CN1038583C - 酰基苯基甘氨酸衍生物及以其为有效成分的胶原酶活性亢进所致疾病的防治药物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及以(Ⅰ)式表示的酰基苯基甘氨酸衍生物或其药学上容许的盐
(式中R1、R2、R3定义见说明书)。还涉及以其作有效成分、预防及治疗胶原酶活性亢进所致疾病的药物。化合物(Ⅰ)或其药学上容许的盐给机体使用后能在血中维持长时间的胶原酶抑制活性，对胶原酶活性亢进所致各种疾病可作为治疗药物。

Description

酰基苯基甘氨酸衍生物及以其为有效成分的胶原酶活性亢进所致疾病的防治药物
                 技术领域
本发明涉及具有胶原酶抑制作用的新型酰基苯基甘氨酸衍生物或其药学上容许的盐，以及以其为有效成分的胶原酶活性亢进所致疾病的防治药物。更具体地说，是涉及以下式(I)
Figure C9419305500031
(式中R1表示氢原子、甲基、甲氨基甲基或4-吗啉基甲基，R2表示氢原子、羟基、氟原子或含1-4个碳原子的直链或支链烷基，R3表示含1-4个碳原子的直链或支链烷基)表示的新型酰基苯基甘氨酸衍生物或其药学上容许的盐，以及以其为有效成分的胶原酶活性亢进所致疾病的防治药物。
                  背景技术
胶原酶是与结缔组织基质的代谢有关的酶，该酶活性的亢进被认为是关节疾病、骨吸收疾病、牙周疾病、角膜溃疡、大疱性表度松解等种种疾病的主要原因。
例如Gravallese E.M.等报道〔Arthritis Rheum.，34(9)，1076(1991)〕慢性关节风湿病、变形性关节病等关节疾病时胶原酶活性均亢进。
骨吸收疾病是骨形成与骨吸收引起的骨再塑造过程偏向骨吸收所致的疾病，已知有高钙血症、骨质疏松症等。对这些疾病的骨吸收亢进，以前所注意的是组织蛋白酶L等半胱氨酸蛋白酶的参与，但近年Everts V.等的报道〔J.Cell.Physiol.150，221(1992)〕认为胶原酶也参与此过程。
由于对胶原酶有抑制活性的化合物有可能成为胶原酶活性亢进的疾病的治疗药，因而研究了种种具有胶原酶抑制活性的化合物(例如，日本专利公开公报昭62-103052号，专利公开公报昭62-230757号，专利公开公报平4-502008，美国专利5114953号等)。然而体内给药后血中抑制活性不能充分维持，因此希望开发给药后在体内能长时间维持高度的胶原酶抑制活性的化合物。
              发明的揭示
本发明的目的是提供给药后在体内能长时间维持高度的胶原酶抑制活性的新型化合物以及以这类化合物为有效成分的防治起因于胶原酶活性亢进的疾病的防治药物。
本发明者进行种种研究的结果，发现下式(I)(式中，R1表示氢原子、甲基、甲氨基甲基或4-吗啉基甲基，R2表示氢原子、羟基、氟原子或含1-4个碳原子的直链或支链烷基，R3表示含1-4个碳原子的直链或支链烷基)表示的酰基苯基甘氨酸衍生物或其药学上容许的盐能达到上述目的，从而完成了本发明。
在本说明书中，含1-4个碳原子的直链或支链烷基可举出甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基或叔丁基等例子。
在本发明的化合物中，上式(I)中R1及R3均为甲基、R2为氢原子的酰基苯基甘氨酸衍生物或其药学上容许的盐，在体内具有优良活性，特别令人满意。
在前述式(I)中R1为甲基、甲氨基甲基或4-吗啉基甲基的化合物中存在着下式
Figure C9419305500051
(式中，R1，R2及R3定义如上)表示的由不对称碳原子①、②和③引起的立体异构体，在R1为氢原子的化合物中存在由不对称碳原子①和②引起的立体异构体，本发明的化合物包括这些立体异构体及其混合物。这些立体异构体中不对称碳原子①上立体构型为(S)、不对称碳原子②上立体构型为(R)的化合物活性较强，令人满意。
作为本发明化合物(I)的具体实例，可举出下面这些。
〔4-(N-羟基氨基)-2(R)-异丁基琥珀酰〕-L-苯基甘氨酸-N-甲基酰胺
〔4-(N-羟基氨基)-2(R)-异丁基琥珀酰〕-L-对羟基苯基甘氨酸-N-甲基酰胺
〔4-(N-羟基氨基)-2(R)-异丁基-3(R)-(4-吗啉基甲基)琥珀酰〕-L-苯基甘氨酸-N-甲基酰胺
〔4-(N-羟基氨基)-2(R)-异丁基-3(S)-(4-吗啉基甲基)琥珀酰〕-L-苯基甘氨酸-N-甲基酰胺
〔4-(N-羟基氨基)-2(R)-异丁基-3(R)-甲基琥珀酰〕-L-苯基甘氨酸-N-甲基酰胺
〔4-(N-羟基氨基)-2(R)-异丁基-3(S)-甲基琥珀酰〕-L-苯基甘氨酸-N-甲基酰胺
〔4-(N-羟基氨基)-2(R)-异丁基-3(R)-甲氨基甲基琥珀酰〕-L-苯基甘氨酸-N-甲基酰胺
〔4-(N-羟基氨基)-2(R)-异丁基-3(S)-甲氨基甲基琥珀酰〕-L-苯基甘氨酸-N-甲基酰胺
〔4-(N-羟基氨基)-2(R)-异丁基琥珀酰〕-L-(p-异丙基苯基)甘氨酸-N-甲基酰胺
〔4-(N-羟基氨基)-2(R)-异丁基琥珀酰〕-L-苯基甘氨酸-N-乙基酰胺。
尤其是〔4-(N-羟基氨基)-2(R)-异丁基-3-甲基琥珀酰〕-L-苯基甘氨酸-N-甲基酰胺(实施例5的化合物)在体内活性优异，特别令人满意。
本发明化合物(I)的药学上容许的盐，可列举钠盐、钾盐、钙盐等金属盐。而R1为甲氨基甲基或4-吗啉基甲基的化合物，可列举与盐酸、硝酸等无机酸形成的盐，或者与富马酸、马来酸、甲磺酸等有机酸形成的盐。
本发明化合物(I)及其药学上容许的盐可用下列(A)法制备
(A)法
Figure C9419305500071
(式中，Bzl表示苄基，R4表示氢原子、甲基、N-苄基-N-甲基氨基甲基或4-吗啉基甲基，R1、R2及R3的定义同前。)
即本发明化合物(I)或其药学上容许的盐可通过化合物(II)的氢解而制备。化合物(II)的氢解，通常在甲醇、乙醇等低级醇中，必要时加水、盐酸、乙酸、N，N-二甲基甲酰胺(以下简称DMF)等，在10％钯炭等催化剂存在下，在氢气流中或加压下于室温至60℃温度下进行。
光学活性的化合物(I)可用光学活性的原料化合物(II)氢解而制得。此外，使化合物(II)的非对映异构体混合物氢解制得(I)后，以结晶化或各种色谱[高效液相色谱(HPLC)、制备型薄层色谱(P.TLC)等]手段进行分离，也可制备光学活性的化合物(I)。
本发明的化合物(I)中，R1为甲基的化合物(Ia)也可用下列(B)法制备。
(B)法(式中，Bzl，R2、R3定义同前)即使化合物(III)催化还原可得化合物(Ia)。化合物(III)的催化还原反应可使用与上述(A)法表示的氢解同样的条件。
(B)法中光学活性的化合物(Ia)可通过光学活性的原料化合物(III)进行反应，并将所得非对映异构体混合物(Ia)用前述方法分离获得。
用以上的方法(A法或B法)得到的本发明的化合物(I)可用常法转化成药学上容许的盐。
下面说明上述(A)法及(B)法所用原料化合物的制备方法。
可按以下方法制备前述(A)法所用的原料化合物(II)中R4为氢原子的化合物(IIa)。
Figure C9419305500081
(式中，Bzl、R2、R3的定义同前)
即，首先将已知的酸酐(V)与当量的O-苄基羟胺在乙醚、四氢呋喃(以下简写作THF)或它们的混合溶剂中于-78-0℃反应1-5小时，得化合物(VI)。
然后，使化合物(VI)与氨基物(IV)缩合。该缩合反应，可在DMF、THF或二氯甲烷等非质子溶剂中利用合成肽时常用的缩合剂如二环己基碳化二亚胺(以下简称DCC)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(以下简称WSC)等进行。反应通常在0℃至室温下进行2-24小时。进行反应的化合物的摩尔比，氨基物(IV)1mol通常用化合物(VI)0.8-1.5mol，缩合剂1.0-1.5mol。
化合物(VI)与氨基物(IV)的缩合还可用混合酸酐法进行。这时，将化合物(VI)溶解于同上所述非质子溶剂中。加当量三乙胺和N-甲基吗啉等叔胺后，最好于-20-5℃下加入氯甲酸乙酯等氯碳酸酯或新戊酰氯等酰氯，制备混合酸酐。然后加氨基物(IV)，最好于0℃至室温下反应2-8小时，可制得目的化合物(IIa)。该反应中，通常1mol氨基酸(IV)使用化合物(VI)0.8-1.2mol、氯碳酸酯或酰氨1.0-1.2mol。
光学活性化合物(IIa)可通过将光学活性的化合物(VD与由D-或L-苯基甘氨酸制得的光学活性氨基物(IV)进行反应而制得。光学活性的化合物(VI)可用辛可尼定或D-1-苯基乙胺等光学活性胺作拆分剂按常法将用前述方法制得的(VI)的外消旋混合物拆分而得。
可按以下方法制得前述(A)法所用的原料化合物(II)中R4为甲基、N-苄基-N-甲基氨基甲基或4-吗啉基甲基的化合物(IIb)。(式中R5表示甲基、N-苄基-N-甲基氨基甲基或4-吗啉基甲基，R6表示N-苄基-N-甲基氨基甲基或4-吗啉基甲基，TFA表示三氟乙酸，Bzl、R2、R3的定义同前)。
即先使丙二酸二苄酯在DMF中并在叔丁醇钾存在下按常法与2-溴-4-甲基戊酸叔丁酯(可由已知的2-溴-4-甲基戊酸按常法与2-甲基丙烯反应而制得)反应，得到的叔丁酯用三氟乙酸进行酸分解，得到羧酸衍生物(VII)。
然后将羧酸衍生物(VII)与氨基物(IV)按上述用缩合剂的方法或混合酸酐法进行缩合。再将所得的二苄酯(VIII)氢解，所得的二羧酸与甲醛反应，即得α-亚甲基羧酸衍生物(IX)。二苄酯(VIII)的氢解反应条件除上述化合物(II)的氢解条件之外，还有用甲酸、甲酸铵等作为氢源，在10％钯炭、阮内镍等还原催化剂的存在下进行反应的方法。二羧酸与甲醛的反应，理想的方法是将二羧酸与等摩尔的碱(例如哌啶等)和大大过量、最好是5-6倍摩尔量的甲醛的水溶液混和，于室温下搅拌过夜，然后再加热回流1-2小时。
再使化合物(IX)与N-苄基甲胺或吗啉反应，得到(X)中R5为N-苄基-N-甲基氨基甲基或4-吗啉基甲基的化合物Xa。该反应最好在THF等溶剂中或不用溶剂、使用等摩尔至30倍摩尔的N-苄基甲胺或吗啉、于室温-100℃下进行数小时至24小时。
此外，也可使用化合物(IX)苄酯化形成化合物(XI)，再使N-苄基甲胺或吗啉与之反应得化合物(XII)之后将化合物(XII)氢解，制得化合物Xa。
另一方面，式(X)中R5为甲基的化合物Xb可由化合物(IX)催化还原而得到。这一场合，可采用与前述(B)法中的催化还原相同的反应条件。
最后，将化合物(X)与O-苄基羟胺用前述以DCC或WSC等为缩合剂的方法或混合酸酐法缩合，得到前述式(II)中R4为甲基、N-苄基-N-甲基氨基甲基或4-吗啉基甲基的化合物即化合物(IIb)。
为得到光学活性化合物(IIb)，可先用光学活性羧酸(VII)与光学活性氨基物(IV)制备光学活性化合物(IX)。然后经还原反应或与吗啉或N-苄基甲胺反应，得化合物(X)的非对映异构体混合物。其后经结晶化或HPLC等手段分离目的立体异构体，再与O-苄基羟胺缩合，得光学活性化合物(IIb)。另外，化合物(X)的非对映异构体混合物可直接与O-苄基羟胺缩合，所得的化合物(IIb)的非对映异构体混合物用上述手段分离，也能得到光学活性化合物(IIb)。
可从前述化合物(IX)按下法制备(B)法所用的原料化合物(III)。
即与前述化合物(X)与O-苄基羟胺缩合的情况相同，可从化合物(IX)与O-苄基羟胺用缩合剂或用混合酸酐法缩合，得到化合物(III)。
光学活性化合物(III)可用化合物(IX)的光学活性异构体与O-苄基羟胺反应容易地制得。
本发明的化合物(I)或其药学上容许的盐，可经口或非经口给予。
口服给药的剂型除片剂、颗粒剂、散剂、细粒剂、硬胶囊剂等固体制剂之外，还包括糖浆剂、软胶囊剂等液体剂型。
这些制剂可用常法制备。片剂、颗粒剂、散剂或细粒剂，可将本发明的化合物(I)或其药学上容许的盐，与乳糖、淀粉、结晶纤维素、硬脂酸镁、羟丙基纤维素、滑石粉等常用的药品添加剂混合而制得，硬胶囊剂可在适当的胶囊中充填上述细粒剂或散剂而制得。
另外，可将本发明的化合物(I)或其药学上容许的盐溶解或悬浮于含蔗糖、羧基纤维素的水溶液中制成糖浆剂；可将本发明的化合物(I)或其药学上容许的盐溶解或悬浮于脂质赋形剂如植物油、油性乳剂、乙二醇等中，再填充软胶囊而制成软胶囊剂。
非经口给药的剂型，除注射剂之外，可举出栓剂、阴道栓等及气雾剂等经鼻给药的剂型等。
这些制剂可用常法制备，例如将本发明的化合物(I)或其药学上容许的盐在生理盐水或脂质赋形剂如植物油、油性乳剂、乙二醇等中溶解或乳化，封入无菌安瓿或小瓶，可制成注射剂。
本发明的化合物(I)或其药学上容许的盐的给药量因患者年龄、性别、体重或症状等而异，一般按化合物(I)计为0.1-200mg/kg体重/日，较好是1-100mg/kg体重/日，该剂量可1次或分2-4次给药。
本发明的化合物在给药后能在体内长时间地显示很强的胶原酶抑制活性，口服吸收也良好。这些已在动物试验中得到证实(参见下述试验例1和2)。
以红细胞沉降率和足跖浮肿(未接种佐剂的足跖的容积增加)为指标，用佐剂性关节炎模型研究了对关节炎的效果，证明本发明的化合物具有优良的效果(参见下述试验例3)。然后，也证实其对作为骨吸收的指标的尿中羟脯氨酸(对肌酸酐的比值)以及血清钙浓度上升具有抑制作用(参见下述试验例3)。
此外，对饲以缺钙饮食的大白鼠给予本发明的化合物，以尿中羟脯氨酸量(对肌酸酐的比值)作为指标，探讨对骨吸收的抑制作用，发现本发明的化合物能使尿中羟脯氨酸量(对肌酸酐的比值)降低(参见下述试验例4)。
另一方面，本发明的化合物毒性很低。例如，给小白鼠口服实施例5的化合物(3000mg/kg体重)，仍未见死亡例。
因此，本发明的化合物(I)或其在药学上容许的盐，作为胶原酶亢进所致疾病如慢性关节风湿病、变形性关节病等关节疾患、对高钙血症、骨质疏松症等骨吸收性疾患的预防和治疗药物是有用的。
以下描述的试验例，详细说明本发明的作用与效果。
〔试验例1〕胶原酶活性的抑制率(使用小鼠)
1.供试化合物
化合物A〔4-(N-羟基氨基)-2(R)-异丁基琥珀酰〕-L-苯基甘氨酸-N-甲基酰胺(实施例1的化合物)
化合物B〔4-(N-羟基氨基)-2(R)-异丁基琥珀酰〕-L-(p-羧基苯基)甘氨酸-N-甲基酰胺(实施例2的化合物)
化合物C〔4-(N-羟基氨基)-2(R)-异丁基-3-(4-吗啉基甲基)琥珀酰〕-L-苯基甘氨酸-N-甲基酰胺盐酸盐(实施例4的化合物)
化合物D〔4-(N-羟基氨基)-2(R)-异丁基-3-甲基琥珀酰〕-L-苯基甘氨酸-N-甲基酰胺(实施例5的化合物)
化合物E〔4-(N-羟基氨基)-2(R)-异丁基-3-(甲氨基甲基)琥珀酰〕-L-苯基甘氨酸-N-甲基酰胺(实施例6的化合物)
化合物F〔4-(N-羟基氨基)-2(R)-异丁基琥珀酰〕-L-苯基甘氨酸-N-乙基酰胺(实施例7的化合物)
化合物G〔4-(N-羟基氨基)-2(R)-异丁基琥珀酰〕-L-(p-氟苯基)甘氨酸-N-甲基酰胺(实施例8的化合物)
化合物H〔4-(N-羟基氨基)-2(R)-异丁基琥珀酰〕-L-(p-异丙基苯基)甘氨酸-N-甲基酰胺(实施例9的化合物)
已知化合物X〔4-(N-羟基氨基)-2(R)-异丁基琥珀酰〕-L-O-甲基酪氨酸-N-甲基酰胺(日本专利公开公报昭62-103052号记载的化合物)
已知化合物Y〔4-(N-羟基氨基)-2(R)-异丁基-3(S)-(2-噻吩基)硫代甲基琥珀酰〕-L-苯丙氯酸-N-甲基酰胺(日本专利公开公报平4-502008记载的化合物)
已知化合物Z〔4-(N-羟基氨基)-2(R)-异丁基琥珀酰〕-L-色氨酸-N-甲基酰胺(美国专利5114953号公报记载的化合物)
2.试验方法
将供试化合物悬浮于0.5％CMC，给一组3只小白鼠口服(供试化合物的给药量30mg/kg)经一定时间后在肝素存在下自腹部大静脉采血，以冰冷却。将它在4℃以10,000rpm离心分离5分钟，得血浆。在此血浆400μ1中加蒸馏水60μl，于100℃加热10分钟。冷却后以10,000rpm离心分离5分钟，然后以微量超滤装置(Molcut II，Millipore)过滤，作为测定腹原酶活性的样品(A)。用此样品按下列测定法求得对血中胶原酶活性的抑制率。
将上述样品(A)与溶于测定用缓冲液(含0.2M氯化钠、5mM氯化钙、0.05％Brij-35及0.02％迭氮化钠的50mM Tris-盐酸缓冲液，pH7.5)的已知量胶原酶(使用按日本专利公开公报平3-103178号记载的方法制得的胶原酶)的溶液混合。以荧光素异硫氰酸酯标记的I型胶原作为底物，按永井等的方法〔Japanese Journalof Inflammation，4，123(1984)〕测定胶原酶活性A。另一方面从不给供试化合物的小白鼠采血，对经同样处理的样品(B)用同样的方法测定胶原酶活性B，按下式求得抑制率：
Figure C9419305500161
3.结果
口服1小时后及3小时后对血中胶原酶活性的抑制率以表1表示。
表  1
口服后对血中胶原酶活性的抑制率(％)
供试化合物 1小时后 3小时后
  化合物A化合物B化合物C化合物D化合物E化合物F化合物G化合物H已知化合物X已知化合物Y已知化合物Z     8884758782898374601458     8362647661536463432151
〔试验例2〕胶原酶活性抑制率(用大白鼠)
1.供试化合物
化合物A〔4-(N-羟基氨基)-2(R)-异丁基琥珀酰〕-L-苯基甘氨酸-N-甲基酰胺(实施例1的化合物)
已知化合物X〔4-(N-羟基氨基)-2(R)-异丁基琥珀酰〕-L-O-甲基酪氨酸-N-甲基酰胺(日本专利公开公报昭62-103052号记载的化合物)
2.试验方法
除以大白鼠代替小白鼠、且供试化合物的给药量为100mg/kg之外，与试验例1相同。
3.试验结果
口服后1小时、3小时和6小时时血中胶原酶活性的抑制率以表2表示。
表2
    口服后血中胶原酶活性的抑制率(％)
  供试化合物 1小时后 3小时后 6小时后
    化合物A已知化合物X   10045   9144   6433
〔试验例3〕关节炎模型试验
1.供试化合物
化合物D〔4-(N-羟基氨基)-2(R)-异丁基-3-甲基琥珀酰〕-L-苯基甘氨酸-N-甲基酰胺(实施例5的化合物)。
已知化合物Y〔4-(N-羟基氨基)-2(R)-异丁基-3(S)-(2-噻吩基)硫代甲基琥珀酰〕-L-苯丙氨酸-N-甲基酰胺(日本专利公开公报平4-502008号记载的化合物)。
2.试验方法及评价指标
8周龄的雄性Lewis系大白鼠〔日本Charles River(公司)〕分成4组，每组7只(正常对照组及对照组各1组，供试化合物组2组)。对照组及供试化合物给药组的大白鼠其右足跖皮内每只接种含0.6mg加热灭活丁酸分枝杆菌(M.butyricum)的液体石蜡悬浮液0.1ml，引起佐剂性关节炎。将供试化合物悬浮于0.5％CMC，按100mg/kg的比例，于接种佐剂后立即并于其后每12小时给予供试化合物组大白鼠，共20日。对照组大白鼠于接种佐剂后立即并于其后每12小时给予0.5％CMC，共20日。正常对照组的大白鼠，不接种佐剂，而与给予供试化合物相应地只给予5％CMC。
评价指标及其测定方法如下。
1)足跖的容积
于即将接种佐剂之前及接种后第3、7、10、14、17及20日，用足容积测定装置测定足跖容积。用t检验法作供试化合物给药组与对照组的显著性测验。
2)红细胞沉降率
于第21日采全血作为样品。用红细胞沉降率测定装置(松吉式血沉台)测定，用Dunnett法作供试化合物给药组与对照阻的显著性测验。
3)血清钙浓度
对上述2)同一样品用钙试剂(和光纯药)进行测定，用Dunnett法作供试化合物给药组与对照组的显著性测验。
4)尿中羟脯氨酸
第20日末次给予供试化合物后将大白鼠移入代谢笼，在禁食、禁水下采集一夜的尿作为样品。用以下方法测定尿量、肌酸酐及羟脯氨酸，计算尿中羟脯氨酸的量对肌酸酐的比值，用Tukey法作供试化合物给药组与对照组的显著性测验。肌酸酐的测定采用肌酸酐试剂(和光纯药)。羟脯氨酸的测定是以6N盐酸水解尿液后以高速液相色谱仪用离子交换柱(日立凝胶#2619)进行分离。并与邻苯二醛反应生成羟脯氨酸衍生物后用荧光光度计进行测定。
4.试验结果
1)足跖容积
图1表示未接种佐剂的足跖其容积的经时变化。图中曲线n、c、y、d分别表示以下各组的足跖容积。
n：正常组
c：对照组
y：已知化合物Y给药组
d：化合物D给药组
另外，用t检验法作供试化合物给药组与对照组的显著性测验。其结果用符号*或**表示。
*P＜0.05               **P＜0.01
化合物D能抑制接种佐剂所致未接种足跖浮肿(容积增加)。
2)红细胞沉降率
表3表示红细胞沉降率。
     表3
   分组      红细胞沉降率(mm/小时)
  正常对照组        1±0.1
对照组              33±2
化合物D给药组       20±2**
化合物Y给药组       30±3
**P＜0.01(与对照组比较)
化合物D能显著抑制接种佐剂所致红细胞沉降率的增加，而化合物Y则未发现此种效果。
3)血清钙浓度
表4表示血清钙浓度。
    表    4
 分组       血清钙浓度(mg/dl)
正常对照组       8.6±0.1
对照组           9.5±0.1
化合物D给药组    8.9±0.1**
化合物Y给药组    9.6±0.1
**P＜0.01(与对照组比较)
化合物D能显著抑制血清钙浓度的增加，而化合物Y则未发现此种效果。
4)尿中羟脯氨酸
表5表示尿中羟脯氨酸的测定结果(与肌酸酐的比值)。
   表    5
 分组        尿中羟脯氨酸的量
              (μg/mg肌酸酐)
正常对照组      71.8±2.6
对照组          94.3±1.8
化合物D给药组   78.4±6.1
化合物Y给药组   107.1±6.5化合物D显示出抑制尿中羟脯氨酸增加的倾向。〔试验例4〕骨吸收抑制试验
1.供试化合物
化合物D〔4-(N-羟基氨基)-2(R)-异丁基-3-甲基琥珀酰〕-L-苯基甘氨酸-N-甲基酰胺(实施例5的化合物)
已知化合物Y〔4-(N-羟基氨基)-2(R)-异丁基-3(S)-(2-噻吩基)硫代甲基琥珀酰〕-L-苯丙氨酸-N-甲基酰胺(日本专利公开公报平4-502008号记载的化合物)
2.试验方法
6周龄Wister系雄性大白鼠〔日本SLC(株)〕于开始饲以缺钙饮食(Oriental酵母(株)、钙0.0105～0.012％、磷0.62％)后第6日经口给予化合物D或化合物Y的0.5％CMC悬浮液(100mg/kg)，此后立即禁食但任其自由饮水共16小时并采尿，按试验例3记载的方法测定尿量、尿中羟脯氨酸及肌酸酐，计算尿中羟脯氨酸对肌酸酐的比值。用Tukey法作供试化合物给药组与对照组的显著性测验。
4.试验结果
表6表示尿中羟脯氨酸对肌酸酐的比值。
表    6
分组         尿中羟脯氨酸
             (μg/mg肌酸酐)
正常对照组      134±7
对照组          174±7
化合物D给药组   144±5*
化合物Y给药组   161±3
*P＜0.05(与对照组比较)
与正常对照组比较，对照组尿中羟脯氨酸对肌酸酐的比值显著增加。化合物Y几乎不抑制其增加，而化合物D与对照组相比有显著抑制作用。
附图的简单说明
图1表示佐剂性关节炎预防试验(试验例3)中未接种佐剂的足其容积的经时变化。
实施发明的最佳方式
以下列举参考例、实施例，更详细地对本发明进行说明。
参考例1
〔4-(N-苄氧基氨基)-2(R)异丁基琥珀酰〕-L-苯基甘氨酸-N-甲基酰胺〔通式(IIa〕中R2为氢原子、R3为甲基的化合物的旋光异构体〕的制备
(1)4-(N-苄氧基氨基)-2(R)-异丁基琥珀酸：
将二氢-3-(RS)-(2-甲基丙基)-2，5-呋喃二酮124g溶于乙醚400ml中，于0℃滴加128g盐酸O-苄基羟胺经碳酸钾中和的乙醚溶液400ml。搅拌3.5小时后，滤取生成的白色固体。以乙醚与乙酸乙酯的混合溶剂(乙醚/乙酸乙酯＝2/1)300ml洗涤，得4-(N-苄氧基氨基)-2(RS)-异丁基琥珀酸98.6g。
然后将得到的4-(N-苄氧基氨基)-2(RS)-异丁基琥珀酸98.6g溶于DMF 2000ml。另将D-1-苯基乙胺42.8g溶于DMF1000ml后加入，并于室温下放置过夜，所得结晶再用DMF2000ml重结晶。所得结晶中加入2N盐酸600ml，以乙酸乙酯500ml提取，水洗后以硫酸镁干燥。减压蒸去溶剂，即得4-(N-苄氧基氨基)-2(R)-异丁基琥珀酸30.5g。
熔点93～95℃
〔α〕D＝+21°(c＝0.5，MeOH)
1H-NMR(DMSO-d6)δ：0.85(6H，t)，1.12～1.22(1H，m)，1.37～1.60(2H，m)，2.05(1H，dd)，2.24(1H，dd)，2.64～2.73(1H，m)，4.76(2H，s)，7.38(5H，s)，11.0(1H，s)，12.2(1H，s)。
(2)N-苄氧羰基-L-苯基甘氨酸-N-甲基酰胺：
将N-苄氧羰基-L-苯基甘氨酸35.2g及三乙胺14.9g溶于THF 900ml，在冰浴冷却下滴加氯甲酸乙酯16.0g，于5～6℃搅拌约30分钟，制备混合酸酐。然后加入40％甲胺的甲醇溶液28.7g，于冰浴冷却下搅拌2小时。滤除不溶物，溶液中加入乙酸乙酯，依次用1N盐酸、饱和碳酸氢钠水溶液和水洗涤。乙酸乙酯层以无水硫酸镁干燥。减压蒸除溶剂。残渣用正己烷与乙醚的混合溶剂洗涤。得N-苄氧羰基-L-苯基甘氨酸-N-甲基酰胺33.3g(收率90.7％)。
1H-NMR(DMSO-d6)δ：2.55(3H，d)，4.98(2H，s)，5.16(1H，d)，7.2～7.5(10H，m)，7.6～7.4(1H，m)，7.95-8.2(1H，d)。
(3)〔4-(N-苄氧基氨基)-2(R)-异丁基琥珀酰〕-L-苯基甘氨酸-N-甲基酰胺：
将N-苄氧羰基-L-苯基甘氨酸-N-甲基酰胺27g溶于甲醇400ml，加10％Pd/C 500mg，在3～4kg/cm2的氢气下进行催化还原。然后滤除催化剂，进行减压浓缩，得油状的L-苯基甘氨酸-N-甲基酰胺。将此油状物溶于DMF 400ml，加4-(N-苄氧基氨基)-2(R)-异丁基琥珀酸24.4g、WSC 17.8g，于室温下搅拌过夜。将减压浓缩得到的残渣溶于氯仿1L，依次用0.1N盐酸、饱和碳酸氢钠溶液、食盐水溶液洗涤，以无水硫酸钠干燥。蒸除氯仿，将所得固体用乙酸乙酯/甲醇的混合溶剂重结晶，得无色结晶29g(收率73％)。
熔点230～232℃。
1H-NMR(DMSO-d6)δ：0.82(3H，d，J＝6.3Hz)，0.87(3H，d，J＝6.3Hz)，1.0～1.1(1H，m)，1.35～1.55(2H，m)，1.97(1H，dd，J＝7，14.4Hz)，2.13(1H，dd，J＝7.4，14.4Hz)，2.57(3H，d，J＝4.5Hz)，2.8～2.95(1H，m)，4.66(1H，d，J＝11Hz)，4.71(1H，d，J＝11Hz)，5.38(1H，d，J＝7.8Hz)，7.2～7.4(5H，m)，8.13(1H，g，J＝4.5Hz)，8.45(1H，d，J＝7.8Hz)，10.9(1H，s)。
IR(KBr)cm-1：3292，3224，2960，1660，1646，1566，1538.
元素分析(C24H31N3O4)：
计算值(％)C67.74；H7.34；N9.87。
实测值(％)C67.49；H7.25；N9.73。
参考例2
〔4-(N-苄氧基氨基)-2(R)-异丁基琥珀酰〕-L-(p-羟基苯基)甘氨酸-N-甲基酰胺〔通式(IIa)中R2为羟基、R3为甲基的化合物的旋光异构体〕的制备。
将4-(N-苄氧基氨基)-2(R)-异丁基琥珀酸1.3g、L-(p-羟基苯基)甘氨酸-N-甲基酰胺0.7g(以日本专利公开公报昭54-84546号记载的方法制备)溶于DMF20ml，在冰浴冷却和搅拌下加WSC0.54g，于室温下搅拌过夜。在减压浓缩得到的残渣中加入氯仿15ml，0.1N盐酸15ml，搅拌，滤取析出的固体，然后以THF和正己烷的混合溶剂重结晶，得无色结晶0.54g(收率24.8％)。
1H-NMR(DMSO-d6)δ：0.81(3H，d，J＝6.3Hz)，0.86(3H，d，J＝6.3Hz)，1.0～1.1(1H，m)，1.35～1.55(2H，m)，1.96(1H，dd，J＝7.145Hz)，2.12(1H，dd，J＝7.3，14.5Hz)，2.56(3H，d，J＝4.5Hz)，2.6～2.7(1H，m)，4.68(1H，d，J＝10.9Hz)，4.72(1H，d，J＝10.9Hz)，5.25(1H，d，J＝7.7Hz)，6.67(2H，d，J＝8.5Hz)，7.16(2H，d，J＝8.5Hz)，7.36(5H，s)，7.97(1H，q，J＝4.5Hz)8.28(1H，d，J＝7.8Hz)，9.34(1H，s)，10.96(1H，s)。
参考例3
〔4-(N-苄氧基氨基)-2(R)-异丁基-3-(4-吗啉基甲基)琥珀酰〕-L-苯基甘氨酸-N-甲基酰胺〔通式(IIb)中R2为氢原子、R3为甲基、R5为4-吗啉基甲基的化合物的旋光异构体(非对映异构体a′)〕的制备
(1)2(R)-溴-4-甲基戊酸叔丁酯：
将2(R)-溴-4-甲基戊酸(从D-亮氨酸制得)33g溶于二氨甲烷100ml，于-40℃搅拌下通入2-甲基丙烯47g，加硫酸0.8ml，于室温下搅拌过夜。将反应液减压浓缩至1/2体积，然后以10％碳酸钠水溶液洗涤，以无水硫酸镁干燥。再减压浓缩得2(R)-溴-4-甲基戊酸叔丁酯37.4g。
〔α〕D＝+29°(c＝2，MeOH)
1H-NMR(CDCl3)δ：0.92(3H，d)，0.95(3H，d)，1.45(9H，s)，1.7～2.0(3H，m)，4.18(1H，t)。
(2)2-苄氧羰基-3(R)-羟基羰基-5-甲基己酸苄酯：
将丙二酸二苄酯68g溶于DMF 500ml，于冰浴冷却和搅拌下逐渐加入叔丁醇钾26.5g。然后于0℃下经1小时滴入2(R)-溴-4-甲基戊酸叔丁酯54.5g溶于MDF100ml的溶液，再在0～5℃下搅拌4日。在反应液中加入乙酸乙酯500ml，饱和氯化铵水溶液300ml，充分搅拌后，分取有机层，水层用乙酸乙酯500ml再次提取。将有机层合并，用食盐水溶液洗涤，以无水硫酸镁干燥后，进行减压浓缩，得到油状物。将它以硅胶中压液相色谱法(正己烷/乙酸乙酯＝30/1)分离精制，得2-苄氧羰基-3(R)-叔丁氧羰基-5-甲基己酸苄酯48.9g。
然后将此2-苄氧羰基-3(R)-叔丁氧羰基-5-甲基己酸苄酯23.2g溶于95％三氟乙酸水溶液75ml，于室温下搅拌过夜。减压蒸除三氟乙酸，将残渣溶于二氯甲烷100ml，以饱和食盐水洗涤，以无水硫酸镁干燥。将减压浓缩得到的糖浆状物溶于乙醚70ml，加正己烷200ml，滤除析出的结晶，滤液减压浓缩，得2-苄氧羰基-3(R)-羟基羰基-5-甲基己酸苄酯12.5g。
〔α〕D＝+30°(c＝2，MeOH)
1H-NMR(DMSO-d6)δ：0.77(6H，d，J＝6.4Hz)，1.0～1.1(1H，m)，1.4～1.6(2H，m)，2.8～3.0(1H，m)，3.71(1H，d，J＝10Hz)，5.09～5.25(2H，m)，7.2～7.4(10H，m)。
(3)〔4-苄氧基-3-苄氧羰基-2-(R)-异丁基琥珀酰〕-L-苯基甘氨酸-N-甲基酰胺〔通式(VIII)中R2为氢原子、R3为甲基的化合物的旋光异构体〕：
将4-苄氧基-3-苄氧羰基-2(R)-异丁基琥珀酸23g、L-苯基甘氨酸-N-甲基酰胺10.3g溶于DMF 100ml，于冰浴冷却下加入N-羟基苯并三唑10.6g、4-二甲氨基吡啶3.6g、WSC13.3g，于室温下搅拌过夜。将反应混合物减压浓缩，所得残渣溶于乙酸乙酯800ml，以水、0.1％盐酸、饱和碳酸氢钠水溶液、饱和食盐水溶液洗涤，以无水硫酸镁干燥后，减压浓缩，得〔4-苄氧基-3-苄氧羰基-2(R)-异丁基琥珀酰〕-L-苯基甘氨酸-N-甲基酰胺无色结晶(26.6g，收率95％)。
1H-NMR(DMSO-d6)δ：0.75(3H，d，J＝6.5Hz)，0.82(3H，d，J＝6.4Hz)，1.0～1.1(1H，m)，1.4～1.6(2H，m)，2.56(3H，d，J＝4.6Hz)，3.2～3.35(1H，m)，3.67(1H，d，J＝10Hz)，4.95(2H，s)，5.07(1H，d，J＝12.4Hz)，5.16(1H，d，＝12.4Hz)，5.39(1H，d，J＝7.7Hz)，7.15～7.45(15H，m)，8.11(1H，q，J＝4.6Hz)，8.74(1H，d，J＝7.7Hz)。
(4)〔4-羟基-2(R)-异丁基-3-亚甲基琥珀酰〕-L-苯基甘氨酸-N-甲基酰胺〔通式(IX)中R2为氢原子、R3为甲基的化合物的旋光异构体〕：
将上述(3)所得化合物26g溶解于乙醇600ml，加甲酸铵20g、10％Pd/C 6g，于室温下搅拌1.5小时。滤除Pd/C，所得滤液中加哌啶5.2g，搅拌30分钟后，加甲醛水溶液(37％)32.7ml，于室温下搅拌18小时，其后再加热回流1.5小时。减压浓缩，所得残渣溶于10％柠檬酸水溶液500ml，以乙酸乙酯提取(500ml×5次)。然后以10％碳酸钾水溶液提取有机层(300ml×3次)，用稀盐酸调节所得提取液的pH至4，以二氯甲烷提取(400ml×5次)。将提取液合并，以无水硫酸镁干燥后，减压浓缩，得〔4-羟基-2(R)-异丁基-3-亚甲基琥珀酰〕-L-苯基甘氨酸-N-甲基酰胺的无色结晶性粉末(12.3g，收率69％)。
1H-NMR(DMSO-d6)δ：0.83(3H，d，J＝6.4Hz)，0.88(3H，d，J＝6.4Hz)，1.3～1.7(1H，m)，1.4～1.6(2H，m)，2.57(3H，d，J＝4.6Hz)，3.6～3.7(1H，m)，5.37(1H，d，J＝7.8Hz)，5.6(1H，s)，6.1(1H，s)，7.2～7.4(5H，m)，8.16(1H，q，J＝4.6Hz)，8.33(1H，d，J＝7.8Hz)，12.6(1H，bs)。
(5)〔4-羟基-2(R)-异丁基-3(RS)-(4-吗啉基甲基)琥珀酰〕-L-苯基甘氨酸-N-甲基酰胺〔通式(X)中R2为氢原子、R3为甲基、R5为4-吗啉基甲基的化合物的非对映异构体混合物〕：
在上述(4)所得结晶12g中加吗啉100ml，于40～45℃下搅拌2日。减压浓缩，所得残渣溶于5％碳酸氢钠水溶液300ml，以乙醚洗涤。水层以稀盐酸调节pH至1，将溶剂量减压浓缩1/5～1/6体积后，以氯仿提取(300ml×5次)。提取液以无水硫酸镁干燥后，减压浓缩，得〔4-羟基-2(R)-异丁基-3(RS)-(4-吗啉基甲基)琥珀酰〕-L-苯基甘氨酸-N-甲基酰胺盐酸盐(由于3位不对称碳原子而形成2种非对映异构体的混合物)11.6g(收率70％)。
为分析的目的，将微量非对映异构体混合物用下述条件的HPLC进行分离，1个非对映异构体显示下列NMR谱。HPLC条件  柱：GL Science公司Inertsil ODS-2(4.6×150mm)
流动相：0.1％TFA水溶液∶乙腈＝7∶3
流速：1ml/分
1H-NMR(DMSO-d6)δ：0.84(3H，d，J＝6.5Hz)，0.90(3H，d，J＝6.4Hz)，1.1-1.2(1H，m)，1.45-1，65(2H，m)，2.57(3H，d，J＝4.6Hz)，2.9-3.15(7H，m)，3.16-3.9(5H，m)，5，38(1H，d，J＝7.4Hz)，7.2-7.5(5H，m)，8.6(1H，g，J＝4.6Hz)，8.81(1H，d，J＝7.6Hz).
(6)〔4-(N-苄氧基氨基)-2(R)-异丁基-3-(4-吗啉基甲基)琥珀酰〕-L-苯基甘氨酸-N-甲基酰胺〔通式(IIb)中R2为氢原子、R3为甲基、R5为4-吗啉基甲基的化合物的旋光异构体(非对映异构体a′)〕：
接着，将上述(5)的非对映异构体混合物2.65g、O-苄基羟胺盐酸盐1.08g、羟基苯并三唑1g溶于二氯甲烷50ml与DMF 25ml的混合溶剂，在冰浴冷却下加入WSC 1.29g，再加N-甲基吗啉1.2ml，于室温下搅拌过夜。将反应液减压浓缩，所得残渣溶于氯仿，以水、饱和碳酸氢钠水溶液洗涤后，以无水硫酸镁干燥。减压浓缩，所得固体为在下述HPLC分析中保留时间约5.9分及约6.6分洗脱的2个立体异构体(分别称为非对映异构体a′和b′)的混合物。HPLC条件  柱：GL Science公司Inertsil ODS-2(4.6×150mm)
流动相：0.1％TFA水溶液∶乙腈＝7∶3
流速：1ml/分
(非对映异构体a′和b′的峰面积比约为5∶1)。
将非对映异构体a′和b′的混合物溶于甲醇，加乙醚使其结晶，得〔4-(N-苄氧基氨基)-2(R)-异丁基-3-(4-吗啉基甲基)琥珀酰〕-L-苯基甘氨酸-N-甲基酰胺的旋光异构体(非对映异构体a′)1.55g(收率51％)。
1H-NMR(DMSO-d6)δ：0.77(3H，d，J＝6，4Hz)，0.82(3H，d，J＝6.4Hz)，0.85-0.9(1H，m)，1.35-1.45(2H，m)，1.73(1H，dd，J＝3.1，11.8Hz)，1.9-2.0(2H，m)，2.55-2.7(2H，m)，2.57(3H，d，J＝4.6Hz)，3.3-3.5(4H，m)，4.76(1H，d，J＝11.3Hz)，4.81(1H，d，J＝11.3Hz)，5.45(1H，d，J＝8Hz)，7.2-7.45(10H，m)，8.1(1H，d，J＝4.6Hz)，8.71(1H，d，J＝8Hz)，11.0(1H，s).
参考例4
〔4-(N-苄氧基氨基)-2(R)-异丁基-3-亚甲基琥珀酰〕-L-苯基甘氨酸-N-甲基酰胺〔通式(III)中R2为氢原子、R3为甲基的化合物的旋光异构体〕
将参考例3(4)所得的〔4-羟基-2(R)-异丁基-3-亚甲基琥珀酰〕-L-苯基甘氨酸-N-甲基酰胺0.3g和三乙胺0.1g溶解于THF20ml，在冰浴冷却和搅拌下加氯甲酸乙酯0.108g，搅拌10分钟。然后加入O-苄基羟胺盐酸盐0.144g及三乙胺0.1g，于室温下搅拌1小时。滤除不溶物后，滤液以1N盐酸和水洗涤，以无水硫酸镁干燥，然后减压浓缩。所得残渣以制备型薄层色谱法精制，得〔4-(N-苄氧基氨基)-2(R)-异丁基-3-亚甲基琥珀酰〕-L-苯基甘氨酸-N-甲基酰胺135g(34.3％)。
1H-NMR(DMSO-d6)δ：0.81(3H，d，J＝6.4Hz)，0.86(3H，d，J＝6.4Hz)，1.25-1.65(3H，m)，2.56(3H，d，J＝4.5Hz)，3.58(1H，t，J＝7Hz)，4.79(2H，s)，5.36(1H，d，J＝7.9Hz)，5.37(1H，s)，5.58(1H，s)，7.2-7.45(10H，m)，8.21(1H，q，J＝4.5Hz)，8.48(1H，d，J＝7.8Hz)，11.4(1H，s).
参考例5
〔4-(N-苄氧基氨基)-2(R)-异丁基-3-(N-苄基-N-甲基氨基)甲基琥珀酰〕-L-苯基甘氨酸-N-甲基酰胺〔通式(IIb)中R2为氢原子、R3为甲基、R5为N-苄基-N-甲基氨基甲基的化合物的旋光异构体〕的制备
(1)〔4-苄氧基-2(R)-异丁基-3-亚甲基琥珀酰〕-L-苯基甘氨酸-N-甲基酰胺〔通式(XI)中R2为氢原子、R3为甲基的化合物的旋光异构体〕
将参考例3(4)所得的〔4-羟基-2(R)-异丁基-3-亚甲基琥珀酰〕-L-苯基甘氨酸-N-甲基酰胺3.0g溶于DMF50ml中，加碳酸氢钠1.5g及溴苄7.7g，于室温下搅拌21小时。在反应液中加水100ml，以乙酸乙酯提取，以无水硫酸镁干燥后减压浓缩。所得残渣用硅胶中压液相色谱(正己烷/乙酸乙酯＝2/1)进行分离精制，得〔4-苄氧基-2(R)-异丁基-3-亚甲基琥珀酰〕-L-苯基甘氨酸-N-甲基酰胺2.8g。
1H-NMR(DMSO-d6)δ：0.81(3H，d，J＝6.4Hz)，0.83(3H，d，J＝6.4Hz)，1.3-1.6(2H，m)，1.6-1.7(1H，m)，2.57(3H，d，J＝4.6Hz)，3.7-3.8(1H，m)，5.1-5.2(2H，m)，5.38(1H，d，J＝7.8Hz)，5.65(1H，s)，6.17(1H，s)，7.2-7.4(10H，m)，8.19(1H，d，J＝4.6Hz)，8.51(1H，d，J＝7.8Hz).
(2)〔4-苄氧基-2(R)-异丁基-3-(N-苄基-N-甲基氨基甲基)琥珀酰〕-L-苯基甘氨酸-N-甲基酰胺〔通式(XII)中R2为氢原子、R3为甲基、R6为N-苄基-N-甲基氨基甲基的化合物的旋光异构体〕
将上述(1)所得化合物1.0g及N-苄基甲胺0.32g在无溶剂存在时于60℃下搅拌2小时，所得非对映异构体的混合物(混合比5∶1)用薄层色谱法精制，得〔4-苄氧基-2(R)-异丁基-3-(N-苄基-N-甲基氨基甲基)琥珀酰〕-L-苯基甘氨酸-N-甲基酰胺单-旋光异构体0.4g。
1H-NMR(DMSO-d6)δ：0.8(3H，d，J＝6.5Hz)，0.85(3H，d，J＝6.5Hz)，1.0-1.6(3H，m)，2.1(3H，s)，2.1-2.4(2H，m)，2.8(3H，s)，5.3(1H，s)，5.8(2H，s)，7.2-7.8(15H，m).
(3)〔4-(N-苄氧基氨基)-2(R)-异丁基-3-(N-苄基-N-甲基氨基甲基)琥珀酰〕-L-苯基甘氨酸-N-甲基酰胺〔通式(IIb)中R2为氢原子、R3为甲基、R5为N-苄基-N-甲基氨基甲基的化合物的旋光异构体〕：
将上述(2)所得的旋光异构体0.4g溶解于甲醇30ml，加10％Pd/C 100mg，在氢气下进行催化进原。然后滤除催化剂，减压浓缩，将所得固体与参考例3(6)进行同样的反应，得〔4-(N-苄氧基氨基)-2(R)-异丁基-3-(N-苄基-N-甲基氨基)甲基琥珀酰〕-L-苯基甘氨酸-N-甲基酰胺的旋光异构体引结晶0.12g。
1H-NMR(CDCl3)δ：0.8(3H，d，J＝6.5Hz)，0.85(3H，d，J＝6.5Hz)，1.0-1.6(3H，m)，2.1(3H，s)，2.1-2.3(2H，m)，2.75(3H，s)，2.7-3.5(2H，m)，4.1(2H，s)，4.85(2H，s)，5.5(1H，s)，7.3-7.5(15H，m).
参考例6
〔4-(N-苄氧基氨基)-2(R)-异丁基琥珀酰〕-L-苯基甘氨酸-N-乙基酰胺〔通式(IIa)中R2为氢原子、R3为乙基的化合物的旋光异构体〕的制备
(1)N-苄氧羰基-L-苯基甘氨酸-N-乙基酰胺：
将甲胺的甲醇溶液以乙胺的甲醇溶液代替，其他与参考例1(2)同样，进行反应，从N-苄氧羰基-L-苯基甘氨基制得N-苄氧羰基-L-苯基甘氨酸-N-乙基酰胺。
1H-NMR(DMSO-d6)δ：1.03(3H，t)，2.9-3.3(2H，m)，5.03(2H，s)，5.20(1H，d)，7.2-7.6(11H，m)，8.0-8.3(1H).
(2)〔4-(N-苄氧基氨基)-2(R)-异丁基琥珀酰〕-L-苯基甘氨酸-N-乙基酰胺：
将N-苄氧羰基-L-苯基甘氨酸N-甲基酰胺以N-苄氧羰基-L-苯基甘氨酸-N-乙基酰胺代替，与参考例1(3)同样地进行反应，得〔4-(N-苄氧基氨基)-2(R)-异丁基琥珀酰〕-L-苯基甘氨酸-N-乙基酰胺。
1H-NMR(DMSO-d6)δ：0.82(3H，d，J＝6.3Hz)，0.88(3H，d，J＝6.3Hz)，0.98(3H，t，J＝7.2Hz)，0.95-1.17(1H，m)，1.30-1.55(2H，m)，1.98(1H，dd，J＝7.2Hz，14.3Hz)，2.14  (1H，dd，J＝7.4Hz，14.3Hz)，2.85-2.98(1H，m)，3.02-3.12(2H，m)，4.67(1H，d，J＝11.1Hz)，4.71(1H，d，J＝11.1Hz)，5.41(1H，d，J＝8.1Hz).7.20-7.42(10H，m)，8.14(1H，t，J＝5.4Hz)，8.44(1H，d，J＝8.1Hz)，10.97(1H，s).
参考例7
〔4-(N-苄氧基氨基)-2(R)-异丁基琥珀酰〕-L-(p-氟苯基)甘氨酸-N-甲基酰胺〔通式(IIa)中R2为氟原子、R3为甲基的化合物的旋光异构体〕的制备
(1)N-苄氧羰基-L-(p-氟苯基)甘氨酸-N-甲基酰胺：
将按文献〔Bull.Chem.Soc.Jpn.，65，2359-2365(1992)〕记载的方法制备的L-(p-氟苯基)甘氨酸220mg和水20ml、碳酸钠551mg的混合物与苄氧羰基氯244mg的二噁烷溶液在冰浴冷却下进行反应，以乙酸乙酯洗涤后加盐酸使水溶液呈酸性，以氯仿提取，硫酸镁干燥。减压浓缩溶剂，得N-苄氧羰基物油状残渣400mg。使其与甲胺按参考例1(2)同样的方法反应，得N-苄氧羰基-L-(p-氟苯基)甘氨酸-N-甲基酰胺262mg。
1H-NMR(CDCl3)δ：2.8(3H，d)，5.05(2H，s)，5.11(1H，d)，5.6-5.8(1H，m)，6.0-6.2(1H，m)，6.8-7.5(9H，m).
(2)〔4-(N-苄氧基氨基)-2(R)-异丁基琥珀酰〕-L-(p-氟苯基)甘氨酸-N-甲基酰胺：
以N-苄氧羰基-L-(p-氟苯基)甘氨酸-N-甲基酰胺代替N-苄氧羰基-L-苯基甘氨酸-N-甲基酰胺，与参考例1(3)进行同样的反应，得〔4-(N-苄氧基氨基)-2(R)-异丁基琥珀酰〕-L-(p-氟苯基)甘氨酸-N-甲基酰胺。
1H-NMR(DMSO-d6)δ：0.81(3H，d，J＝6.3Hz)，0.85(3H，d，J＝6.3Hz)，1.0-1.1(1H，m)，1.35-1.52(2H，m)，1.96(1H，dd，J＝7.0Hz，14.5Hz)，2.12(1H，dd，J＝7.5Hz，14.5Hz)，2.57(3H，d，J＝4.6Hz)，2.8-1.9(1H，m)，4.65(1H，d，J＝12Hz)，4.69(1H，d，J＝12Hz)，5.38(1H，d，J＝7.8Hz)，7.11(2H，dd，J＝8.9Hz，8.9Hz)，7.35(5H，s)，7.40-7.45(2H，m)，8.13(1H，q，J＝4.6Hz)，8.47(1H，d，J＝7.8Hz)，10.95(1H，s).
参考例8
〔4-(N-苄氧基氨基)-2(R)-异丁基琥珀酰〕-L-(p-异丙基苯基)甘氨酸-N-甲基酰胺〔通式(IIa)中R2为异丙基、R3为甲基的化合物的旋光异构体〕的制备
(1)N-苄氧羰基-L-(p-异丙基苯基)甘氨酸-N-甲基酰胺：
将按文献[Bull.Chem.Soc.Jpn.，65，2359-2365(1992)]记载的方法制备的L-(p-异丙基苯基)甘氨酸与参考例7(1)的记载同样地进行N-苄氧羰基化，然后与参考例1(2)同样地与甲胺反应，得N-苄氧羰基-L-(p-异丙基苯基)甘氨酸-N-甲基酰胺。
1H-NMR(CDCl3)δ：1.2(6H，d)，2.75(3H，d)，5.0(2H，s)，5.18(1H，d)，5.4-5.6(1H，m)，5.9-6.1(1H)，7.1-7.3(9H，s).
(2)〔4-(N-苄氧基氨基)-2(R)-异丁基琥珀酰〕-L-(p-异丙基苯基)甘氨酸-N-甲基酰胺：
以N-苄氧羰基-L-(p-异丙基苯基)甘氨酸-N-甲基酰胺代替N-苄氧羰基-L-苯基甘氨酸-N-甲基酰胺，与参考例1(3)同样地进行反应，得〔4-(N-苄氧基氨基)-2(R)-异丁基琥珀酰〕-L-(p-异丙基苯基)甘氨酸-N-甲基酰胺。
1H-NMR(DMSO-d6)δ：0.82(3H，d，J＝6.3Hz)，0.87(3H，d，J＝6.3Hz)，1.0-1.2(1H，m，1.2(3H，d，J＝6.9Hz)，1.35-1.52(2H，m)，1.97(1H，dd，J＝6.8Hz，14.5Hz)，2.12(1H，dd，J＝7.6Hz，14.5Hz)，2.57(3H，d，J＝4.6Hz)，2.75-2.92(2H，m)，4.65(1H，d，J＝11Hz)，4.69(1H，d，J＝11Hz)，5.33(1H，d，J＝7.8Hz)，7.13(2H，d，J＝8.1Hz)，7.29(2H，d，J＝8.1Hz)，7.35(5H，s)，8.06(1H，q，J＝4.6Hz)，8.37(1H，d，J＝7.8Hz)，10.96(1H，s).
参考例9
〔4-(N-苄氧基氨基)-2(R)-异丁基-3-甲基琥珀酰〕-L-苯基甘氨酸-N-甲基酰胺〔通式(IIb)中R2为氢原子、R3为甲基、R5为甲基的化合物的旋光异构体(非对映异构体e)〕的制备
(1)〔4-羟基-2(R)-异丁基-3(RS)-甲基琥珀酰〕-L-苯基甘氨酸-N-甲基酰胺
将参考例3(4)中得到的〔4-羟基-2 (R)-异丁基-3-亚甲基琥珀酰〕-L-苯基甘氨酸-N-甲基酰胺11.1g溶于700ml乙醇，加10％Pd/C1.0g，在氢气下搅拌2小时。滤除催化剂，减压浓缩滤液至干，得〔4-羟基-2(R)-异丁基-3(RS)甲基琥珀酰〕-L-苯基甘氨酸-N-甲基酰胺(因3位不对称碳原子而产生的二种非对映异构体的混合物)11g。对此固体进行下述HPLC分析，表明为保留时间约8.1分及约9.5分洗脱的二种立体异构体(分别称为非对映异构体e′和f′)的混合物。HPLC条件柱：GL Science公司Inertsil Perp-ODS(6×250mm)
流动相：0.1％TFA水溶液∶乙腈＝6∶4
流速：1ml/分
为了进行分析，取微量非对映异构体的混合物以上述条件经HPLC分离，各非对映异构体显示以下的NMR谱。
非对映异构体e′
1H-NMR(DMSO-d6)δ：0.8(3H，J＝6.5Hz).0.87(6H，d，J＝6.6Hz)，0.9-1.1(1H，m)，1.3-1.6(2H，m)，2.2-2.4(1H，m)，2.57(3H，d，J＝4.6Hz)，2.6-2.8(1H，m)，5.47(1H，d，J＝8.0Hz)，7.2-7.45(5H，m)，8.12(1H，d，J＝4.6Hz)，8.73(1H，d，J＝8.0Hz)，12.16(1H，bs).
非对映异构体f＇
1H-NMR(DMSO-d6)δ：0.82(3H，d，J＝6.5Hz)，0.86(3H，d，J＝6.4Hz)，0.95(3H，d，J＝7.1Hz)，1.0-1.15(1H，m)，1.45-1.6(2H，m)，2.57(3H，d，J＝4.6Hz)，2.5-2.6(1H，m)，2.7-2.85(1H，m)，5.39(1H，d，J＝7.8Hz)，7.2-7.4(5H，m)，8.12(1H，d，J＝4.6Hz)，8.50(1H，d，J＝7.8Hz)，12.18(1H，bs).
(2)〔4-(N-苄氧基氨基)-2(R)-异丁基-3-甲基琥珀酰〕-L-苯基甘氨酸-N-甲基酰胺
将上述(1)所得化合物11g溶于DMF 150ml与二氯甲烷200ml的混合物，在冰浴冷却下加O-苄基羟受盐酸盐8.0g、羟基苯并三唑5.5g及三乙胺5.1g后，加WSC7.8g，于室温下搅拌过夜。滤取反应液中析出的固体，依次以稀盐酸、少量甲醇洗涤，得〔4-(N-苄氧基氨基)-2(R)-异丁基-3-甲基琥珀酰〕-L-苯基甘氨酸-N-甲基酰胺的一个旋光异构体7.7g。
通过以下的HPLC分析，在反应液中观察到保留时间8.2分和9.6分时洗脱的2个立体异构体(分别称为非对映异构体e和f)，上述操作得到的化合物为其中之一(非对映异构体e)。HPLC条件  柱：GL Science公司Inertsil Perp-ODS(6×250mm)
流动相：0.1％TFA水溶液∶乙腈＝5∶5
流速：1ml/分
熔点：256-257℃(分解)
1H-NMR(DMSO-d6)δ：0.76(3H，d，J＝2.1Hz)，0.78(3H，d，J＝2.5Hz)，0.84(3H，d，J＝6.4Hz)，0.9(1H，m)，1.3(2H，m)，2.1(1H，m)，2.56(3H，d，J＝4.5Hz)，2.66(1H，m)，4.77(2H，s)，5.46(1H，d，J＝8.0Hz)，7.23-7.42(10H，m)，8.07(1H，dd，J＝4.6Hz)，8.74(1H，d，J＝8.0Hz)，11.04(1H，s).
元素分析(C25H33N3O4)
计算值(％)  C 68.31；  H 7.57；  N 9.56
实测值(％)  C 68.08；  H 7.49；  N 9.51
实施例1
〔4-(N-羟基氨基)-2(R)-异丁基琥珀酰〕-L-苯基甘氨酸-N-甲基酰胺〔通式(I)中R1、R2均为氢原子、R3为甲基的化合物的旋光异构体〕的制备
将参考例1得到的〔4-(N-苄氧基氨基)-2(R)-异丁基琥珀酰〕-L-苯基甘氨酸-N-甲基酰胺7.3g溶于甲醇300ml中，加10％Pd/C200mg，在3kg/m2的氢气压下进行催化还原。滤除催化剂后，减压浓缩，所得残渣以THF/甲醇混合溶剂重结晶，得标题化合物无色结晶4g(收率71.8％)。
熔点：169-170℃
[α]D＝+97.4°(c＝o.2，MeOH)
1H-NMR(DMSO-d6)δ：0.81(3H，d，J＝6.3Hz)，0.87(3H，d，J＝6.3Hz)，1.0-1.1 5(1H，m)，1.45-1.6(2H，m)，1.97(1H，dd，J＝7.4，14.4Hz)，2.13(1H，dd，J＝6.6，14.4Hz)，2.55(3H，d，J＝4.5Hz)，2.8-2.95(1H，m)，5.38(1H，d，J＝7.8Hz)，7.2-7.4(5H，m)，8.13(1H，q，J＝4.5Hz)，8.45(1H，d，J＝7.8Hz)，8.72(1H，s)，10.36(1H，s).
IR(KBr)cm-1：3296，1644，1538.
元素分析(C17H25N3O4)
计算值(％)  C 60.88；  H 7.51；  N 12.53
实测值(％)  C 60.78；  H 7.63；  N 12.36
实施例2
〔4-(N-羟基氨基)-2(R)-异丁基琥珀酰〕-L-(p-羟基苯基)甘氨酸-N-甲基酰胺〔通式(I)中R1为氢原子、R2为羟基、R3为甲基的化合物的旋光异构体〕的制备
将参考例2所得的〔4-(N-苄氧基氨基)-2(R)-异丁基琥珀酰〕-L-(p-羟基苯基)甘氨酸-N-甲基酰胺0.54g溶于甲醇20ml中，加10％Pd/C 50mg，在常压氢气流下进行催化还原。滤除催化剂后，将滤液减压浓缩，所得残渣用制备型HPLC分离精制，得标题化合物240mg无色结晶(收率55.8％)。
熔点：187-188℃
[α]D＝+116.6°(c＝0.2，MeOH)
1H-NMR(DMSO-d6)δ：0.80(3H，d，J＝6.3Hz)，0.86(3H，d，J＝6.63Hz).1.0-1.15(1H，m)，1.35-1.6(2H，m)，1.95(1H，dd，J＝7.5，14.4 Hz)，2.11(1H，dd，J＝6.8，14.4Hz)，2.55(3H，d，J＝4.5Hz)，2.8-2.95(1H，m)，5.22(1H，d，J＝7.7Hz)，6.69(2H，d，J＝8.5Hz)，7.16(2H，d，J＝8.5Hz)，7.98(1H，q，J＝4.5Hz)，8.29(1H，d，J＝7.7Hz)，8.72(1H，s)，9.37(1H，s)，10.34(1H，s).
IR(KBr)cm-1：3304，3072，1642，1552，1518，1442.
元素分析(C17H25N3O5)
计算值(％)  C 58.11；  H 7.17；  N 11.96
实测值(％)  C 57.88；  H 7.15；  N 11.93
实施例3
〔4-(N-羟基氨基)-2(R)-异丁基-3-(4-吗啉基甲基)琥珀酰〕-L-苯基甘氨酸-N-甲基酰胺〔通式(I)中R1为4-吗啉基甲基、R2为氢原子、R3为甲基的化合物的旋光异构体(非对映异构体a)〕的制备
将参考例3中得到的〔4-(N-苄氧基氨基)-2(R)-异丁基-3-(4-吗啉基甲基)琥珀酰〕-L-苯基甘氨酸-N-甲基酰胺的非对映异构体a′L 5g溶于甲醇20ml和THF 20ml中，在氢气下催化还原，滤除催化剂后减压浓缩得一固体。将它用甲醇-乙醚结晶，得〔4-(N-羟基氨基)-2(R)-异丁基-3-(4-吗啉基甲基)琥珀酰〕-L-苯基甘氨酸-N-甲基酰胺单一的旋光异构体1.06g(称为非对映异构体a)(收率85.8％)。
熔点：216-217℃(分解)
[α]D＝+85.1°(c＝o.2，MeOH)
1H-NMR(DMSO-d6)δ：0.78(3H，d，J＝6.4Hz)，0.83(3H，d，J＝6.4Hz)，0.85-0.97(1H，m)，1.35-1.46(2H，m)，1.72(1H，dd，J＝3，11.8Hz)，1.90-1.92(2H，m)，2.15-2.35(3H，m)，2.56(3H，d，J＝4.6Hz)，2.5-2.57(2H，m)，3.4-3.45(4H，m)，5.47(1H，d，J＝8Hz)，7.2-7.45(5H，m)，8.10(1H，d，J＝4.6Hz)，8.66(1H，d，J＝8Hz)，8.77(1H，d，J＝1.7Hz)，10.36(1H，d，J＝1.7Hz).
IR(KBr)cm-1：3312，1646，1566.
元素分析(C22H34N4O5·H2O)
计算值(％)  C 58.39；  H 8.02；  N 12.38
实测值(％)  C 58.43；  H 7.98；  N 12.39
实施例4
〔4-(N-羟基氨基)-2(R)-异丁基-3-(4-吗啉基甲基)琥珀酰〕-L-苯基甘氨酸-N-甲基酰胺盐酸盐〔通式(I)中R1为4-吗啉基甲基、R2为氢原子、R3为甲基的化合物的旋光异构体(非对映异构体a)的盐酸盐〕的制备
将实施例3中得到的〔4-(N-羟基氨基)-2(R)-异丁基-3-(4-吗啉基甲基)琥珀酰〕-L-苯基甘氨酸-N-甲基酰胺(非对映异构体a)0.2g溶于甲醇5ml，于冰冷却下加4N HCl二噁烷溶液1ml，减压浓缩，得标题盐酸盐无色结晶0.2g(收率92％)。
熔点：150-160℃(分解)
[α]D＝+88.4°(c＝0.2，MeOH)
1H-NMR(DMSO-d6)δ：0.81(3H，d，J＝6.4Hz)，0.85(3H，d，J＝6.4Hz)，0.95-1.1(1H，m)，1.4-1.55(2H，m)，2.57(3H，d，J＝4.6Hz)，2.6-3.2(7H，m)，3.5-3.9(5H，m)，5.43(1H，d，J＝7.7Hz)，7.2-7.5(5H，m)，8.20(1H，q，J＝4.6Hz)，8.92(1H，d，J＝7.7Hz)，10.37(1H，s)，10.84(1H，s)
IR(KBr)cm-1：3270，1 648，1530.
元素分析(C22H34N4O5·H2O·HCl)
计算值(％)  C 54.04；  H 7.63；  N11.46
实测值(％)  C 53.76；  H 7.44；  N 11.34
实施例5
〔4-(N-羟基氨基)-2(R)-异丁基-3-甲基琥珀酰〕-L-苯基甘氨酸-N-甲基酰胺〔通式(I)中R1和R3为甲基、R2为氢原子的化合物的旋光异构体(非对映异构体c)〕的制备
将参考例4中得到的〔4-(N-苄氧基氨基)-2(R)-异丁基-3-亚甲基琥珀酰〕-L-苯基甘氨酸-N-甲基酰胺的结晶125mg溶于甲醇5ml中，加10％Pd/C 50mg进行催化还原。滤去催化剂后减压浓缩，得〔4-(N-羟基氨基)-2(R)-异丁基-3-甲基琥珀酰〕-L-苯基甘氨酸-N-甲基酰胺2种立体异构体的混合物(生成比约为3∶1。分别称为非对映异构体c和d)。按下述条件经制备型HPLC进行精制，得非对映异构体c 32mg(收率36％)。HPLC条件  柱：GL Science公司Inertsil PREP-ODS(20.0×
          250mm)
流动相：0.1％TFA水溶液∶乙腈＝7∶3
流速：10ml/分
保留时间：非对映异构体c  约9分
非对映异构体d  约11分
非对映异构体c的物理性质
熔点：224-226℃
[α]D＝+129.6°(c＝0.1，MeOH)
1H-NMR(DMSO-d6)δ：0.78(3H，d，J＝6.8Hz)，0.79(3H，d，J＝6.3Hz)，0.85(3H，d，J＝6.4Hz)，0.9-0.95(1H，m)，1.35-1.5(2H，m)，2.10(1H，m)，2.57(3H，d，J＝4.6Hz)，2.6-2.7(1H，m)，5.47(1H，d，J＝8Hz)，7.2-7.4(5H，m)，8.07(1H，d，J＝4.6Hz)，8.72(1H，d，J＝8Hz)，10.42(1H，s).
元素分析(C18H27N3O4·1/4H2O)
计算值(％)  C 61.08；  H 7.97；  N11.87
实测值(％)  C 61.06；  H 7.92；  N 11.87
实施例6
〔4-(N-羟基氨基)-2(R)-异丁基-3-(N-甲基氨基甲基)琥珀酰〕-L-苯基甘氨酸-N-甲基酰胺〔通式(I)中R1为甲氨基甲基、R2为氢原子、R3为甲基的化合物的旋光异构体〕的制备
将参考例5中得到的〔4-(N-苄氧基氨基)-2(R)-异丁基-3-(N苄基-N-甲基氨基)甲基琥珀酰〕-L-苯基甘氨酸-N-甲基酰胺的旋光映异构体110g在甲醇中与实施例5同样地进行催化还原，得〔4-(N-羟基氨基)-2(R)-异丁基-3-(N-甲基氨基甲基)琥珀酰〕-L-苯基甘氨酸-N-甲基酰胺的旋光异构体50mg。
熔点：117-180℃
[α]D＝+93.4°(c＝0.1，MeOH)
1H-NMR(DMSO-d6)δ：0.79(3H，d，J＝6.4Hz)，0.84(3H，d，J＝6.4Hz)，0.9-0.98(1H，m)，1.35-1.5(2H，m)，2.1-2.3(2H，m)，2.57(3H，d，J＝4.5Hz)，2.6-2.7(1H，m)，5.46(1H，d，J＝8Hz)，7.2-7.4(5H，m)，8.12(1H，d，J＝4.5Hz)，8.69(1H，d，J＝8.1Hz).
实施例7
〔4-(N-羟基氨基)-2(R)-异丁基琥珀酰〕-L-苯基甘氨酸-N-甲基酰胺〔通式(I)中R1、R2均为氢原子、R3为乙基的化合物的旋光异构体〕的制备
将参考例6中得到的〔4-(N-苄氧基氨基)-2(R)-异丁基琥珀酰〕-L-苯基甘氨酸-N-甲基酰胺150mg与实施例1同样地进行催化还原，得〔4-(N-羟基氨基)-2(R)-异丁基琥珀酰〕-L-苯基甘氨酸-N-甲基酰胺结晶性粉末54mg。
熔点：185-190℃(分解)
〔α]D＝+71°(c＝0.5，MeOH)
1H-NMR(DMSO-d6)δ：0.82(3H，d，J＝6.3Hz)，0.87(3H，d，J＝6.3Hz)，0..98(3H，t，J＝7.2Hz)，1.04-1.16(1H，m)，1.38-1.55(2H，m)，1.97(1H，dd，J＝7.5Hz，14.4Hz)，2.13(1H，dd，J＝6.9Hz，14.4Hz)，2.83-2.95(1H，m)，3.02-3.12(2H，m)，5.39(1H，d，J＝8Hz)，7.22-7.42(5H，m)，8.14(1H，t，J＝5.4Hz)，8.43(1H，d，J＝8Hz)，8.70(1H，bs)，10.35(1H，s).
元素分析(C18H27N3O4)
计算值(％)  C 61.87；  H 7.79；  N 12.03
实测值(％)  C 61.98；  H 7.85；  N 11.98
实施例8
〔4-(N-羟基氨基)-2(R)-异丁基琥珀酰〕-L-(p-氟苯基)甘氨酸-N-甲基酰胺〔通式(I)中R1为氢原子、R2为氟原子、R3为甲基的化合物的旋光异构体〕的制备
将参考例7中得到的〔4-(N-苄氧基氨基)-2(R)-异丁基琥珀酰〕-L-(p-氟苯基)甘氨酸-N-甲基酰胺320mg以实施例7同样的方法进行催化还原，得〔4-(N-羟基氨基)-2(R)-异丁基琥珀酰〕-L-(p-氟苯基)甘氨酸-N-甲基酰胺结晶性粉末155mg。
熔点：170-172℃
[α]D＝+78°(c＝0.1，MeOH)
1H-NMR(DMSO-d6)δ：0.81(3H，d，J＝6.3Hz)，0.85(3H，d，J＝6.3Hz)，1.0-1.1(1H，m)，1.40-1.52(2H，m)，1.96(1H，dd，J＝7.3，14.4Hz)，2.12(1H，dd，J＝7.0Hz，14.4Hz)，2.6(3H，d，J＝4.6Hz)，2.8-2.9(1H，m)，5.36(1H，d，J＝7.8Hz)，7.14(2H，dd，J＝8.9，8.9HZ)，7.4-7.45(2H，m)，8.13(1H，d，J＝4.6Hz)，8.45(1H，d，J＝7.8Hz)，10.34(1H，s).
IR(KBr)cm-1：3288，2962，1641，1543，1511.
元素分析(C17H24FN3O4)
计算值(％)  C 57.78；  H 6.85；  N 11.89
实测值(％)  C 57.83；  H 6.96；  N 11.84
实施例9
〔4-(N-羟基氨基)-2(R)-异丁基琥珀酰〕-L-(p-异丙基苯基)甘氨酸-N-甲基酰胺〔通式(I)中R1为氢原子、R2为异丙基、R3为甲基的化合物的旋光异构体〕的制备
将参考例8中得到的〔4-(N-苄氧基氨基)-2(R)-异丁基琥珀酰〕-L-(p-异丙基苯基)甘氨酸-N-甲基酰胺300mg，以实施例1同样的方法进行催化还原，得〔4-(N-羟基氨基)-2(R)-异丁基琥珀酰〕-L-(p-异丙基苯基)甘氨酸-N-甲基酰胺结晶性粉末180mg。
熔点：219-222℃
[α]D＝+95.3°(c＝0.1，MeOH)
1H-NMR(DMSO-d6)δ：0.80(3H，d，J＝6.3Hz)，0.85(3H，d，J＝6.3Hz)，1.0-1.08(1H，m)，1.2(6H，d，J＝6.9Hz)，1.47-1.52(2H，m)，1.95(1H，dd，J＝7.5Hz，14.4Hz)，2.15(1H，dd，J＝6.9Hz，14.4Hz)，2.60(2H，d，J＝4.6Hz)，2.80-2.92(2H，m)，5.3(1H，d，J＝7.8Hz)，7.2(2H，d，J＝8.2Hz)，7.3(2H，d，J＝8.2Hz)，8.05(1H，d，J＝4.6Hz)，8.4(1H，d，J＝7.8Hz)，8.7(1H，d，J＝1.6Hz)10.34(1H，d，J＝1.6Hz).
IR(KBr)cm-1：3298，2962，1662，1639，1608，1572.
元素分析(C20H31N3O4)
计算值(％)  C 63.64；  H 8.28；  N 11.13
实测值(％)  C 63.47；  H 8.30；  N 11.13
实施例10
〔4-(N-羟基氨基)-2(R)-异丁基-3-甲基琥珀酰〕-L-苯基甘氨酸-N-甲基酰胺〔通式(I)中R1和R3为甲基、R2为氢原子的化合物的旋光异构体(非对映异构体c)〕的制备
将参考例9中得到的〔4-(N-苄氧基氨基)-2(R)-异丁基-3-甲基琥珀酰〕-L-苯基甘氨酸-N-甲基酰胺(非对映异构体e)7.7g悬浮于DMF 5000ml中，加10％Pd/C 0.7g，在氢气下搅拌4小时。滤去催化剂后，将滤液减压浓缩，残渣用甲醇重结晶，得标题化合物5.2g。
该化合物在进行HPLC分析时与实施例5制得的非对映异构体C经同一保留时间洗脱，且1H-NMR谱也与非对映异构体C一致。
熔点：217-219℃
[α]D＝+136°(c＝0.1，MeOH)
元素分析(C18H27N3O4)
计算值(％)  C 61.87；  H 7.79；  N 12.03
实测值(％)  C 61.70；  H 7.79；  N 11.97
实施例11
〔4-(N-羟基氨基)-2(R)-异丁基-3-甲基琥珀酰〕-L-苯基甘氨酸-N-甲基酰胺〔通式(I)中R1和R3为甲基、R2为氢原子的化合物的旋光异构体(非对映异构体c)〕的钠盐的制备
将〔4-(N-羟基氨基)-2(R)-异丁基-3-甲基琥珀酰〕-L-苯基甘氨酸-N-甲基酰胺的旋光异构体(非对映异构体c)101mg溶于20ml甲醇，在冰浴冷却下加1/10N氢氧化钠水溶液2.9ml，搅拌5分钟。所得溶液减压浓缩至干，得〔4-(N-羟基氨基)-2(R)-异丁基-3-甲基琥珀酰〕-L-苯基甘氨酸-N-甲基酰胺钠盐无色固体107mg。
1H-NMR(DMSO-d6)δ：0.75(3H，d，J＝6.6Hz)，0.77(3H，d，J＝5.4Hz)，0.82(3H，d，J＝6.3Hz)，1.0(1H，m)，1.4(2H，m)，2.0(1H，m)，2.4-2.6(1H，m)，2.56(3H，d，J＝4Hz)，5.42(1H，d，J＝7.9Hz)，7.2-7.4(5H，m)，8.02(1H，d，J＝4.3Hz)，9.52(1H，d，J＝7.6Hz).
实施例12
如下制得含〔4-(羟基氨基)-2(R)-异丁基-3-甲基琥珀酰〕-L-苯基甘氨酸-N-甲基酰胺(实施例5的化合物)100mg的片剂。
〔处方〕
成    分                  配  比
主药(实施例5的化合物)    100重量份
玉米淀粉                 46重量份
微晶纤维素               98重量份
羟丙基纤维素             2重量份
硬脂酸镁                 4重量份
〔操作〕
将主药、玉米淀粉及微晶纤维素混合，在其中加入溶于50重量份水的羟丙基纤维素，充分搅拌。将搅和的物料过筛，在颗粒机上制粒，干燥后，所得颗粒与硬脂酸镁混合，压成每片250mg的片剂。
实施例13颗粒剂的制备
如下制得含〔4-(羟基氨基)-2(R)-异丁基-3-甲基琥珀酰〕-L-苯基甘氨酸-N-甲基酰胺(实施例5的化合物)200mg的颗粒剂。
〔处方〕
成    分                 配  比
主药(实施例5的化合物)    200重量份
乳糖                     185重量份
玉米淀粉                 109重量份
羟甲基纤维素             6重量份
〔操作〕
将主药、乳糖及玉米淀粉混合，在其中加入溶于120重量份水的羟丙基纤维素，充分搅和。搅和的物料过20  筛制粒，干燥，经整粒得颗粒剂。
实施例14  胶囊剂的制备
如下制得每一胶囊中含〔4-(羟基氨基)-2(R)-异丁基-3-甲基琥珀酰〕-L-苯基甘氨酸-N-甲基酰胺(实施例5的化合物)100mg的胶囊剂。
〔处方〕
成    分                  配  比
主药(实施例5的化合物)    200重量份
乳糖                     35重量份
玉米淀粉                 60重量份
硬脂酸镁                 5重量份
〔操作〕
将上述各成分充分混合，将经混合的粉末填充胶囊，每胶囊200mg，即得胶囊剂。

Claims (4)

1.由下式(I)表示的酰基苯基甘氨酸衍生物或其药学上容许的盐，
Figure C9419305500021
式中，R1为氢原子、甲基、甲基氨基甲基或4-吗啉基甲基。R2为氢原子、羟基、氟原子或含1-4个碳原子的直链或支链烷基，R3为含1-4个碳原子的直链或支链烷基。
2.如权利要求1所述的酰基苯基甘氨酸衍生物或其药学上容许的盐，其中R1及R3均为甲基，R2为氢原子。
3.预防及治疗胶原酶活性亢进所致疾病的药物组合物，包含治疗有效量的权利要求1或2所述酰基苯基甘氨酸衍生物或其药学上容许的盐及药学上可接受的载体。
4.如权利要求3所述的药物组合物，其中胶原酶活性亢进所致疾病为关节疾病或骨吸收疾病。
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