JP3487620B2 - 逆転写酵素阻害剤及び抗ウイルス剤 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、逆転写酵素阻害剤及び
抗ウイルス剤に関し、さらに詳しくは硫酸化チロシン及
び／またはその生理学的に許容しうる塩を有効成分とし
て含有する逆転写酵素阻害剤及び抗ウイルス剤に関す
る。

【０００２】

【従来技術】抗エイズ薬として最初の治療薬ＡＺＴ（ア
ジドチミジン：逆転写酵素阻害剤）は、エイズの発症や
進行を有意に遅らせることが明らかになった。しかし、
ＡＺＴには長期投与に基く慢性毒性、薬剤耐性エイズウ
イルス変異株の出現などの問題がある。また、最近ＤＤ
Ｉ（ダイデオキシイノシン）とＡＺＴの組み合わせ療法
も承認されているが、これも急性膵炎などの重篤な副作
用が報告されている。これらはいずれもモノヌクレオシ
ドであって、逆転写酵素だけでなくヒトのポリメラーゼ
にも影響し、選択性に乏しい。特開平２−１７８２３２
号公報は、有効成分としてスルホン化ポリアミノ酸を含
有することを特徴とするレトロウィルス感染症、特にエ
イズの治療及び予防に有効な薬剤を開示しているが、こ
れらの有効成分は分子量が500 〜500,000 ダルトンほど
の高分子化合物であって、利用しづらく、硫酸化度など
構造的に明確でない。現在開発中の抗ウイルス剤として
は、プロテアーゼ阻害剤、転写・翻訳阻害剤、脱殻阻害
剤、ＨＩＶのエンベロープタンパクのグリコレーション
阻害剤などがある。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、上記
のような欠点を持たず、毒性が弱く、低分子量で構造が
明確な有効成分を含む新規の逆転写酵素阻害剤及び抗ウ
イルス剤を提供することである。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成するために鋭意研究を重ね、ウイルスの逆転写酵
素に対して阻害作用を有する物質を探索したところ、硫
酸化チロシンに優れた逆転写酵素阻害作用があることを
見出し、本発明を完成するに至った。従って、本発明は
硫酸化チロシン及び／またはその生理学的に許容しうる
塩を有効成分として含有する逆転写酵素阻害剤である。
さらに本発明は生理学的に許容しうる塩がナトリウム
塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、バリ
ウム塩またはテトラブチルアンモニウム塩である上記逆
転写酵素阻害剤である。ウイルスには例えばレトロウイ
ルスといったＲＮＡを鋳型として逆転写酵素を用いてＤ
ＮＡを合成するものがあり、この逆転写酵素を阻害する
ことによってウイルスのＤＮＡ合成を阻害することがで
きる。従って本発明はまた、硫酸化チロシン及び／また
はその生理学的に許容しうる塩を有効成分として含有す
る抗ウイルス剤に関し、さらにその生理学的に許容しう
る塩がナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグ
ネシウム塩、バリウム塩またはテトラブチルアンモニウ
ム塩である抗ウイルス剤に関する。本発明はさらに、ウ
イルスがエイズウイルスである上記抗ウイルス剤に関す
る。

【０００５】本発明の硫酸化チロシンにおけるチロシン
はＤ体でもＬ体でもＤＬ体でもよい。この硫酸化チロシ
ンの生理学的に許容しうる塩としては、ナトリウム塩、
カリウム塩、リチウム塩、カルシウム塩、マグネシウム
塩、バリウム塩、テトラブチルアンモニウム塩、塩酸
塩、硫酸塩、酢酸塩など、公知の金属塩、無機酸塩、有
機酸塩などが挙げられる。本発明の逆転写酵素阻害剤及
び抗ウイルス剤の有効成分である硫酸化チロシンは、チ
ロシンのフェノール性水酸基及び／またはアミノ基が硫
酸化された物質である。具体的には下記式（Ｉ）で表さ
れる化合物である。 ＨＯＯＣ−ＣＨ（ＮＨＺ²)−ＣＨ₂ −Ｃ₆ Ｈ₄ −ＯＺ¹ （Ｉ） （式中Ｚ¹ 及びＺ² のどちらか一方は−ＳＯ₃ Ｈであっ
て、他方は−ＳＯ₃ Ｈまたは水素原子である。）式
（Ｉ）中、Ｚ¹ 及びＺ² がともに−ＳＯ₃ Ｈである硫酸
化チロシン及びその生理学的に許容しうる塩が、本発明
において特に好適である。

【０００６】従来フェノール性水酸基のみが硫酸化され
た硫酸化チロシン（式（Ｉ）において、Ｚ¹ が−ＳＯ₃
Ｈであって、Ｚ² が水素原子である）は、Reitz 等によ
り、１９４６年にその合成が報告されている（H. C. Re
itz et al., J. Am. Chem. Soc., vol. 68, p1024 (194
6)) 。１９５４年には、初めて蛋白質の成分として見い
だされ（F. R. Bettelheim. J. Am. Chem.Soc., VOL. 7
6, p2838(1954)) 、また硫酸化チロシンは遊離状態で哺
乳動物の尿中に存在することが知られている（R. A. Jo
hn, et al., Biochem. J. vol. 94, p37 (1965))。この
ように、チロシン及びそのペプチドや蛋白中のチロシン
残基の硫酸エステル化は、動物、植物、微生物などの生
体内で、一般に解毒や生理作用発現のために行われてい
て、かつ硫酸化チロシン及びこれを含有するペプチド、
蛋白が生体成分として存在していることが知られている
（総説；W. B. Huttner, Methods in Enzymology (F. W
old and K. Moldave, eds.) vol.107, pp200-223(198
4)) 。その後、数々の報告があるが、硫酸化チロシンの
抗ウイルス作用については知られていなかった。

【０００７】チロシンのフェノール性水酸基が硫酸化さ
れた硫酸化チロシンの分子量は２６１であり、また、フ
ェノール性水酸基及びアミノ基が硫酸化された硫酸化チ
ロシンの分子量は３４１であって、これらは従来のスル
ホン化ポリアミノ酸の分子量と比較して低く、抗原性を
回避することができ注射の際のショックを軽減すること
ができるという利点がある。また従来、低分子化合物を
硫酸エステル化しても抗ウイルス活性は期待できないと
考えられていたので、上記発見は全く予想されなかった
ことである。従来高分子硫酸化物は硫酸基がどこに結合
しているかといった問題を残しているが、チロシンは水
酸基及びアミノ基を各１個有するため、その硫酸化物の
構造がより明確である。

【０００８】本発明の硫酸化チロシンは、チロシンを酵
素的に、または化学的に処理することによって製造する
ことができる。例えば酵素的方法としては、(1) Saidh
a, T、 Arch. Biochem. Biophys., 272、 237-244 (198
9)；及び(2) Llu, M-C、 Biochem. Int., 21、 815-821
(1990) が知られている。化学的方法として、硫酸化チ
ロシンを含んだ蛋白を分解する方法やチロシンを硫酸エ
ステル化する方法が挙げられる。後者の場合には公知の
硫酸エステル化試薬を用いることができ、硫酸、クロロ
スルホン酸、三酸化イオウ、トリメチルシリルスルホン
酸クロリドなどが適当であり、一例として先に述べた R
eitz等の報告がある（H. C. Reitz et al., J. Am. Che
m. Soc., vol. 68, p1024 (1946))。また、硫酸化チロ
シンの塩としては、カリウム塩（F. R. Jevons, Bioche
m. J. 89,621(1963)) 、バリウム塩（L. Moroder, Hopp
e-Seyler's Z. Physiol. Chem., 360,787 (1979))、ナ
トリウム塩（W. B. Huttner, Method in Enzymology(F.
Wold and K. Moldave, eds.) vol. 107, pp200-223 (1
984))が知られている。

【０００９】以下、本発明で使用する硫酸化チロシンの
製造方法の一例として、チロシンを硫酸エステル化する
場合の操作について具体的に説明する。出発原料とし
て、Ｄ、ＬまたはＤＬ体のチロシンを用い、これを５０
℃、五酸化燐にて真空下、一夜乾燥する。使用する溶媒
としてはピリジン、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）な
どが適当であって、特にピリジンが好ましい。溶媒には
適当な脱水剤を加えてから蒸留することが好ましく、ピ
リジンの場合には脱水剤として例えば水酸化ナトリウム
を使用することができる。溶媒の量はチロシンが均一な
懸濁溶液となる量であればよく、使用するチロシンの重
量に対して１〜1,０００倍量程度でよく、通常は２〜１
００倍量が適当である。硫酸化試薬としては、公知の硫
酸化エステル化試薬、例えば硫酸、クロロスルホン酸、
三酸化イオウ、トリメチルシリルスルホン酸クロリドな
どが使用できる。さらに三酸化イオウとして、そのトリ
メチルアミンコンプレックス、ピリジンコンプレック
ス、N,N-ジメチルホルムアミドコンプレックスが使用で
きる。硫酸化試薬の添加量は、チロシンに対して１〜１
０当量程度が適当であって、通常は２〜４当量、特に3.
３当量が好ましい。好ましくは冷却下で硫酸化試薬を添
加する。上述のチロシン、溶媒及び硫酸化試薬の混合物
を不活性雰囲気下に反応させることが望ましい。使用で
きる不活性ガスとしては、窒素、アルゴンガスなどが挙
げられる。

【００１０】反応温度及び反応時間は一般に、０〜１０
０℃、１〜１００時間が適当である。反応温度が高いほ
ど反応が早く進行するので、反応時間は反応温度に応じ
て適宜選択することができるが、一般的に反応時間が長
いほど収量が高くなる。反応温度及び反応時間はまた、
使用する溶媒や硫酸化試薬の種類及びそれらの組合せに
応じて変動させることが可能である。三酸化イオウ・ト
リメチルアミンコンプレックス−ピリジン系では、例え
ば５５℃で９３時間、あるいは９０℃で数時間の反応に
よって硫酸化チロシンを得ることができる。またクロロ
スルホン酸−ピリジン系では、例えば５５℃、９３時間
の反応によって硫酸化チロシンを得ることができる。反
応中は、水分を防ぐために乾燥塔を付けることが好まし
く、使用する乾燥剤として塩化カルシウム、硫酸ナトリ
ウム、硫酸マグネシウム、水酸化ナトリウム、水酸化カ
リウムなどが挙げられる。

【００１１】本発明の逆転写酵素阻害剤及び抗ウイルス
剤の有効成分は、硫酸化チロシン及びその生理学的に許
容しうる塩の単品または任意の混合物である。本発明の
逆転写酵素阻害剤は、その有効成分である硫酸化チロシ
ン及び／またはその生理学的に許容しうる塩の他に、こ
れらの有効成分を変質させるものや有毒なものでない限
り、用途に応じて適宜選択しうる添加物を含んでもよ
い。本発明の逆転写酵素阻害剤は、試薬及び抗ウイルス
剤といった薬剤に使用することができる。 〔投与方法〕本発明の抗ウイルス剤は、経口及び非経口
投与のいずれも使用可能であり、経口投与する場合は、
軟・硬カプセル剤または錠剤、顆粒剤、細粒剤、散剤と
して投与され、非経口投与する場合は、注射剤、点滴剤
及び固体状または懸濁粘稠液状として持続的な粘膜吸収
が維持できるように座剤のような剤形で投与され得る。
本発明の抗ウイルス剤を注射剤として投与する場合、皮
内、皮下、筋肉内、腹腔内あるいは静脈内投与が可能で
ある。また、局所組織内投与、局所への塗布、噴霧、座
剤、膀胱内注入などの外用的投与法なども用いることが
できる。

【００１２】〔投与量〕本発明の抗ウイルス剤の投与量
は、投与法と病気の悪性度、患者の年齢、病状や一般状
態、病気の進行度などによって一定したものではない
が、成人では通常、１日当たり有効成分として約１mg〜
１０ｇが適当である。 〔製剤化の方法〕本発明の抗ウイルス剤における有効成
分の配合割合は、剤形によって変更し得るが、通常経口
または粘膜吸収に投与されるときは、ほぼ0.３〜１5.０
重量％が適当であり、非経口投与されるときは、ほぼ0.
０１〜１０重量％が適当である。また本発明の有効成分
を製剤化するに当たっては、常法に従い、水溶液、油性
製剤などにして皮下あるいは静脈注射用製剤とすること
ができる他、カプセル剤、錠剤、細粒剤などの剤形に製
剤化して経口用に供することができる。また、有効成分
に長時間の保存に耐える安定性および耐酸性を付与して
薬効を完全に持続させるために、さらに医薬的に許容し
得る皮膜を施して製剤化すれば、優れた安定性を有する
抗ウイスル剤とすることができる。

【００１３】本発明の有効成分の製剤化に用いられる界
面活性剤、賦形剤、滑沢剤、佐剤及び医薬的に許容し得
る皮膜形成物質などを挙げれば、次のとおりである。本
発明のウイルス剤の崩壊、溶出を良好にするために、界
面活性剤、例えばアルコール、エステル類、ポリエチレ
ングリコール誘導体、ソルビタンの脂肪酸エステル類、
硫酸化脂肪アルコール類などの１種または２種以上を添
加することができる。また、賦形剤として、例えば蔗
糖、乳糖、デンプン、結晶セルロース、マンニット、軽
質無水珪酸、アルミン酸マグネシウム、メタ珪酸アルミ
ン酸マグネシウム、合成珪酸アルミニウム、炭酸カルシ
ウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸水素カルシウム、カ
ルボキシメチルセルロースカルシウムなどの１種または
２種以上を組み合わせて添加することができる。滑沢剤
としては、例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、
硬化油などを１種または２種以上添加することができ
る。また矯味剤及び矯臭剤として、食塩、サッカリン、
糖、マンニット、オレンジ油、カンゾウエキス、クエン
酸、ブドウ糖、メントール、ユーカリ油、リンゴ酸など
の甘味剤、香料、着色剤、保存料などを含有させてもよ
い。

【００１４】懸濁剤、湿潤剤のような佐剤としては、例
えばココナッツ油、オリーブ油、ゴマ油、落花生油、乳
酸カルシウム、ベニバナ油、大豆リン脂質などを含有さ
せることができる。また皮膜形成物質としては、セルロ
ース・糖類などの炭水化物誘導体として酢酸フタル酸セ
ルロース（ＣＡＰ）、またアクリル酸系共重合体、二塩
基酸モノエステル類などのポリビニル誘導体としてアク
リル酸メチル・メタクリル酸共重合体、メタクリル酸メ
チル・メタクリル酸共重合体が挙げられる。また、上記
皮膜形成物質をコーティングするに際し、通常使用され
るコーティング助剤、例えば可塑剤の他、コーティング
操作時の薬剤相互の付着防止のための各種添加剤を添加
することによって皮膜形成剤の性質を改良したり、コー
ティング操作をより容易にすることができる。

【００１５】以下、合成例、試験例及び製剤例により本
発明をさらに詳細に説明する。

【合成例１】 Ｌ−チロシン硫酸ナトリウムの合成 Ｌ−チロシン２ｇ、三酸化イオウ・トリメチルアミンコ
ンプレックス５ｇ、及びピリジン２０mlを５５℃にて、
窒素雰囲気下９３時間反応させた。反応終了後、二層と
なるので、上層のピリジン層を除去後、塩化メチレンで
ピリジンを洗浄した。これを、冷却した１２ｇの炭酸水
素ナトリウムを含む水２００mlに注ぎ、不溶物は濾過し
て除去した。次いで濾液にテトラブチルアンモニウムハ
イドロジェンスルフェイト6.８ｇ、炭酸水素ナトリウム
1.８ｇを含む水１００mlを加え、塩化メチレンで抽出し
た。塩化メチレン層を硫酸マグネシウムで乾燥後、濃縮
・乾固した。残査に、アンバーライトＩＲ １２０Ｂ
（Ｎａ⁺ ) ２００mlと水２００mlを加え、室温で一夜攪
拌した。濾過によりアンバーライトを除去後、水溶液を
塩化メチレンで洗浄し、凍結乾燥した。その結果、2.３
ｇの白色ないし淡黄白色の粉末として粗Ｌ−チロシン硫
酸ナトリウムを得た。

【００１６】このようにして合成した粗Ｌ−チロシン硫
酸ナトリウムのＩＲ、ＵＶスペクトルを測定し、その他
の理化学的性質を調べた。その結果は下記のとおりであ
った。 ＩＲ： ν_max, cm ^-1 (KBr) （図１に示す） 3475, 1660, 1510, 1250, 1060, 1020, 880 ＵＶ： λ_max, nm (H₂O) ２６３（ε＝2.6 × 1０²) λ_max, nm (0.01 Ｎ塩酸) ２６３（ε＝5.0 × 1０²) このＵＶ測定の結果から明らかなように、この試料では
２８０nm付近のフェノール性水酸基由来のＵＶ吸収が消
失している。 形状： 白色ないし淡黄白色の粉末 融点： ３００℃以上 元素分析：炭素 ３7.７％、水素 3.４％、窒素 4.８
％、イオウ １1.８％、灰分 ３0.３％ 溶剤に対する溶解性：水、メタノール、ジメチルスルホ
キシドに可溶 アセトン、酢酸エチル、ヘキサン、クロロホルムに不溶 呈色反応： ニンヒドリン反応 陰性 塩化第２鉄反応 陰性

【００１７】また、粗Ｌ−チロシン硫酸ナトリウムを高
速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって下記条
件下で分析したところ、単一ピークを示した。 分離カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−Ａ（YMC Co.,
Ltd. 製)250 ×4.6 mm 粒度；５μｍ ポアサイズ；
１２０Å 移動相：アセトニトリル：0.００２Ｍリン酸アンモニウ
ム水溶液（pH 7.45)＝２：８ 流速：1.０ml/min カラム温度：室温 検出波長：２２０nm、２６０nm（ＵＶ検出器） 保持時間：約２分（同様の条件でチロシンを分析したと
き、その保持時間は約３分であった。）

【００１８】また、粗Ｌ−チロシン硫酸ナトリウムをＨ
ＰＬＣにより下記条件下で分析したところ、図２に示さ
れるおよそ８本のピークが観察され、そのメインピーク
は保持時間１3.４分に観察された。 分離カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−Ａ（YMC Co.,
Ltd. 製)250 ×4.6 mm 粒度：５μｍ ポアサイズ：
１２０Å 移動相：Ａ液；0.００２Ｍリン酸アンモニウム水溶液
（pH 7.45) Ｂ液；アセトニトリル：0.００２Ｍリン酸アンモニウム
水溶液（pH 7.45)＝２：８ 直線グラジエントＡ→Ｂ（１００％） ３０分 流速：1.０ml/min カラム温度：４０℃ 検出波長：２２０nm（ＵＶ検出器）

【００１９】そこで、粗Ｌ−チロシン硫酸ナトリウム１
ｇをSephadex LH-20カラム（ファルマシア製、LH-20:１
５０ml、直径2.５cm×４２cm）に注入し、メタノールに
て溶出し、溶出液を１０ｍｌずつに分画した。このよう
にして得た画分を数本おきに上記と同様の条件のＨＰＬ
Ｃにて分析したところ、画分８８番目以降に図３に示さ
れる単一のピークが観察され、その保持時間は約１3.４
分であった。このピークは、粗Ｌ−チロシン硫酸ナトリ
ウムの図２に示されるメインピークと一致した。このよ
うにして精製されたＬ−チロシン硫酸ナトリウムの理化
学的性質は下記のとおりで、粗Ｌ−チロシン硫酸ナトリ
ウムとＩＲスペクトルを含めほぼ同様の性質を示した。 ＩＲスペクトル： 図４に示す。 形状： 白色ないし淡黄白色の粉末 融点： ３００℃以上 溶剤に対する溶解性：水、メタノール、ジメチルスルホ
キシドに可溶 アセトン、酢酸エチル、ヘキサン、クロロホルムに不溶 呈色反応： ニンヒドリン反応 陰性 塩化第２鉄反応 陰性

【００２０】粗Ｌ−チロシン硫酸ナトリウムを0.１Ｎ塩
酸溶液中で８０℃、１０分間または６Ｎ塩酸中で１０５
℃、２０時間加熱したところ、フェノール性水酸基に特
有のλ_max ２７６nmのＵＶ吸収が出現し、Ｌ−チロシン
の吸収と同一の吸収ピークを示した。また、この塩酸加
水分解物をＨＰＬＣ及びアミノ酸分析計にて分析したと
ころ、単一ピークを示し、Ｌ−チロシンの保持時間と一
致した。従って、ここで合成されたＬ−チロシン硫酸ナ
トリウムは、下式で示されるチロシンのフェノール性水
酸基及び／またはアミノ基が硫酸化されているナトリウ
ム塩であると考えられる。 Ｒ¹ ＯＯＣ−ＣＨ（ＮＨＺ²)−ＣＨ₂ −Ｃ₆ Ｈ₄ −ＯＺ
¹ 式中Ｚ¹ 及びＺ² のどちらか一方は−ＳＯ₃ Ｈまたは−
ＳＯ₃ Ｎａであって、他方は−ＳＯ₃ Ｈ、−ＳＯ₃ Ｎａ
または水素原子であり；Ｒ¹ は水素原子またはナトリウ
ム原子であり；Ｚ¹ 、Ｚ² 及びＲ¹ の少なくとも１つは
ナトリウム原子を含む。

【００２１】

【合成例２】 Ｌ−チロシン硫酸ナトリウムの合成 Ｌ−チロシンに対して１当量の硫酸化試薬を使用してＬ
−チロシン硫酸ナトリウムを合成した。Ｌ−チロシン１
ｇ、三酸化イオウ・トリメチルアミンコンプレックス0.
７７ｇ及びピリジン１０mlを用いて、上記合成例１の操
作に従って、但し下記の３種の条件で反応を実施した。
反応終了後、二層となるので、上層のピリジン層を除去
後、塩化メチレンでピリジンを洗浄した。これを、冷却
した１２ｇの炭酸水素ナトリウムを含む水２００mlに注
ぎ、不溶物は濾過して除去した。得られた各々の硫酸化
チロシンのＩＲスペクトルの測定結果から、硫酸化試薬
を3.３当量用いた上記合成例１より得られた硫酸化チロ
シンと同じ物質であることがわかった。 １．反応温度：５５℃、反応時間：９３時間 ２．反応温度：１００℃、反応時間：３時間 ３．反応温度：１００℃、反応時間：１時間 硫酸化試薬を3.３当量添加すると、ほぼ定量的に硫酸化
チロシンを得ることができるが、１当量の硫酸化試薬で
は収量が減り、3.３当量の場合の収量と比較して５〜１
２％程度であった。

【００２２】

【合成例３】 Ｄ−チロシン硫酸ナトリウムの合成 Ｄ−チロシン２ｇ、三酸化イオウ・トリメチルアミンコ
ンプレックス５ｇ、及びピリジン２０mlを５５℃にて、
窒素雰囲気下９３時間反応させた。反応終了後、二層と
なるので、上層のピリジン層を除去後、塩化メチレンで
ピリジンを洗浄した。これを冷却した１２ｇの炭酸水素
ナトリウムを含む水２００mlに注ぎ、不溶物は濾過して
除去した。次いで濾液にテトラブチルアンモニウムハイ
ドロジェンスルフェイト6.８ｇ、炭酸水素ナトリウム1.
８ｇを含む水１００mlを加え、塩化メチレンで抽出し
た。塩化メチレン層を硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮・
乾固した。残査に、アンバーライトＩＲ １２０Ｂ（Ｎ
ａ⁺ ) ２００mlと水２００mlを加え、室温で一夜攪拌し
た。濾過によりアンバーライトを除去後、水溶液を塩化
メチレンで洗浄し、凍結乾燥した。その結果、2.３ｇの
白色ないし淡黄白色の粉末としてＤ−チロシン硫酸ナト
リウムを得た。このようにして合成したＤ−チロシン硫
酸ナトリウムのＩＲスペクトルを測定した。その結果は
下記のとおりであった。 ＩＲ： ν_max, cm ^-1 (KBr) （図５に示す） 3450, 1650, 1500, 1240, 1050, 1010, 860

【００２３】

【合成例４】 Ｌ−チロシン硫酸ナトリウムの合成 Ｌ−チロシン２ｇをピリジン２０mlに入れ、氷浴にて冷
却した。これにクロロスルホン酸3.２ｇを少量ずつ滴下
した。この反応液を５５℃で、窒素雰囲気下９３時間反
応させた。反応終了後、上層のピリジンを除去し、塩化
メチレンでピリジンを洗浄した。これを、冷却した１２
ｇの炭酸水素ナトリウムを含む水２００mlに注ぎ、不溶
物は濾過して除去した。次にテトラブチルアンモニウム
ハイドロジェンスルフェイト6.８ｇ、炭酸水素ナトリウ
ム1.８ｇを含む水１００mlを加え、塩化メチレンで抽出
した。塩化メチレン層を塩化ナトリウムを含む水で洗浄
後、硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮・乾固した。残渣
に、アンバーライトＩＲ １２０Ｂ（Ｎａ⁺ ) ２００ml
と水２００mlを加え、室温で一夜攪拌した。濾過により
アンバーライトを除去後、水溶液を塩化メチレンで洗浄
し、その後凍結乾燥した。その結果、2.６ｇのＬ−チロ
シン硫酸ナトリウムを得た。

【００２４】

【合成例５】 Ｌ−チロシン硫酸ナトリウムの合成 Ｌ−チロシン２ｇ、三酸化イオウ・トリメチルアミンコ
ンプレックス５ｇ、及びピリジン２０mlを１００℃に
て、窒素雰囲気下１時間反応させた。反応終了後、二層
となるので、上層のピリジン層を除去後、塩化メチレン
でピリジンを洗浄した。これを、冷却した１２ｇの炭酸
水素ナトリウムを含む水２００mlに注ぎ、不溶物は濾過
して除去した。次いで濾液にテトラブチルアンモニウム
ハイドロジェンスルフェイト6.８ｇ、炭酸水素ナトリウ
ム1.８ｇを含む水１００mlを加え、塩化メチレンで抽出
した。塩化メチレン層を硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮
・乾固した。残査に、アンバーライトＩＲ １２０Ｂ
（Ｎａ⁺ ) ２００mlと水２００mlを加え、室温で一夜攪
拌した。濾過によりアンバーライトを除去後、水溶液を
塩化メチレンで洗浄し、凍結乾燥した。その結果、1.４
ｇのＬ−チロシン硫酸ナトリウムが得られた。このＬ−
チロシン硫酸ナトリウムのＩＲスペクトルを測定したと
ころ、結果は下記のとおりであった。 ＩＲ： ν_max, cm ^-1 (KBr) 3475, 1660, 1510, 1250, 1050, 1020, 870

【００２５】次に、上記合成例１で製造された粗Ｌ−チ
ロシン硫酸ナトリウムの抗ウイルス活性を確認した試
験、及び毒性試験について述べる。 試験例１ ＜ＨＩＶ感染による細胞障害に対する薬剤の抑制作用＞
本試験には、成人Ｔ細胞の白血病の原因ウイルスＨＴＬ
Ｖ−１によりトランスフォームされたヒトＴ細胞株ＭＴ
−４細胞（Gann monogr., Vol. 28, pp219〜228(1982))
とＨＩＶの一種であるＨＴＬＶ−IIIBを使用した。実験
方法は、パウエル等の方法に従った（Pauwels 等、J. V
irol. Methods, Vol. 20, pp309 〜321(1988))。９６穴
マイクロタイタープレートに、種々の濃度のＬ−チロシ
ン硫酸ナトリウムと、ＨＴＬＶ−IIIBに感染したＭＴ−
４細胞（2.５×１０⁴ 個／ウェル、ＭＯＩ（multiplici
ty of infection ＝接種ウイルス／細胞数）：0.０１）
を感染直後に加える。炭酸ガスインキュべーターで３７
℃５日間培養した後、ＭＴＴ法で、吸光度を測定するこ
とにより生存細胞数を測定し有効率を求めた。その結果
を表１に示す。

【００２６】

【表１】 このように、Ｌ−チロシン硫酸ナトリウムは、顕著な抗
エイズウイルス活性を示した。５０％有効濃度は、1.２
２μｇ／mlであった。

【００２７】試験例２ ＜逆転写酵素阻害活性の測定＞Ｌ−チロシン硫酸ナトリ
ウムの逆転写酵素阻害活性を次のように測定した。反応
液２０μｌは、５０mMトリス−塩酸緩衝液（pH8.５）、
４０mM ＫＣｌ、６mM ＭｇＣｌ₂ 、１mM ジチオスレ
イトール、５０μｇ／mlのポリ（Ａ）・オリゴ（ｄＴ）
_12-18 、[ α-³² Ｐ] デオキシチミジントリホスフェー
ト、逆転写酵素及びＬ−チロシン硫酸ナトリウムを含
む。上記反応液を３７℃、１０分間保温後、ＤＥ８１(W
hatman製) 濾紙上につける。５％Ｎａ₂ ＨＰＯ₄ でよく
洗浄し、ついで水、エタノール、エーテルで洗浄する。
濾紙上の放射能を測定し、５０％の阻害効果を示す濃度
（ＩＣ₅₀）を求めた。逆転写酵素としてはＡＭＶ（トリ
骨髄芽球症ウイルス）由来及びＨＩＶ由来のものを使用
した。ＡＭＶ由来逆転写酵素に対しては、ＩＣ₅₀＝２３
０μｇ／ｍｌ、ＨＩＶ由来逆転写酵素に対しては、ＩＣ
₅₀＝３６μｇ／ｍｌであった。

【００２８】毒性試験 Ａ）Ｔ細胞増殖に対する影響 試験例１と同様にしてＨＴＬＶ−IIIB非感染ＭＴ−４細
胞の増殖に及ぼすＬ−チロシン硫酸ナトリウムの影響を
観察し、細胞の生存率を測定した。その結果を表２に示
す。

【００２９】

【表２】

【００３０】Ｂ）マウス白血病細胞Ｌ１２１０細胞の増
殖に対する影響 マウス白血病細胞Ｌ１２１０細胞の培養液に、Ｌ−チロ
シン硫酸ナトリウムを250 μg/mlの濃度で添加し、４日
間培養した。無添加の対照と比較して、ほとんど増殖抑
制を示さなかった。 Ｃ）マウスを使用した急性毒性試験 ＩＣＲ４週齢、雄マウスに500mg/kgのＬ−チロシン硫酸
ナトリウムを腹腔内投与したところ、何ら顕著な毒性は
観察されなかった。

【００３１】

【製剤例１】（注射・点滴剤） 有効成分であるＬ−チロシン硫酸ナトリウムを500mg 含
有するように粉末ブドウ糖５ｇを加えてバイアルに無菌
的に分配し、密封した上、窒素、ヘリウム等の不活性ガ
スを封入して冷暗所に保存する。使用前に0.85％生理食
塩水500ml を添加して静脈内注射剤として１日10〜500m
l を症状に応じて静脈内注射または点滴で投与する。

【製剤例２】（注射剤・点滴剤） 有効成分であるＬ−チロシン硫酸ナトリウムを50mg使用
した他は、製剤例１と同様の方法により軽症用静脈内注
射剤を製造し、１日、10〜500ml を症状に応じて静脈内
注射または点滴で投与する。

【００３２】

【製剤例３】（注射剤、カプセル剤） 有効成分であるＬ−チロシン硫酸ナトリウム30mgを精製
ゴマ油１ｇ及びステアリン酸アルミニウムゲル100mg に
溶解し密封した上、窒素、ヘリウム等の不活性ガスを封
入して冷暗所に保存し、皮下注射用製剤とする。症状に
応じて１日に、１回、１〜10mlを皮下注射で投与する。
また、前記製剤を0.5ml ずつカプセルに分注して経口用
カプセル剤とし、１日、１〜10カプセルを症状に応じて
経口投与する。

【００３３】

【製剤例４】（腸溶性錠剤） 以下の成分組成で腸溶性錠剤大人用（イ）及び小人用
（ロ）各々1,000 個を製造した。 [A] （イ） （ロ） Ｌ−チロシン硫酸ナトリウム 100 (g) 50 (g) 乳糖 99.4 49.7 ヒドロキシプロピルセルロース 0.6 0.3 ステアリン酸マグネシウム 2.0 1.0 [B] （イ） （ロ） 酢酸フタル酸セルロース 6.0(g) 4.0(g) ヒドロキシプロピルメチル 6.0 4.0 セルロースフタレート [A] の成分を各々取り、よく混合し、この混合物を直接
に加圧するか、またはよく練合した後、押し出し型製粒
機のスクリーンを通して顆粒成形を行い、十分によく乾
燥したものを加圧して錠剤を製造した。次に、成形され
た錠剤によく溶解させた[B] の基材を被覆して腸溶性の
錠剤とする。

【００３４】

【製剤例５】（腸溶性顆粒剤） 以下の成分で腸溶性顆粒剤1,000gを製造した。 [A] Ｌ−チロシン硫酸ナトリウム 100 (g) 乳糖 737 ヒドロキシプロピルセルロース 3 [B] 酢酸フタル酸セルロース 80 (g) ヒドロキシプロピルメチル 80 セルロースフタレート [A] の成分を各々取り、よく混合した後、常法に従って
粒状に成形し、それをよく乾燥して篩別し、ビン、ヒー
トシール包装などに適した顆粒剤を製造した。次に、こ
の顆粒を浮遊流動させながら、溶解した[B] の基材を被
覆し、腸溶性の顆粒剤とする。

【００３５】

【製剤例６】（腸溶性カプセル剤） 以下の成分で腸溶性カプセル剤1,000 個を製造した。
（イ）は大人用、（ロ）は小人用である。 [A] （イ） （ロ） Ｌ−チロシン硫酸ナトリウム 100 (g) 50 (g) 乳糖 24.6 74.4 ヒドロキシプロピルセルロース 0.4 0.4 [B] （イ） （ロ） 酢酸フタル酸セルロース 10 (g) 10 (g) ヒドロキシプロピルメチル 10 10 セルロースフタレート 上記の成分で製剤例５に記載したのと同様の方法でカプ
セルに適した腸溶性の顆粒剤を製造し、その組成物をカ
プセルに充填して腸溶性カプセルとした。

【００３６】

【発明の効果】本発明の硫酸化チロシン及び／またはそ
の生理学的に許容しうる塩を含む逆転写酵素阻害剤及び
抗ウイルス剤は、低毒性であり、かつ顕著な逆転写酵素
阻害活性及び抗エイズウイルス活性を有する。

【図面の簡単な説明】

【図１】合成例１で製造された粗Ｌ−チロシン硫酸ナト
リウムの赤外線吸収スペクトルである。

【図２】合成例１で製造された粗Ｌ−チロシン硫酸ナト
リウムのＨＰＬＣによるクロマトグラムである。

【図３】合成例１で製造されSephadex LH-20カラムによ
って精製されたＬ−チロシン硫酸ナトリウムのＨＰＬＣ
によるクロマトグラムである。

【図４】精製Ｌ−チロシン硫酸ナトリウムの赤外線吸収
スペクトルである。

【図５】合成例３で製造されたＤ−チロシン硫酸ナトリ
ウムの赤外線吸収スペクトルである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 山本 直樹 東京都渋谷区恵比寿南３−11−17原町住 宅501 (72)発明者 小河原 宏 東京都文京区湯島２−33−９ (56)参考文献 特開 平６−183963（ＪＰ，Ａ) 特開 平４−338330（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−178232（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) A61K 31/195 - 31/80 A61P 31/12 - 31/22 ＣＡＰＬＵＳ（ＳＴＮ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤ Ｓ（ＳＴＮ)

Claims (5)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 硫酸化チロシン及び／またはその生理学
   的に許容しうる塩を有効成分として含有する逆転写酵素
   阻害剤。
2. 【請求項２】 該塩がナトリウム塩、カリウム塩、カル
   シウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩またはテトラブ
   チルアンモニウム塩である請求項１に記載の逆転写酵素
   阻害剤。
3. 【請求項３】 硫酸化チロシン及び／またはその生理学
   的に許容しうる塩を有効成分として含有する抗ウイルス
   剤。
4. 【請求項４】 該塩がナトリウム塩、カリウム塩、カル
   シウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩またはテトラブ
   チルアンモニウム塩である請求項３に記載の抗ウイルス
   剤。
5. 【請求項５】 ウイルスがエイズウイルスである請求項
   ３または４に記載の抗ウイルス剤。