályos cellulóz	mg	10	20	40
h i drox i-propi1-met iΙ-
ον 11u1 óz	mg	5	10	20
ta1kum	mg	30	60	120
kolloidál is kovasav	mg	3	6	12
metakrilsav kopolimer	mg	15	30	60
( ) a készítményekben a	f ősz f at idi1	-kolin	és	foszfátidil
szerin aránya változhat.
2.7 (orálisan, cseppek formájában	adagolandó oldat)
PE	mg	30	60		120
további komponensek:
c i t romsav	mg	7,5	15		30
tisztítót.t vízzel kiegészítve	0,25 0,	5	1 ml-re
2.8 (granula *)
PE	mg	30	60		120
további komponensek:
c i t.romsav	mg	7,5	15		30
szacharóz	mg	30	60		60
kukor i cakemény í tő	mg	12,5	25		25
t .a 1 kuni	mg	5	10		10
po1 i v i n i1pi rrolidőn	mg	4	8		8

( ) 3 granula adandó be egy kemény zselatinkapszulában

2.9 (gyomorban nem oldódó granula )
PE	mg	30	60	120
további komponensek:
c i t. romsav	mg	7,5	15	30
szacharóz	mg	30	60	60
kuko r i cakeményítő	mg	12,5	25	25
talkum	mg	5	10	10
pol ivini1pirro1 időn	mg	4	8	8
inetakrilsav kopolimer	mg	10	15	15
( ) 3 granula adandó be	egy kemény	zselatinkapszulában

3. Nazális vagy pulmonális készítmények

3.1.

PE finom fehér por mg 20 40

A finom fehér por formában levő hatóanyagot egy zsela tin kapszula tartalmazza, amelyet használat előtt feltörünk és a hatóanyagot inhaláló készülékbe töltjük.

3.2. ( inhalációs por)

PE finom fehér por főszfatidil-kolin + foszfatidil-szerin(*) mg 20 40 mg 30 60

A finom fehér por formában levő hatóanyagot zselatin kapszula tartalmazza, amelyet használat előtt feltörünk és a hatóanyagot inhaláló készülékbe öntjük.

( ) a készítményekben a főszfatidi1-kolin és foszfatidil szerin arányéi változhat.

. Rcktálisan adagolható készítmények

-ΟΤ-

PE	mg	30	120
f é 1 s z i n t.e t i kus glicerid	mg	1940	1880
2 PE foszfatidil-szerin +	mg	30	120
foszfatidil-kolin	mg	100	200
félszintetikus glicerid	mg	1840	1680

A találmány szerinti kis molekulatömegü heparinszármazókokat. és azok sóit tehát úgy kaphatjuk, hogy valamely heparin kvaterner ammóniumsóját egy heterogyürüs szerves oldószerben, kölebbröl helyettesitetlen vagy kevés szénatoinos alkilcsoporttal helyettesített N-alkil-pirrolidin-2-onban, N-alkil-piperidin-2-on-ban, ezek olyan származékaiban, ahol a beterogyürüt egy másik heteroatom vagy heteroatomot tartalmazó csoport, azaz oxigén- vagy kénatom vagy -ΝΙΙ-csoport szakítja meg, vagy a fenti vegyületek aprotikus oldószerrel készült tömény oldatában oldjuk, és egy 6-30, előnyösen 8-18 szénatomos szénhidrogénből származtatott alki 1 ezőszerrel (éterezőszerrel) kb. 20°C (szobahőmérséklet) és 60°C közötti hőmérsékleten hosszabb ideig, például kb. 5

-20 órán át reagál tatjuk. A kapott reakcióterméket aztán 5 és 120°C közötti, előnyösen kb. 70°C-on szervetlen vagy szerves bázissal vizes oldatban kezeljük. A bázisos kezelés után kapott, terméket aztán szabad formában vagy alkálifémmel vagy a 1káliföldfémmel alkotott sója formájában különítjük cl. Más fémek vagy szerves bázisok sóihoz úgy juthatunk,

-38hogy a sókat egymásba alakítjuk. Előnyös esetben az eljárás második lépésben a reakcióterméket alkálifém-hidroxiddal vizes oldatban kezeljük. A kapott kis molekulatömegü heparin-származék és sói gyógyászati célra, például trombózisellenes szerekként használhatók.

• · · ·

-39• ·· • ·

Claims

1 0 ------------------1----------------- 5 10 ------------------1 I------------------------------------1 15 20 25 —1 30 —i— 35 —ι— 40 1 45 idő (perc)

3. ábra idő (óxa)

4/4

4. ábra

1/4

1. ábra • ·

1. Eljárás kis molekulatömegü heparin-származuékok és/vagy sóik előállítására, azzal jellemezve, hogy (1) valamely heparin kvaterner ammóniumsóját heterogyürüs szerves oldószerben, amely oldószer helyettesitetlen vagy kevés szénatomos alki1csopor11a 1 helyettesített N-alki1-pirrolidin-2-on, N-alkil-piperidin-2-on vagy ezek olyan származékai, amelyekben a heterogyürü egy másik heteroatommal vagy heteroatomot tartalmazó csoporttal, így oxigén- vagy kénatommal vagy -NH-csoporttal van megszakítva, vagy a fenti vegyület aprotikus oldószerrel készült tömény oldatában oldjuk, és 6-30 szénatomos szénhidrogénből leszármaztatható alkilezőszerrel környezeti vagy annál egy kicsit magasabb hőmérsékleten reagáltatjuk , (2) a kapott reakcióterméket 5 és 12 0 °C közötti hőmérsékleten szervetlen vagy szerves bázissal vizes oldatban kezeljük, és (3) a kapott heparin-származékokat szabad formában vagy alkálifémmel vagy alkáliföldfémmel képezett sóik alakjában elkülönítjük.

2. ábra

26-]

24 - 22- 20- 18- c 16- íű E o 14 - 12- 10- 8- 6- 4 -

2/4

2. Az 1.igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a fenti heparin-származékokat vagy sóikat más fémekkel vagy szerves bázissal alkotott sókká alakítjuk át.

3. Az 1.igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szabad formában kapott heparin-származékokat gyógyászatilag elfogadható sókká vagy a fenti sókat szabad formában levő heparinná alakítjuk.

4. Az 1.igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a a (2) lépésben a reakcióterméket alkálifém-hidroxidda1 vizes • · oldatban kezeljük.

5. Az 1. vagy 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az alkilezöszer és a heparin kvaterner ammóni umsójának reakciójával kapott terméket a szervetlen vagy szerves bázissal való kezelés előtt elkülönítjük.

6. Az 1. vagy 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kiindulási anyagként 2000 és 30 000 dalton közötti molekulatömegü heparin kvaterner ammóniumsóját alkalmazzuk.

7. Az 1. vagy 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemez- ve, hogy kiindulási anyagként nem-frakcionált heparin kvaterner ammóniumsóját alkalmazzuk.

8. Az 1. vagy 4.

igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kiindulási anyagként heparin frakcionálásával kapott 2000 és 10 000 dalton közötti molekulatö megü és heparin részleges kémiai vagy enzimatikus depóiimerizációjával kapott, 500 és 10 000 dalton közötti molekulatömegü heparin kvaterner ammóniumsóját használjuk.

9. Az 1 . vagy 4.igénypont szerinti eljárás, azzal jellemez- ve, hogy kvaterner ammóniumsóként olyan tetraalkil-ammó- nium-sót alkalmazunk, amelyben az alkilcsoportok 1-6 szén-

atomosak

10. Az 1. vagy 4.igénypont szerinti eljárás, azzal jellemez-

ve , hogy kvaterner ammóniumsóként tetrabutil-ammónium-sót alkalmazunk.

11. Az 1. vagy 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a heterogyürüs szerves oldószerben az N-alki.lcsöpört 1-6 szénatomos.

12.Az 1. vagy 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemez ♦ · · · ve, hogy a heterogyürüs szerves oldószer N-metil-pirrolidőn.

13. Az 1. vagy 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy alkilezoszerként valamely sav 6-30 szénatomos alifás vagy aralifás alkohollal képezett észterét alkalmazzuk .

14. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az alkilezőszer 8-18 szénatomos.

15. A 14.igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy alkilezoszerként jodidot, bromidot vagy alki1-kloridőt vagy valamely alkil- vagy aril-szulfonsav észterét alkalmazzuk.

16. Az 1. vagy 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jelle- mezve, hogy az alkilezőszert a heparin kvaterner ammóniumsójával heterogyürüs szerves oldószerben oldva kb. 20 és 60 °C közötti hőmérsékleten reagál tatjuk.

17. Az 1. vagy 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az alkilezoszer és a heparin kvaterner ammóniumsója reakciójával kapott reakcióterméket poláros szerves oldószer hozzáadásával, kicsapással különítjük el.

18. A 17.igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy poláros szerves oldószerként alifás alkoholt alkalmazunk.

19. Λ 18.igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az alifás alkoholhoz egy bázikus puffért adunk .

20. A 19.igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy bázikus pufferként valamely karbonsav bázissal képezett sóját 'alkalmazzuk.

21. A 17.igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kicsapott terméket még néhány alkalommal ugyanazzal a szerves oldószerrel átcsapjuk.

*··· »_w *··· ·« *

··

22. Az 1 . igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a (2) lépésben a reakcióterméket alkálifém-hidroxiddal vagy egy másik szervetlen és/vagy szerves bázissal 0,1 és 1 M közötti koncentrációjú vizes vagy vizes-alkoholos oldatban 5 és 120°C közötti hőmérsékleten kezeljük.

23. A 22.igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a bázissal való kezelést az (1) lépésben kapott,elkülönített reakcióterméken 0,1 és 1 M közötti koncentrációjú vizes nátrium-hidroxiddal kb. 70°C hőmérsékleten és elegendő ideig végezzük ahhoz, hogy a fenti kis molekulatömegü heparinszármazékot és/vagy sóját kapjuk.

24. Az előző igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a (2) lépésben kapott reakcióterméket úgy különítjük el, hogy a bázisos vizes oldatot semlegesítjük, egy vízzel nem elegyedő szerves oldószerrel extraháljuk, és desztillált vízzel és nátrium-kloriddal dializáljuk.

25. Eljárás kis molekulatömegü heparinszármazékok és/vagy sóik előállítására, azzal jellemezve, hogy (1) 15 000 dalton molekulatömegü heparin tetrabutil- ammónium-sót N-meti1-pirro1idonban oldunk és 1-jód-oktánnal szobahőmérsékleten 16 órán át reagáltatunk, (2) a reakcióterméket a kapott oldatnak nátrium-acetátot tartalmazó metanolhoz való öntésével kicsapjuk, (3) a kapott terméket; nátr ium-acetátot tartalmazó metanolból néhány alkalommal átcsapva tisztítjuk, (4) a megszárított terméket; 0,5 N vizes nátrium- hidroxid-oldattál kb. 2 órán át 70°C körüli hőmérsékleten kezeljük, ·♦·· , · ♦ · · • * · · · • -43- (5) a kapott oldatot 2 M sósavval semlegesítjük, (6) az oldatot néhány alkalommal metilén-kloriddal extraháljuk, (7) az oldatot desztillált vízzel és 0,1 M nátriumkloriddal dializáljuk, és (8) a kapott oldatot fagyasztva szárítjuk.

26. Kis molekulatömegü heparin-származékok. és sóik, amelyeket az 1-25.igénypontok bármelyike szerinti eljárással állítunk elő.

27. Kis molekulatömegü heparin-származékok alkálifémmel vagy alkáliföldfémmel alkotott sói, amelyeket az 1-25.igénypontok bármelyike szerinti eljárással állítunk elő.

28. Az 1-25.igénypontok bármelyike szerint előállított heparin-származékok nátrium-, kálium- vagy kalciumsói.

29. Az 1-25.igénypontok bármelyike szerint előállított heparin-származékok gyógyászatilag elfogadható bázisokkal képezett sói.

30. A 29.igénypont szerint előállított heparin-származékok nátrium-, kálium- vagy kalciumsója.

31. Gyógyászati készítmény, amely hatóanyagként a 26.igénypont. szerinti kis molekulatömegü heparin-származékokat és gyógyászatilag elfogadható hordozó-, hígít.ó- vagy segédanyagokat tartalmaz.

32. Gyógyászati készítmény, amely hatóanyagként a 26. igénypont. szerinti kis molekulatömegü heparin-származékok alkáli fémmel vagy alkáliföld fémmel alkotott sóját és gyógyászati 1 ag elfogadható hordozó-, hígító- vagy segédanyagokat t a r tál in az .

33. A 26.igénypont szerinti kis molekulatömegü heparin-szár··«· mazékok gyógyszerként való alkalmazása.

34. A 27.igénypont szerinti kis molekulatömegü heparinszármazékok alkálif émme1 vagy alkáliföldf émme1 képezett sóinak gyógyszerként való alkalmazása.

35. A 26.igénypont szerinti kis molekulatömegü heparin-származékok vagy sóik alkalmazása trombózis kezelésére.

36. A 31. vagy 32. igénypont szerinti gyógyászati készítmény alkalmazása trombózis kezelésére.

‘ODA

3 η

0 1 5 í 10 1 15 i--------------------- 20 1 25 1 30 1 35 idő (óra)

i