CN1060804C - Iv型胶原酶特异性人源基因工程抗体 - Google Patents

Abstract

一种Ⅳ型胶原酶特异性人源基因工程抗体。主要是构建了Ⅳ型胶原酶的抗体基因，它是由705个核苷酸组成，由该基因所表达的Ⅳ型胶原酶特异性人源抗体是由235个氨基酸组成。该抗体能够与Ⅳ型胶原酶特异结合，它能够广泛用于与抑制Ⅳ型胶原酶有关的肿瘤病的治疗。

Description

IV型胶原酶特异性人源基因工程抗体

本发明属于人基因工程抗体，特别是与癌转移有关的，能同IV型胶原酶特异结合的，抑制肿瘤转移的一种人单链抗体。

侵袭和转移是恶性肿瘤的重要特征，是引起肿瘤病人死亡的主要原因。阻止肿瘤转移是治疗肿瘤的关键。由于IV型胶原酶是造成肿瘤转移的重要因子之一，因此寻找一种能抑制IV型胶原酶的物质，通过封闭IV型胶原酶的活性，而阻止肿瘤细胞的侵袭和转移已成为控制癌转移的重要策略。有关抑制IV型胶原酶活性的物质国内外已有报道，如金属蛋白酶抑制剂，能够与IV型胶原酶结合并通过抑制IV型胶原酶的活性而降低肿瘤细胞的侵袭性。另有实验证明，用维甲酸处理人黑色素细胞，可降低细胞内IV型胶原酶的mRNA水平，从而降低黑色素瘤的侵袭性。然而，无论是金属蛋白酶抑制剂还是维甲酸都是与IV型胶原酶非特异性结合，在应用时会产生一些副作用。近年来，虽然产生了能够与IV型胶原酶特异性结合的单克隆抗体，但是由于这种单克隆抗体是鼠源的，只能用于实验室研究和体外免疫学诊断，而在人体内应用时却受到了限制。其主要原因是鼠抗体多次应用后，人体产生人抗鼠抗体过敏反应。人抗体一直被认为是最理想的肿瘤免疫制剂，但由于技术上的原因，长期以来人抗体的研制一直未取得重大突破。

本发明的目的就是要克服某些金属蛋白酶抑制剂等与IV型胶原酶非特异的结合和鼠抗体临床应用时产生的过敏反应等缺点。人源单链抗体在临床应用得到极佳的效果，因为(1)抗体的化学本质是人源蛋白，它将克服鼠源抗体在临床应用中所产生的过敏反应；(2)该抗体能够与IV型胶原酶发生特异性反应，将用于抑制肿瘤的侵袭和转移；(3)分子量小，单链抗体是由抗体重链可变区和轻链可变区通过一个小分子肽连接而成的单链抗体可变区片段(single chain Fv fragment，简称scFv)。分子量约27KDa，是免疫球蛋白IgG分子量的六分之一。因此它的渗透性较好，有利于实体瘤的体内诊断和治疗；(4)用生物工程技术生产抗体操作简便、适用于快速大规模地生产、经济、成本低。

下面对本发明的技术进行详细说明。本发明是利用噬菌体抗体呈现技术系统。该系统是将单链抗体可变区基因插入噬菌体外壳蛋白基因中，使单链抗体以融合蛋白的形式表达于噬菌体的表面，然后通过反复免疫筛选-感染-扩增-再筛选过程，获得抗原特异性重组噬菌体抗体。

本发明是利用噬菌体抗体呈现技术，以人IV型胶原酶为靶抗原，通过免疫亲和筛选法对重组噬菌体人抗体可变区基因文库进行筛选。分离并克隆IV型胶原酶特异性单链抗体基因hCo4，DNA序列分析证明hCo4基因是由705个核苷酸组成，其中抗体重链可变区基因属于抗体V_H3家族。继而把hCo4基因插入到pCANTAB 5E表达载体上，转化大肠杆菌HB2151。由于HB2151细胞中不含supE基因，因此能够表达产生可溶性单链抗体。通过IPTG诱导细胞大量表达外源蛋白，收集培养液上清中的可溶性单链抗体，表达量大约在10-20μ／ml，经过浓缩与纯化后进行免疫活性实验，ELISA与Western blot均证明单链抗体hCo4能够识别IV型胶原酶，其免疫反应随着IV型胶原酶量的增加而增强。进一步的研究证明，单链抗体hCo4不与牛血清白蛋白、乙肝病毒表面抗原、癌胚抗原以及促血管内皮生长因子发生交叉反应，表明单链抗体hCo4与IV型胶原酶的结合是特异性的。

具体操作步骤如下：

(1)培养扩增噬菌体抗体文库：取50μl人噬菌体抗体库，经过培养扩增后，用M13K07辅助噬菌体超感染(细菌与噬菌体的比例为1∶20)培养过夜。收集上清并浓缩噬菌体。

(2)IV型胶原酶噬菌体抗体免疫筛选：以IV型胶原酶为抗原，用0．05MNa2CO3.pH 9．6稀释使其终浓度为100μg／ml。将4ml抗原溶液包被于聚乙烯平皿中，4℃过夜。次日用PBS缓冲液洗平皿三次，然后加20ml 1％BSA封闭液，37℃保温2hr。再用PBS洗平皿三次。把封闭液与含重组噬菌体抗体的上清按1∶1等体积混合，取20ml混合液加入平皿中，于37℃保温2hr。用20ml含0．1％Tween 20的PBS缓冲液洗平皿20次，然后用PBS再洗平皿20次，弃去PBS。加入100mM的三乙胺1ml洗脱结合在平皿上的IV型胶原酶噬菌体抗体。用0．5ml 1M Tris-Cl(pH7．4)中和后，加入10ml处于对数生长期的TGI细胞，室温静止30分钟后，于37℃温育30分钟。再重复上述(1)-(2)步骤，经过4次免疫筛选-感染-扩增-再筛选过程，使IV型胶酶重组噬菌体抗体得到富集。用第4次筛选的重组噬菌体感染TG1细胞，取100μl细胞悬液涂于2xYT培养板上，37℃培养过夜。次日从平板上随意挑选数十个单菌落，分别接种于100μl含100μg／ml氨苄青霉素和2％葡萄糖的2xYT培养液中，于30℃培养过夜。在相同培养基中转接一次长到O．D达0．5，再用M13 KO7辅助噬菌体分别感染转化细胞，于37℃静置半小时、培养1hr，离心，将细胞沉淀分别重悬于含100μg／ml氨苄青霉素和50μg／ml卡那霉素培养液中，37℃过夜培养。培养物离心后取上清用于ELISA鉴定。

(3)ELISA检测重组噬菌体抗体活性：用IV型胶原酶10μg／ml(包被液为0．05MNa₂CO₃，pH9．6)包被96孔酶联板，于4 ℃过夜。次日用1％BSA封闭酶联板。于37℃保温2hrs。再用PBS洗板三次。把封闭液与含重组噬菌体抗体的上清按1∶1等体积混合15分钟后，每孔加入100μl混合液，于37℃保温2hrs。洗板6次，每次用200μl含0．05％Tween 20的PBS。弃去PBS，每孔加入1∶5000倍稀释的辣根过氧化物酶标的抗M13噬菌体抗体(Phamacia)100μl。37℃反应1hr。洗6次后加入底物邻苯二胺(H₂O₂-OPD)，室温作用15mins，加2N H₂SO₄终止反应液50μl，于A495nm处检测每孔的OD值。以抗IV型胶原酶鼠单抗为阳性对照，用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体作为第二抗体，以野生型M13噬菌体作为阴性对照。从数十个克隆中筛选出几个阳性克隆，重复ELISA实验，每个克隆设3排平行孔，最后确定一株活性最高的阳性克隆，命名为hCo4。

(4)抗体hCo4的基因克隆、分析与表达：将含抗体hCo4菌株培养于3ml含氨苄青霉素和葡萄糖的LB培养液中过夜。用碱裂解法抽提质粒。DNA序列分析证明hCo4基因是由705个核苷酸组成，其序列是：GAG GTG CAG CTG GTG GAG TCT GGA GGA GGC TTG ATC CAG CCT GGG GGG TCCCTGAGA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGG TTC ACC GTC AGT AGC AAC TAC ATGAGC TGGGTC CGC CAG GCT CCA GGG AAG GGG CTG GAG TGG GTC TCA GTT ATTTAT AGC GGTGGT AGC ACA TAC TAC GCA GAC TCC GTG AAG GGC CGA TTC ACCATC TCC AGA GACAAT TCC AAG AAC ACG CTG TAT CTT CAA ATG AAC AGC CTGAGA GCC GAG GAC ACGGCC GTA TTA CTG TGC AAG AGA GAC TTG TGT GAT TGGGGC CAA GGT ACC CTG GTCACC GTG TCG AGA GGT GGC GGT GGC TCG GGC GGTGGT GGG TCG GGT GGC GGC GGA TCT TCT GAG CTG ACT CAG GAC CCT GCT GTGTCT GTG GCC TTG GGA CAG ACA GTCAGG ATC ACA TGC CAA GGA GAC AGC CTCAGA AGC TAT TAT GCA AGC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA CAG GCC CCT GTACTT GTC ATC TAT GGT AAA AAC AAC CGG CCC TCA GGG ATC CCA GAC CGA TTCTCT GGC TCC AGC TCA GGA AAC ACA GCT TCC TTG ACC ATC ACT GGG GCT CAGGCG GAA GAT GAG GCT GAC TAT TAC TGT AAC TCC CGG GAC AGC AGT GGT AACCAT GTG GTA TTC GGC GGA GGG ACC AAG CTG ACC GTC CTA GGT其中抗体重链可变区基因属于抗体V_H3家族。进一步用Sfil和Notl酶分别消化含抗体hCo4基因的质粒。把hCo4基因插入到pCANTAB5E表达载体上。转化大肠杆菌HB2151，通过IPTG诱导细胞表达产生可溶性单链抗体。收集培养液上清中的可溶性单链抗体。

(5)可溶性单链抗体的鉴定：培养上清经过浓缩与纯化后进行免疫活性检测，ELISA与Western blot均证明单链抗体hCo4能够识别IV型胶原酶，其免疫反应随着IV型胶原酶量的增加而增强，但不与牛血清白蛋白(BSA)和其它蛋白，如乙肝病毒表面抗原，癌胚抗原以及促血管内皮细胞生长因子发生交叉反应。单链抗体分子量为27KD，是由235个氨基酸组成，其序列如下：E V Q L V E S G G G L I Q P G G S L R L S C A A S G F T V S S N YM S W V R Q A P G K G L E W V S V I Y S G G S T Y Y A D C V K G R F TI S R D N S K N T L Y L Q M N S LR A E D T A V L L C K R D L C D W G QG T L V T V S R G G G G S G G G G S G G G G S S E L T Q D P A V S V AL G Q T V R I T C Q G D S L R S Y Y A S W Y Q Q K P G Q A P V L VI Y G K N N R P S G I P D R F S G S S S G N T A S L T I T G A Q A ED E A D Y Y C N S R D S S G N H V V F G G G T K L T V L G

(6)抗体hCo4的纯化：用SDS-PAGE凝胶电泳及Western blot分析培养上清，可溶性单链抗体的表达量约为2mg／L左右。经葡聚糖G-75分子筛层析可获得纯度大于80％的单链抗体。本发明获得的IV型胶原酶单链抗体属于人抗体，它不仅是研究肿瘤转移的有效工具，而且将应用于肿瘤的治疗。

Claims (2)

1．一种人IV型胶原酶单链抗体，其特征在于：所说的人IV型胶原酶单链抗体是由235个氨基酸组成，其序列是：E V Q L V E S G G G G L I Q P G G S L R L S C A A S G F T V S S N YM S W V R Q A P G K G L E W V S V I Y S G G S T Y Y A D S V K G R F TI S R D N S K N T L Y L Q M N S L RAE DTAV L L C K R D L C D W G QG T LV T V S R G G G G S G G G G S G G G G S S E LT Q D P AV S V AL G Q T V R I T C Q G D S L R S Y Y A S W Y Q Q K P G Q A P V L VI Y G K N N R P S G I P D R F S G S S S G N T A S L T I T G A Q A ED E A D Y Y C N S R D S S G N H V V FG G G T KL T V L G

2．编码权利要求1所述的人IV型胶原酶单链抗体的基因，其序列是：GAG GTG CAG CTG GTG GAG TCT GGA GGA GGC TTG ATC CAG CCT GGG GGGTCC CTG AGA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGG TTC ACC GTC AGT AGC AACTAC ATG AGC TGG GTC CGC CAG GCT CCA GGG AAG GGG CTG GAG TGG GTCTCA GTT ATT TAT AGC GGT GGT AGC ACA TAC TAC GCA GAC TCC GTG AAGGGC CGA TTC ACC ATC TCC AGA GAC AAT TCC AAG AAC ACG CTG TAT CTTCAA ATG AAC AGC CTG AGA GCC GAG GAC ACG GCC GTA TTA CTG TGC AAGAGA GAC TTG TGT GAT TGG GGC CAA GGT ACC CTG GTC ACC GTG TCG AGAGGT GGC GGT GGC TCG GGC GGT GGT GGG TCG GGT GGC GGC GGA TCT TCTGAG CTG ACT CAG GAC CCT GCT GTG TCT GTG GCC TTG GGA CAG ACA GTCAGG ATC ACA TGC CAA GGA GAC AGC CTC AGA AGC TAT TAT GCA AGC TGGTAC CAG CAG AAG CCA GGA CAG GCC CCT GTA CTT GTC ATC TAT GGT AAAAAC AAC CGG CCC TCA GGG ATC CCA GAC CGA TTC TCT GGC TCC AGC TCAGGA AAC ACA GCT TCC TTG ACC ATC ACT GGG GCT CAG GCG GAA GAT GAGGCT GAC TAT TAC TGT AAC TCC CGG GAC AGC AGT GGT AAC CAT GTG GTATTC GGC GGA GGG ACC AAG CTG ACC GTC CTA GGT