CN1311238C - 降压剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供能够控制肾素原活化的物质的筛选方法，该方法以肾素原的原片断区域的蛋白质间相互作用引起的肾素原活化的调节能力作为指标进行，并提供肾素原活化控制物质，该物质具有控制基于肾素原的原片断区域的蛋白质间相互作用引起的肾素原活化的功能，还提供含有该肾素原活化控制物质作为有效成分的降压剂、脏器肥大抑制剂、动脉肥厚抑制剂。

Description

降压剂
技术领域
本发明涉及降压剂、脏器肥大抑制剂和动脉肥厚抑制剂以及它们的筛选方法。
背景技术
已知肾素-血管紧张素-醛固酮系统与血压的上升有关〔东女医大杂志60(4)：342～350，1990〕。也就是说，由肝脏分泌的血管紧张素原通过来源于肾脏的肾素的作用转变为血管紧张素I(以下称为AI)，再通过血管紧张素转化酶(Angiotensin Converting Enzyme)(ACE)的作用转变为血管紧张素II(以下称为AII)。AII直接作用于血管，引起血管收缩，并作用于肾上腺皮质，促进醛固酮的生物合成和分泌，引起Na和水的潴留，从而引起血压上升。
因此，作为针对血压上升的治疗方法，目前作用于肾素-血管紧张素系统的药物作为最新型的降压剂占有一定的地位，ACE抑制剂得到了实用化。同时，对于肾素抑制剂也进行了作为降压剂的研究，但是由于其副作用放弃了开发。ACE抑制剂是血管紧张素转化酶的特异性抑制剂，通用名卡托普利是很有名的。但是，ACE抑制剂也有干咳等副作用，且临床有效性并不能达到体外试验中酶活性抑制效果的程度，因此尝试了与具有其他作用机理的肾素-血管紧张素系统抑制剂并用的疗法。因此，对以前报道或使用的降压剂以外的效果高的降压剂、血管肥厚抑制剂以及脏器肥大抑制剂的需求高。
肾素主要在肾脏中作为其前体——406个氨基酸构成的前肾素原(pre-pro-renin)进行生物合成，切断N末端的23个氨基酸生成肾素原(pro-renin)，接着再由N末端切断43个氨基酸，得到340个氨基酸构成的肾素。肾素是特异性地水解血管紧张素原生成AI的蛋白质分解酶。但是肾素的前体——肾素原通常不显示这种酶活性。因此，尽管肾素原的血中存在量为肾素的约10倍，但是认为肾素-血管紧张素系统中的作用物质仍是肾素或肾素原水解生成的肾素。
本发明人等已经使用抗人肾素原pf抗体，发现惰性型肾素前体肾素原如果与特异性识别由肾素原生成肾素时切断的N末端的43个氨基酸片断(以下称为“原片断(profragment)”或“pf”)的抗体在体外结合形成免疫复合体，则在生理条件下非酶地表达蛋白功能即酶活性(肾素活性)，且不改变一维结构(特开平10-279600号公报、美国专利第5945512号)。迄今为止作为活化肾素原的手段，已知不利用蛋白分解酶向肾素转化、不在酸性和低温状态下改变一维结构进行活化的方法(Nature，288，702-705，1980)、(J，Biol.Chem.，262，2472-2477，1987)、(Clin.Chem.，37，1811-1819，1991)、(J.Biol.Chem.，267，11753-11759，1992)，以及使低分子的肾素抑制剂结合在肾素原的三维结构的深沟中隐藏的酶活性部位形成开放型的方法(J.Biol.Chem.，267，22837-22842，1992)等。但是，机体内肾素原活化的机理及其作用尚不明确。
发明公开
本发明人等考虑上述情况进行了研究，结果发现通过将能够活化肾素原的抗pf抗体或该抗体的抗原即来源于肾素原原片断的部分肽给予高血压病理模型动物，能够获得降压效果、脏器肥大抑制效果和动脉肥厚抑制效果。也就是说，发现通过抑制肾素原的原片断区域的蛋白质间相互作用，能够在体内抑制肾素原的活化，初次证实肾素原的活化在体内进行。基于上述知识，发现通过使用控制机体内肾素原活化的物质，可以提供降压剂、脏器肥大抑制剂和动脉肥厚抑制剂以及它们的筛选方法，从而完成了本发明。
也就是说，本发明的方式可以是：
1)能够控制肾素原活化的物质的筛选方法，以由于该肾素原的原片断区域的蛋白质间相互作用引起的不伴有一维结构改变的肾素原活化的调节能力作为指标进行，
2)能够控制肾素原活化的物质的筛选方法，以对肾素原的原片断区域的抗体引起的肾素原活化的调节能力作为指标进行，
3)如上述1)或2)的筛选方法，作为筛选对象的物质是以肾素原的原片断区域的氨基酸序列中至少3个氨基酸序列的信息为基础设计的物质，
4)如上述1)或2)的筛选方法，作为筛选对象的物质是以肾素原的原片断区域的氨基酸序列的N末端起第1至第19的氨基酸序列或第27至第41的氨基酸序列中至少3个氨基酸序列的信息为基础设计的物质，
5)如上述1)或2)的筛选方法，作为筛选对象的物质是以肾素原的原片断区域的氨基酸序列的N末端起第5至第19的氨基酸序列中至少3个氨基酸序列的信息为基础设计的物质，
6)如上述3)至5)中任意一项的筛选方法，作为筛选对象的物质是肽，
7)如上述3)至5)中任意一项的筛选方法，作为筛选对象的物质是低分子化合物，
8)如上述1)至7)中任意一项的筛选方法，肾素原是人肾素原，
9)如上述1)至7)中任意一项的筛选方法，肾素原是大鼠肾素原，
10)肾素原活化控制物质，具有控制由于肾素原的原片断区域的蛋白质间相互作用引起的不伴有一维结构改变的肾素原活化的功能，
11)按照上述1)至9)中任意一项的方法筛选的肾素原活化控制物质，具有控制由于肾素原的原片断区域的蛋白质间相互作用引起的不伴有一维结构改变的肾素原活化的功能，
12)肾素原活化控制物质，具有抑制由于肾素原的原片断区域的蛋白质间相互作用引起的不伴有一维结构改变的肾素原活化的功能，
13)肾素原活化控制物质，具有抑制由于肾素原的原片断区域的蛋白质间相互作用引起的不伴有一维结构改变的肾素原活化的功能，且不具有肾素抑制活性，
14)按照上述1)至9)中任意一项的方法筛选的肾素原活化控制物质，具有抑制由于肾素原的原片断区域的蛋白质间相互作用引起的不伴有一维结构改变的肾素原活化的功能，
15)按照上述1)至9)中任意一项的方法筛选的肾素原活化控制物质，具有抑制由于肾素原的原片断区域的蛋白质间相互作用引起的不伴有一维结构改变的肾素原活化的功能，且不具有肾素抑制活性，
16)肾素原活化控制物质，具有抑制由于肾素原的原片断区域的蛋白质间相互作用引起的不伴有一维结构改变的肾素原活化的功能，且由具有从肾素原的原片断区域的氨基酸序列中选择的部分序列的肽或其等价肽构成，
17)肾素原活化控制物质，具有抑制由于肾素原的原片断区域的蛋白质间相互作用引起的不伴有一维结构改变的肾素原活化的功能，且由具有从肾素原的原片断区域的氨基酸序列中选择的连续3个至10个的部分序列的肽构成，
18)肾素原活化控制物质，具有抑制由于肾素原的原片断区域的蛋白质间相互作用引起的不伴有一维结构改变的肾素原活化的功能，且由具有从肾素原的原片断区域的氨基酸序列中选择的连续3个至8个的部分序列的肽构成，
19)肾素原活化控制物质，具有抑制由于肾素原的原片断区域的蛋白质间相互作用引起的不伴有一维结构改变的肾素原活化的功能，且由具有从肾素原的原片断区域的氨基酸序列中选择的连续3个至6个的部分序列的肽构成，
20)肾素原活化控制物质，具有抑制由于肾素原的原片断区域的蛋白质间相互作用引起的不伴有一维结构改变的肾素原活化的功能，且由从序列表中序列号7至14记载的肽中选择的肽构成，
21)肾素原活化控制物质，具有抑制由于肾素原的原片断区域的蛋白质间相互作用引起的不伴有一维结构改变的肾素原活化的功能，且由从序列表中序列号3、序列号4和序列号15至20记载的肽中选择的肽构成，
22)肾素原活化控制物质，是根据肾素原的原片断区域的氨基酸序列的信息设计的低分子化合物，具有抑制由于肾素原的原片断区域的蛋白质间相互作用引起的不伴有一维结构改变的肾素原活化的功能，
23)如上述16)至22)中任意一项的肾素原活化控制物质，具有抑制由于肾素原的原片断区域的蛋白质间相互作用引起的不伴有一维结构改变的肾素原活化的功能，且不具有肾素抑制活性，
24)如上述12)至23)中任意一项的肾素原活化控制物质，抑制肾素原活化的效果是通过肾素原的原片断区域的蛋白质间相互作用的拮抗作用产生的，
25)肾素原活化控制物质，其特征在于，基于对肾素原的原片断区域的抗原抗体反应除去肾素原，从而在机体内抑制肾素原活化，
26)肾素原活化控制物质，基于对肾素原的原片断区域的抗原抗体反应除去肾素原，从而能够在机体内抑制肾素原活化，并由对肾素原的原片断区域的抗体构成，
27)降压剂，含有上述12)至26)中任意一项的肾素原活化控制物质的至少1种作为有效成分，
28)如上述27)所述的降压剂，作为降压效果，至少在机体内给药后第12小时，显示10％程度以上的降压率，
29)如上述27)的降压剂，仅对高血压患者选择性地发挥降压效果，
30)脏器肥大抑制剂，含有上述12)至26)中任意一项的肾素原活化控制物质的至少1种作为有效成分，
31)如上述30)所述的脏器肥大抑制剂，能够在心脏和/或肾脏中抑制脏器肥大，
32)动脉肥厚抑制剂，含有上述12)至26)中任意一项的肾素原活化控制物质的至少1种作为有效成分，
33)高血压的治疗方法，使用上述27)至29)中任意一项的降压剂，
34)心衰或肾衰的治疗方法，使用上述30)或31)的脏器肥大抑制剂，
35)伴有血管肥厚的疾病的治疗方法，使用上述32)所述的动脉肥厚抑制剂。
发明的最佳实施方式
以下详细说明本发明，本说明书中使用的技术用语和科学用语只要没有另外进行定义，均具有本发明所属技术领域中具有常规知识的人通常理解的含义。在本说明书中，本领域技术人员可以参照已知的各种方法。公开这种引用的公知方法的发行物等资料通过对其引用，将其全部作为完整记载的内容引入本说明书中。
(机体内抑制肾素原活化产生的效果)
本发明人等已经使用抗人pf抗体，发现通过对肾素原的pf区域的氨基酸片断的特异抗体，能够在体外将肾素原活化成显示酶活性的开放型结构，而不改变其的一维结构(特开平10-279600号公报、美国专利第5945512号)。基于这一发现，制作特异地识别大鼠pf肽的抗体(抗大鼠pf抗体)，所述大鼠pf肽是在大鼠肾素原的一维结构上，与人肾素原的pf区域的肽(人pf肽)在氨基酸序列的顺序上同一部位的大鼠pf肽，并将上述抗体给予高血压病理模型动物即高血压自然发病大鼠(SHR)。结果，该抗大鼠pf抗体尽管能够在体外活化大鼠肾素原，而不改变其一维结构，但是如试验例所示在体内显示持续的降压效果。一般，抗体在血液中与抗原结合形成抗原抗体复合体，接着该形成的抗原抗体复合体通过免疫系统从血液中除去。也就是说，可以认为肾素原或活化的肾素原通过抗pf抗体的结合从血液中除去，从而得到降压效果。或者，也可以认为通过抗pf抗体与血液中的肾素原或活化的肾素原结合，抑制肾素原或活化的肾素原与其作用部位结合，从而得到降压效果。
另外，本发明人等合成了能够在体外活化大鼠肾素原的上述抗大鼠pf抗体的抗原，即来源于大鼠肾素原原片断的部分肽，并给予SHR。这些肽与人pf肽抑制抗人pf抗体引起的体外的人肾素原活化同样，能够拮抗抑制抗大鼠pf抗体引起的体外的大鼠肾素原活化。也就是说，这些肽能够抑制由于蛋白质间相互作用引起的不伴有大鼠肾素原一维结构改变但伴有多维结构改变的活化。如果将这些肽给予SHR，如下所述，至少给药后第12小时能够获得充分的降压效果。但是，即使将这些肽给予正常大鼠，血压也没有变化。如下述实施例所示，这些肽的经时降压效果与肾素抑制剂H6137(Sigma公司)或肾素中和抗体产生的效果不同，由于确认降压效果时间长，因此判断这些肽产生的降压效果不是抑制肾素产生的。另外，判断出这些肽如果连续14天给予SHR，则抑制心脏和肾脏的肥大，而且也抑制动脉的肥厚即血管改型。通过给予上述肽获得的这些效果推测是通过上述肽，抑制机体内大鼠肾素原的蛋白质间相互作用引起的伴有结构改变的活化，或者抑制大鼠肾素原或活化的大鼠肾素原与其作用部位结合而获得的效果。
根据上述结果，可以判断出SHR存在肾素原通过与肾素原结合性蛋白质相互作用表达酶活性，使肾素-血管紧张素系统活化，引发高血压的可能性，肾素原的pf肽和抗pf肽抗体对于肾素-血管紧张素系统活化引起的高血压显示降压作用。这种肾素原与高血压的关系以及肾素原的原片断区域的蛋白质间相互作用引起的体内的肾素原活化是在这里首次确认的。另外，还发现能够抑制肾素原的蛋白质间相互作用引起的伴有结构改变的活化以及肾素原或活化的肾素原与其作用部位的蛋白质间相互作用的肾素原活化控制物质作为降压剂、脏器肥大抑制剂、动脉肥厚抑制剂等有用。
大鼠肾素原的pf肽与人肾素原pf肽的氨基酸残基数相同，但是构成氨基酸不同。尽管如此，如上所述与在体外能够活化人肾素原的抗人pf抗体的表位肽即人pf肽在一维结构上的氨基酸序列顺序中同一部位的大鼠pf肽以及对该pf肽的特异抗体在大鼠高血压病理模型中显示降压效果。因此，可以说与高血压有关的肾素原的药理作用、肾素原活化涉及的其结构上的部位以及其活化的机理不存在种的差异。也就是说，虽然上述肽的降压效果是通过大鼠高血压病理模型动物确认的，但是考虑人肾素原的pf肽的氨基酸序列，选择适当的肽，当然对于人的高血压也可以期待同样的效果。
而且，如上所述，在体外惰性型酶前体与其抗pf肽特异抗体相互作用表达酶活性即蛋白功能时，由于其机理超越种的差异而存在，因此pf肽、对该pf肽的抗体以及病理模型动物等作为用于筛选蛋白功能表达引起的病态的治疗剂的筛选方法有用。
(肾素原活化控制物质的筛选方法)
本发明的能够控制肾素原活化的物质的筛选方法特征在于，以肾素原的原片断区域的蛋白质间相互作用引起的肾素原活化的调节能力作为指标进行。其中，肾素原的原片断区域的蛋白质间相互作用引起的肾素原活化是指，由于pf区域的蛋白质间相互作用产生的，不伴有肾素原的一维结构改变，但伴有多维结构改变的酶活性部位的开放。因此，由于该蛋白质间相互作用活化的肾素原保持与活化前的肾素原的一维结构相同的氨基酸序列，但能够显示肾素样的酶活性。作为具有pf区域上的蛋白质间相互作用的蛋白质，例如识别pf肽活化的抗体、作为机体内肾素原或活化的肾素原的作用部位的蛋白质以及能够与肾素原结合并将其活化的血液中的蛋白质等。
上述肾素原活化控制物质的筛选方法可以利用自身公知的药物筛选系统构筑。例如，使用肾素原和能够活化肾素原的抗pf抗体，通过测定肾素原与该抗pf抗体的结合，能够筛选抑制肾素原活化的物质。另外，例如使用肾素原和能够活化肾素原的抗pf抗体，通过测定活化的肾素原的酶活性，可以筛选抑制肾素原活化的物质或者抑制肾素原的酶活性的物质。当然筛选方法并不限于这些。另外，如上所述，由于肾素原pf区域的氨基酸序列的构成氨基酸因种的不同而不同，因此人肾素原活化控制物质的筛选使用人肾素原和例如对人肾素原的pf肽的抗体进行是1种优选的方式。
具体而言，例如利用按照特开平10-279600号公报和美国专利第5945512号的记载制备的能够特异地识别人肾素原以及人肾素原pf肽活化人肾素原的抗体，可以构筑筛选系统。
上述肾素原活化控制物质的筛选方法中，作为筛选对象的物质可以广泛利用低分子化合物、来源于天然物的化合物或肽等在自身公知的药物筛选系统中使用的作为筛选对象的候补物质。
另外，以肾素原特别是人肾素原的pf区域的氨基酸序列信息为基础设计的肽和低分子化合物也可以作为筛选对象。
人肾素原的pf区域的氨基酸序列是已知的，由特开平8-285852所示的43个氨基酸序列(序列表中的序列号1)构成。肾素原的pf肽的氨基酸序列是对于设计筛选肾素原活化控制物质的对象物质有用的信息。特别是肾素原pf区域的N末端起第1～第19(pf1-19)，特别是第5～第19(pf5-19)，以及第27～第41(pf27-41)的氨基酸序列中至少3个，更优选至少4个连续的氨基酸序列的信息对于设计肾素原活化控制物质有用。来源于人的pf1-19、来源于人的pf5-19、来源于人的pf27-41、来源于大鼠的pf1-19、来源于大鼠的pf5-19以及来源于大鼠的pf27-41的氨基酸序列分别如序列表中的序列号2、3、4、6、7和8所示。以下，将pf区域的N末端起例如第M～第N的肽记做pfM-N。
如上所述，肾素原pf区域的氨基酸序列即使种不同，氨基酸残基数也相同，但是其构成氨基酸不同。在试验例中，例举大鼠肾素原的pf肽的氨基酸序列(序列表中的序列号5)作为对于设计用于筛选肾素原活化控制物质的对象物质有用的信息。在实施例中合成了大鼠肾素原pf区域的氨基酸序列片断，即pf1-11(序列表中的序列号9)、pf5-19(序列表中的序列号7)、pf1-4(序列表中的序列号10)、pf1-7(序列表中的序列号11)、pf5-11(序列表中的序列号12)、pf12-19(序列表中的序列号13)、pf11-15(序列表中的序列号14)和pf27-41(序列表中的序列号8)，确认了其抑制肾素原活化产生的降压效果、脏器肥大抑制效果以及动脉肥厚抑制效果，但是未必限于这些序列。只要是本领域技术人员，就可以按照自身公知的方法适当合成至少3个的肽，以该合成肽作为基础设计合成作为筛选对象的物质。
另外，如上所述，对与能够在体外活化人肾素原的抗人pf抗体的表位即人pf肽在一维结构上的氨基酸序列顺序中同一部位的大鼠pf肽的特异抗体在大鼠高血压病理模型中显示降压效果，因此可以容易地推测与大鼠pf肽在一维结构上的氨基酸序列顺序相同的人肾素原pf肽对于人能够获得同样的效果。作为优选方式之一，将人肾素原的pf肽作为用于设计作为筛选对象的物质的信息。
作为筛选对象的物质只要是肽，如上所述就能够以肾素原pf区域的氨基酸序列的信息为基础适当设计，供于选择。构成该肽的氨基酸不一定必须与肾素原pf区域的氨基酸序列相同，只要具有与该肽同样的功能，可以是在该肽的氨基酸序列中适当导入缺失、替换、添加、插入等变异得到的肽(以下，有时也称为等价肽)。
另外，作为筛选对象的物质也可以是根据基于pf区域的氨基酸序列的二维和/或三维结构的信息，以其结构上的互补性为基础进行药物设计得到的低分子化合物。
在上述方法中，可以得到能够抑制抗人pf肽抗体引起的人肾素原活化的物质。而且，以具有从pf区域的氨基酸序列中选择的部分序列的肽、已知的降压剂等为基础收集信息，并通过使用动物模型的试验等，能够由得到的物质选择具有降压效果、脏器肥大抑制效果、动脉肥厚抑制效果的物质。
(肾素原活化控制物质)
因此本发明也提供肾素原活化控制物质，该物质能够控制基于肾素原的pf区域的蛋白质间相互作用引起的肾素原活化。
本发明的1种方式是能够控制人肾素原活化的肾素原活化控制物质。
本发明的肾素原活化控制物质可以是竞争性抑制活化肾素原的蛋白质间相互作用的物质、在肾素原或活化的肾素原的作用部位拮抗性抑制其结合的物质、对肾素原或活化的肾素原具有抗原抗体反应性的物质、或者作用于肾素原或活化的肾素原的作用部位抑制肾素原或活化的肾素原作用的物质等。
优选方式之一是上述肾素原活化控制物质具有抑制基于肾素原的pf区域的蛋白质间相互作用引起的肾素原活化的功能，并且是不具有肾素抑制活性的肾素原活化控制物质。也就是说，上述肾素原活化控制物质作为其作用机理不显示对肾素的直接抑制作用。因此，能够抑制病态时活化的肾素原的活性，而不会象肾素抑制剂等那样抑制在机体的生命维持机理中承担重要作用的肾素-血管紧张素系统。这是本发明的肾素原活化控制物质的重要特征。
作为具体实例，可以例举具有从肾素原pf区域的氨基酸序列中选择的部分序列的肽、该肽的等价肽、根据肾素原pf区域的氨基酸序列的信息设计的低分子化合物以及对肾素原pf区域的抗体等，但是并不限于这些。
作为优选方式之一，上述肽是具有从人肾素原pf区域的氨基酸序列中选择的部分序列的肽或该肽的等价肽。例如，作为来源于人肾素原pf区域的氨基酸序列的肽，可以例举以下的肽。
hp1：人肾素原pf1-11(序列表中的序列号15)
hp2：人肾素原pf5-11(序列表中的序列号16)
hp3：人肾素原pf5-19(序列表中的序列号3)
hp4：人肾素原pf1-4(序列表中的序列号17)
hp5：人肾素原pf1-7(序列表中的序列号18)
hp6：人肾素原pf12-19(序列表中的序列号19)
hp7：人肾素原pf11-15(序列表中的序列号20)
hp8：人肾素原pf27-41(序列表中的序列号4)
控制肾素原活化时，可以使用这些肽中的1种，也可以2种以上混合使用。
另外，作为优选方式之一，上述抗体是对人肾素原pf区域的抗体。例如，可以例举使用来源于人肾素原pf区域的氨基酸序列的下述肽作为抗原得到的抗人pf抗体。
hp9：人肾素原pf1-15(序列表中的序列号21)
hp10：人肾素原pf18-30(序列表中的序列号22)
hp11：人肾素原pf30-41(序列表中的序列号23)
控制肾素原活化时，可以仅使用1种抗体，也可以2种以上混合使用。将上述抗体作为肾素原活化控制物质用于药物时，该抗体优选按照公知方法得到的单克隆抗体，更优选以该抗体作为人源化抗体制作。人源化抗体的制作方法可以利用自身公知的方法(J.Immunol.Methods，100，5-40，1987)。
(降压剂)
作为本发明的1种方式，本发明提供含有上述肾素原活化控制物质中至少1种作为有效成分的降压剂。该降压剂特征在于至少在机体内给药后第12小时还发挥充分的降压效果，效果的持续时间非常长。例如在高血压病理模型大鼠的试验中，在给药后第12小时，作为SBP(Systolic Blood Pressure)值(％)显示至少10％程度的降压率。该数值作为降压剂未必很高，但是只要是本领域技术人员，在给药量、给药时间和/或给药方法等方面下工夫，就能够容易地得到更高的效果。另一方面，现有降压剂即肾素抑制剂的体内效果在给药之后立即出现，之后以每分钟为单位消失。另外，ACE抑制剂的体内效果虽然在给药后持续6～8小时，但是之后便消失。因此，在考虑改善高血压时，本发明降压剂的长时间持续的降压效果可以说是非常有用的特征。
另外，本发明的降压剂通过与现有的高血压治疗药，例如ACE抑制剂或肾素抑制剂不同的机理，显示降压效果，在高血压的治疗中，也可以与现有的高血压治疗药等联用。
而且，上述降压剂仅选择性地对高血压患者发挥其降压效果。在正常大鼠和高血压病理模型大鼠的比较试验中，证明上述降压剂仅对高血压病理模型大鼠发挥作用。也就是说，本发明的降压剂对于高血压的治疗有用。
(脏器肥大抑制剂)
本发明还提供含有上述肾素原活化控制物质中至少1种作为有效成分的新型脏器肥大抑制剂。本发明的脏器肥大抑制剂可以在心脏和/或肾脏中抑制脏器肥大。因此，该脏器肥大抑制剂可以期待对心衰或肾衰的效果。
(动脉肥厚抑制剂)
本发明提供含有上述肾素原活化控制物质中至少1种作为有效成分的新型动脉肥厚抑制剂。本发明的动脉肥厚抑制剂可以抑制肺动脉、大腿动脉等的肥厚即血管改型。因此，该动脉肥厚抑制剂对动脉硬化等伴有血管肥厚即血管改型的疾病有效。
(制剂化)
将上述降压剂、脏器肥大抑制剂和动脉肥厚抑制剂制成制剂时，可以根据肽或低分子化合物的物性，适当使用公知的方法。例如可以利用片剂、胶囊制剂、水溶液制剂、乙醇溶液制剂、脂质体制剂、脂肪乳剂、环糊精等的包合物等的制剂方法。
散剂、丸剂、胶囊剂和片剂可以使用乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇等赋形剂，淀粉、海藻酸钠等崩解剂，硬脂酸镁、滑石等润滑剂，聚乙烯醇、羟丙基纤维素、明胶等粘合剂，脂肪酸酯等表面活性剂，甘油等增塑剂等进行制备。制备片剂或胶囊时，可以使用固体的制剂载体。
悬浊剂可以使用水、蔗糖、山梨醇、果糖等糖类，PEG等二醇类，油类进行制备。
注射用的溶液可以使用盐溶液、葡萄糖溶液或者盐水与葡萄糖溶液的混合物构成的载体进行配制。
脂质体化可以通过下述方法进行，即在将磷脂溶解于有机溶剂(氯仿等)得到的溶液中加入将该物质溶解于溶剂(乙醇等)得到的溶液后，蒸馏除去溶剂，向其中加入磷酸缓冲液，振荡、超声波处理和离心分离后，过滤处理上清液，回收的方法。
脂肪乳剂化可以通过下述方法进行，即将该物质、油成分(大豆油、芝麻油、橄榄油等植物油，MCT等)、乳化剂(磷脂等)等混合，加热制成溶液后，加入必要量的水，使用乳化机(匀浆机，例如高压喷射型、超声波型等)，进行乳化、匀化处理的方法。另外，也可以将其冷冻干燥。另外，脂肪乳剂化时，也可以添加乳化助剂，作为乳化助剂，可以例举甘油、糖类(例如葡萄糖、山梨醇、果糖等)。
环糊精包合化可以通过下述方法进行，即在将该物质溶解于溶剂(乙醇等)得到的溶液中加入将环糊精加热溶解于水等得到的溶液后，冷却，过滤析出的沉淀，进行灭菌干燥的方法。这时使用的环糊精可以根据该物质的大小，适当选择空隙直径不同的环糊精(α、β、γ型)。
上述降压剂、脏器肥大抑制剂或动脉肥厚抑制剂的给药量可以根据患者的病症、性别、年龄、体重适当选择。作为给药途径，可以是口服、非口服任意一种。优选方式之一是制成口服剂的形态口服给药。作为其给药量，例如每天1～1000μg。
实施例
以下结合实施例更具体地说明本发明，但是本发明并不受这些实施例的限定，在不脱离本发明的技术思想的范围内各种应用均有可能。
(实施例1)
(制备识别来源于大鼠肾素原pf区域的肽的抗体)
采用固相法按照常规方法合成大鼠肾素原的pf肽，即pf1-15(序列表中的序列号24)、pf18-30(序列表中的序列号25)、pf30-41(序列表中的序列号26)，以这些寡肽作为抗原，按照特开平10-279600号公报和美国专利第5945512号的实施例的记载，制备对这些抗原的抗体，即Ab1、Ab2和Ab3。具体而言，将抗原即上述寡肽与佐剂一起对新西兰白兔进行免疫，得到抗血清。得到的抗血清按照该公报中记载的方法进行纯化。
Ab1：特异地识别pf1-15的抗体
Ab2：特异地识别pf18-30的抗体
Ab3：特异地识别pf30-41的抗体
另外，将这些抗体等量混合，得到Abmix。并且，按照该公报中记载的方法研究这些抗体引起的体外的肾素原活化，确认这些抗体能够活化肾素原。
(实施例2)
(制备来源于大鼠肾素原pf区域的肽)
采用固相法按照常规方法合成来源于大鼠肾素原的pf区域的序列的下述肽。
p1：pf1-11(序列表中的序列号9)
p2：pf5-19(序列表中的序列号7)
p3：pf27-41(序列表中的序列号8)
p1a：pf1-4(序列表中的序列号10)
p1b：pf1-7(序列表中的序列号11)
p1c：pf5-11(序列表中的序列号12)
p2a：pf12-19(序列表中的序列号13)
p2b：pf11-15(序列表中的序列号14)
另外，将p1、p2和p3等量混合，得到Pmix。
(试验例1)
(抗pf肽抗体和pf肽产生的降压效果的研究)
使用作为高血压病理模型动物的SHR雄性大鼠(12～14周龄，体重258～310g)，每组3只。将实施例1制备的Abmix、实施例2制备并溶解于生理盐水的Pmix以及作为比较试验药的抗肾素中和抗体与卡托普利分别以0.44mg/kg、0.6mg/kg、0.12mg/g和100mg/kg的给药量静脉给药。血压测定通过下述方法进行，即将插入总颈动脉和外颈动脉的导管与压力转换器(P23XL，Gould Eletronics公司)连接，输入压力处理器信号调节器(Gould Electronis公司)，从试验物质给药开始至1小时后，每隔10分钟进行测定，之后每隔1小时进行测定，记录在热阵列记录器(RS3400，Gould Electronics公司)上。
作为比较试验药的抗肾素中和抗体在给药后第6小时之前未显示血压降低，在第6小时和第24小时分别确认了11％和14％的血压降低趋势。Pmix和Abmix在给药后至试验结束为止显示持续的血压降低，分别为最大9％和最大7％。阳性对照的卡托普利直到给药后第6小时显示最大的血压降低(最大31％)，第24小时即试验结束时确认没有降压作用。
结果，判断出Pmix和Abmix显示与抗肾素中和抗体以及作为ACE抑制剂的卡托普利不同的经时降压效果。也就是说，判断出Pmix和Abmix在给药后具有非常长时间的持续的降压能力。另外，由此推测出Pmix和Abmix的降压效果不是抑制肾素活性产生的。
(试验例2)
以试验例1得到的数据为基础，对Pmix增加给药量(2mg/kg)，使用SHR 5例与试验例1同样进行试验。对照组使用生理盐水溶液。结果，确认给药之后立即有11％的一时性降压作用，给药后5分钟恢复，之后再缓慢出现血压降低，确认最大至9％，与对照组相比，给药后1～6小时有显著差异。也就是说，确认Pmix具有二重性的降压作用。
(试验例3)
对于实施例2制备的p1(pf1-11)、p2(pf5-19)、p3(pf27-41)，使用SHR 2例或4例与试验例1同样进行试验。结果，p1在给予2mg/kg时，确认给药之后立即有6％程度的一时性血压上升作用，给药5分钟后恢复，之后缓慢出现血压降低，确认最大至6％，并确认直到24小时均有持续的效果。另外，给予10mg/kg时，确认给药6小时后有约7％的血压降低，并确认直到24小时均有持续的效果，最大10％的程度。p2在给予2mg/kg时，确认给药之后立即有35％程度的一时性血压降低，给药5分钟后恢复，并确认之后直到24小时均有持续的降压作用，最大6％的程度。p3在给予2mg/kg时，确认给药之后立即有14％程度的一时性血压上升，给药5分钟后恢复，之后确认没有作用。给予10mg/kg时，确认2小时后有7％的血压降低，并确认直到24小时均有持续的降压作用，最大为11％。
也就是说，判断出大鼠肾素原pf区域的N末端起第1～第11或第5～第19的氨基酸序列构成的肽、以及相当于大鼠肾素原pf区域的C末端侧的第27～第41的氨基酸序列构成的肽具有持续的降压作用。
另外，该结果表明Pmix产生的给药之后的一时性血压降低是p2的作用，之后的持续降压作用是p1、p2和p3的相互作用。
(试验例4)
作为比较试验，使用相同周龄的正常血压大鼠(WKY大鼠)5例代替SHR，进行与试验例2同样的试验。除Pmix给药之后的一时性血压降低以外，确认一切血压降低均没有。因此，确认Pmix对于正常大鼠不显示持续的血压降低作用。
(试验例5)
对于实施例2制备的p1(pf1-11)、p1a(pf1-4)、p1b(pf1-7)、p1c(pf5-11)、p2a(pf12-19)和p2b(pf11-15)，使用SHR各2例与试验例1同样进行试验，p2a(pf12-19)和p2b(pf11-15)分别以给药量1mg/kg进行，其他肽以给药量10mg/kg进行。
结果，p1直到给药后24小时均显示最大14％的持续血压降低。p1a在给药之后立即显示13％的一时性血压上升，之后直到给药后24小时均显示最大13％的持续血压降低。p1b在给药之后立即显示17％的一时性血压上升，之后直到给药后24小时均显示最大13％的持续血压降低。p1c在给药之后立即显示21％的一时性血压上升，之后直到给药后24小时均显示最大16％的持续血压降低。p2a在给药之后立即显示6％的一时性血压上升，之后直到给药后24小时均显示最大14％的持续血压降低。另外，使用p2b也能够得到同等的效果。
结果，判断出来源于大鼠肾素原pf区域的氨基酸序列N末端起第1～第19的氨基酸序列的肽具有持续的降压作用。
(试验例6)
使用实施例2制备的p2a(pf12-19)和作为肾素抑制剂的H6137(D-His·Pro·Phe·His·Leu·ψ·[CH2NH]·Leu·Val-Tyr，Sigma公司)，分别以给药量1mg/kg由外颈静脉通过插管给药，按照实施例1记载的方法测定经时血压变化。
结果，p2a在给药后5～8小时显示最大11％的持续血压降低，其效果持续至给药后至少12小时。另一方面，H6137在给药后3～8小时显示最大9％的持续血压降低，但给药6小时以后确认其效果有消失的趋势。
可以得知p2a发挥作用需要时间，但是作用时间长，H6137发挥作用时间快，但是作用时间短。根据这种经时降压效果之间的差异，可以推测p2a代表的肾素原活化控制物质的降压效果不是抑制肾素引起的。
(试验例7)
将实施例2制备的p1c(pf5-11)给予SHR，每组4只，以1.6mg/kg1日1次，连续14天静脉给药。第14天放血处死，摘出心脏和肾脏，测定其重量。结果作为每100g体重的脏器重量列于表1中。如表1所示，给予p1c的SHR的心脏和肾脏的重量比给予生理盐水的对照组轻，表明p1c抑制心脏肥大和肾脏肥大。
表1
给药物质   脏器重量(g/g体重)
  心脏   右肾脏   左肾脏
生理盐水   12   0.430.47   0.380.39   0.400.44
  平均值标准误差   0.450.02   0.390.00   0.420.02
  p1c   3456   0.370.400.390.40   0.340.350.350.33   0.340.350.350.35
  平均值标准误差   0.390.01   0.340.00   0.350.00
(试验例8)
对于试验例7中进行了试验的大鼠，摘出肺动脉、肠系膜上动脉、大腿动脉，测定其重量。将各动脉的重量分别换算为单位面积的重量，再将该换算值换算为各大鼠的单位体重的值进行比较，结果如表2所示。如表2所示，给予p1c的SHR的各动脉的重量比对照组显著轻，判断出p1c抑制动脉肥厚即血管改型。
表2
  给药物质   动脉重量(mg/mm2/g体重)
  肺动脉   肠系膜上动脉   大腿动脉
  生理盐水   12   0.000930.00119   0.000840.00107   0.001380.00135
  平均值标准误差   0.001060.00013   0.000960.00012   0.001370.00002
  p1c   3456   0.000670.000870.000880.00082   0.000940.000950.000960.00100   0.000680.000940.001060.00087
  平均值标准误差   0.000810.00005   0.000960.00001   0.000890.00008
(实施例3)
利用按照特开平10-279600号公报和美国专利第5945512号的记载制备的能够特异地识别人肾素原以及人肾素原pf肽活化人肾素原的抗体，构筑筛选系统。用构筑的筛选系统对候补化合物进行试验，确认对于抗pf肽抗体引起的人肾素原活化的作用。按照该方法，能够得到可以抑制抗人pf肽抗体引起的人肾素原活化的物质。而且，以选自人肾素原原片断区域的肽、已知的降压剂等为基础收集信息，并通过使用动物模型的试验等，能够由得到的物质选择具有降压效果、脏器肥大抑制效果、动脉肥厚抑制效果的物质。
工业实用性
按照本发明，提供能够控制肾素原活化的物质的筛选方法，该方法以肾素原的原片断区域的蛋白质间相互作用引起的肾素原活化的调节能力作为指标进行，并提供肾素原活化控制物质，该物质具有控制基于肾素原的原片断区域的蛋白质间相互作用引起的肾素原活化的功能。而且，通过使用上述肾素原活化控制物质，能够提供具有新型机理的降压剂、脏器肥大抑制剂、动脉肥厚抑制剂。这些药物通过单独使用或者与现有的药物联用，可以有效用于高血压、心衰、肾衰以及伴有动脉硬化即血管改型的疾病等的治疗。
                               序列表
<110>石田雄一
<120>抗高血压剂
<130>GP00-1030
<150>JP P2000-108670
<151>2000-04-10
<160>26
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>43
<212>PRT
<2l3>人(Homo sapiens)
<400>1
Leu Pro Thr Asp Thr Thr Thr Phe Lys Arg Ile Phe Leu Lys Arg Met
1               5                   10                  15
Pro Ser Ile Arg Glu Ser Leu Lys Glu Arg Gly Val Asp Met Ala Arg
            20                  25                  30
Leu Gly Pro Glu Trp Ser Gln Pro Met Lys Arg
        35                  40
<210>2
<211>19
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>2
Leu Pro Thr Asp Thr Thr Thr Phe Lys Arg Ile Phe Leu Lys Arg Met
1               5                   10                  15
Pro Ser Ile
<210>3
<211>15
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>3
Thr Thr Thr Phe Lys Arg Ile Phe Leu Lys Arg Met Pro Ser Ile
1               5                   10                  15
<210>4
<211>15
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>4
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1               5               10                  15
<210>5
<211>43
<212>PRT
<213>褐鼠
<400>5
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<213>褐鼠
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<212>PRT
<213>褐鼠
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Thr Thr Thr Phe Lys Arg Ile
1               5
<210>17
<211>4
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>17
Leu Pro Thr Asp
1
<210>18
<211>7
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>18
Leu Pro Thr Asp Thr Thr Thr
1               5
<210>19
<211>8
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>19
Phe Leu Lys Arg Met Pro Ser Ile
1               5
<210>20
<211>5
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>20
Ile Phe Leu Lys Arg
1               5
<210>21
<211>15
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>21
Leu Pro Thr Asp Thr Thr Thr Phe Lys Arg Ile Phe Leu Lys Arg
1                5                  10                  15
<210>22
<211>13
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>22
Ser Ile Arg Glu Ser Leu Lys Glu Arg Gly Val Asp Met
1               5                   10
<210>23
<211>12
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>23
Met Ala Arg Leu Gly Pro Glu Trp Ser Gln Pro Met
1               5                   10
<210>24
<211>15
<212>PRT
<213>褐鼠
<400>24
Leu Pro Thr Asp Thr Ala Ser Phe Gly Arg Ile Leu Leu Lys Lys
1               5                   10                  15
<210>25
<211>13
<212>PRT
<213>褐鼠
<400>25
Ser Val Arg Glu Ile Leu Glu Glu Arg Gly Val Asp Met
1               5                   10
<210>26
<211>12
<212>PRT
<213>褐鼠
<400>26
Met Thr Arg Ile Ser Ala Glu Trp Gly Glu Phe Ile
1               5               10

Claims (10)

1.选自降压剂、脏器肥大抑制剂和动脉肥厚抑制剂中的至少一种治疗剂用的肾素原活化控制物质的筛选方法，其包括下述工序a)～d)：
a)准备肾素原；
b)准备通过与肾素原的原片断区域进行蛋白质间相互作用能够活化肾素原而不伴有一维结构改变的抗体；
c)准备作为筛选对象的候补物质；
d)测定在候补物质存在下通过工序(b)中准备的抗体非酶促活化的肾素原的肾素活性，将上述活性与在候补物质不存在下通过抗体非酶促活化的肾素原的肾素活性进行比较，选择与候补物质不存在下的肾素原的肾素活性相比，候补物质存在下肾素原的肾素活性被抑制时的候补物质。
2.如权利要求1所述的筛选方法，上述候补物质是以肾素原的原片断区域的氨基酸序列中至少3个氨基酸序列的信息为基础设计的物质。
3.如权利要求1所述的筛选方法，上述候补物质是以肾素原的原片断区域的氨基酸序列的N末端起第1至第19的氨基酸序列或第27至第41的氨基酸序列中至少3个氨基酸序列的信息为基础设计的物质。
4.如权利要求1所述的筛选方法，上述候补物质是以肾素原的原片断区域的氨基酸序列的N末端起第5至第19的氨基酸序列中至少3个氨基酸序列的信息为基础设计的物质。
5.如权利要求2至4中任意一项所述的筛选方法，上述候补物质是肽。
6.如权利要求2至4中任意一项所述的筛选方法，上述候补物质是低分子化合物。
7.如权利要求1至4中任意一项所述的筛选方法，肾素原是人肾素原。
8.如权利要求1至4中任意一项所述的筛选方法，肾素原是大鼠肾素原。
9.选自降压剂、脏器肥大抑制剂和动脉肥厚抑制剂中的至少一种治疗剂，其含有下述肾素原活化控制物质作为有效成分，
该肾素原活化控制物质具有抑制由于肾素原的原片断区域的蛋白质间相互作用引起的不伴有一维结构改变的肾素原活化的功能，且不保持肾素抑制活性，由具有从肾素原的原片断区域的氨基酸序列中选择的部分序列的肽或其等价肽构成。
10.选自降压剂、脏器肥大抑制剂和动脉肥厚抑制剂中的至少一种治疗剂，其含有下述肾素原活化控制物质作为有效成分，
该肾素原活化控制物质具有抑制由于肾素原的原片断区域的蛋白质间相互作用引起的不伴有一维结构改变的肾素原活化的功能，且不保持肾素抑制活性，由从序列表中序列号3、序列号4和序列号7至20记载的肽中选择的肽构成。
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