JPWO2006132245A1 - 腫瘍増殖抑制剤 - Google Patents

Abstract

本発明の課題は、新規な腫瘍増殖抑制剤を提供することである。かかる課題は、プロレニンのプロフラグメント領域のアミノ酸配列において、N末端の１〜１８番目の配列より選択される部分配列からなるポリペプチド又はその等価ペプチドを有効成分として含有する腫瘍増殖抑制剤により解決される。前記部分配列は、２〜８個のアミノ酸配列であることが好ましい。本発明の腫瘍増殖抑制剤は、従来のアンジオテンシン変換酵素阻害剤等より、高い腫瘍増殖抑制効果を発揮し得ると考えられる。

Description

本発明は、プロレニンのプロフラグメント領域のアミノ酸配列において、N末端の１〜１８番目の配列より選択される部分配列からなるポリペプチド又はその等価ペプチドを有効成分として含有する腫瘍増殖抑制剤に関するものである。

本出願は、参照によりここに援用されるところの、日本特許出願特願２００５‐１６５２９５号からの優先権を請求する。

腫瘍増殖抑制剤は、アルキル化剤、核酸に影響する抗生物質（ドキソルビシン等）、白金複合体、アルカロイド系抗腫瘍薬、代謝拮抗剤（5-フルオロウラシル等）、トポイソメラーゼ阻害剤、生体反応調整剤（インターフェロン等）、ホルモン療法剤（タモキシフェン等）のような幾つかのカテゴリーに分類される。これらの制癌剤は、種々の作用機序により、直接腫瘍細胞に対して増殖抑制作用を発揮する。

近年、内因性のアンジオテンシンII（Ang II）が腫瘍血管新生に関与していることが明らかになりつつある。Ang IIの産生酵素の阻害剤やAng II受容体拮抗剤は、各々単独で略同等の臓器保護作用を有するが、腫瘍増殖抑制作用を有する可能性も示唆されている。アンジオテンシン変換酵素阻害剤（ACE阻害剤）は、アンジオテンシンI（Ang I）をAng IIに変換する酵素ACEを阻害する作用を有し、ACE阻害剤を連用していた患者では、癌による死亡率が有意に低いことが報告された。また、Ang II受容体の拮抗剤及びAng II受容体のノックアウトマウスを用いることにより、血管新生及び腫瘍増殖にAng IIが関与していることが確認された（非特許文献１、２）。

Ang IIを産生するレニン−アンジオテンシン系（RAS）には、循環RASと組織RASがある。生体の血圧や体液などの恒常性維持に必須の生理的循環RASと独立して、病態時の組織におけるRASの活性化は、組織中のAng IIの濃度を上昇させて、増加したAng IIが特異的に受容体を介して働くことにより、高血圧、糖尿病合併症、腎疾患、心不全等の発症と進展に深く関与していると考えられている。従来、降圧剤として、ACE阻害剤やAng II受容体拮抗剤が用いられてきたが、エスケープ現象といわれるAng II又はAng II効果の再上昇のため、単独の治療効果には限界の存在が示唆されている。

レニンは、RASにおいてAng Iを生成する律速酵素である。レニンは、主に腎臓において、その前駆体である406個のアミノ酸からなるプレプロレニン（pre-pro-renin）として、生合成される。その後、N末端の23個のアミノ酸が切断されてプロレニンが生じ、ついで43個のアミノ酸断片（「プロフラグメント」又は「pf」とも称する。）がN末端からさらに切断されて、340個のアミノ酸からなるレニン（「完熟レニン」とも称する。）となる。プロレニンは通常は酵素活性を示さないが、前記プロフラグメント部位を特異的に認識する抗体とin vitroで結合して免疫複合体を形成すると、酵素活性（レニン様活性）を発現するようになることが知られている（特許文献１及び２）。

本発明者等は、先にプロレニンのプロフラグメント由来の部分ペプチドを、ストレプトゾトシン（STZ）糖尿病病態モデル動物に投与することにより、組織RASの活性化を制御しうることを見い出した。また、プロレニンプロフラグメント由来の部分ペプチドを、STZ糖尿病病態モデル動物に投与することにより、糖尿病に由来する腎糸球体硬化病変を抑制しうることを見い出した（特許文献３）。
しかしながら、プロレニンのプロフラグメント由来の部分ペプチドを有効成分として含む腫瘍増殖抑制剤についての報告はない。
特許第3271157号 米国特許第5945512号 国際公開第WO2004/073740号 医学のあゆみ, 207: 35-40, (2003) Biochem. Biophys. Res. Commun, 294: 441-447, (2002)

本発明の課題は、新規な腫瘍増殖抑制剤を提供することにある。

本発明者らは、プロレニンのプロフラグメント領域のアミノ酸配列において、N末端の１〜１８番目の配列より選択される部分配列からなるポリペプチドが、腫瘍増殖抑制効果を有することを見出し、新規な腫瘍増殖抑制剤を提供することを可能にした。

すなわち、本発明は以下に記載の発明からなる。
１．プロレニンのプロフラグメント領域のアミノ酸配列において、N末端の１〜１８番目の配列より選択される部分配列からなるポリペプチド又はその等価ペプチドを有効成分として含有する腫瘍増殖抑制剤。
２．前記部分配列が、２〜８個のアミノ酸配列である前項１に記載の腫瘍増殖抑制剤。
３．前記部分配列が、N末端の１１〜１３番目の配列、１３〜１５番目の配列、及び１１〜１５番目の配列のうち、少なくともいずれか１配列を含むアミノ酸配列である前項１又は２に記載の腫瘍増殖抑制剤。
４．前記部分配列が、N末端の１１〜１８番目のアミノ酸配列である前項１〜３の何れか一に記載の腫瘍増殖抑制剤。
５．固型腫瘍に対して使用する前項１〜４の何れか一に記載の腫瘍増殖抑制剤。
６．肝癌に対して使用する前項５に記載の腫瘍増殖抑制剤。

本発明の新規な腫瘍増殖抑制剤によれば、従来公知のACE阻害剤等より優れた腫瘍増殖抑制効果をもたらすことが可能となる。本腫瘍増殖抑制剤は、通常、腫瘍に対する治療において用いられ得るが、ACE阻害剤等を含む他の腫瘍増殖抑制剤では効果が得られない又は効果が低い病態の患者に対して、有効である可能性が高い。

マウスの最終体重の比較を示す。 ヌードマウス移植ヒト肝癌平均腫瘍体積の経時的変化量（mm³）を示す。

符号の説明

ａ 生食
ｂ カプトプリル10mg/kg
ｃ pf11-18ペプチド1mg/kg
ｄ pf11-18ペプチド10mg/kg

以下、本発明を詳しく説明するが、本明細書中で使用されている技術的及び科学的用語は、別途定義されていない限り、本発明の属する技術分野において通常の知識を有する者により普通に理解される意味を持つ。本明細書中では当業者に既知の種々の方法が参照されている。そのような引用されている公知の方法を開示する刊行物等の資料は、それらを引用することにより本明細書中にそれらの全体が完全に記載されているものとして導入される。

本発明は、プロレニンのプロフラグメント部位のアミノ酸配列において、N末端の１〜１８番目の配列より選択される部分配列からなるポリペプチド又はその等価ペプチドを有効成分として含有する腫瘍増殖抑制剤に関するものである。

ヒトプロレニンのプロフラグメント部位を特異的に認識する抗体である抗ヒトpf抗体は、in vitroでヒトプロレニンを活性化する。ヒトプロレニンのプロフラグメント部位に由来するヒトpfペプチドは、抗ヒトpf抗体によるin vitroでのヒトプロレニン活性化を拮抗阻害することが既知である。これと同様に、抗ラットpf抗体の抗原であるラットpfペプチドも、抗ラットpf抗体によるin vitroでのラットプロレニン活性化を拮抗阻害することができる。すなわち、これらのペプチドは、プロレニンとプロレニン結合性蛋白との結合を拮抗阻害することにより、蛋白質間相互作用によっておこる、ラットプロレニンの一次構造変化は伴わないが高次構造変化を伴う活性化（「非酵素的なプロレニン活性化」とも称する。）を阻害することができる。

先に本発明者らは、ラット高血圧病態モデルSHRにラットプロレニンプロフラグメント由来の部分ペプチドを投与すると降圧効果が得られたが、正常ラットにこれらのペプチドを投与しても血圧は変動しなかったことを報告した。また、該ペプチドの降圧効果は、レニン阻害剤（H6137：Sigma社）やレニン中和抗体によるものとは異なり、降圧効果が長時間にわたって認められた。よって、該ペプチドによる降圧効果はレニン活性の阻害によるものではないと考えられる（国際公開第WO01/077673号）。また、ラットプロレニンプロフラグメント由来の部分ペプチドは、STZラットでは腎臓内Ang IIを有意に減少させるが、正常ラットではAng IIを変化させなかった（国際公開第WO2004/073740号）。これらの効果は、上記ペプチドが、生体内におけるラットプロレニンの非酵素的な活性化を阻害したことによるものと推測される。
ここで、非酵素的に活性化されたプロレニンの活性は、完熟レニンが有する酵素作用と同様のもの（「レニン様活性」と称する。）であるが、完熟レニンの活性とは区別されるものである。

本発明の腫瘍増殖抑制剤において有効成分として含有されるペプチドは、プロレニンとその結合性蛋白との結合に拮抗して、非酵素的プロレニン活性化の阻害作用を発揮することにより、腫瘍血管新生を阻害し、腫瘍増殖抑制効果を示すと考えられる。
また、上記ペプチドはその作用メカニズムからレニン活性の阻害作用を有しないと考えられ、これは本発明の腫瘍増殖抑制剤の重要な特徴である。この特徴により、生体の生命維持機構に重要な役割を担っているRASをレニン阻害剤などの様に阻害することなく、病態時のプロレニン活性化を阻害し、拮抗阻害による下流域の組織Ang II産生を抑制することができる。本発明の腫瘍増殖抑制剤は、公知の制癌剤の様な腫瘍細胞に対する直接的な細胞増殖抑制作用は認められない。

プロレニンのプロフラグメントのアミノ酸配列は公知である（下記の配列番号１）。
（配列番号１）
LPTDTTTFKR IFLKRMPSIR ESLKERGVDM ARLGPEWSQP MKR
本発明の有効成分である部分ペプチドは、N末端の１番目ロイシンから１８番目セリンの配列（LPTDTTTFKR IFLKRMPS（配列番号２））より選択されるアミノ酸配列からなる。かかる部分ペプチドは２個から８個、好ましくは２個から５個の連続したアミノ酸配列を有する。さらに好ましくは、部分ペプチドは、N末端の１１〜１３番目の配列、１３〜１５番目の配列、及び１１〜１５番目の配列の少なくともいずれかの１配列を含むアミノ酸配列である。このような部分ペプチドとして、N末端の１１〜１８番目の配列からなるアミノ酸配列からなるペプチドが好適に用いられる。本発明の有効成分は、上記部分ペプチドの等価ペプチドであってもよい。かかる等価ペプチドを構成するアミノ酸は、必ずしもプロフラグメント部位のアミノ酸配列と同一である必要はない。等価ペプチドは、上記部分ペプチドと同様の作用、すなわち非酵素的プロレニン活性化の阻害作用を有するものであればよく、上記部分ペプチドのアミノ酸配列に、適宜、欠失、置換、付加、挿入などの変異を導入したペプチドを含む。もちろん、本発明の腫瘍増殖抑制剤は、上述したペプチドのうち、１種を含むものであってもよいし、２種以上を組み合わせて含むものであってもよい。

これらペプチドは当該技術分野で公知の種々の方法によって作製することができる。例えば、固相法により合成することができる。

本発明の腫瘍増殖抑制剤の製剤化には、当該ペプチドの物性に応じて適宜公知の方法が適用できる。例えば、錠剤、カプセル製剤、水溶液製剤、エタノール溶液製剤、リポソーム製剤、脂肪乳剤、シクロデキストリンなどの包接体などの製剤化方法が利用できる。
散剤、丸剤、カプセル剤及び錠剤は、ラクトースなどの賦形剤、澱粉などの崩壊剤、マグネシウムステアレートなどの滑沢剤、ポリビニルアルコールなどの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤、グリセリンなどの可塑剤などを用いて製造できる。錠剤やカプセルを製造するには、固体の製薬担体が用いられる。
懸濁剤は、水、シュークロースなどの糖類、PEGなどのグリコール類、油類を使用して製造できる。
注射用の溶液は、塩溶液、グルコース溶液、又は、塩水とグルコース溶液の混合物からなる担体を用いて調製可能である。
リポソーム化は、例えば、リン脂質を有機溶媒に溶解した溶液に、当該物質を溶媒（エタノールなど）に溶解した溶液を加えた後、溶媒を留去し、これにリン酸緩衝液を加え、振盪、超音波処理及び遠心分離した後、上清を濾過処理して回収することにより行うことができる。
脂肪乳剤化は、例えば、当該物質、油成分（植物油など）、乳化剤（リン脂質など）などを混合、加熱して溶液とした後に、必要量の水を加え、乳化機を用いて、乳化・均質化処理して行い得る。また、これを凍結乾燥化することも可能である。なお、脂肪乳剤化するとき、乳化助剤を添加してもよく、乳化助剤としては、例えば、グリセリン、糖顆などが例示される。
シクロデキストリン包接化は、例えば、当該物質を溶媒（エタノールなど）に溶解した溶液に、シクロデキストリンを水などに加温溶解した溶液を加えた後、冷却して析出した沈殿を濾過し、滅菌乾燥することにより行い得る。この際、使用されるシクロデキストリンは、当該物質の大きさに応じて、空隙直径の異なるシクロデキストリン（α、β、γ型）を適宜選択すればよい。

本発明の腫瘍増殖抑制剤は、静注、筋注等の注射剤、坐剤、経皮、腹腔内投与等による非経口投与、あるいは経口投与することができるが、安定性や吸収性を考慮すると、非経口投与が好ましい。投与量は症状、投与対象の年齢、性別等を考慮して個々の場合に応じて適宜決定されるが、通常成人１人当たり、１日につき0.05〜1000mg/kg、好ましくは0.1〜50mg/kg、より好ましくは1〜20mg/kgの範囲で投与される。例えば、１日１回から数回に分け静脈内投与されるか、又は、１日１時間〜２４時間の範囲で静脈内持続投与、若しくは皮下埋め込み式持続投与をされてもよい。もちろん前記したように、投与量は種々の条件で変動するので、上記投与量範囲より少ない量で十分な場合もある。注射剤の場合は、安定性の点から、バイアル等に充填後、冷凍し、通常の凍結乾燥処理により水分を除き、使用直前に凍結乾燥物から液剤を再調製して投与することもできる。

本発明の腫瘍増殖抑制剤が適用される腫瘍の種類は、特には限定されないが、固型腫瘍に対して使用することが好ましい。固型腫瘍としては、肝癌などが例示される。

以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではなく、本発明の技術的思想を逸脱しない範囲内で種々の応用が可能である。

（実施例１）
ヒトプロレニンに由来する、N末端の１１番目イソロイシンから１８番目セリンの配列IFLKRMPS（配列番号３）を有するペプチドを固相法により常法どおり合成した。以下、本ペプチドをh-ヒトプロレニンペプチド（「pf11-18ペプチド」とも称する。）として使用した。

（実験例１）
方法
以下の実験は、ヒト肝癌細胞移植ヌードマウスを用いて行った。
５週齢のBALB/c nu/nuマウス２５匹を準備した。移植ヒト肝癌細胞（HCC:Hepatocellular Carcinoma）の成長した腫瘍を５０片ほどに細片し、５週齢（雄）BALB/c nu/nuマウス２５匹中、２３匹に移植した。無菌生食水5mLを加えたシャーレに、HCC細胞片を広げ、ヌードマウスの左右の背中右に各一片ずつ移植した。ハサミで切った切り口はそのままピンセットでつまんで閉じた。70%エタノール消毒綿で傷口を消毒した。その後、傷口が自然に閉じるのを待った。通常、傷口は１日程度できれいにふさがった。
その後毎日、本発明のh-プロレニンペプチド（pf11-18ペプチド）を、10mg/kg/day及び1mg/kg/dayで５匹のマウスに腹腔内投与した。投与するペプチド溶液は滅菌生食中に各々0.25mg/mL及び2.5mg/mLの濃度となるように調製した。pf11-18ペプチド5mg/バイアルは5mg/mL滅菌生食で溶解し、その後、滅菌生食で2倍希釈して調製し、-20℃で保存した。pf11-18ペプチド5mg/バイアルは5mg/mL滅菌生食で溶解し、9.5mL滅菌生食に0.5mLを加えて20倍希釈し、1mLずつバイアルにいれて調製し、-20℃で保存した。投与前には体重を測定し、25G注射針、ツベルクリン注射器を用いて、約100〜150μLで注射した。陰性コントロールには滅菌生食を、陽性コントロールにはカプトプリル（ACE阻害剤）を用い、カプトプリルは10mg/kg/dayとなるように、滅菌生食中2.5mg/mLの濃度で投与した。

デジタルカメラ及びビデオにて、マウスの様子を記録し、体重の測定、腫瘍径の測定を毎日行った。腫瘍径の測定は、ノギスを用いて縦×横を測定することにより行い、肝癌移植後１３日目から始めた。
実験中、マウス移植肝癌細胞の成長は順調に進み、肝癌移植後２２日目には一部の腫瘍でネクローシスが始まったので、腫瘍を摘出することとした。２２日目には、最終体重測定、最終腫瘍重量測定、肝癌腫瘍のサンプリング、血清の採取を行った。最終重量測定は採取した腫瘍の重量を測定した。肝癌腫瘍のサンプリングは、次のようにして行った。まず、摘出腫瘍の半分を10%ホルマリン固定液につけ、塊のまま保存した。摘出腫瘍の残りの半分を２〜３個に切り分け、-80℃に保存した。血清の採取は、各マウスについて、それぞれ心臓採血にて血液を採取し、血清分離することにより行った。500μLの血液から約200μLの血清が採取された。これを-20℃で保存した。血清中の内因性プロレニンの量を測定した。

結果
結果を表１、表２、図１、図２に示す。（注：本実験例の投与量ではマウスの死亡例は認められず、肉眼的副作用は認められなかった。）
表１は内因性プロレニンの量の測定結果を示す。

図１に、２２日目の最終体重比較を示す。最終体重は全ての群でほとんど差が見られなかった。
表２及び図２は、ヌードマウス移植ヒト肝癌平均腫瘍体積の１２日目〜２１日目までの経時的変化を示す。陰性コントロールの生食投与群（ａ）に比べて、pf11-18ペプチド1mg/kg/day投与群（ｃ）、pf11-18ペプチド10mg/kg/day投与群（ｄ）、及びカプトプリル投与群（ｂ）で腫瘍体積の増加の抑制が見られた。pf11-18ペプチド1mg/kg/day投与群（ｃ）よりもpf11-18ペプチド10mg/kg/day投与群（ｄ）で高い腫瘍体積増加の抑制効果が確認された。また、pf11-18ペプチド10mg/kg/day投与群（ｄ）では、カプトプリル10mg/kg/day投与群（ｂ）よりも腫瘍体積増加の抑制効果は高かった。

以上説明したように、本発明の新規な腫瘍増殖抑制剤によれば、従来公知のアンジオテンシン変換酵素阻害剤等より優れた腫瘍増殖抑制効果がもたらされ得る。本腫瘍増殖抑制剤は腫瘍に対する治療において用いられるが、副作用が低く抑えられ、ACE阻害剤等の腫瘍増殖抑制剤では効果が得られなかった病態の患者に対して、有効である可能性が高いと考えられる。

Claims (6)

1. プロレニンのプロフラグメント領域のアミノ酸配列において、N末端の１〜１８番目の配列より選択される部分配列からなるポリペプチド又はその等価ペプチドを有効成分として含有する腫瘍増殖抑制剤。
2. 前記部分配列が、２〜８個のアミノ酸配列である請求の範囲第１項に記載の腫瘍増殖抑制剤。
3. 前記部分配列が、N末端の１１〜１３番目の配列、１３〜１５番目の配列、及び１１〜１５番目の配列のうち、少なくともいずれか１配列を含むアミノ酸配列である請求の範囲第１項又は第２項に記載の腫瘍増殖抑制剤。
4. 前記部分配列が、N末端の１１〜１８番目のアミノ酸配列である請求の範囲第１項〜第３項の何れか一に記載の腫瘍増殖抑制剤。
5. 固型腫瘍に対して使用する請求の範囲第１項〜第４項の何れか一に記載の腫瘍増殖抑制剤。
6. 肝癌に対して使用する請求の範囲第５項に記載の腫瘍増殖抑制剤。